HER2 IQFISH pharmdx Kód K5731

Transkript

1 HER2 IQFISH pharmdx Kód K vydání HER2 IQFISH pharmdx je přímou analýzou in situ fluorescenční hybridizace (FISH) ke kvantitativnímu stanovení amplifikace genu HER2 v tkáních karcinomu prsu a tkáních pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Tato analýza je určena ve spojení s testem HercepTest k hodnocení pacientů, u kterých je zvažována léčba látkou Herceptin. Souprava obsahuje činidla postačující na 20 testů. ( ) P04090CZ_01_K / str. 1/60

2 Obsah Strana Použití... 4 Souhrn a vysvětlení prs... 5 Princip metody prs... 5 Činidla prs... 5 Dodávané materiály... 5 Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky... 7 Bezpečnostní opatření prs... 7 Skladování prs Příprava vzorku prs Řezy zalité v parafínu NÁVOD K POUŽITÍ prs A. Příprava činidla prs A.1 Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution A.2 Strigentní promývací pufr Wash Buffer A.3 Promývací pufr Wash Buffer A.4 Etanolová řada A.5 Roztok pepsinu B. Postup barvení prs B.1 Poznámky k postupu B.2 Úprava tkání před barvením B.3 Protokol barvení Kontrola kvality prs Interpretace zabarvení prs Omezení prs Charakteristiky účinnosti prs Analytická citlivost Analytická specifičnost Studie odolnosti Opakovatelnost Reprodukovatelnost Klinické využití Řešení problémů prs Příloha 1 prs Příloha 2 prs Příloha 3 prs Souhrn a vysvětlení žaludek Princip metody žaludek ( ) P04090CZ_01_K / str. 2/60

3 Činidla žaludek Dodávané materiály Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Mikroskopické vybavení a příslušenství Bezpečnostní opatření žaludek Skladování žaludek Příprava vzorku žaludek Řezy zalité v parafínu NÁVOD K POUŽITÍ žaludek A. Příprava činidla žaludek A.1 Roztok pro předběžnou úpravu A.2 Stringentní promývací pufr Wash Buffer A.3 Promývací pufr Wash Buffer A.4 Etanolová řada A.5 Roztok pepsinu B. Postup barvení žaludek B.1 Poznámky k postupu B.2 Úprava tkání před barvením B.3 Protokol barvení Kontrola kvality žaludek Interpretace zabarvení žaludek Omezení žaludek Charakteristiky účinnosti žaludek Analytická citlivost Analytická specifičnost Studie odolnosti Opakovatelnost Reprodukovatelnost Klinické využití Řešení problémů žaludek Příloha 4 žaludek Příloha 5 žaludek Příloha 6 žaludek Příloha 7 žaludek Literatura Vysvětlení symbolů ( ) P04090CZ_01_K / str. 3/60

4 Použití In vitro diagnostikum. HER2 IQFISH pharmdx je přímá fluorescenční in situ hybridizační (FISH) analýza navržená ke kvantitativnímu stanovení amplifikace genu HER2 ve formalínem fixovaných, do parafínu zalitých (FFPE) vzorků tkáně nádoru prsu a vzorků FFPE pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. HER2 IQFISH pharmdx je určen ve spojení s výrobkem HercepTest jako pomůcka v hodnocení pacientů, u kterých byla zvažována léčba přípravkem Herceptin (trastuzumab), (viz příbalový leták k výrobku Herceptin ). U pacientů s rakovinou prsu jsou výsledky testu HER2 IQFISH pharmdx určeny pro doplnění klinickopatologických informací, v současné době používaných k odhadu prognózy u stadia II, u pacientů s rakovinou prsu a pozitivitou uzlin. Adenokarcinom žaludku, včetně gastroezofageálního spojení, je v tomto dokumentu uváděn také jako rakovina žaludku. Použití pro rakovinu prsu, viz strany Použití pro rakovinu žaludku, viz strany Důležitá informace: Povšimněte si rozdílů u tkáně rakoviny prsu a tkáně rakoviny žaludku, zejména v částech Interpretace zabarvení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 4/60

