Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Mykotoxiny v obilovinách pro lidskou výživu

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Mykotoxiny v obilovinách pro lidskou výživu Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Viera Šottníková, Ph.D. Vypracovala: Michaela Dížková Brno 2013

2 1

3 2

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mykotoxiny v obilovinách pro lidskou výživu vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne... podpis 3

5 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat paní Ing. Vieře Šottníkové, Ph.D. a panu RNDr. Janu Nedělníkovi, Ph.D. za cenné připomínky a rady při vypracování této bakalářské práce. Ráda bych také poděkovala lidem ve svém okolí za trpělivost a podporu. 4

6 ABSTRAKT V práci je řešena problematika mykotoxinů, což jsou sekundární metabolity mikroskopických hub, které se často vyskytují na obilovinách a výrobcích z nich. Typickými rody, které se objevují je Fusarium a Alternaria, ve skladech se přidávají i skladové plísně, mezi které patří hlavně Aspergillus a Penicillium. Při napadení zrna je zhoršená jeho kvalita a zrno může představovat i hrozbu pro lidské zdraví. Mykotoxiny, jako například aflatoxin, ochratoxin, fumonisiny, často způsobují onemocnění jater, ledvin, jsou karcinogenní a není výjimkou ani smrt. Aby se množství mykotoxinů ve finálním produktu snížilo na minimum, je důležité používat kvalitní suroviny a dodržovat zásady hygienické praxe. Limity mykotoxinů jsou uvedeny v legislativě a jsou nastaveny tak, aby nehrozilo žádné nebezpečí. Klíčová slova: obiloviny, mykotoxiny, legislativní limity ABSTRACT The paper dealt with the issue of mycotoxins, which are secondary metabolites of microscopic fungi that are often found on cereals and products of them. Typical genera that occur are Fusarium and Alternaria, are added in warehouses and storage fungi, which include mainly Aspergillus and Penicillium. When grain is aggravated assault its quality and grain can pose a threat to human health. Mycotoxins, such as aflatoxin, ochratoxin A, fumonisins, often cause liver, kidney, are carcinogenic and there is no exception or death. To the levels of mycotoxins in the final product is minimized, it is important to use high quality raw materials and principles hygiene practice. Limits mycotoxins are listed in the legislation, and are set so that there is no danger. Keywords: cereals, mycotoxins, legislative limits 5

7 Obsah 1 ÚVOD CÍL LITERÁRNÍ PŘEHLED Mikroskopické houby Obecná charakteristika Morfologie a rozmnožování Podmínky růstu plísní Mykotoxiny Historie mykotoxinů v potravinách Aflatoxiny Ochratoxin Patulin Trichothecény Fumonisiny Zearalenon Deoxynivalenol Významné mykotoxikózy Ergotismus Aflatoxikóza Reyův syndrom Primární karcinom jater Respirační nádorové onemocnění Ochratoxikóza Alimentární toxická aleukie Mikroskopické houby a mykotoxiny v obilí Rod Fusarium Metody stanovení mykotoxinů HLPC Kapalinová chromatografie s hmotnostním detektorem Plynová chromatografie Tenkovrstvá chromatografie ELISA Mikrobiologické metody Test pro měření potenciálu tvorby mykotoxinů v obilí Možnosti eliminace mykotoxinů Legislativa ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

8 1 ÚVOD Zajištění kvalitních a bezpečných surovin a potravin pro lidskou výživu je nejaktuálnějším trendem současné zemědělské a potravinářské výroby. Dodržení tohoto trendu je závislé na neustálé kontrole a na zajištění optimálních výrobních podmínek, které eliminují případný výskyt zdraví škodlivých látek v surovinách pro výrobu potravin. Velmi důležitý je stav počáteční suroviny, která by měla být prostá plísní, které by mohly být zdrojem tolik obávaných mykotoxinů. Přítomnost vláknitých mikroskopických hub je velmi častá a přidají-li se optimální podmínky pro růst, může dojít i k produkci sekundárních metabolitů, které označujeme jako mykotoxiny (Váňová, Nedělník a kol., 2007). Jedná se o toxiny, které mikroskopické houby vylučují do prostředí, při boji o živiny a potravu. Chemické sloučeniny známé pod názvem mykotoxiny jsou široce studovány a diskutovány nejen mezi odborníky, ale i veřejností jako jedna z potenciálních příčin zhoršení kvality potravin a krmiv (Feriancová, 2010). Jedná se o látky toxické pro teplokrevné živočichy včetně člověka (Váňová, Nedělník a kol., 2007). Jejich výskyt je nutné sledovat zejména z důvodu negativních dopadů na lidské zdraví, kdy většina mykotoxinů způsobuje poruchy imunity, jsou karcinogenní, neurotoxické apod., některé druhy mohou i v malém množství způsobovat smrt (Prugar a kol., 2008). Nejčastěji se vyskytující mykotoxiny, které ohrožují lidské zdraví, jsou DON a ZEA, které budou v práci podrobně popsány a rozebrány. Problém při výkupu zrna a jeho zpracování způsobuje především výskyt rodu Fusarium. Tento druh může mít za následek nejen nižší výnosy, ale i přítomnost mykotoxinů v zrnu (Hladišová, 2010). Obecně výskyt mikroskopických hub u obilí zhoršuje jeho zpracovatelnost a následně i finální produkt. Je známé velké množství faktorů, které ovlivňují výskyt těchto hub. Patří sem zejména počasí, předplodina, zpracování půdy a také odolnost pěstované plodiny. Snížit kontaminaci je možné také správně provedenou chemickou fungicidní ochranou. Základem prevence výskytu mikroskopických hub a mykotoxinů je správná zemědělská a zpracovatelská praxe. Důležitý je správný a účinný systém kontroly s vhodně zvolenými detekčními metodami (Prugar a kol., 2008), z nichž nejvíce je využívána kapalinová chromatografie. Limitní množství mykotoxinů v surovinách a potravinách určuje legislativa, která zajišťuje bezpečnost vyprodukovaného zboží. 7

9 2 CÍL Cílem práce bylo: - prostudovat dostupnou naši i zahraniční odbornou literaturu zabývající se problematikou mykotoxinů v obilovinách, - zaměřit se na jejich dopad na lidské zdraví a výživu, - seznámení se se sekundárními metabolity toxinogenních plísní, jejich vlivem na lidský organismus a popsat jejich produkty, - prostudování současné legislativy EU, - popsat významné mykotoxikozy, - seznámit se s metodami stanovení mykotoxinů, - zdokumentovat nejnovější výzkum a jeho výsledky o výskytu mykotoxinů v obilovinách a výrobků z nich. 8

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mikroskopické houby Obecná charakteristika Plísně jsou mikroorganismy, které jsou podle současné klasifikace zařazovány do říše hub. Věda zabývající se houbami se nazývá mykologie (z řeckého mykés = houby, logia = učení). Taxonomické členění hub je následující: a) Oddělení: Myxomycota (hlenky), b) Oddělení: Chytridiomycota, c) Oddělení: Hypochytridiomycota, d) Oddělení: Oomycota (řasohouby), e) Oddělení: Eumycota: a. Třída: Zygomycetes, b. Třída: Trichomycetes, c. Třída: Endomycetes, d. Třída: Ascomycetes, e. Třída: Basidiomycetes f. Pomocná třída: Deuteromycetes Systematika hub je velmi složitá, jedná se o heterogenní skupinu nejen z hlediska fylogenetického a taxonomického, ale i po stránce morfologické a ekologické. Z praktického hlediska se mikroskopické houby dělí na mikroskopické kvasinkovité houby a mikroskopické vláknité houby (mikromycety). V aplikované mykologii se zažil pro mikroskopické kvasinkovité houby název kvasinky a pro mikroskopické vláknité houby název plísně (Paříková, Kučerová, 2001). Na potravinách se často vyskytují plísně rodu Alternaria, Fusarium, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Mucor a další (Görner, Valík, 2004). Obr 1 znázorňuje kvantitativní výskyt mikroskopických hub v životním prostředí a potravinách. 9

