prasata přeneseny rovněž z volně žijících kachen.

Transkript

1 Doc. MVDr. Vladimír Dubanský, CSc., Doc. MVDr. Josef Drábek, CSc., V práci jsou přehledně shrnuty nové poznatky týkající se chřipky prasat ze všech přednášek a posterů (včetně workshopů ) ze sympozia konaného v Římě pod názvem 4th International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases. Chřipka prasat (Swine Influenza SI ) je akutní, vysoce kontagiózní virové onemocnění respiračního traktu prasat, které je rozšířeno po celém světě. Infikovaná prasata mají snížené denní přírůstky a vykazují zpomalený růst. Virus chřipky prasat (SIV) vyvolává buď samostatné onemocnění, nebo je spolu s ostatními respiračními patogeny příčinou vzniku komplexu respiračních onemocnění prasat (PRDC). Z virů influenzy (A, B, C), které je možno rozlišit na základě přítomnosti charakteristických nukleoproteinů (NP) a proteinů matrix (tzv. M proteinů), je nejdůležitější chřipkový virus typu A. SI virus typu A patří do čeledi Orthomyxoviridae a rodu Influenza. Nejčastěji bývá izolován z plic vodních ptáků, lidí, prasat, koní, mořských savců (např. velryb) a norků. Virus chřipky typu A obsahuje dva povrchové glykoproteiny hemaglutinin (HA) a neuraminidázu (NA). HA proteiny se vážou na sialiloligosacharidové receptory na povrchu buněk a zaručují tak fúzi virového obalu (tj. nukleokapsidy) s buněčnou membránou. NA proteiny působí svou enzymatickou aktivitou. Jejich sialidáza štěpí terminální sialovou kyselinu z glykoproteinů buněčného povrchu. Uvedené sialové kyseliny glykoproteinů obsahují receptory pro kmeny viru chřipky typu A. Chřipkové viry typu A izolované z plic nemocných lidí jsou schopny rozeznat a vázat se na 2,6 galaktózu N- acetylneuraminové kyseliny alfa. SIA viry izolované u koní a ptáků se vážou na 2,3 galaktózu N- acetylneuraminové kyseliny alfa. Jedině chřipkové viry typu A izolované u infikovaných prasat dokážou detekovat a vázat se jak na 2,6, tak na 2,3 galaktózové receptory. Oba zmíněné receptory jsou lokalizovány v epiteliálních buňkách tracheální sliznice prasat. Proto se prase stalo nejdůležitějším rezervoárovým zvířetem chřipkových virů. Vzhledem k tomu se mohou na prasata adaptovat nejen SIA viry běžně se vyskytující u koní a lidí, ale i chřipkové viry typu A izolované u ptáků. Organismus prasat se tak stal šejkrem, ve kterém se mohou mísit a geneticky přestavovat ( reassortment ) SIA viry ptáků, koní, lidí a prasat. 1 V respiračním ústrojí prasat tak vznikají vysoce virulentní chřipkové viry s novými vlastnostmi, které mohou být příčinou fatálních pandemií lidí. Například pandemie španělské chřipky lidí z roku 1918 (která si vyžádala 20 miliónů obětí) vznikla na základě nového genetického uspořádání ( HA-reassortment ) linie prasečích a lidských chřipkových virů. Uvedenou genetickou přestavbou se výrazně zvýšila virulence těchto chřipkových kmenů. 2 U asijské chřipky (asijský kmen/57) z roku 1957 se u původního chřipkového viru typu A ptačí linie změnily tři geny (kódující HA, NA a PB1) a zbývající geny pocházely z lidské linie SIA virů. 3 U hongkongské chřipky z roku 1968 pandemický SIA kmen obsahoval HA a PB1 geny z ptačí linie a zbývající geny byly typické pro lidskou linii chřipkových virů. 4 Na základě studií hongkongské chřipky z roku 1997, u níž pandemický virus H9N2 patřil k ptačí linii, bylo jasně prokázáno, 5 že chřipkové viry ptačí linie po přímém