Současné moţnosti laboratorní diagnostiky anémií

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Současné moţnosti laboratorní diagnostiky anémií (Bakalářská práce) V Hradci Králové, 2016 Monika Šmídlová

2 Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Filip Vrbacký Autor bakalářské práce: Monika Šmídlová Studijní obor: Zdravotní laborant Klíčová slova: anémie, diagnostika anémií, laboratorní diagnostika, laboratorní metody Poděkování Chtěla bych velmi mnoho poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Mgr. Filipu Vrbackému především za trpělivost, ochotu, věcné a cenné připomínky a rady, které mi věnoval při řešení problematiky práce. Velké poděkování patří také mé rodině a přátelům za podporu a povzbuzení po celou dobu mého studia. 2

3 Prohlášení Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného nebo stejného kvalifikačního titulu. V Hradci Králové podpis 3

4 OBSAH 1. Seznam pouţitých zkratek ABSTRAKT ABSTRACT ÚVOD (ZADÁNÍ PRÁCE- CÍL PRÁCE) ANÉMIE Morfologické dělení anémií Anémický syndrom, klinický obraz Kompenzační mechanismy lidského organismu ETIOPATEGENETICKÉ ROZDĚLENÍ ANÉMIÍ Anémie z poruchy tvorby erytrocytů Porucha syntézy hemu Porucha syntézy globinu Porucha syntézy DNA- megaloblastové anémie Porucha proliferace a diferenciace Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů (hemolytické anémie, neboli HA) Korpuskulární HA Defekt membrány erytrocytů Defekt enzymové výbavy erytrocytů (enzymopatie) Nestabilní strukturální varianty Hb (hemoglobinopatie) Extrakorpuskulární HA Imunitní extrakorpuskulární HA Neimunitní extrakorpuskulární HA Anémie z krevních ztrát (akutní posthemorhagické) Anémie ze smíšených příčin (multifaktoriální) LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ V DIAGNOSTICE ANÉMIÍ Druhy vyšetřovaného biologického materiálu a jeho odběr Vyšetřovaný biologický materiál v diagnostice anémií:

5 7.1.2 Odběr biologického materiálu Konvenční hematologická vyšetření Morfologická vyšetření v mikroskopu Zhotovení a barvení nátěru periferní krve (ČHS ČLS JEP) Hodnocení nátěru PK v mikroskopu Stanovení retikulocytů Morfologické hodnocení nátěru kostní dřeně Biochemická vyšetření, speciální instrumentální metody Elektroforéza hemoglobinu Absorpční spektrofotometrie Cytochemie Molekulárně- biologické metody Příprava vzorku Cytogenetické metody DĚDIČNÉ ANÉMIE- LABORATORNÍ NÁLEZY U NĚKTERÝCH TYPŮ Thalassemie Blackfen-Diamondova anémie (DBA) Hemoglobinopatie S- Srpkovitá anémie Hereditární sférocytóza Defekt G-6-PD Kongenitální Fanconiho anémie (FA) ZÁVĚR- SHRNUTÍ PRÁCE SEZNAM ZDROJŮ INFORMACÍ- POUŢITÁ LITERATURA SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ Seznam tabulek Seznam obrázků

6 1. Seznam pouţitých zkratek 2,3-DPG 2,3-bisfosfoglycerát AIHA autoimunitní hemolytická anémie AK aminokyselina ARC absolutní počet retikulocytů (absolute reticulocyte counts) AS anemický syndrom ATP adenosintrifosfát BASO bazofily C komplement CAE celulóza-acetát elektroforéza cdna komplementární DNA CTT chronická transfúzní terapie ČHS ČLS JEP.Česká hematologická společnost České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně DBA Diamond-Blackfen anémie DEB diepoxybutan DIF diferenciální rozpočet leukocytů DNA deoxyribonukleová kyselina EMA eosin-5-maleimid EOS eozinofily EPO erytropoetin Ery erytrocyt/y Fe. ţelezo FISH fluorescenční in situ hybridizace G-6-P glukóza-6-fosfát G-6-PD glukóza-6-fosfátdehydrogenáza GPI kotva glykosylfosfatidylinositolová kotva HA hemolytická anémie Hb hemoglobin HbA. Hemoglobin A HbC Hemoglobin C HbS. Hemoglobin S HCT hematokrit 6

7 HE hereditární eliptocytóza HELLP Hemolysis-Elevated Liver enzymes-low Platelets HGB hemoglobin HNSHA hereditary nonspherocytic hemolytic anemia HON hemolytické onemocnění novorozence HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC-MS spojení HPLC a hmotnostní spektrometrie HPV Lidský Papilomavirus (Human Papilomavirus) HS hereditární sférocytóza HUS hemolyticko-uremický syndrom IEF izoelektrická fokusace IPF immature platelet fiction K 3 EDTA draselná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové KD kostní dřeň KO krevní obraz Leuko leukocyt/y LYM lymfocyty MCV mean cell volume MCV Mean corpuscular volume MDS myelodysplastický syndrom MCH mean corpuscular haemoglobin MCHC mean corpuscular hemoglobin concentration MMS monocyto-makrofágový systém MONO monocyty MPV mean platelet volume NADP nikotinamidadenindinukleotidfosfát NADPH redukovaná forma NADP+ Na-K sodíko-draslíkové NEU neutrofily NK nukleová/é kyselina/y NO oxid dusnatý NRBC normoblast PAT přímý antiglobulinový test 7

8 PCT plateletcrit PDW platelet distribution width PIG-A gen fosfatidylinositol glykan třídy A PK periferní krev PK pyruvátkináza PLT,,, platelets POCT point of care test RBC Red blood cells RDW red distribution width RES retikulo-endotheliální systém RET#... absolutní počet retikulocytů RET Relativní počet retikulocytů RI retikulocytární index RNA ribonukleová kyselina SDS-PAGE elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (sodium dodecylsulphate- polyacrylamid gel electrophoresis) SLE systémový lupus erythematoides SNP single nukleotide polymorphism stfr sérový transferinový receptor Tab. tabulka Trombo trombocyt/y TTP trombotická trombocytopenická purpura Vit. Vitamin WBC white blood cells WHO Světová zdravotnická organizace (World Health Organization) 8

9 2. ABSTRAKT Tato bakalářská práce pojednává o celkovém zhodnocení a shrnutí problematiky anémií z hlediska etiopatogeneze a moţností laboratorní diagnostiky. Práce je především blíţe zaměřena na laboratorní diagnostiku dědičných typů anémií. Anémie neboli anémický syndrom je patologický stav vyznačující se sníţením hladiny hemoglobinu a hematokritu pod fyziologickou mez. Projevy anémie jsou různě závaţné dle rychlosti rozvoje a stupně závaţnosti konkrétního typu anémie. Dochází k poklesu oxygenace tkání, od kterého se odvíjí řada příznaků tkáňové hypoxie. Mezi další následky patří hypovolemie a hyperkinetická cirkulace. U hemolytických anémií se navíc vyskytují příznaky intravaskulární či extravaskulární hemolýzy v organismu. Primární (dědičné) anémie jsou vrozené, jejich příčina tkví ve změně genotypu následkem různých mutací chromozomů, coţ má za následek změnu fenotypu v oblasti vlastností erytrocytů. Proces diagnostiky dědičných anémií zahrnuje správné určení rodinné anamnézy, příslušná podrobná lékařská vyšetření a metody laboratorních vyšetření, které jsou nedílnou součástí současné medicíny. Důleţitá jsou klasická morfologická vyšetření (parametry krevního obrazu, morfologie krevních buněk) i speciální laboratorní vyšetření (cytogenetické a molekulární genetické metody), parametry biochemických vyšetření a také mikroskopické vyšetření kostní dřeně mívá velký význam v diagnostice. Důleţitou roli má poskytování genetického poradenství na odděleních klinické a lékařské genetiky ve zdravotnických zařízeních, která pacientům poskytují edukaci a poradenství v oblasti problematiky dědičných onemocnění. Správná a včasná diagnostika přispívá ke zlepšení prognózy díky moţnostem včasného nasazení léčby. Ta bývá v případě geneticky podmíněných anémií substituční, nejčastěji se provádí podávání transfuzních přípravků. 9