11 Obr 1 Kvantitativní výskyt mikroskopických hub v životním prostředí (Ostrý, 1998) Morfologie a rozmnožování Mikroskopické houby jsou eukaryotické organismy. Základem jejich těla jsou vláknité útvary zvané hyfy. Ty mohou být buď vícebuněčné, nebo jednobuněčné. Hyfy se větví a vytváří spleť vláken tzv. mycelium (podhoubí). Mycelium můžeme pozorovat v podobě různě barevných nárůstů. Rozmnožovacími částicemi plísní jsou spory. Ty vznikají nepohlavním nebo pohlavním způsobem. Jsou lehké, vodoodpudivé a snadno se uvolňují do okolí a kontaminují tak další plochy. Častější je nepohlavní rozmnožování, které se může opakovat až několikrát do roka. Dalším způsobem je také rozmnožování za pomocí hyf, které se rozrůstají Podmínky růstu plísní Plísně mají aerobní metabolismus, mohou tedy růst a rozmnožovat se jen tam, kde je zajištěn přísun kyslíku. Odolné jsou však k poklesu jeho koncentrace. Většina plísní je schopna růst a množit se při nízkých hodnotách aktivity vody a w, optimální hodnota relativní vlhkosti vzduchu je více než 80 %. Některým druhům stačí vlhkost již kolem 65 %. Optimální teploty pro rozvoj plísní jsou v širokém intervalu a ve většině případů se shodují s optimálními teplotami pro člověka. Jedná se tedy o teploty kolem 25 C, některé druhy jsou však schopny růst i při teplotách -10 C. Mikroskopické houby mají rády kyselé až neutrální prostředí (ph 5 7), působením svých metabolických produktů jsou plísně schopny si ph prostředí upravovat tak, aby jim co nejvíce vyhovovalo. Na živiny jsou plísně nenáročné, některým druhům stačí prach a organické nánosy, jiným uhlík a kyslík z atmosféry (Paříková, 10

12 Kučerová, 2001). Pro rody Aspergillus je ideální teplé prostředí s nižší vlhkostí (Prugar a kol., 2008). Z hlediska výskytu je možné mikroskopické houby kontaminující obiloviny rozdělit na polní, které jsou přítomny v zrnu již před sklizní (Fusarium, Alternaria, Cladosporium), dále na skladištní (Aspergillus), které produkují mykotoxiny při vlhkosti obilí % a v rozmezí teplot 10 až 50 C. Do poslední skupiny patří rod Penicillium, který je zahrnován jak mezi plísně polní, tak skladištní (Komprda, 2000). Tab. 1 Obecné charakteristiky pro růst mikromycetů a produkci mykotoxinů (Ostrý, 1998) Faktor Růst Produkce mykotoxinu Teplota C 4 40 C ph 1,7 10 2,5 8 Optimum 5 7 a w Min. 0,62 Min 0,8 0,85 Eh Aerobní podmínky Aerobní podmínky Vliv solí Do 20 % NaCl Do 14 % NaCl Vliv cukrů Do 50 % sacharosy Do 50 % sacharosy Vliv fytoalexinů Inhibice Inhibice Vliv látek v koření Inhibice (eugenol, anetol, Inhibice (eugenol, anetol, tymol) tymol) Vliv jiných mikromycetů? Inhibice (výskyt Aspergillus sk. niger) Infekce viry? Inhibice (RNA mykoviry) 3.2 Mykotoxiny Mykotoxiny jsou produkty sekundárního metabolismu houbovitých mikroorganismů. Jsou nebezpečné jak pro člověka, tak i zvířata (Moravcová, 2011). Jedná se o strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (nižší než 700 g/mol) (Macuchová a kol., 2007). Jsou problémem prakticky všech klimatických pásem zeměkoule. Mají úlohu zejména v konkurenčním boji mikroorganismů o substrát a živiny a jsou také významné jako faktor virulence v průběhu patogeneze. V současné době je známo asi 400 různých druhů mykotoxinů s přibližně možnými metabolity. Mezi nejvýznamnější producenty mykotoxinů patří rody Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Alternaria spp a Claviceps spp. nejvýznamnějšími mykotoxiny jsou aflatoxiny, trichothecény, zearalenony, patulin a další (Moravcová, 2011). Důležitý je také 11

13 poznatek, že různé houby mohou tvořit stejné mykotoxiny a jeden druh může produkovat mykotoxinů více. Nejdříve známými mykotoxiny byly aflatoxiny (Prugar a kol., 2008). Z praktického hlediska lze producenty mykotoxinů rozdělit na dvě základní skupiny: a) Kontaminanti primární spory napadají rostliny v průběhu vegetace (Fusarium), b) Kontaminanti sekundární spory kontaminují materiály až při sklizni, transportu, zpracování a skladování. Intoxikace mykotoxiny může být tedy přímá nebo nepřímá. Při přímé intoxikaci dojde k požití mykotoxinu vyprodukovaného houbovým mikroorganismem přímo v neupraveném produktu. Intoxikace způsobené zpracovanými potravinami nebo jejich částmi obsahujícími mykotoxiny jsou nepřímé intoxikace. Mykotoxiny způsobují v závislosti na druhu, typu a množství akutní nebo chronické mykotoxikózy. Vyskytují se imunologické problémy, alergie, kožní problémy apod. Mykotoxiny poškozují všechny orgány, narušují jejich funkci (játra, ledviny), často jsou karcinogenní, neurotoxické, teratotoxické. V některých případech mohou způsobit i smrt. Podstatnou vlastností mykotoxinů je ta, že je velmi nesnadné je zničit nebo odstranit (Moravcová, 2011) Historie mykotoxinů v potravinách První zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z konce minulého století z oblasti Japonska. Byla popsána lidová zkušenost se žlutou rýží, kterou doporučovali na několik hodin vystavit přímému slunečnímu záření, aby pozbyla svoji toxicitu (fotolýza mykotoxinu citreoviridinu). Více bylo známo o toxicitě plesnivých výrobků v polovině tohoto století. Ve 30. a 40. letech byly zkoumány vzorky obilí, které byly napadeny rodem Fusarium. Vzorky vykazovaly toxicitu pro pokusná zvířata a v praxi byly spojeny s onemocněními, která jsou v současné době nazývána alimentární toxická aleukie. Ve 40. letech byl objeven penicilin, k jehož rozvoji přispěla zejména 2. světová válka. V tuto dobu se zapomnělo na toxicitu jiných mykotoxinů. Přírodní penicilin se rozkládá pouze v žaludku a není možné ho podávat ústy jako lék, naopak může způsobit prudkou alergickou reakci, narušena může být také mikroflóra trávicího ústrojí. K obnovení zájmu o mykotoxiny došlo v roce 1960, kdy na farmách v Nové Anglii došlo k úhynu desítek tisíc krůťat. Bylo prokázáno, že k němu došlo díky zkrmování směsí, které obsahovaly arašídy kontaminované mykotoxiny. Práce s mykotoxiny se začala rozvíjet i v tehdejší ČSSR. V jednom z tehdejších závodů došlo k zaplísnění rajčat a pracovníci hygienické služby po senzorické analýze onemocněli 12

14 s příznaky na poškození jater. Problémem se začal zabývat doc. RNDr. Miroslav Polster, CSc. a referenční laboratoř pro analýzu mykotoxinů byla zbudována při KHS Plzeň. V 70. letech se výzkum rozšířil i do mnoha dalších pracovišť a v současné době je vrcholovým pracovištěm s mykotoxiny Centrum hygieny potravinových řetězců na Státním zdravotním ústavu v Brně (Slonek, 2008) Aflatoxiny Jsou produkovány mikromycetami rodu Aspergillus spp., konkrétně Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus a Aspergillus nomius (Moravcová, 2011). Přehled mykotoxinů produkovaných rody Aspergillus je v Tab 1. Další toxiny produkované těmito rody jsou například ochratoxin, patulin, a další (Betina, 1990). Aflatoxiny jsou považovány za jedny z nejsilnějších přírodních karcinogenů a jejich toxicita je velmi vysoká (Moravcová, 2011). Zatím jsou známy asi dvě desítky aflatoxinů, z nichž se v přirozeně v rostlinných substrátech vyskytují zejména čtyři základní typy aflatoxin B 1, B 2, G 1 a G 2. Jedná se o kontaminanty, které se objevují zejména u kukuřice, ořechů, koření a suchého ovoce. U obilovin, které jsou skladovány ve vhodných podmínkách, se aflatoxiny příliš neobjevují (Prugar a kol., 2008). Ze základních typů pak v těle konzumenta mohou vznikat aflatoxiny typu M. Nejčastěji se vyskytuje aflatoxin B 1, který je také nejtoxičtější. V těle konzumenta způsobují imunosupresi (sníženou odolnost k nemocem a neúčinnost očkování), růstové retardace, onemocnění jater i smrt. K intoxikaci může dojít buď klasickým orálním způsobem, kdy zkonzumujeme kontaminovaný materiál, nebo přes kůži a dýchací cesty inhalací (Moravcová, 2011). Absorpce aflatoxinu se tedy uskutečňuje jak orální cestou, tak i inhalační. To bylo prokázáno u mlynářů a v mísírnách krmiv (Martochová, 2008). Obr 2 Struktura aflatoxinu D 1 ( Tab. 2 Mykotoxiny rodu Aspergillus (Slezáková, 2007) Producenti mykotoxinů Aspergillus flavus Mykotoxiny aflatoxiny B, G, kys. kojová, kys. cyklopiazonová, kys. aspergilová, sterimatocystin, versicoloriny 13