přenosu z ptáků se v lidském organismu nedokážou pomnožit. Z výzkumů prováděných v Číně 6 vyplývá, že chřipkové viry kolují v organismu prasat různě dlouho předtím, než se změní na pandemické. Obvykle se jedná o subpopulaci prasat, která není dostatečně chráněna specifickými anti-sia protilátkami. Byla tak potvrzena skutečnost, která se již dlouhou dobu hypoteticky předpokládala: Chřipkové viry typu A, které původně patřily k ptačí linii, musí patrně nejprve zdolat mezidruhovou bariéru a infikovat prasata. U nich pak vytvoří stálou prasečí linii. Teprve z prasat se přenášejí na lidi. K dalšímu možnému přenosu dochází z lidí na prasata a z prasat zpátky na lidi.6 Z fylogenetických studií je jasné, že většina chřipkových virů typu A je druhově specifická. Vyvolávají samostatné onemocnění u lidí, prasat, koní, mořských savců a ptáků. Pokud však dojde k mezidruhovému přenosu: z ptáků na prasata takové SIA viry pak patří k tzv. ptačí linii ( avian-like ) prasečích virů; z lidí na prasata pak se jedná o tzv. lidskou linii ( human-like ) prasečích chřipkových virů. Chřipkové viry (SIV) ptačí linie ( avian-like viruses ) Přenášejí se na prasata v zemích Evropy i Asie. Jedná se zejména o H1N1 virus, který u prasat často vykazuje epizootický průběh. Od roku 1979 se v evropských chovech prasat stal dominantním kmenem. Antigenně i geneticky se dá snadno odlišit od klasických prasečích H1N1 kmenů. H1N1 virus ptačí linie je antigenně úzce příbuzný s H1N1 kmeny virů izolovaných od volně žijících kachen. Předpokládá se, že se může z prasat přenášet na lidi. 7 Přenosem z divokých kachen na prasata došlo k výrazné změně afinity k typu receptorů. Uvedený H1N1 kmen se přednostně váže na 2,6 alfa receptory. I u kmenů H4N6 a H9N2 virů ptačí linie, které byly v nedávné době detekovány v populaci prasat, 8 došlo ke změnám genů kódujících hemaglutinin. Výsledkem uvedených změn je preferenční vazba na 2,6 alfa receptory. H3N2 kmeny virů ptačí linie, izolované v asijských chovech prasat od 70. let minulého století, byly na

2 prasata přeneseny rovněž z volně žijících kachen. Chřipkové viry (SIV) lidské linie ( human-like viruses ) Rovněž se přenášejí na prasata. Přestože první důkazy o infekci prasat těmito kmeny SIA virů pocházejí již z roku 1938, 9 jejich intenzivní výzkum byl ve skutečnosti zahájen až po roce V té době byl v chovech prasat na Tchai-wanu poprvé izolován hongkongský chřipkový virus H3N2. 10 Předpokládá se, že některé kmeny H3N2 virů lidské linie by se mohly v budoucnu znovu přenést z prasat na lidi a vyvolat chřipkovou pandemii. K objevení (nebo znovuobjevení) nových chřipkových kmenů virů dochází tím, že: 1) se za určitou dobu nahromadí bodové mutace. Geny kódující hlavní virové proteiny se tímto procesem po antigenní stránce změní. Jedná se o tzv. antigenní drift ; 2) rekombinací vznikne nový typ chřipkového viru. K těmto změnám nejčastěji dochází v případě, že je například prase simultánně infikováno dvěma antigenně odlišnými kmeny chřipkových virů. Smícháním jejich genů (tj. rekombinací) může vzniknout zcela nový typ (nebo subtyp) chřipkového viru. Jedná se o tzv. antigenní shift ; 3) se přenese na prase celý A virus z jiného druhu zvířete nebo z člověka ( human-like ) či z ptáků ( avianlike ); 4) se v organismu prasat uskuteční úplná genetická přestavba ( genetic reassortment ) chřipkového viru. K úplné přestavbě genetické informace (na rozdíl od pouhé rekombinace) dochází pouze u virů, které mají segmentovaný genom. V případě chřipkových A virů se jedná o osm segmentů jednovláknité RNA. Všech osm segmentů dohromady kóduje 10 virových proteinů. Reassortment se liší od rekombinace i tím, že vyvolává jen určité funkční změny genomu. Naproti tomu při rekombinaci může dojít ke změnám v kterémkoliv (i různě dlouhém) úseku genetické sekvence. 