5 Rakovina prsu Souhrn a vysvětlení prs Lidský gen HER2 (známý také jako ERBB2 nebo NEU) je umístěn na chromozomu 17 a kóduje protein HER2 nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový receptor s tyrozin-kinázovou aktivitou s homologií na receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1)(1-2). Gen HER2 je ve všech normálních diploidních buňkách přítomný ve 2 kopiích. U části pacientů s karcinomem prsu je gen HER2 amplifikován jako část maligní transformace a nádorové progrese (3-8). Amplifikace genu HER2 obvykle vede k nadměrné expresi proteinu HER2 na povrchu buněk rakoviny prsu (9). Amplifikace genu HER2 a/nebo nadměrná exprese jeho proteinu byla prokázána ve % karcinomů prsu. Tato nadměrná exprese je spojena s horší prognózou, zvýšeným rizikem rekurence a kratší dobou přežití. Několik studií prokázalo, že stav HER2 koreluje s citlivostí nebo rezistencí k některým chemoterapeutickým režimům (10). Průkaz nadměrné exprese proteinu HER2 nebo amplifikace genu HER2 je nezbytný pro zahájení léčby přípravkem Herceptin, monoklonální protilátkou proti proteinu HER2. Klinické studie ukázaly, že pro pacienty, jejichž nádory vykazují nadměrnou expresi proteinu HER2 nebo amplifikaci genu HER2, je léčba látkou Herceptin nejvíce prospěšná (11). Princip metody prs HER2 IQFISH pharmdx obsahuje všechna základní činidla nezbytná k provedení metody FISH na formalínem fixovaných, do parafínu zalitých vzorcích tkáňových řezů. Po odstranění parafínu a rehydrataci jsou vzorky zahřívány v roztoku pro předběžnou úpravu, následuje proteolytické natrávení za použití pepsinu. Po předběžné úpravě zahříváním a proteolytickým štěpením využívá kit směs netoxických sond IQISH Probe Mix k přímému použití, založenou na kombinaci technologií PNA (peptid nukleová kyselina) (12) a DNA. Směs sond Probe Mix je tvořena směsí DNA sond značených texaskou červení, pokrývajících oblast o 218 kb, včetně genu HER2, na chromosomu 17 a směsí fluoresceinem značených PNA sond zaměřených na centromerické oblasti chromosomu 17 (CEN-17). Výsledkem této specifické hybridizace zaměřené proti dvěma cílovým místům je tvorba zřetelného červeného fluorescenčního signálu v oblasti lokusu genu HER2 a zřetelného zeleného fluorescenčního signálu v každém centromeru chromozomu 17. Po důkladném promytí jsou vzorky montovány za použití fluorescenčního montovacího média Fluorescence Mounting Medium obsahujícího DAPI a zakryty krycím sklíčkem. Za použití fluorescenčního mikroskopu vybaveného vhodnými filtry (viz Příloha č. 3) jsou lokalizovány rakovinové buňky a je proveden výpočet červených (HER2) a zelených (CEN-17) signálů. Poté se vypočte poměr HER2/CEN-17. Normální buňky v analyzované tkáni poslouží jako vnitřní pozitivní kontrola předběžné úpravy a účinnosti hybridizace. Více informací naleznete v části Interpretace zabarvení. K interaktivnímu e-learningu použijte program HER2 IQFISH pharmdx vytvořený za účelem poskytnout laboratorním technikům, patologům a vědeckým pracovníkům přesné a rychlé informace, jak dosáhnout optimálních výsledků pomocí soupravy HER2 IQFISH pharmdx : Činidla prs Dodávané materiály Materiály uvedené níže postačí na 20 testů (jeden test je definován jako cílová oblast o velikosti 22 mm x 22 mm). Počet testů vychází z použití 250 µl na sklíčko lahvičky 2A (5 8 kapek), 10 µl na sklíčko lahvičky 3 a 15 µl na sklíčko lahvičky 5. Roztoky v lahvičce 3 a 5 jsou viskózní a je možné, že bude potřeba je krátce odstředit v mikrocentrifuze, aby se shromáždilo všechno dodané činidlo. ( ) P04090CZ_01_K / str. 5/60

6 Rakovina prsu Kit obsahuje dostatek materiálů na 10 samostatných cyklů barvení (čtyři oddělené cykly, pokud se používá pepsinová metoda ponořování). HER2 IQFISH pharmdx se dodává na suchém ledu. Suchý led musí být přítomen až do převzetí, aby bylo zajištěno, že komponenty kitu nebudou vystaveny vysokým teplotám během přepravy. Upozorňujeme, že některé součásti kitu mohou zůstat rozmražené, toto neovlivní výkonnost kitu HER2 IQFISH pharmdx. Lahvička 1 Lahvička 2A Lahvička 2B Lahvička 3 Lahvička 4 Lahvička 5 Lahvička 6 Roztok pro předběžné zpracování (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný Pufr MES (2-[N-morfolino]etansulfonická kyselina). Pepsin 4 x 6,0 ml, k okamžitému použití Roztok pepsinu, ph 2,0; obsahuje stabilizátor a antimikrobiální prostředek. Ředící roztok pepsinu (10x) 24 ml, 10x koncentrovaný Ředicí pufr, ph 2,0; obsahuje antimikrobiální látku. Směs sond HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, k přímému použití Směs sond značených texaskou červení HER2 DNA a sond značených fluoresceinem CEN-17 PNA; dodávané v hybridizačním pufru IQISH. Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný SSC (saline-sodium citrate) pufr s detergentem (Tween-20). Fluorescenční montovací médium 0,4 ml, k přímému použití Fluorescenční montovací médium s 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Promývací pufr Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentrovaný Tris/HCl pufr. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka 1 tuba, k přímému použití Roztok pro odstranitelné těsnění krycích sklíček. POZNÁMKA: Následující činidla z kitu: Roztok pro předběžnou úpravu (20x), pepsin, ředící roztok pepsinu (10x), stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), fluorescenční montovací médium, promývací pufr Wash Buffer (20x) a těsnící prostředek pro krycí sklíčka je možné nahradit odpovídajícími činidly z kitu Dako Histology FISH Accessory Kit, kód K5799. ( ) P04090CZ_01_K / str. 6/60