15 Aspergillus fumigatus fumitoxiny, fumitremorginy A, B, gliotoxin, ochratoxin A Aspergillus niger malforminy, naphtopyrony, ochratoxin A ochratoxin A, kys. penicilová, viomellein, vioxanthin, kys. sekalonová, Aspergillus ochraceus xantomegnin Aspergillus oryzae aflatoxiny, aspergilomarasmin, kys. kojová, kys. cyklopiazonová Aspergillus aflatoxiny B, G, kys. kojová, kys. cyklopiazonová, kys. aspergilová, parasiticus sterimatocystin, versicoloriny Aspergillus sclerotiorum ochratoxin A, kys. penicilová Aspergillus tamarii aflatoxiny, kys. kojová, kys. cyklopiazonová, fumigaklavin Aspergillus terreus patulin, citrinin, citreoviridin, teritrem A, B, C, A, B, kys. tereová sterigmatocystin, nidulotoxin, aspertoxin, ochratoxin A, versicoloriny, kys. Aspergillus versicolor cyklopiazonová Ochratoxin Mezi nejvýznamnější patří ochratoxin A, který je v teplých subtropických a tropických oblastech produkován rody Aspergillus, v chladnějších oblastech rody Penicillium. Vyskytuje se v produktech rostlinného i živočišného původu. Hlavním zdrojem jsou obiloviny, káva, koření apod. Řadí se k mykotoxinům, které kontaminují materiál až sekundárně, tedy většinou po sklizni rostlinného materiálu v důsledku špatných skladovacích podmínek. Ochratoxin A je nefrotoxický, karcinogenní a teratogenní (Prugar a kol., 2008). Resorbovaný mykotoxin způsobuje toxickou nefropatii (poškození ledvin), která je doprovázena nechutenstvím, depresemi, průjmem, horečkou a žíznivostí. Objevuje se také časté močení a postupná dehydratace organismu. Ochratoxin A přechází také z krve zvířat do jejich masa a takto kontaminované produkty mohou být rizikové pro člověka. Rezistentní jsou vůči ochratoxinu přežvýkavci, protože v bachoru dochází k jeho detoxikaci (Martochová, 2008). Přítomnost ochratoxinu v obilovinách prokázal také výzkum uskutečněný v Maroku. 81 vzorků složených především z rýže, kukuřice, čiroku a prosa zakoupených na místních trzích bylo analyzováno metodou kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí. Výsledky prokázaly přítomnost velkého množství mikroskopických hub zejména rodu Aspergillus, Fusarium a také Penicillium a tím i přítomnost mykotoxinu (Toffa a kol., 2013). 14

16 Obr 3 Struktura ochratoxinu ( Patulin Jedná se o nenasycený lakton, který je obvykle izolován z jablek a jejich produktů (Martochová, 2008). Nejčastějším producentem patulinu je Penicillium expansum. Tato houba se běžně vyskytuje na povrchu ovoce a obiloviny napadá málo (Prugar a kol., 2008). Rod Penicillium obsahuje velké množství toxinogenních druhů, které jsou uvedeny v Tab. 2. Tento rod byl nejdříve izolován z plesnivé kukuřice (Slezáková, 2007). Jedná se o středně toxický mykotoxin, který je indikátorem špatných výrobních postupů nebo používání surovin kontaminovaných mikroskopickými houbami. Patulin se ničí běžně používanými konzervačními prostředky, jako je například oxid siřičitý. Váže se na SH skupiny bílkovin a tím zhoršuje funkčnost enzymů a proteinů a zvyšuje permeabilitu buněčných membrán (Martochová, 2008). Patulin vykazuje širokospektrální antibiotické účinky, proto se ověřovalo jeho možné využití k léčbě, což bylo ovšem zavrženo. V pokusech na myších bylo zjištěno, že dráždí zažívací trakt, způsobuje krvácení a tvorbu vředů a je karcinogenní. Obr 4 Struktura patulinu ( 15

17 Tab. 3 Mykotoxiny rodu Penicillium (Slezáková, 2007) Producenti mykotoxinů Mykotoxiny Penicilliium kys. penicilová, kys. terestrová, viomellein, nefrotociké glykopeptidy, aurantiogriseum xynthomegnin, verrucosidin, penitrem A Penicillium brevicompactum kys. mykofenolová, brevianamid Penicillium chrysogenum PR toxin, xantociliny, roquefortin C, D, kys. cyklopiazonová, ochratoxin A Penicillium citreonigrum citrinin, citreoviridin, xanthocilin X Penicillium citrinum Carinin Penicillium kys. cyklopiazonová, rugulosin A, B, fumigaklavin A, B, ocharatoxiny, commune roquefortin A, B, sterigmatocystin Penicillium coprophilum Griseofulvin Penicillium crustosum roquefortin A, B, C, penitren A, kys. cyklopiazonová, viridicatin, xanthomegnin Penicillium digitatum Tryptoguivaliny Penicillium expansum roquefortin C, patulin, citrinin, chaetoglobosiny Penicillium griseofulvum roquetortin C, kys. cyklopiazonová, patulin, griseofulvin, sterigmatocystin Penicillium hordei roquefortin C, kys. terestrová Penicillium chrysogenum roquefortin C, penicilin, meleargin, ochratoxiny, kys. penicilová Penicillium islandicum emodin, rugulozin, luteoskyrin, skyrin, islanditoxin, cyklochlorotin Penicillium oxalicum kys. sekalonová D, roquefortin C Penicillium purpurogenum rubratoxin A, B Penicillium variabile rugulozin, ochratoxiny Penicillium xanthomegnin, viomelllein, vioxanthin, kys. penicilová, kys. viridová, viridicatum ochratoxiny, citrinin, kys. cyklopiazonová Trichothecény Jsou skupinou látek, které jsou produkovány především houbami rodu Fusarium spp. Význam pro lidské zdraví má však jen několik z nich (Moravcová, 2011). Trichothecény se liší navzájem svoji chemickou strukturou a fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Dle toho se dělí do dvou skupin, na makrocyklické a nemakrocyklické. Nemakrocyklické jsou produkovány zejména rodem Fusarium. Lze je rozdělit na typ A, kam řadíme T-2 toxin, T-2 triol, T-2 tetraol, HT-2 toxin, DAS a další, dále na typ B, kam patří NIV, DON, FUS-X, 3,15-acetyl-DON. Trichothecény prvního typu jsou až desetkrát toxičtější než typu B (Slezáková, 2007). Jedná se o látky, které inhibují syntézu proteinů a způsobují 16

18 imunosupresi. Mezi nejvýznamnější zařazujeme deoxynivalenol, T-2 toxin, nivalenol a diacetoxyscripenol. Deoxynivalenol je nejčastěji produkován celosvětově rozšířeným druhem Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichoides a Fusarium poae. Velmi často se vyskytují v obilovinách a také v pivu. T-2 toxin byl velmi často prokázán v pšeničných, kukuřičných, ovesných i žitných produktech. Trichothecény jsou rezistentní vůči světlu a teplotě, deaktivovat je lze silnou kyselinou nebo zásadou (Moravcová, 2011). U člověka je dlouhodobý příjem potravy, která je kontaminována trichothecény spojována s výskytem onemocnění jako septická angína apod. Rozhodujícím faktorem pro toxický účinek mykotoxinu je dávka a délka působení, neméně důležitý je také věk, pohlaví a druh živočicha (Slezáková, 2007). Obr 5 Struktura a číslování atomů trichothecénu ( Fumonisiny Fumonisiny lze popsat jako složité alifatické sloučeniny s otevřeným řetězcem. Za hlavní producenty jsou považovány druhy Fusarium verticillioides a F. proliferatum. K nejvýznamnějším zdrojům fumonisinů patří kukuřice a krmiva a potraviny z ní vyrobené (Remešová, 2007). Jedná se o látky strukturálně podobné sfingosinu, které mohou uplatnit svoji biologickou aktivitu v blokaci klíčových enzymů biosyntézy sfingolipidů (Feriancová, 2010). Bylo izolováno více jak 28 typů fumonisinů, z nichž ovšem nejvýznamnější je fumonisin B 1, který se vyskytuje nejčastěji. Jedná se o mykotoxiny, které tlumí syntézu sfingolipidů, které jsou významnou součástí buněčné stěny mozku a nervové tkáně (Remešová, 2007). Často způsobují neinfekční onemocnění mozku u koní, nádorové onemocnění jater s toxickými účinky na ledviny laboratorních krys (Slezáková, 2007). U drůbeže jsou schopny vyvolat tzv. syndrom toxicity krmiva. Z dostupné literatury vyplývá, že skot je k těmto mykotoxinům relativně málo vnímavý (Feriancová, 2010). Fumonisiny jsou také dle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny považovány za karcinogeny pro člověka, způsobují zhoubné bujení, jsou nefrotoxiké a hepatotoxické (Slezáková, 2007). 17