11 Potenciál genetických změn chřipkových A virů Vyplývá z počtu permutací dvou hlavních povrchových proteinů, tedy ze změn: - hemaglutininu (HA), který zajišťuje adhezi chřipkových virů na buňky; - neuraminidáz (NA), které uvolňují chřipkový virus z buněk. U chřipkových virů typu A je v současné době známo 15 různých hemaglutininů (H1-H15) a 9 typů neuraminidáz (N1-N9). U prasat byla navíc popsána i řada subtypů zahrnujících kmeny H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H3N1 a H4N6. 12 Subtyp H3N2 izolovaný v amerických chovech prasat vznikl trojnásobnou genetickou přestavbou ( triple reassortant ). Obsahuje genové sekvence chřipkových A virů člověka, prasat a ptáků. V terénních podmínkách chovů byla tak znovu potvrzena klíčová úloha prasat při evoluci mezidruhových reassortantů. 13 U prasat vyvolávají manifestní onemocnění nejčastěji subtypy H1N1, H3N2 a H1N2. Zahrnují klasické prasečí H1N1 viry, H1N1 viry ptačí linie, H3N2 viry lidské i ptačí linie i H1N2 pocházející z různých zdrojů. Uvedené subtypy jsou enzooticky vázány na určité geografické oblasti. Občas však (zejména v přítomnosti imunologicky naivních prasat) vyvolávají i epizootický průběh. 14 H1N1 subtypy chřipkových virů V USA vyvolával chřipku prasat (SI) více než 80 let klasický prasečí subtyp H1N1. Ale od roku 1998 byl v amerických chovech detekován i subtyp H3N2. Kromě respiračních příznaků vyvolával u prasnic a prasniček i poruchy reprodukce. 15 I v evropských chovech prasat dlouhou dobu vyvolával chřipku klasický prasečí subtyp H1N1. V evropských zemích byl u prasat opakovaně izolován zejména v období let Ale již od roku 1979 se většina H1N1 kmenů geneticky přibližovala H1N1 subtypům ptačí linie, které v evropských chovech prasat postupně zcela převládly. Téměř ve stejné době byly subtypy H1N1 ptačí linie izolovány i v asijských chovech prasat. V současné době existuje asijská i evropská sublinie ptačích typů H1N1 kmenů chřipkových virů. V Asii se u prasat kmeny H1N1 ptačí linie vyskytují nejčastěji spolu s klasickými prasečími H1N1 subtypy. V Jižní Americe byl klasický subtyp H1N1 detekován sérologicky v argentinských a brazilských chovech prasat. H3N2 subtypy chřipkových virů prasat V evropských i asijských chovech prasat byly od roku 1984 (v amerických od roku 1998) opakovaně popsány epizootie chřipky prasat vyvolané kmeny subtypů H3N2 lidské linie. Uvedené subtypy byly na prasata přeneseny od nemocných lidí. V organismu infikovaných prasat došlo k jejich genetické přestavbě. Většina těchto H3N2 subtypů je antigenně úzce příbuzná se staršími humánními kmeny (např. A/Port Chambers/1/73). V důsledku toho, že u prasat dochází jen k relativně malé imunitní selekci chřipkových kmenů, uvedené H3N2 subtypy se dnes zjišťují v chovech prasat na celém světě. Z lidské populace kmeny H3N2 již vymizely. Není vyloučeno, že někdy v budoucnu budou znovu přeneseny z prasat na člověka. V současné době v chovech prasat vznikají nové sublinie chřipkových kmenů, které již nejsou závislé na lidských nebo ptačích