7 Rakovina prsu Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Laboratorní činidla Destilovaná nebo deionizovaná voda Etanol, 96% Xylen nebo substituty xylenu Laboratorní vybavení Absorpční ubrousky Nastavitelné pipety Kalibrovaný imerzní teploměr (rozsah C) Kalibrovaný povrchový teploměr (rozsah C) Krycí sklíčka (22 mm x 22 mm) Kleště Digestoř Dako Hybridizer (kód S2450 nebo S2451)* Topný blok nebo hybridizace* Vlhkostní hybridizační komora* Mikrocentrifuga Sklíčka, silanizovaná sklíčka Dako, kód S3003 nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem (viz Příprava vzorků) Barvící nádoby nebo lázně Časový spínač (umožňující intervaly 2 15 minut) Vířivý mixér Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat teplotu 37(±2) C, 63 (± 2) C a 95 C až 99 C) Mikrovlnná trouba se schopností snímání, v případě, že je předběžné zpracování prováděno pomocí mikrovlnné trouby (viz B3. Protokol barvení Krok 1: Předběžná úprava, metoda B) * Jako alternativní metoda k hybridizéru Dako Hybridizer je použití topného bloku nebo hybridizační trouby k denaturaci (66 (±1) C) a hybridizaci (45 (±2) C) spole čně s vlhkostní hybridizační komorou. Mikroskopické vybavení a příslušenství Filtry pro fluorescenční mikroskop: Dvojitý filtr DAPI a FITC/texaská červeň nebo jednoduché filtry FITC a jednoduché filtry na texaskou červeň - viz Přílohu č. 3 pro další podrobnosti. Jako světelný zdroj by se měl použít fluorescenční mikroskop se 100wattovou rtuťovou lampou. S těmito filtry se nedoporučuje používat jiné světelné zdroje. Složka na mikroskopická sklíčka (kartonová přihrádka pro 20 sklíček se sklápěcím víkem nebo podobně). Bezpečnostní opatření prs 1. In vitro diagnostikum. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Roztok Pre-Treatment Solution (20x), nevyžaduje označení nebezpečnosti. Bezpečnostní list (Safety Data Sheet (SDS)) pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 4. Lahvička 2A, Pepsin, obsahuje 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, a <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one a 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Lahvička 2A je označen: ( ) P04090CZ_01_K / str. 7/60

8 Rakovina prsu Nebezpečí H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Může vyvolat alergickou kožní reakci. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste osobu na čerstvý vzduch a ponechte ji v poloze usnadňující dýchání. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 5. Lahvička 2B, Roztok Pepsin Diluent (10x) obsahuje 50-<75% propan-2-ol a 5-<10% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 2B je označen: Nebezpečí H225 Vysoce hořlavá kapalina a páry. H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H336 Může způsobit ospalost nebo závratě. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. P210 Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. 6. Lahvička 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, obsahuje 10-<25% ethylene carbonate a 3- <5% sodium chloride. Lahvička 2B je označen: Varování H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 7. Lahvička 4, Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 4 je označen: H319 H315 Varování Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. ( ) P04090CZ_01_K / str. 8/60

9 Rakovina prsu P280 P264 P305 + P351 + P338 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 8. Lahvička 6, Promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje ), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% trometamol. Lahvička 6 je označen: H319 H315 P280 Varování P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 9. Coverlip Sealant, Těsnící prostředek pro krycí sklíčka, obsahuje 100% benzinová frakce (ropná), hydrogenovaná lehká a má označení: Nebezpečí H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Vysoce hořlavá kapalina a páry. Při požití a vniknutí do dýchacích cest může způsobit smrt. Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. Používejte elektrická, ventilační, osvětlovací zařízení a všechna zařízení pro manipulaci s materiálem vhodná do výbušného prostředí. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Uchovávejte v chladu. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 10. Se vzorky před a po fixaci a veškerým materiálem jim vystaveným by mělo být nakládáno jako s možným zdrojem přenosu infekce a měly by být zneškodňovány za dodržení příslušných bezpečnostních opatření (16). Nikdy nenabírejte činidla do pipety ústy a zamezte styku činidel a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se činidla dostanou do styku s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 11. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, abyste zabránili chybným výsledkům. 12. Nedodržení inkubačních dob, teplot nebo metod může vést k chybným výsledkům. ( ) P04090CZ_01_K / str. 9/60

10 Rakovina prsu 13. Jiné než předepsané metody fixace tkáně a tloušťky vzorků mohou způsobit ztrátu morfologie tkáně nebo změnit intenzitu signálu. 14. Zamezte vypařování směsi sond HER2/CEN-17 během hybridizace zajištěním dostatečné vlhkosti v hybridizační komůrce. 15. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit chybnou účinnost. 16. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. Další informace naleznete v bezpečnostním listu o materiálech (SDS). 17. Pro metodu pepsinového ponoření se musí používat pouze čisté barvicí nádoby (krok 2, metoda C). Skladování prs Směs sond HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (lahvička 3) uchovávejte při teplotě -18 C v temnu. Všechna ostatní činidla uchovávejte při teplotě 2 8 C v temnu. Všechna činidla snáší uchovávání v mrazničce. Zmrazování a rozmrazování činidel až 10krát neovlivňuje výkonnost. Pepsin, směs sond HER2/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 2, 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny působením tepla. Neponechávejte tyto komponenty při pokojové teplotě. Směs sond HER2/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny při vystavení nadměrnému působení světla. Neuchovávejte tyto součásti nebo neprovádějte analýzu při silném světle, jako je přímé sluneční světlo. Nepoužívejte soupravu po uplynutí data exspirace, které je vyznačené na krabici soupravy. Pokud jsou činidla uchovávána za jiných podmínek, než jsou stanoveny v příbalovém letáku v tomto balení, musí uživatel validovat jejich výkonnost (14). Neexistují žádné zjevné známky toho, že by byl tento produkt nestabilní. Proto je důležité vyhodnotit normální buňky v analyzovaném tkáňovém řezu. Pokud dojde k nečekanému vzoru fluorescence, který nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech a máte-li podezření na problém s kitem HER2 IQFISH pharmdx, kontaktujte technické služby společnosti Dako. Příprava vzorku prs Se vzorky pro biopsie, excize a resekce je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro FISH analýzy. U všech vzorků by měly být použity standardní metody zpracování tkání pro imunohcytochemické barvení (15). Řezy zalité v parafínu K použití jsou vhodné pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu. Vzorky by měly být například bločkovány na tloušťku 3 nebo 4 mm a fixovány po dobu hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Tkáně jsou poté dehydrovány vzestupnou etanolovou a xylenovou řadou a následně infiltrovány rozpuštěným parafínem za teploty nižší než 60 C. Pokud jsou správně fixované a zalité tkáně uchovávány na chladném místě (15 25 C), vydrží před krájením a montováním na sklíčko neomezeně dlouhou dobu (15-16). Jiná fixativa nejsou vhodná. Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce asi 4 6 µm. Sklíčka pro analýzu amplifikace HER2 genu a ověření přítomnosti nádoru by měla být připravována zároveň. Je doporučeno provést nejméně 2 řezy, 1 řez na přítomnost nádoru, barvený hematoxylinem a eosinem (H a E barvení) a 1 řez pro analýzu amplifikace HER2 genu. Tkáňové řezy je doporučeno montovat na silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003, nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem. Pokud jsou vzorky uchovávány za pokojové teploty (20 25 C), měly by být analyzovány do 4 6 měsíců po krájení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 10/60