19 Fumonisiny jsou polární sloučeniny a absorbce z gastrointestinálního traktu je nízká. Také jejich degradace formou bachoru se zdá být velmi nízká a jeví se tedy pravděpodobné, že jsou tyto mykotoxiny asorbovány v tenkém střevě ve stejném poměru jako u monogastrů (Feriancová, 2010). Na základě posledních znalostí o fumonisinech je možné předpokládat nálezy reziduí těchto mykotoxinů v mléce, v malém množství ve vepřových ledvinách a játrech (Remešová, 2007). T-2 toxin (T2) je mykotoxin, který způsobuje převážně kožní problémy, častá jsou krvácivá ložiska v oblasti hlavy a pohlavních orgánů zvířete. U prasat se vyskytují poruchy reprodukce, u skotu snížená imunita telat, poruchy srážlivosti krve a hemorhagie. Jedná se o toxin s vysokou akutní toxicitou (Feriancová, 2010). Fumonisiny byly prokázány i v čínském rýžovém víně. Výzkumem se zabývala Laboratoř bezpečnosti potravin v Číně a odebrané vzorky byly testovány metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí (Ma a kol., 2013). Obr 6 Struktura fumonisinu ( Zearalenon Zearalenon byl pojmenován v roce 1966 podle druhu Gibberella zeae (Remešová, 2007). Opět se jedná o skupinu, která je produkovány rodem Fusarium spp (Moravcová, 2011). Patří mezi látky s estrogenní aktivitou (Komprda, 2000). Napadají klasy a spodní části stébel obilnin (Moravcová, 2011). Nejčastěji se vyskytují v zrně pšenice, kukuřice, ječmene, ovsa, sóji, laskavce a sezamu, ovšem výjimkou nejsou ani semena řepky (Velíšek, 1999). Jejich množství v napadené surovině se může ještě zvýšit činností hmyzích škůdců. Na organismus konzumenta mají nežádoucí estrogenní efekt. Tyto látky v těle konzumenta nahrazují přirozené estrogeny a váží se na jejich receptory v děloze, mléčné žláze a játrech (Moravcová, 2011). Zearalenon je poměrně lipofilní sloučenina, která působením UV záření přechází z přírodní trans formy na cis izomer. Obsah toho mykotoxinu při zpracování obilovin a 18

20 produkci pečiva významně klesá. V bílé mouce připravené z kontaminované suroviny je obsaženo již jen % původního množství mykotoxinu, v chlebu je množství sníženo o % oproti mouce. Při výrobě těstovin se množství zearalenonu snížilo o % (Velíšek, 1999). Při hodnocení výskytu ZEA v potravinových výrobcích byly odebrány vzorky potravin i nezpracovaných obilovin z 19 evropských zemí. Nejvyšší koncentrace ZEA byly zjištěny u pšeničných otrub, kukuřice a kukuřičných výrobků jako je mouka, lupínky apod. Na základě těchto výsledků stanovil vědecký Panel pro kontaminující látky v potravinovém řetězci EFSA tolerovaný denní příjem pro ZEA ve výši 0,25 µg/kg tělesné hmotnosti. Pro snídaňové cereálie byl limit navýšen z původních 50 µg/kg na 75, 100, 125 až 150 µg/kg. K překročení této dávky by došlo pouze ve výjimečných případech, kdy by byly snídaňové cereálie konzumovány každý den po dobu 4 týdnů ( Obr 7 Struktura zearalenonu ( Deoxynivalenol Patří k nejčastěji se vyskytujícím fusariovým toxinům. Jeho největšími producenty jsou Fusarium graminearum a F. culmorum. Vyskytuje se obvykle v několikanásobně vyšších koncentracích než ostatní toxiny (Macuchová a kol, 2007). Podle Americké asociace pro pšenici (USW) je deoxynivalenol nejběžnějším a nejčastěji se vyskytujícím mykotoxinem v dováženém obilí (Martochová, 2008). Jedná se o mykotoxin, který je rozpustný ve vodě. Jeho množství se zvyšuje například při zpracování ječmene na slad, zejména v procesu máčení a klíčení (Macuchová a kol., 2007). Naopak ke snížení množství lze přispět omýváním suroviny, díky rozpustnosti deoxynivalenolu ve vodě, čehož se využívá zejména u kukuřice (Velíšek, 1999). V těle konzumenta způsobuje zažívací potíže, změny kožní a hematologické, prokázán byl i účinek imunosupresivní a teratogenní (Prugar a kol., 2008). Deoxynivalenol je jedním ze sledovaných mykotoxinů v obilí. Limitní hodnota pro DON v nezpracovaném obilí je 1250 µg/kg, v mouce 750 µg/kg a v potravinách pro děti 250 µg/kg. Monitoring uskutečněný na konci 90. let minulého století a na začátku tohoto století 19

21 v ČR dokumentoval rozsáhlý výskyt fuzáriových mykotoxinů v cereáliích, které byly sklizeny v různých agrárních ekosystémech. V některých letech byla přítomnost DON prokázána až v 95 % vzorků. Ovšem překročení maximálního limitu bylo pouze ojedinělé (Lancová a kol., 2007). V prosinci roku 2012 byly z prodeje stahovány ovesné vločky původem z Německa, které prodával obchodní řetězec Lidl. V 500 g balení vloček byl limit pro deoxynivalenol překročen trojnásobně ( Italský národní institut zdraví studoval vliv mletí pšenice tvrdé na obsah DON. Získány byly čtyři druhy krupic, které byly zpracovány na různé druhy těstovin. V každém kroku přípravy probíhalo testování na obsah DON. Výsledkem bylo zjištění, že obsah DON se čištěním a mletím snižoval. Výrazný nárůst byl v otrubách, klíčcích a zbytcích z čistírny. U těstovin byl obsah mykotoxinu oproti původnímu zrnu snížen o 78 % (Brera a kol., 2013). Výskyt deoxynivalenolu byl studován u 113 vzorků pšenice také v brazilském státě Paraná. Vzorky byly testovány metodou ELISA a přítomnost DON byla prokázaná u 66,4 % vzorků v množství od 206,3 do 4732,3 µg/kg. V souvislosti s touto studií proběhlo také hodnocení příjmu DON obyvatel potravinami vyrobených z pšenice. Odhadovaný denní příjem DON konzumací chleba byl 0,79 µg/kg tělesné hmotnosti a těstovin 0,35 µg/kg (Sifuentes a kol., 2013). Obr 8 Struktura deoxynivalenolu ( Tab. 4 Hodnoty obsahu mykotoxinů v produktech určených ke krmení zvířat (Macuchová a kol., 2007) mykotoxin deoxynivalenon směrné hodnoty v mg/kg (ppm) produkty určené ke krmení zvířat pro krmivo s obsahem vlhkosti 12 % Krmné suroviny a) obiloviny a produkty obilovin s výjimkou vedlejších produktů kukuřice 8 20

22 zearalenon ochratoxin A fumonisin B1 + B2 b) vedlejší produkty kukuřice 12 Doplňková a kompletní krmiva s výjimkou: 5 a) doplňkových a kompletních krmiv pro prasata 0,9 b) doplňkových a kompletních krmiv pro telata (< 4 měsíce), jehňata a kůzlata 2 Krmné suroviny a) obiloviny a produkty obilovin s výjimkou vedlejších produktů kukuřice 2 b) vedlejší produkty kukuřice 3 Doplňková a kompletní krmiva: a) doplňková a kompletní krmiva pro selata a prasničky (mladé prasnice) 0,1 b) doplňková a kompletní krmiva pro prasnice a výkrm prasat 0,25 c) doplňková a kompletní krmiva pro telata, dojnice, ovce (včetně jehňat) a koz (včetně kůzlat) 0,5 Krmné suroviny a) obiloviny a produkty obilovin 0,25 Doplňková a kompletní krmiva pro: a) doplňková a kompletní krmiva pro selata 0,05 a) doplňková a kompletní krmiva pro drůbež 0,1 Krmné suroviny a) kukuřice a produkty kukuřice 60 Doplňková a kompletní krmiva pro: a) prasata, koně, králíky a zvířata v zájmovém chovu 5 b) ryby 10 c) drůbež a telata (< 4 měsíce), jehňata a kůzlata 20 d) dospělé přežvýkavce (> 4 měsíce) a norky Významné mykotoxikózy Mykotoxikóza je onemocnění způsobené toxiny mikroskopických hub, kdy toxin vzniká mimo tělo postiženého (Šimůnek, 2003) Aby bylo možné objektivně posoudit podíl určitého mykotoxinu na vzniku mykotoxikózy u člověka, musí být splněno pět podmínek: 1. Musí se zjistit přítomnost mykotoxinu v potravině, 2. Musí se potvrdit, že člověk byl vystaven danému mykotoxinu na základě reziduí mykotoxinu ve tkáních, 3. Musí se stanovit korelace (vztah) mezi expanzí (vystavením) a výskytem onemocnění, 4. Musí se zjistit a potvrdit reprodukovatelnost charakteristických příznaků onemocnění u laboratorních zvířat, 5. Musí se potvrdit, že způsob toxického účinku je podobný u zvířat, jako u člověka (Martochová, 2008). 21