3 kmenech chřipkových virů. H1N2 subtypy chřipkových virů prasat Byly detekovány koncem 70. let minulého století v Japonsku a ve Francii. Vznikly z H3N2 virů lidské linie a klasických prasečích H1N1 subtypů. V evropských chovech prasat se původní H1N2 subtypy neudržely. Znovu se objevily teprve v nedávné době. Nejprve (v roce 1994) byly izolovány ve Velké Británii, odkud se rozšířily do Itálie, Francie, Německa a Belgie. 16 Tyto evropské H1N2 subtypy vznikly několikanásobnou genetickou přestavbou ( genetic reassortment ). Zahrnují prasečí H3N2 chřipkové viry (antigenně příbuzné s chřipkovými viry lidské linie ), dále lidské H1N1 subtypy a prasečí H1N1 kmeny ptačí linie. 17,18 V USA byly H1N2 subtypy nejprve izolovány u prasat v Indianě, 19 odkud se rozšířily do značné části amerických chovů prasat. 20 Další, méně časté subtypy (H1N7, H4N6, H9N2) chřipkových virů prasat Subtyp H1N7 izolovaný u prasat ve Velké Británii v roce vznikl z chřipkových virů lidí a koní. Jeho další šíření zatím nebylo prokázáno. K podobnému vývoji došlo i u ptačích subtypů H4N6 a H9N2, které byly izolovány v 80. letech minulého století v Hongkongu 22 a později8 i v Japonsku. Ani tyto subtypy se v chovech prasat zatím nerozšířily, přestože u nich zřejmě došlo k modifikaci HA genu umožňujícímu vazbu na 2,6 receptory. Na druhé straně platí, že adaptační proces nových subtypů na prasata může někdy trvat i desítky let. 14 Patogeneze a klinická manifestace chřipky u prasat Bývá téměř stejná, ať už je onemocnění vyvoláno subtypem H1N1, či H1N2 nebo H3N2. U kmenů subtypů H3N2 se však kromě respiračních příznaků ve zvýšené míře zjišťují i poruchy reprodukce. Nejčastěji se chřipka klinicky projeví po nákupu infikovaných prasat a jejich převedení do vnímavého stáda. V důsledku neustálého přísunu mladých prasat se v chovech infekce udržuje dlouhou dobu. Ne vždy však dochází ke klinické manifestaci. Epizootický průběh se obvykle objevuje simultánně v několika chovech lokalizovaných v dané oblasti. Přímou příčinou však nemusí být nákup prasat, protože ve většině chovů v oblasti s intenzivním chovem prasat se chřipka udržuje jako enzootické onemocnění. Chřipkové viry nejsou obsaženy v krvi, ale v nazálních, tracheálních a bronchiálních exkretech. Přenášejí se přímým kontaktem prasat pomocí aerogenní infekce. Klinickou manifestaci usnadňuje nadměrná koncentrace prasat v kotcích, stresové situace i meteorologické vlivy. I když k infekci dochází v průběhu celého roku, přece jen nejčastěji propuká chřipka prasat (stejně jako u lidí) v chladných měsících. Vylučování virů může být dlouhodobé (tzn. po dobu několika měsíců), ale většinou trvá jen 7 10 dnů. Klinické příznaky se obvykle zjišťují pouze u % prasat v chovu. Pokud jsou prasata infikována pouze chřipkovými viry, onemocnění probíhá benigně. Je charakterizováno nízkým procentem mortality a brzkým uzdravením. 