10 3. ABSTRACT This bachelor thesis discusses the general informations and summary of etiopathogenetical classification of anaemia and possibilities of laboratory diagnostics. Thesis is mainly focused on laboratory diagnosis of inherited types of anaemia. Anaemia or anaemia syndrome is a pathological condition characterized by low levels of haemoglobin and hematocrit under the physiological limit. Clinical manifestations are variously severe depending on development of disease and type of anaemia. Anaemia patient suffer from reduced oxygenation of tissues which determinates many symptoms of tissue hypoxia. Other symptoms are associated with hypovolemia and hyperkinetic circulation that can occur. In haemolytic anaemia, patients have symptoms of intravascular or extravascular haemolysis. Primary (hereditary) anaemia are congenital, the cause lies in genetic mutations that result a changes of phenotype properties of erythrocytes. The process of diagnosis determinating includes correct identification of family history, relevant medical examinations and laboratory testing methods, which are essential part of modern medicine. Important are methods such as routine morphological examinations (blood counts, blood cell morphology) or specific laboratory tests (cytogenetic and molecular genetic methods), biochemical parameters examination and microscopic examination of bone marrow. All the examinations have great importance in the diagnosis. Providing of genetic counselling have importance role. It includes education and counselling on issues of inherited disease and psychosocial support. It is available at the department of clinical and medical genetics in health care facilities. Correct and early diagnosis contributes to a better prognosis due to early initiation of treatment options. In the case of genetically inherited anaemia, there is available replacement therapy, the most common is the administration of transfusion blood products. 10

11 4. ÚVOD (ZADÁNÍ PRÁCE- CÍL PRÁCE) Při tvorbě bakalářské práce jsem se zaměřila na charakterizování anémií z hlediska laboratorních parametrů. Soustředila jsem se především na dědičné typy anémií, čili primární anémie, které nejsou následkem jiného onemocnění. Cílem mé práce je zhodnotit současná laboratorní vyšetření a porovnat význam klasických (konvenčních) i moderních vyšetřovacích laboratorních metod aplikovaných v diagnostice u dědičných typů anémií. Práce má charakter rešerše. Anemičtí pacienti tvoří přibliţně 30 % lidské populace, z čehoţ pacienti s dědičnými typy anémií tvoří pouze velmi malý zlomek. Některé typy ale mohou být klinicky závaţné a proto je důleţitý vývoj v diagnostice, od kterého se odvíjí i vývoj léčby. Z hlediska diagnostiky jsem se zaměřila na význam jak konvenčních rutinních hematologických metod, tak i na význam novějších moderních metod v oblasti cytogenetiky, také jsem se zaměřila na významnost genetického poradenství vzhledem k moţnostem léčby některých dědičných typů anémií. 5. ANÉMIE Anémie, nebo také chudokrevnost, je patologický stav charakteristický sníţenou hladinou hemoglobinu (Hb) a hematokritu (Hct) periferní krve pod fyziologická rozmezí, která se liší v závislosti na pohlaví a věku. U ţen je dolní fyziologická mez pro Hb 120 g/l a pro Hct 0,35, u muţů je dolní fyziologická mez pro Hb 135 g/l a pro Hct 0,40. Počet erytrocytů v periferní krvi nehraje tak důleţitou roli, neboť u některých typů anémií můţe být v normě (např. mikrocytární anémie) nebo dokonce zvýšený (např. thalassémie). Hodnoty erytrocytární sloţky krve se mohou také jevit jako sníţené např. při hypervolemii (těhotenství, hypersplenismus, městnavá srdeční 11

12 slabost aj.), v tomto případě se jedná o tzv. relativní anémii. Pokud dojde k opačnému stavu, tedy hypovolemii (dehydratace při průjmech, nadměrném pocení, polyurické fázi renální insuficience aj.), jedná se o tzv. skrytou anémii.[1] [2] [3] 5.1 Morfologické dělení anémií Díky tomuto systému dělení anémií na ucelenější skupiny, z nichţ kaţdá tvoří určité stavy s charakteristickými změnami v erytrocytech, je moţné postupovat v určování příčiny a přesné diagnózy díky pouţití dalších cílených laboratorních vyšetření či zobrazovacích metod. Uvedené parametry v závorkách níţe odpovídají dospělé populaci. [3] [4] Podle hodnoty MCV: Mikrocytární (< 82 fl) Normocytární (82-98 fl) Makrocytární (> 98 fl) Podle hodnoty MCH (nebo MCHC): Hypochromní (< 28 pg) Normochromní (28-32 pg) Podle hodnoty RDW: s anizocytózou s homogenní populací Podle hodnoty RET (relativní počet): stav se zachovalou kompenzační schopností dřeně stavy, kdy je porušena schopnost krvetvorby nahradit nedostatek [3] [4] 5.2 Anémický syndrom, klinický obraz Anémie nejsou obecně povaţovány za onemocnění, nýbrţ za syndrom, čili soubor subjektivních příznaků a klinických projevů, které jsou následkem nedostatečného zásobování tkání kyslíkem- hypoxie. Stupeň klinických projevů a rozvoj anémického syndromu (AS) se odvíjí od typu (závaţnosti) anémie, ale také především od rychlosti rozvoje samotné 12

13 anémie. Další důleţité faktory mající vliv na závaţnost AS jsou věk a zdravotní stav nemocného (stav kardiovaskulárního a jiných systémů, současný výskyt a stupeň závaţnosti jiných onemocnění aj.). Některé klinické projevy anémického syndromu jsou často společné pro většinu typů anémií (projevy tkáňové hypoxie atd.), jiné příznaky mohou být naopak částečně charakteristické pro určité typy anémií (např. angulární stomatitidy, glositidy, třepivost nehtů, předčasné šedivění vlasů u sideropenické anémie). [2] Obecně se klinické projevy mohou zařadit do třech základních skupin: Odvozené od poklesu transportu kyslíku Mezi subjektivní příznaky (příznaky pociťované pacientem) patřící do první skupiny patří únava, slabost, malátnost, pokles fyzické kondice, zhoršení paměti, zpomalení psychomotorického tempa, zhoršení zraku, dyspeptický syndrom, stenokardie (svíravá bolest na hrudi) a cephalea (bolest hlavy). Objektivní nálezy spadající do této skupiny mohou být tachypnoe, ischemie/infarkt myokardu, srdeční slabost, klaudikace (kulhání v důsledku bolesti při nedostatečném prokrvení svalů) dolních končetin, řídnutí kštice či pokles hmotnosti. [2] Odvozené od poklesu krevního objemu (hypovolemie) S hypovolemií jsou spojené tyto subjektivní příznaky: ortostatická hypotenze, kolaps/synkopa, závratě, tinnitus ( hučení v uších), akroparestézie (mravenčení v akrálních částech těla), pocit chladných aker, přecitlivělost na chlad a sníţení libida. Objektivní projevy odvozené od hypovolemie jsou pak: hypotenze, bledost kůţe (také nehtových lůţek, dlaňových rýh), bledost sliznic a spojivek, tranzitorní ischemie CNS, amaurosis fugax (částečná či úplná přechodná ztráta zraku trvající obvykle několik minut), akrohypotermie. 13