23 3.3.1 Ergotismus Jedná se o jedno z prvních onemocnění, které bylo v souvislosti s mykotoxiny popsáno. Zpravidla bylo spojováno s konzumací obilnin, zejména žita a rýže, které byly kontaminovány tvrdými tmavě fialovými až černými sklerocii. Jedná se o vývojové stadium mikroskopické houby rodu Claviceps. Ergotismus se projevuje ve dvou formách. Jako gangrenózní forma a konvulzivní forma (Martochová, 2008). U gangrenózní formy dominují spasmy drobných cév a při opakovaném požití mykotoxinu může dojít až k odumření akrálních částí těla (ušní boltce, nos, prsty apod.). Konvulzivní forma se projevuje halucinacemi a křečemi ( V současné době je výskyt ergotismu pouze ojedinělý, neboť vykoupené obilí se čistí a zbavuje námelových sklerocií. Častěji se vyskytuje v rozvojových zemích (Etiopii), a proto výrobky dovážené z těchto oblastí by měly procházet zvýšenou kontrolou (Šimůnek, 2003) Aflatoxikóza Jde o akutní a chronické onemocnění, které vzniká po konzumaci potravin s vysokými dávkami aflatoxinu. Akutní aflatoxikóza není u lidí příliš častá. Pokud se objeví, projevuje se ložiskovými nekrózami a může dojít až ke smrti v důsledku selhání jater (Martochová, 2008). Jedná se o onemocnění, které nejčastěji postihuje drůbež. První zmínky pocházejí z Anglie z roku 1960, kde byly krůty krmeny peletovaným krmivem, které obsahovalo aflatoxiny z podzemnice olejné ( Klinickými příznaky jsou křeče v žaludku, vysílení, hubnutí, nažloutlé oční bělmo a bezvědomí, které končí smrtí (Martochová, 2008) Reyův syndrom Onemocnění je způsobováno mykotoxinem aflatoxin B 1 (Martochová, 2008). Jde o polyetiologický chorobný stav, který je možné vyvolat i některými léky, například acylpyrinem, jedy, virovou infekci a není vyloučena ani dědičná dispozice (Šimůnek, 2003). Ohrožena je hlavně dětská populace, především kojenci do 1 roku života, kteří jsou krmeni umělou výživou. Onemocnění má většinou dvoufázový průběh. První fáze se projevuje jako běžné respirační onemocnění, druhá fáze přichází za několik hodin až dní a projevuje se zvracením, průjmem a encefalopatií. Není výjimkou, že druhá fáze končí smrtí (Martochová, 2008). 22

24 3.3.4 Primární karcinom jater Opět se jedná o onemocnění způsobováno aflatoxinem B 1. Karcinogenita toho mykotoxinu je dána jeho metabolizovanou formou, která způsobuje bodovou mutaci na kodonu 249 (ser) dochází ke změně pořadí bází z AGT na AGG u tumor supresovaného genu p53. Tato mutace vede ke vzniku primárního karcinomu (Martochová, 2008) Respirační nádorové onemocnění Onemocnění vzniká inhalací vzduchu kontaminovaného aflatoxinem B 1. Častý výskyt tohoto onemocnění byl pozorován u dělníků v lisovnách oleje, kde byla přítomnost aflatoxinu B 1 prokázána ve výliscích lněných semen a arašídů (Martochová, 2008) Ochratoxikóza Toto onemocnění je celosvětově se vyskytující u zvířat i lidí. Způsobuje ho ochratoxin A, který se vyskytuje v zaplísněném krmivu zvířat a v potravinách. Příznakem onemocnění jsou léze na ledvinách až ledvinové selhání, nepravidelná srdeční činnost a smrt. Nemoc se objevuje regionálně a častěji poskytuje ženy (Martochová, 2008) Alimentární toxická aleukie Onemocnění se často vyskytovalo ve východní Sibiři, kde se lidé živili převážně ječmenem a prosem, které bylo napadeno houbami Fusarium spp (Martochová, 2008). Aleukie je vyvolána T-2 toxinem a příbuznými trichothecény. Největší epidemie tohoto onemocnění byla v SSSR ve 40. letech, kdy v důsledku válečných událostí zůstalo obilí nesklizené ležet pod sněhem. Došlo k napadení chladnomilnými fuzáriemi a na jaře po sklizení a konzumaci vypuklo onemocnění (Šimůnek, 2003). Příznaky onemocnění jsou bolesti hlavy, závratě, třesavka a zrakové poruchy (Martochová, 2008). 3.4 Mikroskopické houby a mykotoxiny v obilí Na čerstvém a dobře skladovaném obilí, především na pšenici, se vyskytují zejména bakterie. Vláknité houby se objevují většinou v menších počtech. Převládají typické polní druhy, jako jsou Fusarium a Alternaria. Jedná se o druhy, které napadají i vnitřní prostřední zrna mezi exokarpem a perikarpem (Görner, Valík, 2004). Tyto houby jsou známé zejména pro vznik onemocnění, tzv. klasové fuzariózy. Nejvýznamnějšími producenty jsou Fusarium graminearum, F. culmorum a F. verticillioides (Prugar a kol., 2008). Množství plísní se zvyšuje při nepříznivých povětrnostních podmínkách. Při dlouhodobém skladování se mění složení mikroflóry ve prospěch skladových plísní, které 23

25 jsou méně náročné na vlhkost. Mezi skladové plísně patří Aspergillus a Penicilliuum (Görner, Valík, 2004). V půdně-klimatických podmínkách naší republiky mohou být dalšími potencionálními producenty také Alternaria. Oba druhy (Fusarium spp. a Alternaria spp.) jsou proto společně nazývány jako polní plísně. Výskyt plísňových chorob se zvyšuje zejména při bezorebných technologiích, protože houby přezimovávají v posklizňových zbytcích v půdě (Slezáková, 2007). Při řešení projektu QF 3121 ve Výzkumném ústavu pícninářském v Troubsku bylo zjištěno, že obsah mykotoxinů se v průběhu zpracování obilí na pečivo mění. V laboratorních podmínkách byl napodoben proces ve mlýně, kdy zrno bylo proseto, obroušeno a pomocí aspirace odděleny prachové částice. Jednotlivé frakce byly vyšetřeny a získané výsledky ukázaly, že obsah DON se snížil. Graf 1 znázorňuje hladiny DON v jednotlivých frakcích. Následovalo mletí zrna v laboratorním mlýnu, kde byly získány tři frakce šrotovacích mouk a tři frakce mouk vymílacích. Graf 2 nám ukazuje, že nejvyšší množství DON se vyskytuje v otrubách. Hodnoty jsou až dvojnásobně vyšší než hodnoty v přečištěném zrnu. Pro zjištění změn během pečení se provedlo pokusné pekařství, kdy bylo připraveno těsto z mouky, droždí, cukru, tuku, soli a vody. Těsto se po vyhnětení zvážilo, nechalo se zrát a tvořily se klonky. Po vyzrání klonků následovalo pečení při teplotě 240 C po dobu 14 minut. Takto získané vzorky byly usušeny, homogenizovány a vyšetřeny na obsah DON. Výsledky ukazují, že přídavkem vody do těsta se obsah DON oproti původnímu množství v mouce zvýšil, což mohlo být způsobeno uvolněním mykotoxinů z jeho vazebných forem. Při následné fermentaci významně hladina DON klesla, což se přisuzuje práci kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které jsou přítomny v těstu. Pečením se hladina opět snížila. Jednotlivé kroky a obsah DON jsou znázorněny v grafu 3 (Lancová a kol., 2007). Problém s mykotoxiny se často řeší i v Chorvatsku, kde studie prokázala největší výskyt fuzáriových mykotoxinů u kukuřice. Metodou ELISA byly stanovovány mykotoxiny u vzorků kukuřice, pšenice, ječmene a ovsa, přičemž vyšší než povolená koncentrace byla zjištěna u 4 vzorků kukuřice a jednoho vzorku pšenice. Výzkum také dokázal, že na výskyt mykotoxinů mají podstatný vliv i jiné faktory než jen klimatické podmínky, neboť během odběru vzorku bylo počasí suché a teplé (Pleadin a kol., 2013). V Belgii byl zkoumán příjem mykotoxinů formou obilných příkrmů a výrobků. Zkoumán byl chléb obohacený otrubami, snídaňové cereálie, popcorn a ovesné vločky, které byly zakoupeny v klasických supermarketech v období od dubna 2010 do října Studie neprokázala zvýšený příjem mykotoxinů těmito potravinami a byly tak označeny za bezproblémové (De Boevre a kol., 2013) 24