11 Rakovina prsu NÁVOD K POUŽITÍ prs A. Příprava činidla prs Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution V lahvičce 1 se mohou objevit krystaly, ale ty se při pokojové teplotě rozpustí. Před přípravou činidel zkontrolujte, zda se v nich nevyskytují krystaly. Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 1 (roztok pro předběžné zpracování 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Strigentní promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 4 (stringentní promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.3 Promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 6 (promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Naředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.4 Etanolová řada Z roztoku 96% etanolu připravte 3 nádobky o koncentracích etanolu 70 %, 85 %, resp. 96 %. Zakryté nádoby skladujte při pokojové teplotě nebo při 2 8 C a použijte pro maximálně 200 podložních skel. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. A.5 Roztok pepsinu Roztok pepsinu je potřebný pouze, když se používá pepsinová metoda ponořování (metoda C). Pepsinový roztok se připravuje následujícím způsobem. Pro nádobu s kapacitou šesti sklíček připravte 60 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 48 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Pro nádobu s kapacitou 24 sklíček připravte 240 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 192 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zahřátý roztok pepsinu se musí použít během 5 hodin. ( ) P04090CZ_01_K / str. 11/60

12 Rakovina prsu B. Postup barvení prs B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl pečlivě přečíst tyto pokyny a před použitím se dobře seznámit se všemi součástmi. (viz Bezpečnostní upozornění). U všech činidel by mělo dojít před použitím k vyvážení na odpovídající teplotu následujícím způsobem: Lahvička 1: Zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na C, je-li použita vodní lázeň pro předběžné zpracování (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda A). Je-li pro předběžnou úpravu používána mikrovlnná trouba se schopností snímání (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda B) zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Lahvička 2A: Pepsin se aplikuje při teplotě 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2: metoda A a B) a udržovat stále chladný. Lahvička 2B: Ředicí roztok pepsinu (10x) se aplikuje při teplotě 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2: metoda C). Lahvička 3: Směs sond HER2/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C ) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. Lahvička 4: Naředěný stringentní promývací pufr Wash Buffer; před použitím by jedna nádobka měla být vyvážena na pokojovou teplotu, další nádobka na 63 (±2) C. Lahvička 5: Fluorescenční montovací médium může být aplikováno při jakékoli teplotě od 2 25 C. Lahvička 6: Zředěný promývací pufr Wash Buffer by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka může být aplikován při teplotě od 2 25 C. Všechny kroky musí být prováděny při uvedené teplotě. Postup zahrnuje počet dehydrací následovaných vysoušením tkáňových řezů. Ujistěte se, že tkáňové řezy jsou před provedením dalšího kroku úplně suché. V průběhu dalších kroků nenechejte tkáňové řezy vyschnout. Pokud musí být proces barvení přerušen, mohou být sklíčka po odstranění parafínu v kroku 1 uchovávána v promývacím pufru Wash Buffer až 1 hodinu při pokojové teplotě (20 25 C), aniž by došlo k ovlivnění výsledků. B.2 Úprava tkání před barvením Odstraňovaní parafínu a rehydratace: Před provedením analýzy musí být ze sklíček s tkáněmi odstraněn parafín, aby se odstranilo zalévací médium, a potom sklíčka rehydratovat. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní sklíčka do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 96 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 70 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl A.3) na minimálně 2 minuty. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.3, krok 1, Předběžné zpracování. ( ) P04090CZ_01_K / str. 12/60

13 Rakovina prsu Roztoky xylenu a alkoholu by měly být vyměněny po zpracování 200 nebo méně sklíček. Mohou být použity substituty xylenu. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie. B.3 Protokol barvení Krok 1: Předběžné zpracování Předběžná úprava může být prováděna ve vodní lázni, viz metoda A) nebo jako alternativa, mikrovlnná trouba se schopností snímání, metoda B). Metoda A: Předběžné zpracování při použití vodní lázně Naplňte barvící nádobky, např. Coplinovy nádobky, zředěným roztokem pro předběžné zpracování (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvicí nádoby obsahující zředěný roztok pro předběžné zpracování do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný roztok pro předběžné zpracování na C. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín, při pokojové teplotě do předehřátého roztoku pro předběžné zpracování v nádobách na barvení. Zkontrolujte teplotu a inkubujte po dobu 10 (±1) minut při teplotě C. Vyjměte celou nádobku se sklíčky z vodní lázně. Odstraňte víčko a nechte sklíčka po dobu 15 minut chladit v roztoku pro předběžné zpracování při pokojové teplotě. Přemístěte sklíčka do nádobky se zředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. POZNÁMKA: Roztok pro předběžné zpracování je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Metoda B: Předběžné zpracování prováděné v mikrovlnné troubě se schopností snímání Naplňte plastovou nádobu naředěným roztokem pro předběžné zpracování pokojové teploty (20 25 C). Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku pro předběžné zpracování, zakryjte nádobu víkem s otvory a umístěte ji do mikrovlnné trouby. Zvolte funkci vaření se snímačem a program, který běží po dobu 10 minut poté, co bylo dosaženo teploty bodu varu*. Po 10 minutách inkubace vyjměte nádobu se sklíčky z trouby, sejměte víko a nechejte ochladit 15 minut při pokojové teplotě. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným pufrem Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte naředěný promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. * Použití mikrovlnné trouby s funkcí snímání znamená, že trouba musí obsahovat snímač a program, který nejprve zahřeje roztok pro předběžné zpracování k bodu varu a potom udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) a zároveň odečítá nastavený čas (10 (±1) minut). Některé modely mikrovlnných trub s funkcí snímání nemají možnost nastavení odečítání času. Pokud model zahrnuje pouze předem nastavené programy, je potřeba zvolit program, který udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) po dobu nejméně 10 (±1) minut a manuálně ukončit program po 10 (±1) minutách. POZNÁMKA: Roztok k předběžnému zpracování je určen k aplikaci pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Pepsin, připravený k okamžitému použití (ready-to-use, RTU) nebo roztok pepsinu ( ) P04090CZ_01_K / str. 13/60