14 Odvozené od hyperkinetické cirkulace (zvýšený srdeční výdej, pokles periferní rezistence, snížení viskozity krve) K subjektivním příznakům vzniklým díky hyperkinetické cirkulaci, patří palpitace, nespavost, tepání ve spáncích, tinnitus, srdeční dilatace, edémy končetin. K objektivním nálezům patří systolická hypertenze, vysoká tlaková amplituda, průtokové anemické šelesty či sinusová tachykardie (event. extrasystolie). [2] 5.3 Kompenzační mechanismy lidského organismu Dle rychlosti rozvoje anémie se odvíjí moţnost a stupeň uplatnění kompenzačních mechanismů v organismu, které jsou vzájemně provázané, patří mezi ně [3]: Posun disociační křivky Hb doprava (zvýšená hladina 2,3- difosfoglycerátu v erytrocytech) jedná se o okamţitou a citlivou odpověď na hypoxii v tkáních Sníţené prokrvování tkání méně citlivých na nedostatek kyslíku (kůţe, ledviny)- přesun krve do orgánů náchylnějších k nedostatku kyslíku Zvýšení minutového srdečního výdeje- umoţněn také niţší viskozitou krve při anémii, díky tomuto mechanismu se organismus snaţí zvýšit obsah kyslíku v arteriální krvi Stimulace erytropoézy- zvýšená produkce erytropoetinu (EPO) ledvinami díky jejich sníţenému prokrvení [3] 6. ETIOPATEGENETICKÉ ROZDĚLENÍ ANÉMIÍ Pod pojem etiopatogenetické dělení řadíme klasifikační systém rozřazující anémie s ohledem na příčinu a způsob jejich vzniku. I tento způsob klasifikace je velmi uţitečný a důleţitý, neboť zjištění přesné příčiny je obligátní pro zahájení správné a cílené léčby a tím pádem i pro zlepšení prognózy, pokud je to moţné. [3] V tomto systému klasifikace rozlišujeme čtyři obecné základní skupiny 14

15 anémií dle příčiny a způsobu vzniku [2]: Anémie z poruchy tvorby erytrocytů (poruchy krvetvorby) Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů (hemolytické) Anémie z krevních ztrát (posthemorhagické) Anémie z kombinovaných příčin (multifaktoriální) [2] 6.1 Anémie z poruchy tvorby erytrocytů Porucha syntézy hemu Sideropenická anémie Tento typ anémie je vyvolán nedostatkem ţeleza v organismu kvůli nadměrným ztrátám, nedostatečnému příjmu potravou či zvýšenými nároky organismu. Jedná se o nejčastější typ anémie vůbec. Tento typ anémie patří mezi z počátku normocytární a s rozvojem později mezi mikrocytární hypochromní. Nedostatek ţeleza se pak ještě řadí do třech stupňů [3]: - prelatentní sideropenie- postupné sniţování zásob Fe bez vlivu na dodávku do erytroblastů kostní dřeně - latentní sideropenie- dochází k vyčerpání zásob Fe v organismu a dodávka do erytropoézy se sniţuje, ještě ale není přítomna anémie - sideropenická anémie- poslední fáze, kdy chybí zásoby Fe úplně a rozvíjí se anémie [3] Sideroblastická anémie Jedná se o skupinu vzácnějších onemocnění, pro která je charakteristický výskyt prstenčitých sideroblastů, coţ jsou zralejší jaderné prekurzory červené řady v kostní dřeni, v jejichţ mitochondriích se kumuluje ţelezo ve formě amorfních depozit. Základní princip příčiny spočívá v poruše inkorporace ţeleza do molekuly hemu. Existují dědičné a získané formy. U dědičné sideroblastické anémie se vyskytují vrozené defekty enzymů důleţitých pro syntézu hemu- sníţená aktivita δ-aminolevulinátsyntetázy (koenzym pyridoxalfosfát), sníţená koncentrace koproporfyrinu či protoporfyrinu nebo můţe dojít k mutaci mitochondriálních genů pro 15

16 cytochromoxidázu. Získané formy těchto anémií bývají způsobené nedostatkem pyridoxinu v potravě, alkoholismem, léky (reverzibilní typ), otravou olovem či nedostatkem mědi a nadbytkem zinku. [3] Porucha syntézy globinu Thalasémie Pokud dochází k poruše syntézy jednoho či více polypeptidových řetězců molekuly globinu, jedná se o tzv. thalasémie. Podle převaţujícího typu řetězce, u kterého je porušena syntéza, rozlišujeme thalasemie na α- thalasémii a β-thalasémii (existují i typy γ- a δ-). Porucha spočívá ve sníţené rychlosti tvorby globinových řetězců nebo aţ jejich zástavě. Dále rozlišujeme thalasémie na minor (heterozygotní) a major (homozygotní či dvojitě heterozygotní). [3] Strukturální varianty hemoglobinu Do této skupiny poruch syntézy globinových řetězců patří choroba hemoglobinu H, při které jsou postiţeny tři geny pro α-řetězec, kdy pak vzniká hemoglobin H, který intracelulárně precipituje. Další onemocnění patřící do této skupiny je choroba hemoglobinu Barts. Při této chorobě chybí všechny geny pro hemoglobin α. Vzniká hemoglobin Barts, který má vysokou afinitu ke kyslíku, ale nedokáţe ho předávat do tkání. Jedná se o stav neslučitelný s ţivotem a k úmrtí nejčastěji dochází jiţ během nitroděloţního ţivota. [3] Porucha syntézy DNA- megaloblastové anémie Jedná se o skupinu anémií, u kterých je typická megaloblastová přestavba v kostní dřeni. Příčinou můţe být porucha metabolismu vitaminu B 12 či kyseliny listové, působení léků (cytostatika, antimetabolity), porucha v genetické výbavě buňky (MDS). Buňky díky poruše tvorby DNA mají prodlouţený metabolismus a setrvávají v S-fázi mitózy. Následně vznikají krátké Okazakiho fragmenty DNA a dochází k poruše zrání jádra. Cytoplazma vyzrává běţnou rychlostí, neboť 16