26 Studován byl také výskyt mykotoxinů při skladování obilovin v silážních vacích. Studie probíhala po dobu dvou let ( ), po tuto dobu byly každých 14 dní odebírány vzorky, přímo uvnitř sila měřena teplota a obsah CO 2 a O 2, sledována byla i vodní aktivita zrna a KTJ. Výsledkem je zjištění, že po dobu silážování se nijak výrazně nemění množství mykotoxinů v obilovinách, změny byly zaznamenány pouze u aktivity zrna a obsahu O 2 (Gregori a kol., 2013). Polská studie prokázala vyšší výskyt mykotoxinů v obilovinách při ekologickém způsobu pěstování než při konvenčním způsobu, což se zdá být logické z důvodu nepoužívání fungicidních přípravků v ekologickém zemědělství (Kuzdraliński a kol., 2013). V Maroku bylo na přítomnost mykotoxinů testováno 81 vzorků pšenice tvrdé. Jako metoda pro stanovení byla zvolena kapalinová chromatografie detekcí diodovým polem a za pozitivní bylo označeno 9 vzorků, u kterých se množství DON pohybovalo v rozmezí 65 až 1310 µg/kg (Ennouari a kol., 2013). Graf 1 Změna obsahu DON v průběhu čištění (Lancová a kol., 2007) 25

27 Graf 2 Změna obsahu DON v jednotlivých mlecích fázích (Lancová a kol., 2007) Graf 3 Změna obsahu DON v dílčích krocích pekařství (Lancová a kol., 2007) Rod Fusarium V posledních letech je pozornost věnována zejména onemocněním vyskytujících se v klase. Největší význam na těchto chorobách má právě rod Fusarium. Rod byl poprvé popsán Linkem v roce Systematicky tento rod patří do čeledi Hypocreaceae, řádu Hypocreales a oddělení Ascomycota. Jedná se o rod s fialidickou konidiogenezí, zahrnuje druhy produkující dva typy konidií: hyalinní, vícebuněčné, rohlíkovité makrokonidie a jednobuněčné elipsoidní, oválné nebo široce vejčité mikrokonidie. Mohou se vytvářet chlamydospory a u některých rodů jsou známy teleomorfy. Fruktuifikačním orgánem je 26

28 konidiofor, který vyrůstá z fertilní hyfy. Konidiofory se vyskytují ve dvou typech. První je komplexně větvený, druhý je nevětvený nebo větvený pouze chudobně. Rod Fusarium je velice druhově obsáhlý a zahrnuje přes více než 80 druhů. Jedná se jak o druhy saprotrofní (vyskytující se v půdě, rostlinných částech, potravinách i krmivech), tak o druhy parazitické (způsobují hniloby rostlin a tracheomykózy). Fusarium způsobuje celosvětově rozšířené onemocnění zejména ječmene, ale i pšenice. Označuje se Fusarium head blight (FHB). Nejčastěji jsou tímto onemocněním postiženy lokality, které jsou vlhké až středně vlhké, ale vliv mají také další klimatické podmínky (teplota) (Macuchová a kol., 2007). Optimální klimatické podmínky mikromycetů rodu Fusarium pro rozvoj choroby jsou uvedeny v Tab. 4 (Remešová, 2007). Houbové mycelium Fusarium způsobuje velké ekonomické ztráty, ničí úrodu a snižuje kvalitu zrna. Obilky jsou často svraštělé, narůžovělé barvy a po konzumaci mohou být i příčinou onemocnění hospodářských zvířat. Výskyt houbového mycelia je prvotním problémem spojeným s FHB. Fusarium totiž produkuje velmi stabilní mykotoxiny, které mohou přecházet i do finálního produktu, jako například mouky, pekařských výrobků nebo piva (Macuchová a kol., 2007). Pšenice je plodinou, u které se o mykotoxinech hovoří již delší dobu. K dispozici je také početné množství výsledků. Hlavní opatření jsou proto soustředěna zejména na výskyt klasových fuzárií. Všechny rody Fusarium nemusí být toxinogenní, u nás se vyskytuje zejména Microdochium nivale. Způsobuje velké výnosové ztráty, ale neprodukuje toxin (Váňová, Nedělník a kol., 2007). Při napadení klasů pšenice druhy rodu Fusarium dojde zpočátku ke zbělení a zaschnutí jednotlivých klásků nebo celých částí klasů. V napadených květech se často nevytvoří žádné obilky, jinak se v napadených kláscích vyvíjejí různě deformované, scvrklé a růžovo-bílé zbarvené obilky. Klasy může napadat celá řada druhů rodu Fusarium, ale celosvětově je za nejvýznamnější považováno Fusarium graminearum (Klem, Tvarůžek, 2005). V posledních letech se studuje úroveň napadení druhy Fusarium a kumulace jejich toxinů na obilovinách následně pěstovaných po kukuřici. Stále častější střídání kukuřice a obilnin vede ke zvýšenému výskytu toxinogenních mikromycet na kukuřici i obilovinách. Problém kukuřice používané jako předplodina jsou také pozdní termíny výsevu. Ty oddalují termíny kvetení, které pak spadají do období s maximální tvorbou infekčního potenciálu na posklizňových zbytcích dozrávání askospor. Riziko představují také opatření, které prodlužují dobu vegetace, dochází tak k prodlužování období infekce a produkce mykotoxinů (Remešová, 2007). U kukuřice jsou významné z negativního hlediska zejména patogeny, které jsou přenášeny na osivu nebo uvnitř osiva. Uvnitř zrna je často napaden klíček rody 27

29 Alternaria, Cladosporium, Fusarium a dalšími. Fusarium také patří mezi houby, které způsobují na porostu kukuřice největší škody. Nejčastěji se objevují Fusarium graminearum, F. culmorum a F. poae. Pokud je kukuřice použita jako předplodina, je vysoké riziko napadení rody Fusarium i u následně pěstovaných obilovin. Jako ochrana pro kukuřici se využívají zejména mořidla (Slezáková, 2007). Tab. 5 Optimální klimatické podmínky mikromycetů rodu Fusarium pro rozvoj chorob na obilninách (Remešová, 2007). Druh Optimální podmínky pro rozvoj choroby Fuzariové vadnutí klasů a hniloba klasů Spála vzcházejících rostlin a bazální hniloba F. graminearum F. culmorum F. poae F. avenaceum Teplé vlhké počasí v době kvetení (25 C a >20 h množství srážek) Teplé suché počasí (>16 C) Microdochium nivale Mírně teplé vlhké počasí v době Chladné suché počasí (10-15 C) kvetení (20 C a >20 h množství srážek) F. verticillioides Horké a suché podmínky F. proliferatum F. subglutinans Převážně teplé vlhké podnebí 3.5 Metody stanovení mykotoxinů V ČR zatím neplatí ucelené evropské normy pro stanovení obsahu mykotoxinů v potravinách a krmivech, proto je dovoleno použít jakoukoliv z metod, která ovšem musí splňovat předpoklady týkající se její reprodukovatelnosti a výtěžnosti. Při stanovování mykotoxinů se využívá především jejich fyzikálních (vzhled, barva, pach, hustota), chemických (způsob projevu, do jakých reakcí vstupují) a biologických charakteristik (Martochová, 2008). Pro další stanovení mykotoxinů je používáno několik metod (Moravcová, 2011). Stanovení se liší dle finančních možností jednotlivých laboratoří (Remešová, 2007). Jedná se o metody zejména HPLC, plynová chromatografie, tenkovrstvá chromatografie a metoda ELISA (Moravcová, 2011). Chromatografie je separační metoda, která je založena na rozdělování molekul mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílné afinity složek směsi k dané fázi (Nedělník, 2006). U plynové chromatografie je mobilní fází plyn, u tenkovrstvé chromatografie papír nebo tenká vrstva. Jako standardní a nejcitlivější je 28

30 považována HPLC. Jedná se o kapalinovou chromatografii prováděnou ve speciálním přístroji v koloně za vysokého tlaku (Moravcová, 2011). Všechny metody jsou dostatečně citlivé a přesné, ale existují některá rizika, která je nutné při stanovení mykotoxinů minimalizovat. Prvním z nich je správný odběr vzorků. Zvyšováním hmotnosti analyzovaného vzorku se snižuje riziko vzniku chyb. Vzorkovací postup je upraven direktivou EU č. 98/53/EC. Druhým rizikovým krokem je purifikace a extrakce vzorku. Při nesprávné nebo nedokonalé purifikaci mohou zůstat mykotoxiny maskovány jinými látkami a my tak získáme falešné výsledky (Remešová, 2007) HLPC Jde o metodu, ve které se využívají drobné kolonky ve spojení s pumpou, přes které dochází k protlačování unášecí směsi. Po průchodu látky kolonkou dochází k detekci většinou na základě fyzikálních vlastností roztoku (absorpce viditelného, infračerveného nebo ultrafialového záření). Výhodou této metody je vysoká přesnost. Nevýhodou je materiální náročnost a nákladnost (Martochová, 2008). Metoda je vynikající pro stanovování zejména aflatoxinu B 1, ochratoxinu A a patulinu, kdy výhodou je minimální předprava vzorku a rychlé stanovení. V USA se metoda využívá také pro stanovení bisfenolu A, který se používal pro výrobu plastových lahví a vzniky tak obavy o zdraví zejména kojenců a malých dětí (Song a kol., 2013). Obr 9 Blokový diagram HPLC systému (Ježková, 2009) Kapalinová chromatografie s hmotnostním detektorem Spojení LC a MS umožňuje zjednodušení přípravy vzorku, zvýšení citlivosti metody a hlavně získání vícerozměrných dat. Při jedné analýze získáme retenční čas, odezvu a hmotnostní spektrum látky, čímž se zvyšuje spolehlivost pro potvrzení nálezů. Často se jako rozhraní mezi kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií využívá elektrospreje nebo chemické ionizace za atmosférického tlaku. V této metodě dochází k tvorbě iontů, jejich převedení do plynné fáze a odstranění nadbytku mobilní fáze (Ježková, 2009). 29