14 Rakovina prsu Inkubace pepsinem se může provádět přímo použitím kapek pepsinu RTU na sklíčka při pokojové teplotě (20 25 C) (metoda A) nebo při 37 C (metoda B). Sklíčka se také mohou ponořit do roztoku pepsinu a inkubovat při 37 (±2) C (metoda C). Metoda A a metoda B: Přebytek pufru oklepejte. Použijte materiál nezanechávající chloupky (jako např. absorpční ubrousek nebo gázový tampon), opatrně otřete okolí vzorku, aby se odstranila zbývající tekutina a aby se činidla udržela v předepsané oblasti. K zakrytí vzorku aplikujte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Pepsin uchovávejte vždy při 2 8 C. Metoda A: Pepsin, RTU inkubace při teplotě C Inkubujte po dobu 5 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Inkubační doba 5 15 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte naředěný promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Metoda B: Pepsin, RTU inkubace při teplotě 37 C Vzorky s pepsinem vložte na topný blok při 37 C např. Dako Hybridizer a inkubujte 3 5 minut. Inkubační doba 3 5 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Metoda C: Roztok pepsinu - ponoření sklíček do pepsinového roztoku o teplotě 37 C Kit obsahuje činidla postačující na čtyři jednotlivé cykly (60 ml roztoku pepsinu, malá nádobka na šest sklíček) nebo na jeden cyklus (240 ml roztoku pepsinu, velká nádoba na 24 sklíček). Roztok pepsinu připravte podle návodu v části A.5. Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zkontrol ujte, zda je teplota stabilní. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přebytek promývacího pufru Wash Buffer oklepejte. Sklíčka ponořte do pepsinového roztoku o teplotě 37 (±2) C a inkubujte po dobu minut. Inkubační doba minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na fixaci tkání nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85 % etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Krok 3: Směs sond HER2/CEN-17 IQISH Směs sond HER2/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C ) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ( ) P04090CZ_01_K / str. 14/60

15 Rakovina prsu ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. Aplikujte 10 µl směsi sond HER2/CEN-17 (lahvička 3) do středu tkáňového řezu. Ihned překryjte směs sond krycím sklíčkem 22 mm x 22 mm a nechejte směs pod sklíčkem rovnoměrně rozprostřít. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud se vytvoří bublinky vzduchu, jemně je vyklepejte pomocí pinzety. Nezapomeňte ihned po použití uložit lahvičku 3 při teplotě -18 C. Krycí sklíčko utěsněte těsnícím prostředkem vytlačením těsnícího prostředku podél obvodu krycího sklíčka. Překryjte těsnícím prostředkem krycí sklíčko k podložnímu uhnětením těsnícího prostředku kolem krycího sklíčka. Zajistěte, aby těsnící prostředek pro krycí sklíčka pokryl celou hranu krycího sklíčka. Připravte Dako Hybridizer* (kód S2450 nebo S2451) na hybridizační cyklus. Zkontrolujte, zda jsou kontrolní proužky Humidity Control Strips (kód S2452) saturované a optimální pro použití. Spusťte hybridizér a zvolte program, který: Bude denaturovat při teplotě 66 C po dobu 10 minuta potom hybridizovat při teplotě 45 C po dobu minut. Sklíčka umístěte do hybridizéru, zkontrolujte, zda je víko dobře uzavřené a spusťte program. Podrobné informace naleznete v návodu k použití hybridizéru Dako Hybridizer. * K denaturaci a hybridizaci lze použít vybavení odpovídající výše popsaným podmínkám: Umístěte sklíčka na rovnou kovovou nebo kamennou plochu (topný blok nebo do hybridizační trouby) předehřátou na 66 (±1) C. Denaturujte po dobu přesně 10 minut. Umístěte podložní skla do předehřáté vlhkostní hybridizační komory. Zakryjte komůrku víčkem a inkubujte při teplotě 45 (±2) C po dobu minut. Teplota hybridizace 37 C nen í vhodná pro použití se sondami v tomto kitu. Krok 4: Stringentní promývání Naplňte dvě barvící nádobky, např. Coplinovy, zředěným pufrem pro důkladné promytí (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Pro každé sklíčko v každé nádobce je doporučen minimální objem 100 ml nebo 15 ml. Umístěte jednu z barvících nádobek se zředěným stringentním promývacím pufrem Wash Buffer při pokojové teplotě do digestoře a druhou do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný stringentní promývací pufr Wash Buffer na 63 (±2) C. Zajistěte ustálení teploty. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Kalibrovaným teploměrem měřte teplotu v nádobce s vodní lázní, aby dosáhla správné výše. Stringentní promývací pufr Wash Buffer obsahuje detergent a při 63 C se může zkalit; toto neovlivní výsledek. Použijte pinzetu nebo rukavice a vyndejte sklíčka z hybridizační komůrky a opatrně odstraňte těsnící prostředek a krycí sklíčko a umístěte sklíčka jedno po druhém do předmývací nádobky o pokojové teplotě. Jakmile byla odstraněna všechna krycí sklíčka, přeneste podložní sklíčka z pokojové teploty, předmývací nádobu do nádoby s teplotou 63 (±2) C do vodní lázně. Ihned po přenesení sklíček do lázně zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer o teplotě 63 (±2) C je třeba spustit časovač. Důkladné promývání provádějte přesně 10 minut. Vyndejte sklíčka ze zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer a po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C) řezy máčejte ve zředěném promývacím pufru Wash Buffer. Vyměňte naředěný Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy úplně vyschnout. Krok 5: Montáž Na cílovou oblast sklíčka aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média obsahujícího DAPI (lahvička 5) a přikryjte krycím sklíčkem. ( ) P04090CZ_01_K / str. 15/60