17 Tvorba RNA a bílkovin není porušena. Vzniká tedy plazmojaderná asynchronie. Postiţení bývá i u granulocytární a trombocytární řady. Mezi megaloblastové anémie řadíme také perniciózní anémie, při které bývá nedostatek vnitřního faktoru pro resorpci vit B 12 díky protilátkám proti parietálním buňkám nebo proti samotnému vnitřnímu faktoru. [3] Porucha proliferace a diferenciace Aplastické anémie Aplastické anémie tvoří různorodou skupinu anémií, jejichţ společným rysem je pancytopenie v periferní krvi (anémie, leukopenie, trombocytopenie). Příčinou je porucha normální erytropoézy, kdy je poškozena kmenová buňka ve smyslu schopnosti regenerace a udrţování konstantního poolu kmenových buněk. Dle způsobu vzniku dělíme aplastické anémie na vrozené (Fanconiho, Diamond-Blackfanova aj.), získané, idiopatické a sekundární. Dle stupně závaţnosti je dělíme na chronické cytopenie, těţkou aplastickou anémii a velmi těţkou aplastickou anémii. [3] Izolované aplazie erytropoézy Jedná se o získané typy aplastických anémií, které mohou mít různý průběh: Akutní erytroblastopenie (Gasserova)- krátkodobá aplazie s absencí normoblastů v kostní dřeni u dětí po virové infekci Akutní čistá aplazie červené řady- zástava erytropoézy u chronických hemolytických anémií či virových infekcí, jedná se o těţkou anémii Přechodná anémie s aplazií červené řady- u kojenců a malých dětí, trvá několik týdnů aţ měsíců, prognóza je dobrá Chronická čistá aplazie červené řady- chronická forma získané hypoplazie erytropoézy z různých příčin [3] 17

18 Získaná aplastická anémie- sekundární dřeňový útlum Toto onemocnění je definováno jako selhání proliferace a/nebo diferenciace hematopoetických buněk. Následkem je pak hypocelularita kostní dřeně a cytopenie v periferní krvi (postiţení jedné, více či všech vývojových řad krevních buněk). Postiţen můţe být jakýkoliv stupeň krvetvorby, včetně pluripotentní kmenové buňky. Mezi příčiny patří působení myelotoxických vlivů (cytostatika, ionizační záření) nebo můţe být příčina nejasná, často bývá dané onemocnění podmíněné také imunitně. Klinický obraz se odvíjí od pancytopenie, kdy se kromě anémického syndromu objevují také sklony ke krvácení (trombocytopenie) a infekční komplikace (granulocytopenie). [3] Kongenitální dyserytropoetické anémie (KDA) KDA tvoří skupinu několika vzácných chorob (výskyt bývá sporadický) charakteristických refrakterní anémií, inefektivní erytropoézou, změnami v morfologii a sloţení membrány, změnami antigenní výbavy erytrocytů a také v metabolismu erytrocytů. Často jsou doprovázené lehkou aţ středně těţkou periferní hemolýzou. [3] Rozlišujeme tři typy KDA: KDA typ I- vrozená, autozomálně recesivní vada na genu CDAN1, coţ způsobí poruchu syntézy nukleoproteinů s následnými abnormálními mitózami a změnami v apoptóze, jsou doprovázeny ţloutenkou a splenomegalií KDA typ II- HEMPAS- vrozená, autozomálně recesivní vada genu CDAN2, coţ způsobuje defekt v enzymatické glykosylaci membránových proteinů KDA typ III- autozomálně dominantní onemocnění s postiţením genu CDAN3, vyskytují se ataky slabosti a intravaskulární hemolýzy nebo jsou bezpříznakové [3] Myelodysplastický syndrom (MDS) Klonální onemocnění postihující hematopoetickou buňku, které je 18

19 charakteristické dysplazií v jedné i více hematopoetických řadách. Nejvíce postiţeni jsou pacienti kolem 60 let věku. MDS je povaţován za preleukemické podmínky a je zde velká pravděpodobnost transformace do akutní myeloidní leukemie. [52] [53] 6.2 Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů (hemolytické anémie, neboli HA) Korpuskulární HA Defekt membrány erytrocytů Jedná se o skupinu dědičných chorob, u kterých dochází k poruše buněčné membrány na základě deficitu membránových proteinů případně narušení jejich vazeb mezi sebou, a tím dochází také k poruše normální funkce erytrocytů. Hereditární sférocytóza Jedná se o vrozené onemocnění s defektem membrány erytrocytů, charakteristické různými stupni extravaskulární hemolýzy a přítomností sférocytů v periferní krvi. Většinou se jedná o autozomálně dominantní dědičnost s různou expresivitou, v některých případech se ale můţe vyskytovat i recesivní dědičnost. Při tomto onemocnění dochází k poruše periferních bílkovin membrány erytrocytu, které jsou důleţité pro formování cytoskeletu. [3] Existuje několik typů: - Částečný deficit spektrinu (mutace SPTA1 a ANK1 genu) - Těţký deficit spektrinu (mutace SPTA1 genu kombinovaná se Spa alelou s nízkou expresí) - Kombinovaný deficit spektrinu a ankyrinu - Částečný deficit pásu 3 Následkem daných mutací je pak nestabilita lipidové dvouvrstvy membrány, sniţování mnoţství cholesterolu a fosfolipidů a větší 19

20 propustnost pro sodík. Vzniká sférocyt, jehoţ Na-K pumpy v membráně musí vypumpovat velké mnoţství sodíku proti gradientu, coţ je energeticky neúnosné, buňka se stává rigidnější a méně deformovatelná, ztrácí další membránový povrch, aţ dojde k jejímu zadrţení a fagocytóze ve slezině. Klinickými příznaky jsou anémický syndrom, ţloutenka, splenomegalie. [3] Hereditární eliptocytóza (HE) a přidruţená onemocnění Hereditárních eliptocytóza je různorodá skupina onemocnění, pro která je společným znakem dominantní dědičnost membránových poruch erytrocytů a přítomností eliptocytů v periferní krvi. Jde o molekulární poruchy α i β řetězce spektrinu. Přesný mechanismus příčiny vzniku eliptocytu není objasněn. Normální erytrocyty mají také eliptický tvar např. při průchodu mikrocirkulací, který je ale dočasný. U tohoto onemocnění dochází k oslabení vazby heterodimerů spektrinu, reorganizaci cytoskeletu a při opakovaném průchodu mikrocirkulací pak zřejmě dochází k trvalé elongaci erytrocytu. Následně jsou více poškozené eliptocyty vychytány slezinou. [3] Existuje několik podtypů s odlišným klinickým průběhem a různými stupněmi anémie, hemolýzy a splenomegalie: - Běţná HE - Homozygotní (dvojitě heterozygotní) HE - Hereditární pyropoikilocytóza - Sférocytární eliptocytóza - Jihovýchodní asijská ovalocytóza [3] Hereditární stomatocytóza Jedná se opět o heterogenní skupinu HA, které jsou autozomálně dominantně dědičné a jejich společným znakem je přítomnost stomatocytů v nátěru periferní krve. Příčiny nejsou jednoznačné. Jedna z moţností je nedostatek bílkoviny 20