31 Jedná se o metodu rychlou a spolehlivou, která je ve světě využívána zejména pro stanovení aflatoxinů B 1, B 2, G 1 a G 2 u ječmene, pšenice, sojových bobů, kukuřice apod. (Sirhan a kol., 2013). S využitím této metody byl například stanovován výskyt deoxynivalenolu v 150 vzorcích pšenice tvrdé ze 3 různých oblastí Itálie. U všech vzorků se prokázala přítomnost DON v koncentraci od 47 do 3715 µg/kg (Dall Asta a kol., 2013). Stanovovány touto metodou byly také aflatoxiny v těstovinách. Cílem studie bylo porovnat rozdíl v obsahu aflatoxinů v těstovinách, na které byla použita pšenice z ekologického zemědělství a z konvenčního zemědělství. Výsledky jasně prokázaly vyšší výskyt mykotoxinu v těstovinách z ekologického zemědělství (Serrano a kol., 2013) Plynová chromatografie Metoda plynové chromatografie se využívá pro stanovení plynných vzorků a těkavých látek. Do proudu nosného plynu je nadávkován vzorek, který je v chromatografické koloně rozseparován vlivem interakce s náplní kolony. Následuje detekce, kdy získáme chromatogram s výsledky. Jedná se o rychlou a účinnou metodu pro stanovení i poměrně malých vzorků (Martochová, 2008). Jedná se o metodu, která je použitelná pro stanovení většiny mykotoxinů. Širší uplatnění však nachází při separaci trichothecénových mykotoxinů (Ježková, 2009) Tenkovrstvá chromatografie TLC je velmi jednoduchá a nenáročná metoda, která je využívána spíše k rutinnímu sledování obsahu mykotoxinů (Ježková, 2009). Při této metodě na povrchu odpovídajícího nosiče dochází ke vzlínání směsi rozpouštědel v tenké vrstvě použitého sorbentu. Poté co naneseme vzorek dojde k přechodu rozpouštědla přes vzorek a jednotlivé složky jsou unášeny po vrstvě sorbentu různou rychlostí. Detekce je provedena buď přímo, a nebo pod UV zářením, popřípadě postřikem vhodným činidlem (Martochová, 2008) ELISA Test je založen na interakci antigen-protilátka (Ježková, 2009). V kompetitivním ELISA testu analyzovaný mykotoxin obsažený ve vzorku a konjugovaném antigenu soutěží o vazebná místa protilátky, na antigenu je vázaný enzym, který štěpí chromogen za vzniku barevné reakce. Čím více mykotoxinu vzorek obsahuje, tím je obsazeno více vazebných míst. Dojde k navázání menšího množství konjugovaného antigenu a výsledná barevná reakce je 30

32 slabší. Intenzita zabarvení je měřena při odpovídající vlnové délce a výsledné koncentrace analytu jsou vypočteny na základě srovnání s absorbancí roztoků (Moravcová, 2011). Mykotoxiny většinou nevyvolají imunitní odezvu s tvorbou protilátek, ale působí jako hapteny. To znamená, že po navázání na vhodný nosič, kterým může být například bílkovina, vyvolají tvorbu specifických protilátek (Ježková, 2009) Mikrobiologické metody Pro stanovení mykotoxinů u různých druhů mikroskopických hub se používají metody založené na: a) Rozpoznání morfologických znaků hub, b) Identifikaci pomocí fyziologických znaků, c) Využití biochemických znaků (Martochová, 2008) Test pro měření potenciálu tvorby mykotoxinů v obilí Mezi mykotoxiny s výrazným dopadem na zdraví paří trichothecény, které jsou produkovány zejména rody Fusarium. Problematika sanitární ochrany obilí před sklizní je náročná, protože tentýž trichothecén může být produkován různými druhy i rody mikroskopických hub a zároveň tentýž druh houby může produkovat rozdílné mykotoxiny. Francouzští vědci po prostudování této problematiky vyvinuli test, který je schopný zjistit druh houby, potenciálně produkující trichothecény, produkované zejména rody Fusarium. Jako model byla použita pšenice napadená toxinogenními houbymi toho rodu v předsklizňovém období. Nový test, určený k hodnocení toxinogenního potenciálu vzorku se nazývá Tri 5, podle jména genu, který je identifikován podle genové amplifikace. Tento gen kóduje enzym, který se podílí na biosyntéze trochothecénů. Nový test je schopen rychleji a přesněji určit druh hub, které mají potenciál produkovat trichothecény. Hodnotí riziko tvorby, ne přítomnost mykotoxinu. Metoda Tri 5 se nejčastěji používá jako doplňková metoda (Slonek, 2008). 3.6 Možnosti eliminace mykotoxinů Základním opatřením pro výrobu kvalitních obilovin pro lidskou výživu je systém pěstování plodin s vhodně volenými prvky ochrany rostlin. Tento systém zahrnuje zejména volbu optimálního stanoviště, výběr vhodné odrůdy pro konkrétní pěstitelskou oblast, vyváženou výživu, střídání plodin a přiměřenou fungicidní ochranu. Přípravky použitelné vůči původcům fuzarióz jsou mnohé, důležitý je včasný zásah a v případě potřeby i opakované vstupy do porostů dávkami, které odpovídají síle napadení. Správně volená 31

33 fungicidní ochrana je základním opatřením v boji proti fuzariózám klasu (Moravcová, Nedělník, 2006). Je tedy důležité, zamezit vytvoření optimálních podmínek prostředí, které vyhovují mikroorganismům pro jejich růst, rozmnožování a produkci toxinů. Tyto podmínky jsou dány zejména teplotou, vlhkostí, množstvím počátečního infekčního substrátu apod. Základem prevence je tedy dodržování správně zemědělské a zpracovatelské praxe (Prugar a kol., 2008). Důležitá je dobře načasovaná a správně provedená sklizeň. Při správně seřízeném kombajnu dojde již při sklizni k odloučení poškozených a lehčích zrn. Další oddělení nekvalitních zrn zajistí posklizňové čištění. Sklizeň by měla být prováděna za optimální vlhkosti zrna. I posklizňová úprava by měla odpovídat teplotním, vlhkostním a hygienickým podmínkám (Moravcová, Nedělník, 2006). Pokud se nepodařilo sklidit zrno s nízkou vlhkostí, je důležité velmi rychle po sklizni snížit vlhkost zrna pod kritickou hranici. Hlavním cílem posklizňové úpravy je dosažení konečné skladovací vlhkosti, která nepřevyšuje 14% (Komprda, 2000). Snížení vlhkosti pod kritickou hranici by mělo být dosaženo do 48 hod. po sklizni. Zrno je stále živý organismus a voda je jedním z klíčových faktorů pro probíhající biologické procesy. Při snížení vlhkosti dochází ke zpomalení dýchání a zůstávají zachovány kvalitativní parametry zrna. Pokud je naskladněno zrno s vlhkostí vyšší než 15% objevuje se i voda volná, která negativně urychluje biologické procesy. Pokud by byla použita vyšší teplota při sušení, hrozí nebezpeční popraskání obalových vrstev zrn a může docházet k následné kontaminaci sekundárními houbovými patogeny. Dalším faktorem důležitým pro uchování kvalitativních parametrů zrna je aktivní provzdušňování. V boji proti producentům mykotoxinů se používají také protiplísňové přípravky zejména na bázi organických kyselin (především kyselina propionová). K aplikaci dochází nástřikem do toku obilí. Všechna výše zmíněná opatření jsou významná pro eliminaci možného dalšího růstu mikrobiální flory včetně producentů mykotoxinů. Jedná se tedy o protiplísňová opatření. Došlo-li však ke kontaminaci obilnin mykotoxiny již v průběhu vegetace tato opatření obsah mykotoxinů již nezmění. Eliminace mykotoxinů je velmi obtížná. Mykotoxiny jsou chemické sloučeniny, proto odolávají nejen chemické, ale také fyzikální inaktivaci. Proto je nutné, aby části s nadlimitním obsahem mykotoxinů byly ihned vyloučeny (Moravcová, Nedělník, 2006). V současné době se také zkoumá možnost ošetření zrna mikrovlnným zářením, ovšem metoda je ještě ve vývinu (Yadav a kol., 2012). Velíšek ve své Chemii potravin 3 uvádí tři základní preventivní opatření proti výskytu mykotoxinů. Patří mezi ně omezení infekce zemědělských plodin toxinogenními plísněmi v období růstu, dále rychlé a účinné vysušení sklizených plodin a jejich správné skladování a nevylučuje ani použití chemických přípravků proti rozvoji plísní (Velíšek, 1999). 32