23,24 Vzhledem k tomu, že neexistuje specifická terapie a prasata se většinou sama uzdraví, farmáři v USA veterinární lékaře ke zvládnutí chřipky ani nezvou. Ve vnímavém chovu propuká chřipka prasat náhle a má akutní průběh. Inkubační doba bývá dvou- až čtyřdenní. Onemocnění je charakterizováno anorexií, celkovou skleslostí a ztrátou kondice. Denní přírůstky se snižují. Dochází ke zpomalování růstu s častým vznikem zakrslíků. Horečka (40,5 41,0 C) se zjišťuje obvykle 4. den po infekci. Výrazné respirační příznaky zahrnují zrychlené a namáhavé dýchání s pomocí břišního lisu ( thumping ). Objevují se déletrvající záchvaty kašle, někdy i kýchání. Jsou doprovázeny výtoky z očí (konjunktivitida) a z nosu (zánět nosní sliznice). Vrhy bývají málopočetné. Březí prasničky (a někdy i prasnice) mohou zmetat. V enzooticky zamořených chovech (díky kolostrálním protilátkám) může probíhat onemocnění selat asymptomaticky. S plnou silou však často propuká až u prasat ve výkrmu. V mnoha případech se onemocnění přenáší na lidi, neboť chřipka prasat je zoonóza. Přenosem určitých subtypů (s rozsáhlou genovou přestavbou - reassortment ) na lidi vznikají těžké (někdy i fatální) pandemie. Patoanatomicky se zjišťuje virová pneumonie. Ostře ohraničené úseky změněné plicní tkáně bývají lokalizovány v apikálních a kardiálních lalocích. V současné době se chřipkové viry mohou podílet na vzniku komplexu respiračních chorob prasat. Při PRDC je proto vždy nezbytně nutné podíl chřipkových virů typu A u nemocných prasat potvrdit, nebo vyloučit. Diagnóza Provádí se pomocí izolace (či jiné detekce) viru nebo sérologicky. Antigenní typizace virových izolátů se tradičně provádí pomocí sérologických testů, tzn. hemaglutinačně inhibičními (HI) a neuraminidázo-inhibičními testy. Při sérologické diagnostice chřipky je třeba vycházet z toho, že u prasat, která se uzdravila, ještě dlouhou dobu (až 6 měsíců PI) perzistují v krevním oběhu specifické protilátky. Protilátky je možno prokázat i po vakcinaci. Diagnózu potvrzuje signifikantní (tzn. nejméně čtyřnásobné) zvýšení hladiny specifických protilátek v párových vzorcích krve, odebraných v intervalu 4 6 týdnů. K průkazu H1N1 a H3N2 protilátek je nutno použít dvou HI testů s použitím H1N1 a H3N2 antigenů. Vzhledem k izolaci subtypu H1N2 v evropských chovech prasat se doporučuje provést i třetí HIT s H1N2

4 antigeny. Přítomnost specifických anti-siv protilátek je možno přesně určovat i pomocí ELISA testů (IDEXX SIV Antibody Test KIT, IDEXX Lab. Westbrook, Maine, USA). Poměr mezi vyšetřovaným vzorkem S ( Sample ) a pozitivní kontrolou P pro průkaz specifických protilátek se musí rovnat nebo být vyšší než 0,40 (P/S 0,40). I když je možno provádět izolace chřipkových virů z plicní tkáně kultivací na kuřecích embryích nebo pomocí speciálních tkáňových kultur TK-NPTr ( Newborn Pig Trachea ) či TK-MDCK ( Madine Darby Canine Kidney ), nejspolehlivější průkaz chřipkových virů, umožňující navíc i diferenciální detekci jednotlivých subtypů, se provádí pomocí rychlých imunoesejových testů 25 nebo dvou multiplex RT-PCR. 23 Princip multiplex RT-PCR Virová RNA se extrahuje pomocí komerčně dostupného kitu (RNeasy mini kit Quiagen). RNA se transkribuje pomocí primérů za použití dvou oddělených multiplex PCR reakcí určených k amplifikaci hemaglutininu (HA) a neuraminidázy (NA). RT-PCR amplifikáty se oddělí a vizualizují v 1,5% agarovém gelu barvením pomocí ethidium bromidu. Průkaz jednotlivých subtypů (tj. H1N1, H1N2 a H3N2) se potvrzuje na základě velikosti amplifikačních produktů. Přehled používaných primerů uvádí tabulka 1. RT-PCR je vhodná i k vyšetření běžných klinických vzorků ze změněné plicní tkáně nebo z nazálních či tracheálních výtěrů. Při náhlém vzplanutí chřipky v chovu se doporučuje nejprve vyšetřit směsné vzorky ( pool of specimens ). RT-PCR je v tomto případě použita jako orientační skreeningová metoda