21 stomatinu díky změnám v genu pro xerocytózu v oblasti 16q23-q24. Následkem je pak zvýšená propustnost membrány a erytrocyt následně můţe zvětšit (hyperhydratace) či zmenšit (xerocytóza) svůj objem. Také dojde ke změně koncentrace intracelulárního sodíku a draslíku. Stupeň hemolýzy a závaţnost anémie bývají různé. [1] Hereditární akantocytóza Hereditární akantocytóza je vzácný typ anémie, která je charakteristická výskytem akantocytů v periferní krvi. Příčina spočívá v absenci β lipoproteinů v plazmě (abetaproteinemii). Konkrétně se jedná o poruchu syntézy apolipoproteinu B a následné absenci několika frakcí lipoproteinů. Mechanismus vlivu poruchy obsahu lipidů v plazmě na změnu tvaru erytrocytů zatím není objasněn. Akantocyty vznikají aţ po přechodu erytrocytů do periferní cirkulace (včetně erytrocytů transfundovaných dárcovských). Mezi nejvýznamnější příznaky patří porucha růstu, mentální retardace, steatorea, kolem 5-10 let se objevuje renitis pigmentosa a progresivní ataxie. Pacienti s tímto onemocněním umírají mezi rokem ţivota, objevuje se u nich srdeční arytmie a selhání srdce. [1] Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH) PNH je jedinou získanou korpuskulární hemolytickou anémií. Patří mezi nemaligní klonální onemocnění zapříčiněné somatickou mutací pluripotentní kmenové buňky. PNH je charakteristická intravaskulární hemolýzou a hemoglobinurií, dále náchylností k trombózám a relativní nedostatečností kostní dřeně. Příčina spočívá v postiţení genu PIG-A na krátkém raménku chromosomu X. Produkt tohoto genu je nezbytný pro vznik N-acetylglukasamin-fosfatidylinositolu, coţ je první meziprodukt GPI kotvy. Pokud je tento mechanismus narušen zmíněnou mutací, vznikají defekty bílkovin v buněčné membráně, které by za normálních okolností tlumily aktivaci komplementu. Následně jsou erytrocyty lyzovány komplementem. [1] Rozlišujeme několik typů fenotypického postiţení erytrocytů u PNH: - PNH I- normální citlivost k C (komplement) 21

22 - PNH II- 3-4 krát vyšší citlivost k C - PNH III krát vyšší citlivost k C Ve výsledku je pak buněčná membrána nadměrně citlivá na aktivovaný komplement, který způsobí i v nepatrné koncentraci lýzu erytrocytů a v plazmě se pak nachází volný Hb způsobující konzumpci NO. Membránový defekt postihuje také trombocyty a granulocyty. Klinické projevy závisí na zastoupení PNH III krvinek, pokud mají pacienti méně neţ 20% PNH III krvinek, mohou být asymptomatičtí. Při vyšším zastoupení (od 50%) se zvyšuje riziko těţkých trombotických komplikací, mnohdy dochází k trombózám v atypických lokalizacích. Dále pacienty provází opakované a nepravidelné epizody hemolýzy (při infekci, menstruaci, po transfúzi, aj, nebo často z neodhalených příčin). Jmenované komplikace mívají velmi často fatální následky (aţ u 50% nemocných s PNH). [1] Defekt enzymové výbavy erytrocytů (enzymopatie) Hereditární enzymopatie erytrocytů jsou dědičná onemocnění postihující geny, které kódují klíčové enzymy erytrocytů. Jedná se o specifický typ anémií označovaných jako dědičné nesférocytové hemolytické anémie (HNSHA). Dle základní klasifikace anémií patří tyto mezi normocytární normochromní anémie. Na rozdíl od ostatních typů HA se v tomto případě vyskytují nespecifické morfologické abnormality. Příčina obecně tkví v poruše enzymů buněčného metabolismu- především anaerobní a aerobní glykolýzy, glutationového metabolismu a nukleotidového metabolismu. Nejčastější jsou poruchy enzymů G-6-PD a PK, existuje ale i řada poruch dalších enzymů. [6] Deficit glukózo-6-fosfátdehydrogenázy (G-6-PD) Princip příčiny spočívá ve vrozené genetické odchylce vázané na chromosom X. Díky sníţené aktivitě G-6-PD je narušen iniciální stupeň hexozo-monofosfátového zkratu (aerobní glykolýzy), který je nezbytný pro ochranu erytrocytu před oxidačním stresem. Vzniká nedostatek redukovaného NADPH a glutathionu, hemoglobin je pak nedostatečně 22

23 chráněn před oxidací. Oxidovaný hemoglobin můţe pak precipitovat ve formě Heinzových tělísek. Dále dochází k oxidaci membránových lipidů a následně k lýze erytrocytů. [1] Při oxidační zátěţi různého původu pak dochází k akutním hemolytickým epizodám, nebo vzácně k chronické hemolýze. Existuje více variant G-6-PD, která jsou řazeny do tříd I-V dle zvyšující se aktivity enzymu. Enzymové varianty vznikají na základě různých mutací (často bodových). Deficit G-6-PD patří k nejrozšířenějším vrozeným HA i genetickým defektům. Nejvyšší výskyt variantní mutace genu pro G-6-PD je popsán u černošské populace, ve Středomoří a v Asii. V celé lidské populaci se vyskytuje zřejmě 300 milionů nosičů variantní mutace. Vyskytují se čtyři základní typy klinické manifestace: - Akutní hemolytická anémie- hemolytické epizody 2-4 dny od vyvolávající příčiny - Kongenitální nesférocytová hemolytická anémie- anémie a ţloutenka od narození, mimo dětský věk málo vyjádřené známky hemolýzy - Neonatální hyperbilirubinémie- příčina není plně objasněna - Favismus- výskyt ve Středomoří, akutní intravaskulární hemolýza po expozici bobům Vicia fava v potravě, mateřském mléce aj., doprovázeno bolestmi hlavy a hrudi, hemoglobinurií, pokles hemoglobinu výrazný aţ fatální [1] Deficit pyruvátkinázy (PK) Jde o autozomálně recesivní onemocnění, díky kterému dochází k vrozenému nedostatku enzymu PK, coţ je důleţitý enzym glykolytického cyklu erytrocytů, díky kterému vzniká ATP jako důleţitý zdroj makroergní fosfátové vazby. Daný proces je nezbytný pro energeticky náročné pochody v buňce, např. pro aktivní přenos látek membránovou na ATP závislou pumpou a tím i deformovatelnost erytrocytu. Při deficitu daného enzymu mají erytrocyty zvýšenou rigiditu a jsou vychytány slezinou. Dále dochází k zásahu do apoptózy a vyzrávání erytroidních progenitorů. Anémie ale bývá dobře tolerována, neboť není postiţen vznik 2,3-DPG, 23