16 Rakovina prsu POZNÁMKA: Podložní skla lze číst po 15 minutách nebo během 7 dnů po montáži. Pokud jsou však sklíčka vystavena světlu nebo vysokým teplotám, může se objevit vyblednutí. Pro minimalizaci blednutí sklíček je uchovávejte ve tmě při teplotě C. ( ) P04090CZ_01_K / str. 16/60

17 Rakovina prsu Kontrola kvality prs 1. Signály musí být světlé, výrazné a snadno hodnotitelné. 2. Normální buňky umožňují vnitřní kontrolu barvicího cyklu. Normální buňky by měly mít 1 2 jasně zřetelné zelené signály poukazující na to, že sonda CEN-17 PNA byla úspěšně hybridizována na centromerickou oblast chromozomu 17. Normální buňky by měly také mít 1 2 jasně zřetelné červené signály poukazující na to, že sonda HER2 DNA byla úspěšně hybridizována na amplikon HER2. V důsledku krájení tkáně budou mít některé normální buňky méně než 2 očekávané signály každé barvy. Selhání detekce signálů v normálních buňkách indikuje selhání testu a výsledky by měly být považovány za neplatné. 3. Pokud se při hodnocení používá filtr DAPI, musí být jaderná morfologie intaktní. Četné jakoby průhledné buňky a obecně špatná jaderná morfologie indikují nadměrné natrávení vzorku, což může mít za následek ztrátu nebo fragmentaci signálů. Takové vzorky by měly být považovány za neplatné. 4. Rozdíly ve fixaci tkání, zpracování a zalití tkání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Interpretace zabarvení prs Hodnotitelná tkáň Testovány by měly být pouze vzorky pacientů s invazivním karcinomem. V případě výskytu karcinomu in situ a invazivního karcinomu ve stejném vzorku se hodnotí pouze invazivní komponenta. Vyhněte se oblastem s těžkým zánětem, nekrotickým oblastem a oblastem, kde jsou nukleové hranice nejasné. Nezahrnujte jádra, která vyžadují subjektivní posouzení. Vynechejte jádra se slabou intenzitou signálu a nespecifickým nebo přílišným pozadím. Výpočet signálů: Lokalizujte nádor v rámci celého sklíčka barveného H a E a zhodnoťte stejnou oblast na sklíčku barveném FISH. Zběžně prohlédněte několik oblastí s nádorovými buňkami, aby byla zhodnocena případná heterogenita. Vyberte oblast s dobrou distribucí jader. Při analyzování začněte v horním levém kvadrantu zvolené oblasti a po zběžném prohlédnutí zleva doprava spočítejte množství signálů na ploše každého hodnoceného jádra podle návodu uvedeného níže (viz také Příloha č. 3). - Postupujte shora dolů a hledejte všechny signály v jednotlivých jádrech. - Počítejte dva signály, které jsou stejně velké a vzdálené od sebe stejně nebo méně než je průměr signálu, jako pouze jeden signál. - V jádrech s vysokými hladinami amplifikace genu HER2 mohou být signály HER2 lokalizovány těsně vedle sebe a mohou vytvářet shluk signálů. V těchto případech není možno množství signálů HER2 spočítat, ale musí se odhadnout. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zeleným signálům, protože shluky signálů HER2 mohou překrýt zelené signály a učinit je tak neviditelnými. V případě pochybností prosím zkontrolujte zelené signály použitím specifického filtru FITC. Nezaznamenávejte jádra bez signálů nebo se signály jen jedné barvy. Zaznamenejte pouze ta jádra, která vykazují jeden nebo více FISH signálů každé barvy. ( ) P04090CZ_01_K / str. 17/60