ještě před vlastní kultivací. Multiplex RT-PCR v kombinaci s kultivací na TK-NPTr (tj. z buněk trachey novorozených selat) dokáže detekovat chřipkové viry v 96 % případů. Jedná se o vysoce citlivou a časově nenáročnou diagnostickou metoda. Profylaxe V evropských zemích jsou inaktivované chřipkové vakcíny komerčně dostupné od roku Obvykle obsahují olejové adjuvans a oba virové subtypy (tj. H1N1 a H3N2), které v daném období v Evropě převládaly. Z hlediska jednotlivých kmenů většina evropských vakcín (doporučovaných pro použití v chovech prasat) obsahuje lidský kmen New Yersey/76/ H1N1 a kmen Port Chalmers/73/H3N2. Při zkoušení těchto vakcín za přísných experimentálních podmínek (na selatech pocházejících z chovů zaručeně prostých chřipky prasat, mykoplazmové i aktinobacilové pneumonie a viru reprodukčního a respiračního syndromu PRRS) jsou očkovaná prasata (po následné čelenži SIV) chráněna před rozvojem klinických příznaků onemocnění. Účinnost těchto vakcín závisí na použitém adjuvans a kvalitě i množství hemaglutininu (HA) obsaženém ve vakcíně. Tyto bivalentní vakcíny však ani za experimentálních podmínek nechrání prasata proti infekcím subtypu H1N2, který se v evropských chovech (a v současné době i všude na světě) běžně vyskytuje. Když se do uvedené bivalentní vakcíny přidá kmen H1N2, prasata jsou vůči tomuto subtypu chráněna, ale automaticky se snižují výšky titru protilátek proti subtypům H1N1 a H3N2. Na druhé straně platí, že prasata vakcinovaná kmenem H1N1 jsou zcela nechráněna vůči infekci H3N2. Naproti tomu bylo prokázáno, že experimentální infekce (ne vakcinace) může vytvářet určitou míru ochrany i proti odlišným subtypům chřipkových virů. 27 Na rozdíl od vakcinace je přirozená infekce z hlediska pozdější imunity daleko účinnější. Je třeba zdůraznit, že po vakcinaci je možno v krevním séru očkovaných prasat detekovat pouze odpovídající HA protilátky. V důsledku přirozené infekce ale vznikají 1. systémové (tj. cirkulační) protilátky, jak proti HA proteinům, tak i vůči NA antigenům vnitřních nukleoproteinů (NP) i vůči proteinům matrix (M); 2. lokální slizniční protilátky v respiračním traktu. Jedná se o virus specifické IgA protilátky nejen na povrchu nosní sliznice, ale i v hlubších částech respiračního traktu; 3. buněčná imunitní reakce. I v USA se v experimentálních podmínkách osvědčily inaktivované bivalentní vakcíny (např. END-FLU ence- 2 Intervet Anim Health nebo MaxiVac R Excell TM ) obsahující H1N1 a H3N2 subtypy. 28 I když je tento typ inaktivovaných bivalentních vakcín za experimentálních podmínek velmi účinný, ze zkušeností farmářů i veterinárních lékařů vyplývá, že v terénních podmínkách infikovaných chovů prasat jsou buď zcela neúčinné nebo je protekční účinek těchto vakcín minimální. Příčin je několik: V případě, že se v chovu prasat kromě chřipkových virů prokáže i virus PRRS, účinnost SI vakcín se výrazně snižuje Pokud v krevním oběhu vakcinovaných selat nebo mladých prasat kolují specifické anti-siv mateřské protilátky, vakcinace bývá málo účinná nebo zcela neúčinná. Výsledek vakcinace nepříznivě ovlivňují i relativně nízké titry kolostrálních protilátek, tj. 1:20, podle jiných autorů 1: Správné načasování vakcinace by tedy mělo vycházet ze znalostí doby nutné k poklesu specifických mateřských protilátek v krevním oběhu selat a mladých prasat. Pokud výchozí titry mateřských protilátek jsou u selat nebo mladých prasat vyšší než 1 : 40 (což v enzooticky SIV zamořených chovech není žádnou zvláštností), poločas rozpadu odpovídá: - u kmenů subtypů H1N2 6,3 týdnům, - u kmenů subtypů H1N1 6,6 týdnům, - u kmenů subtypů H3N2 7,5 týdnům. Pokles HI protilátek pod hladinu 1:40 proto vyžaduje dobu:

