Vyšetřovací metody KLINICKÉ VYŠETŘENÍ LABORATORNÍM VYŠETŘENÍ PRO IMUNOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MUSÍ BÝT. Anomálie v základním laboratorním vyšetření

Transkript

1 PRO IMUNOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MUSÍ BÝT INDIKACE Vyšetřovací metody v klinické imunologii - imunologický profil Anamnéza Klinický obraz Anomálie v základním laboratorním vyšetření Neobvyklé mikrobiologické nálezy ANAMNÉZA KLINICKÉ VYŠETŘENÍ rodinná anamnéza (dědičná zátěž, úmrtí v časné postnatální fázi života, příbuzenská plemenitba) vliv stáří a pohlaví chronicita procesu léky a jejich účinnost výživa, profylaktická opatření temperament, výživný stav, stav kůže a sliznice, chronické zánětlivé infekční a nádorové procesy, trias, stav kloubů nespecifické příznaky dlouhotrvající subfebrilie až febrilie, artralgie až artritidy, myalgie, celkové neprospíváni specifické příznaky ANOMÁLIE V ZÁKLADNÍM LABORATORNÍM VYŠETŘENÍ hematologické vyšetření elektroforéza bílkovin séra biochemické vyšetření NEOBVYKLÉ MIKROBIOLOGICKÉ NÁLEZY tzv. oportunní patogeny (Pneumocystic carinii, Candida albicans, plísně, atypické mykobakterie) recidivující infekce nebo infekce s prodlouženým průběhem

2 ODBĚR MATERIÁLU funkční testy nesrážlivá krev (heparin, EDTA), sterilní odběr, rychle do laboratoře serologické testy krev bez antikoagulancií, srazit a odstředit, skladování, doprava do laboratoře TESTY IMUNOLOGICKÉHO PROFILU Testy počtu a aktivity buněk počet leukocytů stanovení subpopulací lymfocytů funkční testy neutrofilů (monocytů-makrofágů) funkční testy lymfocytů Stanovení hladiny protilátek a humorálních faktorů celková hladina imunoglobulinů (izotypů) složky komplementu, hemolytický komplement proteiny akutní fáze a další humorální faktory cytokiny STANOVENÍ POČTU LEUKOCYTŮ Celkový počet leukocytů Bürkerova komůrka počítačové (polo)automaty Diferenciální rozpočet leukocytů krevní nátěr barvený dle Pappenheima (Wrighta) počítací automaty průtoková cytometrie Počet leukocytů Leukocytóza (a neutrofilie) zánětlivý proces - bakteriální infekce, akutní pankreatitida Monocytóza chronické hnisavé infekce, dlouhodobá terapie kortikoidy Eosinofilie hypersensitivita I. typu, parazitární infekce, Lymfopenie virové infekce, imunosuprese (stres, kortikoidy) Lymfocytóza lymfoproliferativní onemocnění (lymfóm) Neutropenie vyčerpání kostní dřeně Stanovení subpopulací lymfocytů průtoková cytometrie PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE

3 Subpopulace lymfocytů T lymfocyty - CD3 Th (pomocné) lymfocyty - CD4 Tc (cytotoxické) lymfocyty - CD8 B lymfocyty - CD19, CD79alfa NK buňky CD56 T lymfocytů > B lymfocytů Th lymfocytů > Tc lymfocytů Subpopulace lymfocytů v periferní krvi psa Parametr průměr ± SD Lymfo % 27.4 ± 8.7 x 1 9 /l 2.7 ± 1. Ne/Ly poměr 2.5 ± 1.4 CD3+ % 8. ± 7.4 CD4+ % 43.2 ± 6.9 CD8+ % 19.1 ± 5.7 CD21+ % 14.4 ± 5.9 CD4/CD8 poměr 2.5 ±.9 Meziplemenné rozdíly v zastoupení subpopulací lymfocytů v periferní krvi psů IMUNOKOMPETENCE ŠTĚŇAT % * NO ** ** Da lm Be ag J eze * ** * ** * B-lymfo T-lymfo CD4+ CD8+ CD4/CD8 Marker 5. Ratio 2.5. Protilátky IgG prochází částečně placentou, ale jejich koncentrace u novorozených štěňat je zcela nedostatečná V našich studiích zaměřených na imunokompetenci štěňat v prvních týdnech života jsme zjistili: v prvních čtrnácti dnech se významně mění počty leukocytů počty leukocytů a subpolulací lymfocytů se ustálí až asi ve 3 měsících aktivita lymfocytů je po narození asi poloviční oproti dospělým zvířatům, ale rychle se zvyšuje štěňata jsou schopna již ve stáří cca 1 týden odpovídat na imunizaci (atenuovaným parvovirem) téměř adekvátní tvorbou protilátek (pokud však nemají kolostrální protilátky LEUKOCYTE COUNTS IN THE PERIPHERAL BLOOD OF DOGS DURING THE FIRST THREE MONTHS OF LIFE /l 1 5 T AND B LYMPHOCYTE SUBSETS IN THE PERIPHERAL BLOOD OF DOGS DURING THE FIRST THREE MONTHS % 4 CD3+ CD Leukocytes Neutrophiles Lymphocytes days adults days adults

4 CD4/CD8 ratio in different compartments: blood ( ), spleen ( ), popliteal ( ) and mesenterial ( ) lymph nodes. Puppies in the age of one day (1), one week (2), two weeks (3), one-month (4) are compared to adult dogs (5). FUNKČNÍ TESTY BUNĚK 4 3 ratio Funkční testy buněk Aktivita lymfocytů test blastické transformace po stimulaci mitogeny (PHA, ConA, PWM) test inhibice migrace leukocytů, směsná lymfocytární reakce, cytotoxické testy produkce cytokinů Fagocytóza (aktivita neutrofilů, příp. monocytů) test migrace a chemotaxe, test adherence test pohlcování částic (syntetické, bakterie) testy metabolické aktivity produkce ROI test mikrobicidní exprese povrchových molekul PROBLÉMY FUNKČNÍCH TESTU Potřeba pracovat s plně aktivními buňkami Technická obtížnost metod Potřeba kultivace (aseptické postupy) Náročnost na přístrojové vybavení Obtížná standardizace Referenční hodnota Vysoká variabilita výsledků Blastická transformace lymfocytů princip: mitogeny jsou schopné aktivovat lymfocyty, mitotická aktivita se zjistí zabudováním thymidinu značeného radioaktivním vodíkem mitogeny: ConA, PHA, PWM 2 µl l na jamku mononukleární buňky o koncentaci 1x1 6 /ml - 2 µl l na jamku kultivace v mikroplotnách (kultivační medium + prekolostrální telecí sérum) - 3 dny 2 hodin před koncem kultivace + 5 µl l media s radionuklidem množství radioaktivního thymidinu v buňkách se zjistí na přístroji pro kapalnou scintilaci vyhodnocení: poměr stimulovaných a nestimulovaných kultur lymfocytů, tzv. stimulační index Izolace mononukleárních buněk princip: buňky menší specifické hmotnosti zůstanou nad denzitním gradientem 1,77g/l do zkumavky 3ml ficoll + telebrix opatrně navrstvit 5ml krve s mediem (1+2) odstředit (6g, 4 minut) prstenec mononukleárních buněk odsát (červené krvinky a granulocyty propadly do sedimentu) mononukleární buňky propláchnout 2x mediem (odstřeďování 2g, 1 minut)