18 Rakovina prsu Návod pro počítání signálů 1 Nepočítejte. Jádra se překrývají, nejsou viditelné všechny oblasti jader. 2 Dva zelené signály, nezaznamenávejte jádra se signály jen jedné barvy. 3 Počítejte jako 3 zelené a 12 červených signálů (odhadování shluku) 4 Počítejte jako 1 zelený a 1 červený signál. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 5 Nepočítejte (jádra s nadměrným nebo malým nebo proteolytickým štěpením). Chybějící signály ve středu jádra (jádro ve tvaru koblihy). 6 Počítejte jako 2 zelené a 3 červené signály. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 7 Počítejte jako 1 zelený a 5 červených signálů. 8 Počítejte jako 3 zelené (1 zelený mimo ohnisko) a 3 červené signály. 9 Shluk červených signálů skrývající zelené signály, zkontrolujte zelené signály specifickým filtrem FITC nebo nepočítejte. Zapište počty do tabulky, jak je ukázáno v Příloze č. 2. Spočítejte 20 jader u každého tkáňového vzorku, pokud možno ze zřetelných nádorových oblastí (17). Spočítejte poměr HER2/CEN-17 vydělením celkového počtu červených signálů HER2 celkovým počtem zelených signálů CEN-17. Vzorky s poměrem HER2/CEN-17 vyšším nebo rovným 2 by měly být pokládány za pozitivní pro amplifikaci genu HER2 (5, 17-19). Výsledky odpovídající mezní hodnotě nebo se k ní blížící (1,8 2,2) by měly být interpretovány s opatrností. Pokud je poměr hraniční (1,8 2,2), spočítejte dalších 20 jader a přepočítejte poměr na 40 jader. V případě pochybností by mělo být sklíčko se vzorkem znovu zhodnoceno. U hraničních případů je odůvodněna konzultace patologa s ošetřujícím lékařem. ( ) P04090CZ_01_K / str. 18/60

19 Rakovina prsu Omezení prs 1. FISH je vícestupňový proces, který vyžaduje specializovaný zácvik ve výběru vhodných činidel, stejně jako výběru tkáně, fixace, zpracování a přípravě FISH sklíčka a interpretaci výsledků barvení. 2. Výsledky FISH závisejí na zacházení s tkání a jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, promývání, vysoušení, zahřívání, prořezávání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může ovlivnit hybridizaci sond. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Pro dosažení optimálních a reprodukovatelných výsledků musí být ze sklíček s tkání úplně odstraněn parafín. Odstranění parafínu musí být dokončeno na začátku procesu barvení. (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl B.2). 4. Používána by měla být pouze teplotně kalibrovaná vodní lázeň, topný blok a hybridizační pec. Použití vybavení jiného typu může vést k odpaření směsi sond HER2/CEN-17 během hybridizace a musí být validováno uživatelem. Charakteristiky účinnosti prs Analytická citlivost Citlivost směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byla zkoumána za použití 18 vzorků normálního lidského epitelu prsu. Poměr mezi množstvím signálů HER2 a CEN-17 signálů byl počítán na základě hodnocení 20 jader na jeden vzorek. Poměr signálů HER2/CEN-17 pro těchto 18 vzorků normálního lidského epitelu prsu byl v rozmezí 0,97 1,08. Analytická specifičnost HER2 DNA sondy ve směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byly koncově setříděny a zmapovány, aby bylo potvrzeno celkové pokrytí v rozsahu 218 kb včetně genu HER2. CEN-17 PNA sondy ve směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byly testovány jednotlivě a v kombinaci, aby byla potvrzena jejich specifická hybridizace na centromerickou oblast chromosomu 17. K vyhodnocení schopnosti testu identifikovat pouze cílové substance HER2 a CEN-17 bez interference s jinými substancemi byly provedeny studie na tkáňových vzorcích normálního lidského epitelu prsu za použití lahvičky 3, která obsahuje hybridizační pufr, ale bez směsi sond. Bylo hodnoceno celkem 18 vzorků na přítomnost signálů, které nesouvisejí se směsí sond. V žádném z 18 vzorků nebyla zjištěna detekce jiných cílových chromozomů ani interference s úzce souvisejícími látkami. Studie odolnosti Odolnost analýzy HER2 IQFISH pharmdx byla testována za různých časů a teplot pufru pro předběžné zpracování (mikrovlnná trouba nebo vodní lázeň), časů a metod inkubace s pepsinem (pepsin RTU nebo ponoření), denaturačních časů teplot, časů hybridizace a časů a teplot stringentního promývání. Při níže popsaných experimentálních podmínkách nebyly zaznamenány žádné významné rozdíly ve výsledcích: Metoda A) předběžného zpracování, vodní lázeň 10 minut v kombinaci s každou z teplot 95 C, C a 99 C spole čně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě C. Metoda B) předběžného zpracování, mikrovlnná trouba po dobu 9, 10 a 11 minut při teplotě >95 C. ( ) P04090CZ_01_K / str. 19/60

20 Rakovina prsu Metoda A) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 5, 10 a 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Metoda B) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 3, 4 a 5 minut při teplotě 37 C. Metoda C) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 20, 25 a 30 minut v kombinaci s každou z teplot 35, 37 a 39 C. Denaturace po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 65, 66 a 67 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 66 C. Čas hybridizace 60, 90 a 120 minut při teplotě 45 C. Stringentní promývání po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 61, 63 a 65 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 63 C. Poznámka: Aby byl test důkladný, změnil se v postupu barvení vždy pouze jeden parametr, zatímco ostatní parametry byly konstantní. Doporučujeme držet se časů a teplot uváděných v postupu barvení. Hybridizace v délce 60 minut vedla k vysoké intenzitě signálu, i když v porovnání s hybridizací v délce 90 a 120 minut trochu méně intenzivnímu. U jiných kombinací časů a teplot nebyly pozorovány významné rozdíly ve výsledcích. Postup barvení s HER2 IQFISH pharmdx nabízí proměnné protokolu pro teplotu předběžného zpracování, natrávení pepsinem a časy hybridizace. Každá jednotlivá možnost kombinace byla validována s ohledem na stav genu HER2. Validace byla provedena na 10 vzorcích lidského karcinomu prsu FFPE pro všech 12 možných kombinací. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) byl použit jako reference. Poměr HER2/CEN-17 pro každý jednotlivý vzorek je zobrazen na obrázku 1. Křížová srovnání v tabulkách mezi těmito 12 test a referenčním barvením prokázala všeobecnou shodu ve stavu genu HER2 v 100 % (10/10) s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 78,3 %, resp. 100 %. Hodnota kappa byla 1,00 a McNemarův test neprokázal odchylku (oboustranná p-hodnota 1,00). Obrázek 1. Jednotlivé poměry HER2/CEN-17 pro 10 lidských vzorků karcinomu prsu barvených za použití 12 možných variant kombinací protokolu pomocí HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731) (test 1 12) a pomocí HER2 FISH pharmdx Kit (kód K5331) reference (R). Horizontální přímka zobrazuje mezní hodnotu 2,0. Opakovatelnost Opakovatelnost poměru HER2/CEN-17 byla zjišťována za použití analýzy HER2 IQFISH pharmdx pomocí postupných řezů devíti lidských vzorků karcinomu prsu s neamplifikovaným nebo amplifikovaným stavem genu HER2. Ve stejném cyklu byl každý ( ) P04090CZ_01_K / str. 20/60