5 - u subtypů H1N1 15 týdnů, - subtypů H3N2 23 týdnů, - u subtypů H1N2 se přesná doba určuje obtížně, protože počet séropozitivních prasat bývá relativně nízký. V enzooticky zamořených chovech by se doba vakcinace u subtypu H1N1 měla posunout až na hranici 15 týdnů a u subtypu H3N2 až za hranici 23 týdnů (tzn. že by se správně měla vakcinace provádět až ve věku téměř 6 měsíců). Načasování doby vakcinace a revakcinace by mělo vycházet ze zjištěných hladin specifických anti-siv protilátek v příslušném chovu. 24 Dosavadní neuspokojivé výsledky použití inaktivovaných vakcín (u prasat i lidí) vedou ke snaze o přípravu živých atenuovaných vakcín. Podle některých autorů33 by měly větší naději na úspěch, protože by dokázaly indukovat nejen humorální, ale i buněčnou imunitu. Literatura: 1. Corradi A., Ferrari M., Di Lecce R., Cacchioli A., Cabassi E. Influenza A Hemagglitinin Receptors Expression in Two Pig Cell Lines. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Gibbs M. J., Armstrong J. S., Gibbs H. J. Recombination in the Hemagglutinin Gene of the 1918 Spanish Flu. Science 2001;293(5536): Scholtissek C., Rohdo W., von Hoyningen V. et al. On the origin of the human ingluenza subtypes H2N2 and H3N3. Virology 1978;87: Kawaoka Y., Webster R. G. Interplay between carbohydrate in the stalk and the lenght of the connecting peptide determines the cleavability of influenza virus hemagglutinin. J Virol 1989;63: Lin Y. P., Show M., Gregory V. et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza viruses: relationship between H9N2 and H5N1 human isolates. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97: Li H., Yang H., Xin X. et al. Swine influenza H3N2 viruses circulating in pig population in China in 2001 closely related to avian influenza viruses. Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Pensaert M., Ottis K., Vandeputte J., Kaplan M., Backmann P. A. Evidence for natural transmission of influenza A virus from wild ducks to swine and its potential importance for man. Bull World Health Org 1981;59: Katsuda K., Sato S., Shirahata T. et al. Antigenic and genetic characteristics of H1N1 human influenza virus isolated from pigs in Japan. J Gen Virol 1995;76: Shope R. E. Serological evidence for the occurence of infection with human influenza virus in swine. J Exp Med 1938;67: Kundin W. D. Hong Kong A2 influenza virus infection among swine during a human epidemic in Taiwan. Nature 1970;228: Mengeling W. L. How viruses change. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Olsen C. W. The emergence of novel swine influenza viruses in North America. Virus Res 2002;85: Scholtissek C. Molecular evolution of influenza viruses. Virus Genes 1995;11: Brown J. H. The molecular epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Webby R. J., Swenson S. L., Krauss S. L. et al. Evolution of swine H3N2 influenza virus in United States. J Virol 2000;74: Marozin S., Gregorg V., Cameron K. et al. Antigenic and genetic diversity among swine influenza A H1N1 and H1N2 viruses in Europe. J Gen Virol 2002;83: Brown I. H., Chakraverty P., Harris P. A., Alexander