34 3.7 Legislativa Úřední kontrola obsahu mykotoxinů v České republice byla zahájena s účinností zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů (Feriancová, 2010). Hygienické limity pro vybrané mykotoxiny byly deklarovány ve vyhlášce 298/1997 Sb. Od května 2004 je obsah mykotoxinů regulován vyhláškou 305/2004 Sb. V Tab. 3 jsou uvedeny limity mykotoxinů v obilovinách a z nich vyrobených produktech. Hygienický limit byl pro DON nově stanoven u obilovin pro přímou spotřebu 0,5 mg/kg, 0,35 mg/kg pro chléb a jemné pečivo, 0,1 mg/kg pro výrobky určené pro dětskou výživu. Oproti staré legislativě byl také stanoven limit pro zearalenon ve výši 0,05 mg/kg pro obiloviny a výrobky z nich. V roce 2005 byla také vydána nová nařízení související s mykotoxiny. Jedná se o Směrnici Komise (ES) č. 2005/38/EC z června 2005 o vzorkování a analytických metodách pro účely oficiální kontroly úrovně fuzariových mykotoxinů v potravinách pro lidskou výživu a Nařízení Komise (ES) č. 856/2005 ze stejného měsíce, doplňující Nařízení Komise (ES) č. 466/2001 o limitech pro fuzariové mykotoxiny. Pro DON v nezpracovaném a neupraveném obilí je maximální limit 1250 µg/kg, v mouce 750 µg/kg a v potravinách určených pro děti 250 µg/kg. Dalším pozorovaným a regulovaným mykotoxinem je zearalenon s limitem 100 µg/kg v nezpracovaném obilí, 75 µg/kg v mouce a 20 µg/kg v potravinách pro děti. Aktuální pro české producenty potravinářské pšenice jsou od roku 2006 přebíraná pravidla společného evropského trhu s obilovinami s definovanými podmínkami intervenčního nákupu, který se nyní řídí novelou Nařízení komise (ES) č. 1068/2005 (novelizuje Nařízení Komise (ES) č. 824/2000). Členským státům Evropské unie novela ukládá povinné kontrolování limitu kontaminujících látek u obilovin v rámci intervenčního nákupu ze sklizně 2005/2006. Výše uvedená povinnost se týká intervenčních agentur členských států Evropské unie včetně agentury SZIF, která zajišťuje intervenční nákup pšenice v ČR. Za zástupce výskytu ostatních mykotoxinů bývá považován deoxynivalenol. To znamená, že v místech, kde byla zjištěna vysoká koncentrace DON, mohou být přítomny i ostatní mykotoxiny (Váňová, Nedělník a kol., 2007). Základními harmonizovanými a přímo použitelnými právními předpisy pro kontrolu obsahu mykotoxinů v potravinách, pomineme-li zásady správné zemědělské a výrobní praxe, které jsou řešeny formou doporučení Komise jsou: a) Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, 33

35 b) Nařízení Komise (ES) č. 401/2006, kterým se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro kontrolu množství mykotoxinů v potravinách, c) Nařízení Komise (ES) č. 1152/2009, kterým se stanoví zvláštní podmínky dovozu některých potravin z některých třetích zemí v důsledku rizika kontaminace aflatoxiny, d) Nařízení Komise (ES) č. 669/2009, kterým se provádí nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004, pokud jde o zesílené kontroly dovozu některých krmiv a potravin jiného než živočišného původu, a kterým se mění rozhodnutí 2006/504/ES (Feriancová, 2010). V současné době se kontrola mykotoxinů přesunula více k počátku potravinového řetězce, k výrobcům, dovozům a velkoobchodům. Byla také zahájena kontrola některých potravin dovážených ze třetích zemí. Jedná se zejména o suché skořápkové plody a sušené ovoce, u nichž se vyskytuje vyšší riziko kontaminace aflatoxiny. Tab. 6 Limity mykotoxinů v obilovinách a z nich vyrobených produktech ((ES) č. 856/2005). Mykotoxiny Surovina/potravina Maximáln í obsah Aflatoxin B kukuřice, která má být před použitím k lidské spotřebě nebo jako potravinová složka tříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena 5 µg/kg Suma aflatoxinů kukuřice, která má být před použitím k lidské spotřebě nebo jako 10 µg/kg B a G potravinová složka tříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena Ochratoxin A nezpracované obiloviny, 5 µg/kg produkty pocházející z nezpracovaných obilovin s výjimkou těch, 3 µg/kg které jsou určeny dětem nebo pro speciální účely Deoxynivalenol nezpracovaná kukuřice 1750 µg/kg obiloviny určené k přímé lidské spotřebě, obilná mouka, těstoviny, 750 µg/kg otruby ve formě konečného výrobku uváděného na trh a klíčky, s výjimkou potravin určených pro děti pečivo běžné, jemné a trvanlivé, sušenky a snídaňové cereálie 500 µg/kg obilné příkrmy pro kojence a malé děti 200 µg/kg Zearalenon nezpracovaná kukuřice 200 µg/kg kukuřice, určená k přímé lidské spotřebě, kukuřičná mouka, krupice 200 µg/kg a klíčky, rafinovaný kukuřičný olej pečivo běžné, jemné a trvanlivé, sušenky a snídaňové cereálie 50 µg/kg obilné příkrmy pro kojence a malé děti 20 µg/kg Fumonisiny nezpracovaná kukuřice

36 µg/kg kukuřičná mouka, krupice a klíčky, rafinovaný kukuřičný olej 1000 µg/kg kukuřičné potraviny k přímé spotřebě 400 µg/kg kukuřičné příkrmy pro kojence a malé děti 200 µg/kg 35

37 4 ZÁVĚR V práci jsou popsány vláknité mikroskopické houby, které jsou producenty mykotoxinů. Zaměřila jsem se na jejich obecnou charakteristiku, morfologickou stavbu, rozmnožování a také podmínky růstu, které ovlivňují velkou mírou produkci mykotoxinu. U jednotlivých mykotoxinů je popsán jejich původ a houba, která je produkuje. Většina mykotoxinů má negativní vliv na lidské zdraví. Jsou karcinogenní, neurotoxické, hepatotoxické a některé mohou způsobit i smrt. Je důležité vědět, že jeden mykotoxin může být produkován více mikroskopickými houbami a také naopak, jedna houba může produkovat více druhů mykotoxinů. V práci jsem se zaměřila na mykotoxiny, které se objevují v obilovinách nejvíce. Je to především deoxynivalenol, jehož limitní obsah v nezpracovaném obilí je 1250 µg/kg a také zearalenon, který vyniká svojí estrogenní aktivitou. Dalšími významnými mykotoxiny jsou například aflatoxiny, ochratoxiny, patulin, trichothecény a další. Po konzumaci potraviny, která obsahuje mykotoxin, dochází k onemocnění, tzv. mykotoxikóze. Každý toxin se projevuje jinými příznaky a vyvolává odlišné onemocnění. Dříve byla tato onemocnění záhadou, protože nebyl vysvětlen původ a často se spojovala s čarodějnictvím a nadpřirozenými silami. Základem prevence výskytu a eliminace mykotoxinů v rostlinných produktech je dodržení zásad správné zemědělské a zpracovatelské praxe. Je nutné zrno správně dosoušet a uchovávat při správné teplotě a vlhkosti. Důležitý je účinný systém kontroly, který zamezuje vstupu kontaminované suroviny do potravinového řetězce. Ke snížení počtu mykotoxinů v obilovinách je účinně využíváno také třídění a čištění zrna, kdy dochází k separaci zlomků, nečistot a lehčích obilek, které většinou obsahují nejvíce mykotoxinu. Neméně významné je správné stanovení mykotoxinů při podezření výskytu například v krmivu. V současné době se využívá několik metod, z nichž nejdůležitější je metoda kapalinové chromatografie a ELISA. Není náhodou, že se téměř všechny plísně, které produkují mykotoxiny, nachází právě na obilovinách. Uvádí se, že téměř 25 % všech konzumovaných potravin je kontaminováno plísněmi, proto je důležitá znalost legislativy, která upravuje limitní množství v krmivech, surovinách i potravinách a zabraňuje tak nadměrné konzumaci mykotoxinů a jejich negativním dopadům na lidské zdraví. Závěrem bych chtěla upozornit na to, že jsou limity legislativně nastaveny tak, že nehrozí žádné výrazné nebezpečí. 36

38 PŘÍLOHA Možnost výskytu mykotoxinů v zaplísněném chlebu ( Výskyt fuzárií na klasech ( 37