24 který zabezpečí díky sníţení afinity ke kyslíku uvolnění dostatečného mnoţství kyslíku pro tkáňové dýchání. Dané onemocnění se vyskytuje spíše v severní a střední Evropě a je druhou nejčastější příčinou hemolýzy z nedostatku enzymu. Závaţnost je široce heterogenní- od těţkých forem s trvalou substituční terapií aţ po klinicky němé formy. Můţe dojít také ke komplikaci aplastickými krizemi po infekcích parvoviry či při nedostatku folátů. [1] Nestabilní strukturální varianty Hb (hemoglobinopatie) Tato skupina vrozených, geneticky podmíněných anémií je charakteristická změnami v primární struktuře hemoglobinových řetězců. Postiţen můţe být kterýkoliv řetězec (α, β, δ, γ, ε). Obecně jsou tato onemocnění způsobena bodovou mutací či inzercí, delecí a jejich kombinacemi. Některé hemoglobinopatie jsou spojené s hemolýzou, popřípadě s polyglobulií a cyanózou. [1] Hemoglobinopatie S (srpkovitá anémie) Jde o skupinu hemoglobinopatií vyskytujících se především v oblastech s výskytem malárie. [1] Základním znakem onemocnění je dědičná změna v genu pro β-řetězec hemoglobinu. Pozměněný gen se značí β S. Vzniklý abnormální hemoglobin se nazývá HbS. Pokud je postiţený homozygot (zdědil β S od obou rodičů), je postiţen váţným onemocněním- srpkovitou anémií. [5] β S gen má velkou incidenci v tropických a subtropických oblastech, coţ je dáno výskytem malárie. HbS slouţí jako jakási ochrana před malárií způsobenou krevním parazitem Plasmodium falciparum. Rozdíl mezi HbS a normálním HbA spočívá v záměně kyseliny glutamové za valin na pozici 6. AK z N-konce β-globinového řetězce. Klinické následky vyplývají ze sklonu erytrocytů obsahujících HbS měnit tvar na drepanocyty (srpky). V odkysličeném stavu HbS podstupuje konformační změnu vedoucí ke vzniku tetrametrů Hb, které pak agregují za vzniku velkých polymerů. Erytrocyty díky tomuto jevu ztrácí svou deformabilitu, vznikají drepanocyty, které mají navíc poškozenou 24

25 membránu (zvýšení tuhosti). Drepanocyty jsou pak sekvestrovány RES, coţ vede k HA. Drepanocyty také mohou uvíznout v mikrocirkulaci a způsobit obstrukci a městnání krve. Klinický obraz: chronická HA, vaskulo-okluzivní krize, sekvestrační krize a náchylnost k infekcím. [5] Hemoglobinopatie C Touto autozomálně recesivní chorobou jsou postiţeni homozygoti s HbC, heterozygotní nosiči jsou bezpříznakoví. Příčina je analogická jako u hemoglobinopatie S, jen je zde kyselina glutamová zaměněna za lyzin. Vzniklý HbC má odlišnou rozpustnost, v odkysličené formě tvoří krystaly. Erytrocyty následně ztrácí deformovatelnost a jejich přeţívání je kratší. [1] Další typy hemoglobinopatií: - Choroby z hemoglobinu D - Hemoglobinopatie E - Choroby z nestabilních hemoglobinů - Hemoglobinopatie M - Hemoglobinopatie s odchylkou v afinitě ke kyslíku Extrakorpuskulární HA Extrakorpuskulární HA zahrnují širokou škálu získaných hemolytických stavů, u kterých je příčina v okolních podmínkách a vlivech Imunitní extrakorpuskulární HA Způsobené aloprotilátkami: - potransfuzní hemolytické reakce - HON (hemolytické onemocnění novorozence) Způsobené autoprotilátkami (AIHA) - Autoimunitní HA- selhání kontrolních mechanismů imunity - 2 typy autoprotilátek: -tepelné (IgG)- vazba při tělesné teplotě 25

26 -chladové (IgM)- optimální vazba při nízkých teplotách (22-31 C) V obou případech mohou být protilátky třídy IgG (senzibilizace erytrocytů), kdy následně dojde k sekvestraci slezinou. Nebo se můţe jednat o protilátky typu IgM, které jsou schopny způsobit přímo intravaskulární hemolýzu s aktivací komplementu. [1][2] Neimunitní extrakorpuskulární HA Opět se jedná o širokou škálu hemolytických syndromů, které mají velmi heterogenní příčiny. [1] Chemické, metabolické a biologické příčiny - Nedostatek fosfátů- nedostatek ATP, sníţená deformormabilita erytrocytů, při parenterální výţivě či léčbě antacidy, erytrocyty vychytávány MMS - Měď- blokace enzymů glykolýzy (Wilsonova choroba) - Olovo- porucha syntézy Hb, prudká hemolýza - Kyslík- ojediněle (hyperbarická komora) - Jedy- bodnutí hmyzem (vosa, včela, pavouk), štírem - Alkohol- jistý stupeň hemolýzy Fyzikální příčiny - Popáleniny- fyzikální a osmotická hemolýza - Mechaničtí činitelé- umělé chlopně, extrakorporální oběh (operační zákroky na srdci) - Pochodová hemoglobinurie- dlouhé tratě (běh, pochod) Infekční příčiny - Clostridium perfringens- exotoxin (rychlá a rapidní destrukce erytrocytů) - Malárie- extravaskulární hemolýza, splenomegalie - Trypanosomiáza- toxické i imunitní vlivy infekce - Leptospiróza- charakter MAHA - Bartonelóza 26

27 - Babezióza - Borelióza- lehká splenomegalie MAHA (mikroangiopatické hemolytické anémie) U tohoto typu anémií dochází k intravaskulární hemolýze fragmentací erytrocytů. - HUS- hemolyticko-uremický syndrom - TTP- trombotická trombocytopenická purpura - HELLP syndrom- komplikace těhotenství - Katastrofický antifosfolipidový syndrom [1] 6.3 Anémie z krevních ztrát (akutní posthemorhagické) Tato samostatná skupina anémií vzniká kvůli nadměrné ztrátě erytrocytů během krátké doby. Nermocný je tedy ohroţen prudkým sníţením objemu krve v cirkulaci a tím i hypovolemickým šokem aţ úmrtím (dle závaţnosti krevních ztrát). Příčiny jsou zde rozmanité: úrazy, jícnové varixy, perforace ţaludečního či duodenálního vředu, rozsáhlá pooperační krvácení, ruptura aneurysmatu atd. Po náhlé ztrátě krve nastávají dvě fáze, kdy v první dominuje problematika hypovolemie bez známek vyplývajících z anémie a ve fázi druhé se projevují známky anémie, dojde k doplnění objemu a probíhá aktivní regenerace erytrocytů. Při masivní krevní ztrátě dochází také k rozvoji koagulopatie, která můţe také potencovat krvácivý stav. [3] 27

28 6.4 Anémie ze smíšených příčin (multifaktoriální) Tato široká skupina anémií vzniká jako jeden ze sekundárních následků jiného onemocnění, které se přímo netýká erytrocytů. [2] Tabulka č. 1: Přehled příčin multifaktoriálních anémií Chronické infekce -plicní (pneumonie, pleuritida, TBC aj.) -infekční endokarditida (bakteriální, mykotická) -renální a urologické záněty- nedostatečnost ledvin- porucha tvorby EPO -systémové mykózy -záněty v dutině břišní a pánevní -meningitida -esteomyelitida, pyogenní artritida -AIDS, TBC, lepra, tularemie, břišní tyfus, brucelóza, lymská borelióza aj. Chronické neinfekční zánětlivé stavy -nespecifické střevní záněty -hluboká tromboflebitida aj. Autoimunitní choroby -revmatická horečka -revmatoidní artritida -systémová onemocnění pojiva (SLE, nodózní polyarteritida, revmatická polymyalgie aj.) Maligní onemocnění -solidní tumory (karcinomy, sarkomy atd.) -hemoblastózy (maligní lymfomy aj.) Traumatické a pooperační stavy -poškození vysokou teplotou -potransplantační stavy Ostatní příčiny -chronická městnavá srdeční slabost -idiopatické stavy [2] 28