D. J. Disease outbreak in pigs in Great Britain due to an influenza A virus of H1N2 subtype. Vet Rec 1995;136: Brown I. H., Harris P. A., McCauley J. W., Alexander D. J. Multiple genetic reassortment of avian and human influenza A viruses in European pigs, resulting in the emergence of an H1N2 virus of a novel genotype. J Gen Virol 1998;79: Karasin A. I., Olsen C. W., Anderson G. A. Genetic characterization of H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J Clin Microbiol 2000;38: Karasin A. I., Landgraf J., Swenson S. et al. Genetic characterization of H1N2 influenza A viruses isolated from pigs throughout the United States. J Clin Microbiol 2002;40: Brown I. H., Alexander D. J., Chakraverty P., Harris P. A., Manwell R. J. Isolation of an influenza A virus of unusual subtype (H1N7) from pigs in England and the subsequent experimental transmission from pig to pig. Vet Microbiol 1994;39: Nerome K., Ishida M., Nakayama M. et al. Antigenic and genetic analysis of A Hong Kong (H3N2) influenza viruses isolated from swine and man. J Gen Virol 1981;56: Heinen P. P., van Nieuwstadt A. P., Pol J. M. et al. Systemic and mucosal isotype-specific antibody responses in pigs to experimental influenza virus infection. Viral Immunol 2000;13: Candotti P., Foni E., Leotti G. et al. Serological Prevalence for Swine influenza virus in Pigs between 3 and 15 weeks of age in Italian farms: Evaluation of a Maternal Antibody Decay Curve. 4th Int Symp Emerg and Re-emerg. Pig Dis Rome 2003:

6 25. Todd S. J., Minnich L., Warner J. L. Comparison of rapid immunofluorescence procedure with Test Pack RSV and Directigen Flu A for diagnosis of respiratory syncytial virus and influenza A virus. J Clin Microbiol 1995;33: Chiapponi C., Fallacara F., Foni E. Subtyping of H1N1, H1N2 and H3N2 Swine influenza viruses by two multiplex RT-PCR. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Van Reeth K., Labarque G., Pensaert M. The Establisment of an H1N2 Influenza virus in the European Swine population and its Impact on Prevention and Control. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003; Rapp-Gabrielson V. J., Gergen L. R., Eddy B. A. et al. Protection of a swine influenza virus vaccine against an H3N2 virus antigenically and genetically distinct from the vaccine virus. 4th Int Symp Emerg Reemerg Pig Dis Rome 2003: Van Reeth K., Labargue G., De Clerk S. et al. Efficacy of vaccination of pigs with different H1N1 swine influenza viruses using a recent challenge strain and different parameters of protection. Vaccine 2001;49: Heinen P. P., van Nieuwstadt A. P., de Boer-Luitze E. A. et al. Analysis of the quality of protection induced by a porcine influenza A vaccine to challenge with an H3N2 virus. Vet Immun Immunopath 2001;82: Thacker E., Kittikoon P., Vincent A. et al. Influence of PRRS virus infection on Swine Influenza vaccine Efficacy. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Wasmoen T. Swine influenza virus vaccine development technologies in keeping pace with SIV: new strategies in diagnostics and managment. Allen D. Leman Swine Conf, Minneapolus 2000: Richt J. A., Lager K. M., Janka B. H. et al. Attenuation of an H3N2 Swine Influenza Virus utilising a reverse genetics approach. 4th Int Symp Emerg Re-emerg Pig Dis Rome 2003: Doc. MVDr. Vladimír Dubanský, CSc., Doc. MVDr. Josef Drábek, CSc., Klinika chorob prasat FVL VFU Brno Palackého Brno