5 LYMPHOCYTE TRANSFORMATION TEST (ConA) IN DOGS DURING THE FIRST THREE MONTHS OF LIFE 3 CPM 2 1 Detekce cytokinů na úrovni genu RT-PCR pro detekci mrna na úrovni proteinu ELISA, intracelulární značení na úrovni biologické funkce - bioassay days adults TEST CHEMOTAXE POD AGARÓZOU agaróza na misku, po ztuhnutí 2 jamky 1. jamka testované granulocyty 2. jamka chemotaktická látka (aktivovaný komplement) měří se dráha spontánní a stimulované migrace TEST POHLCOVÁNÍ SYNTETICKÝCH ČÁSTIC inkubace 1 hodinu při 37ºC, 2-3x protřepat 5 minut před koncem inkubace + 2 µl l chelatonu nátěr na podložní sklíčko barvení: May-Grünwald, Giemsa-Romanowski mikroskopicky odečíst 2 leukocytů stanovit diferenciální počet leukocytů, procento fagocytujících buněk TESTY DETEKCE TVORBY ROI redukce tetrazoliových solí přeměna bezbarvé tetrazoliové soli na barevný formazan test chemiluminiscence luminol je oxidován, při následné spontánní redukci dojde k vyzařování fotonů TEST MIKROBICIDIE krev + bakterie (S.aureus, C.albicans) inkubace 1 hodinu při 37ºC počítá se množství přeživších bakterií měří se spontánní a stimulovaná vyloučení tzv. chronické granulomatózní choroby

6 Stanovení protilátek Celková hladina imunoglobulinů srážecí metody, elektroforéza stanovení jednotlivých tříd IgM, IgG, IgA Hladina specifických protilátek (sérologie) diagnostika infekce (FeLV-Ag, FIV-Ab) antiinfekční imunita VÝZNAM KOLOSTRÁLNÍCH PROTILÁTEK Mláďata hospodářských zvířat se rodí agamaglobulinemická, štěňata, koťata hypogamaglobulinemická (zvýšená hladina svědčí pro intrauterinní infekci) Novorozená mláďata jsou závislá na příjmu kolostrálních protilátek Epitel střeva je v prvních hod prostupný pro imunoglobuliny bez ztráty jejich aktivity, přestup je aktivní děj Napití cca 2 l kvalitního kolostra do 2 hod po narození navodí u telete do 24 hod normoglobulinémii Kolostrální protilátky ochrání mláďata před neonatální sepsí a generalizovanými infekčními chorobami Kolostrální protilátky inhibují aktivní imunitní odezvu Pro ochranu proti střevním patogenům je třeba kontinuální přísun protilátek mlékem - laktogenní imunita Stanovení imunoglobulinů radiální imunodifůzí připravit 1% agarózu s vhodnou koncentrací antiséra (obvykle 1% - titrace) 56 o C vyředit standardní sérum na kalibraci aplikace vzorku (konstantní množství) do jamek v agaróze inkubace ve vlhké komůrce 24 hod o C odečíst průměr precipitace na pravítku a vyhodnotit z kalibrační křivky

7 Vyšetření protilátek metodou ELISA ELISA aplikace přísluš. antigenu ve vazném pufru ph 7,2 9,6 noc lednice 3x vymytí přebytku antigenu vyředit vyšetř. vzorek nebo napipetovat předředěný vzorek, inkubace 6 37 o C 3x vymytí nenavázaného séra napipetovat příslušný konjugát ve vhodném ředění inkubace 6 37 o C 3x vymytí přebytku konjugátu aplikace substrátu TMB, OPD, ABTS, 5AS inkubace 5-15 stop roztok a měření iems reader ODPOVĚĎ NA IMUNIZACI PARVOVIREM stáří 1 týden stáří 2 týdny stáří 4 týdny stáří 6 týdnů stáří 8 týdnů VYŠETŘENÍ KOMPLEMENTOVÉHO SYSTÉMU vyšetření jednotlivých složek C3, C4 vyšetření aktivity komplementové kaskády: CH5-5% hemolýza vyvolaná komplementem suspenze ovčích Erys + postupně ředěné pacientovo sérum určí se množství séra potřebné pro 5% hemolýzu čím méně séra je potřeba, tím více komplementu v séru je VYŠETŘENÍ PROTEINŮ AKUTNÍ FÁZE C-reaktivní protein alfa-1-antitrypsinantitrypsin orosomukoid ceruloplasmin alfa-2-makroglobulin transferin prealbumin