29 7 LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ V DIAGNOSTICE ANÉMIÍ 7.1 Druhy vyšetřovaného biologického materiálu a jeho odběr Vyšetřovaný biologický materiál v diagnostice anémií: - Venózní periferní krev - Aspirát kostní dřeně [15] Odběr biologického materiálu Odběr biologického materiálu je stěţejní část preanalytické fáze laboratorního vyšetření. Pro zamezení chyb je důleţité dodrţet obecné zásady odběru: - Přesná a jednoznačná identifikace vzorku (předcházení záměně vzorků)- označení štítkem s čárovým kódem, jménem a rodným číslem pacienta atd. - Přiložení správně vyplněné žádanky s požadovanými vyšetřeními - Dodržení správného způsobu odběru, který je adekvátní pro daný typ materiálu (např. vhodná stabilizační a protisráţlivá činidla) - Správné poučení a příprava pacienta před odběrem - Šetrný a včasný transport odebraného vzorku do laboratoře [15] Odběr plné krve pro morfologická vyšetření Odebírá se venózní krev do zkumavky s antikoagulačním činidlem K 3 EDTA (má malý vliv na většinu laboratorních stanovení obecně). Pacient by měl před odběrem přijmout dostatek tekutin. Venózní krev se získá venepunkcí většinou z kubitální ţíly ve fossa antebrachii nebo z ţíly v loketním ohbí. Popis průběhu odběru: - Desinfekce místa vpichu a jeho úplné zaschnutí - Odběr pomocí vakuového systému, který je uzavřený, chrání pacienta (jednorázové pomůcky) i zdravotní personál (není zde kontakt s krví) - Ošetření místa vpichu 29

30 Poznámky k odběru: - Odběr by neměl být prováděn z paţe se zavedenými katetry a přívody infuzí (zkreslení hematokritu, další interference). - Je důleţité odebrat předepsané mnoţství krve pro dodrţení poměru krve a protisráţlivého činidla. - Stabilita vzorku na morfologické vyšetření je 5 hodin (nutné do té doby transportovat do laboratoře). [15] Odběr plné krve pro molekulární diagnostiku - Odběr se provádí stejným způsobem jako na morfologické vyšetření, ale odebírá se menší mnoţství krve (2-10 ml) - Antikoagulancia: citrát sodný, sodná či draselná sůl EDTA - Pouţívají se komerčně dostupné odběrové sady pro odběr krve na izolaci NK (princip chemické stabilizace) [19] Odběr aspirátu kostní dřeně Odběr aspirátu kostní dřeně provádí lékař ze spina iliaca posteriori superior nebo ze sterna pomocí cytologické jehly. Odběr se provádí do nádobky s protisráţlivým činidlem (EDTA) nebo se provede nativní aspirát. Je nutné provést punkci lege artis a okamţitě po odběru zhotovit na místě dobře hodnotitelné nátěry na podloţní sklíčka. [17] [18] Zhotovení nátěru: - rozprostření kapky KD na hraně roztíracího skla - poté pouţití nového podloţního skla nebo provedení rozprostření na roztírací sklo v nakloněné Petriho misce Barvení nátěru KD: - panoptické barvení (May-Grünwald, Giemsa-Romanowsky) Indikace: - pokud nestačí klinické vyšetření a vyšetření PK - zhodnocení stavu krvetvorby [17] [18] 30

31 7.2 Konvenční hematologická vyšetření Krevní obraz Vyšetření krevního obrazu na automatických analyzátorech V současné době se ke stanovení parametrů krevního obrazu (KO) pouţívá široká škála hematologických analyzátorů, které jsou na trhu. Obecnou výhodou automatických analyzátorů je moţnost zpracování velkého počtu vzorků během poměrné krátké doby a zajištění stejných podmínek stanovení pro všechny vzorky. Analyzátory jsou schopné rozlišit jednotlivé buněčné řady a v případě patologických neobvyklých nálezů vydají hlášku (flag), kdy je následně třeba provést mikroskopické vyšetření. Nejširší uplatnění mají analyzátory fungující na principu měření impedančním a optickém. Impedanční princip: Naředěná suspenze krevních buněk putuje nosným proudem do měřící kyvety. Na obou stranách kyvety je polarizované stejnosměrné elektrické pole, při průchodu buňky měřící aperturou dojde ke změně odporu prostředí a vybuzení napětí. Při průchodu buněk tak vznikají napěťové impulzy úměrné objemu buněk a na základě integrace počtu impulzů přístroj vyhodnotí i počet daných buněk. Nevýhodou tohoto systému je moţnost mnoha interferencí, neboť jsou měřeny prakticky všechny částice. Optický princip: Daná analýza je zaloţena na principu průtokové cytometrie, kdy dochází k interakci buněk s laserovým paprskem. Je zde detekováno rozptýlené světlo či fluorescence. Buňky zde procházejí průtokovou kyvetou pomocí hydrodynamické fokusace a při jejich průchodu jsou vyhodnoceny různé analýzy [1][16][17]: - Analýza prošlého světla- počet buněk - Analýza rozptýleného světla- buněčný povrch, tvar, reflektivita - Analýza po fytochemickém obarvení buněk - Analýza fluorescence- detekce a specifikace buněk na základě povrchových CD znaků [1] [16] [17] 31

32 Parametry krevního obrazu: Tabulka č. 2: Parametry KO z analyzátoru Parametr Zkratka Princip stanovení Počet ery RBC Dle principu analyzátoru Hemoglobin HGB spektrofotometrie Hematokrit HCT Výpočet (RBCxMCV)/10 Střední objem ery MCV Dle principu analyzátoru Průměrné mnoţství Hb v ery MCH Výpočet (HGB/RBC)x10 Průměrná koncentrace Hb v MCHC Výpočet (HGB/HCT)x100 ery Distribuční šíře ery RDW Odvození z objemu RBC Normoblasty NRBC Dle principu analyzátoru Počet leukocytů WBC Dle principu analyzátoru Neutrofily NEU Lymfocyty LYM % dané populace x Monocyty MONO WBC/100 Eosinofily EOS Basofily BASO Počet trombocytů PLT Dle principu analyzátoru Trombocytární hematokrit Střední objem trombocytů Distribušní šíře trombocytů Frakce nezralých trombo PCT MPV PDW IPF Výpočtem (PLTxMPV)/10000 Dle principu analyzátoru Odvození z objemu trombo Nezralé PLT/všechny PLT [1] 32

33 Fyziologická rozmezí dle ČHS JEP Tabulka č. 3: Referenční rozmezí parametrů KO dle ČHS JEP-nad 15 let Parametr Ref. rozmezí jednotka WBC /l RBC Ţeny: 3,8-5,2 Muţi: 4,0-5, /l HGB Ţeny: Muţi: g/l HCT Ţeny: 0,35-0,47 Muţi:0,40 0,50 l/l MCV 82,0 98,0 fl MCH pg MCHC g/l RDW 10,0 15,2 % PLT /l MPV 7,8 11,0 fl PDW % PCT 1,2 3,5 ml/l RET# /l NRBC# /l DIF leuko NEU LYM MONO 2 12 % EOS 0 5 BAS 0-2 [4] Morfologická vyšetření v mikroskopu Zhotovení a barvení nátěru periferní krve (ČHS ČLS JEP) Nátěr PK se provádí za účelem zhotovení mikroskopického preparátu pro mikroskopické hodnocení morfologie krevních buněk. Provedení nátěru: - Nanesení kapky PK (K 3 EDTA) k okraji podloţního skla - Přiloţení roztíracího skla před kapku pod úhlem Vytvoření nátěru plynulým tahem - Zaschnutí nátěru cca 10min na vzduchu 33

34 Panoptické barvení: - Základní barvení v hematologii - Pouţití kyselých a zásaditých barviv - Obarvení buněčných struktur a fixace (methanol pro archivaci) - Pouţití roztoků May-Grünwald a Giemsa-Romanowsky Barvení se můţe provádět ručně dle předepsaného návodu nebo ve větších provozech laboratoří spíše na barvicích a nátěrových automatech [18] Hodnocení nátěru PK v mikroskopu Morfologické hodnocení erytrocytů Fyziologický erytrocyt (normochromní, normální MCV i tvar- normocyt): Obrázek č. 1: Normocyt Převzato z: (citováno ) Odchylky velikosti Mikrocyty- menší průměr neţ 6,7 µm a MCV pod 80 fl (anémie sideropenické, sideroblastické, některé hemoglobinopatie) Makrocyty- průměr větší neţ 7,7 µm, MCV nad 97 fl (nedostatek vit. B12 a kyseliny listové, MDS ) Anizocytóza- více neţ 10% erytrocytů o nestejné velikosti [16] Obrázek č. 2: Mikrocyty Obrázek č. 3: Makrocyty Obrázky č. 2 a č. 3 převzaty z: (citováno ) 34

35 Obrázek č. 4: Anizocytóza Převzato z: (citováno ) Odchylky barvitelnosti Hypochromie- sníţený obsah Hb v ery Polychromazie- ery s modravým nádechem, mladé formy částečně bazofilní (RNA, DNA) Anizochromie- nestejný obsah Hb v ery (odlišná barvitelnost) [16] Odchylky tvaru (morfologické anomálie) Akantocyty- ery s ostnatými výběţky, hereditární akantocytóza Dakryocyty- ery slzovitého tvaru, myelofibróza, perniciózní anémie, thalassemie, některé HA Drepanocyty- srpkovité ery, srpkovitá anémie, thalassemie Eliptocyty, ovalocyty- oválný tvar, dědičná ovalo či eliptocytóza Keratocyty- rohovité ery s 1-2 výběţky Poikilocytóza- různý aţ bizarní tvar, těţké anémie Sférocyty- kulovité aţ bochníkovité ery, sytě barvitelné, hereditární sférocytóza Schistocyty- fragmenty ery tvaru helmice či skořápky, MAHA Stomatocyty- ery s centrálním projasněním ve tvaru pootevřených úst, vrozená stomatocytóza, cirhóza jater Terčovité ery- tvarově podobné klobouku, tenké ery, HAhemoglobinopatie (thalassemie, hemoglobinopatie C) [16] 35

36 Inkluze v erytrocytech Bazofilní tečkování- jemná tmavomodrá zrnka v ery (agregáty RNA, ribozomů), anémie z otrav kovy, z těţkých infekcí Cabotovy prstence- zbytky jaderné membrány erytroblastů, megaloblastové anémie Howell-Jollyho tělíska- zbytky jaderných chromozomů, červenofialová zářivá tělíska, 1-3 v jednom ery, perniciozní anémie, splenektomie Heinzova tělíska- denaturovaný Hb (precipitace oxidovaného Hb a bílkovin stromatu membrány), deficit G-6-PD, uţití oxidačních látek, nestabilní hemoglobiny Papenheimerova tělíska- granula ţeleza v mitochondriích, téţké anémie, thalassemie, splenektomie [16] Stanovení retikulocytů Technologický pokrok analyzátorů poskytuje v dnešní době i zhodnocení rovnováhy mezi mírou erytropoézy a zásobami Fe či neefektivní erytropoézu. V posledním desetiletí se podstatně změnily poznatky ohledně homeostázy Fe. Centrálním regulátorem vstřebávání Fe je malý peptidický hormon hepcidin, který inhibuje tok Fe do plazmy z makrofágů recyklujících staré erytrocyty. Vliv na expresi hepcidinu mají zásoby Fe, erytropoetická aktivita, Hb, obsah kyslíku v krvi, přítomnost zánětů. Anémie z nedostatku ţeleza nastává při vyčerpání jeho zásob v těle. Spolehlivý biomarker stavu Fe je hladina sérového transferinového receptoru (stfr). Pokud dojde k anémii u chronického onemocnění ledvin, příčina spočívá v nedostatečné syntéze EPO. Příčina anémie můţe být i na straně sníţené proliferační aktivity erythroidních prekurzorů v kostní dřeni, zkrácené přeţívání erytrocytů či sníţená dostupnost Fe. Parametr, pomocí kterého dobře posoudíme účinnost erytropoézy vzhledem k hladině Fe je stanovení retikulocytů. [20-24] Retikulocyty jsou nezralé formy erytrocytů, které jiţ nemají jádro a obsahují zbytky jaderné RNA. Při kompenzatorně zvýšené erytropoéze jsou 36

37 retikulocyty zvýšeně vyplavovány do periferní krve (při substituci Fesideropenické anémie, při nedostatku B12-megaloblastové anémie atd.). Zmíněný děj se nazývá retikulocytární krize. Při hemolytických anémiích je počet retikulocytů zvýšen trvale. U anémií z chronických onemocnění je vyplavování retikulocytů sníţeno (nedostatek EPO, zvýšená hladina cytokinů). [15] Retikulocytární index Přesně vystihuje stupeň nedostatečnosti dřeňové erytropoézy s ohledem na hladinu RTC vzhledem ke stupni anémie, čili odpověď organismu na anémii. [15] naměřená hodnota Hb RI = RTC. normílní hodnota Hb Metody pro stanovení retikulocytů: - Automatické analyzátory- průtoková fluorescenční cytometrie - Mikroskopické stanovení- ruční supravitální barvení (brylantkresolová modř- obarvení RNA struktur) [16] Shrnutí významu: - Posouzení aktivity a regenerace KD (chemoterapie, transplantace) - Diagnostika a terapie anémií - Posouzení léčby chronických onemocnění- léčba erytropoetinem při chronickém selhání ledvin [16] Morfologické hodnocení nátěru kostní dřeně Součástí hodnocení je stanovení relativního rozpočtu hematopoetických buněk (myelogram) a morfologický popis hematopoetických vývojových řad a dalších buněk přítomných v kostní dřeni. [14] Pro celkové hodnocení a interpretaci výsledků je také důleţité znát: - vstupní a suspektní klinickou diagnózu (popř. diferenciálně diagnostická rozvaha) - zhodnocení stavu hematopoetických orgánů (uzliny, slezina, játra) - další klinické a laboratorní nálezy (osobní anamnéza aj.) - druh podávané léčby [14] 37