21 Rakovina prsu vzorek testován trojmo. Průměrný variační koeficient byl 5,2 % u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 1 % do 8 %) a 14 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 7 % do 20 %). S HER2 IQFISH pharmdx bylo testováno celkem pět konsekutivních vzorků lidského karcinomu prsu s různou tloušťkou (3, 4, 5, 6 a 7 µm). Průměrný variační koeficient poměru HER2/CEN-17 byl 7 % (rozmezí od 6 % do 9 %). Reprodukovatelnost Reprodukovatelnot analýzy HER2 IQFISH pharmdx byla testována mezi jednotlivými šaržemi a mezi jednotlivými vyšetřovateli za použití tří šarží HER2 IQFISH pharmdx a tří vyšetřovatelů. Reprodukovatelnost byla testována na devíti různých vzorcích lidského karcinomu prsu s neamplifikovaným nebo amplifikovaným stavem genu HER2. Průměrný variační koeficient reprodukovatelnosti mezi šaržemi byl 5% u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 2% do 8 %) a 7,8 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 5 % do 11 %). Průměrný variační koeficient reprodukovatelnosti mezi vyšetřovateli byl 3,2 % u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 0,2 % do 6 %) a 2,8 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 2 % do 4 %). Klinické využití Klinické využití Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kód K5331) bylo zkoumáno ve srovnávací studii s kitem Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Studie zahrnovala 150 archivovaných vzorků pacientů, kteří měli buď pozitivní nebo negativní uzliny, s karcinomem prsu, st. II-III. Primárním cílem studie bylo zjištění stupně shody mezi poměrem HER2/centromera chromosomu 17 u 150 vzorků testovaných kity Dako a Vysis, jak ve všeobecné shodě poměrů, tak ve shodě rozdílných výsledků FISH analýzy (skupiny +/- ). Celkem bylo úspěšně hybridizováno a hodnoceno 145 vzorků, které byly tedy vhodné pro statistické zhodnocení. Křížová tabulace typu 2 x 2 s výsledky je uvedena v tabulce 1. Tabulka 1. Rozdílné výsledky 145 vzorků karcinomu prsu testovaných za použití Dako HER2 FISH pharmdx Kit a Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. V každém vzorku bylo hodnoceno 60 jader každým ze dvou kitů. Vysis Kit (-) amplifikovaný Vysis Kit (+) amplifikovaný Dako Kit (-) amplifikovaný Dako Kit (+) amplifikovaný Celkem Celkem Shoda mezi testy Dako a Vysis byla 95 % s intervalem spolehlivosti %. Hodnota kappa byla 0,89. McNemarův test pro zjištění systematické odchylky mezi těmito 2 testy nebyl významný (p=0,22). Obrázek 2 ukazuje rozptylový graf dvojitých hodnocení u 145 vzorků. ( ) P04090CZ_01_K / str. 21/60

22 Rakovina prsu Scatter plot of paired observations 12,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Obrázek vzorků karcinomu prsu testovaných pro amplifikaci genu HER2 za použití Dako HER2 FISH pharmdx Kit a Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Výsledky jsou vyjádřeny poměrem HER2/centromera chromosomu 17. V každém vzorku bylo hodnoceno 60 jader každým ze dvou kitů. Všeobecná shoda mezi testy Dako HER2 FISH pharmdx a Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe byla zkoumána za použití rozdílové analýzy párových pozorování poměrů a lineární regresní analýzy poměru těchto dvou testů. Bylo dosaženo závěru, že rozdíl mezi párovými pozorováními poměrů systematicky narůstá se součtem poměrů HER2/centromer chromosomu 17, a že pro vyšší poměry je poměr měřený testem Dako vyšší než při testu Vysis. Vyšší poměr HER2/centromera chromosomu 17 pozorovaný se sadou Dako HER2 FISH pharmdx Kit může souviset se skutečným rozdílem mezi těmito dvěma testy, například vyšší rozlišení sady Dako HER2 FISH pharmdx Kit vede k vyšším poměrům u případů s vysokou hodnotou amplifikace genu HER2. Jelikož testování kitů bylo prováděno na dvou místech, očekávala se i variace mezi laboratořemi. Navíc byla vyšší variace u případů s vysokou hodnotou amplifikace popsána v literatuře, ale není považována za klinicky významnou (18). Současná studie nedovoluje zkoumání systematických rozdílů mezi těmito dvěma testy mezi mnoha laboratořemi. Je třeba dodat, že pozorovaná variace mezi těmito dvěma testy je podobné velikosti jako variace mezi jednotlivými místy ve studii přenositelnosti. V komparativní studii se 78 tkáňovými vzorky lidského karcinomu prsu byly porovnány výsledky testů Dako HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731) a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kód K5331). Křížová srovnání stavu HER2 v tabulce získaná z těchto dvou ( ) P04090CZ_01_K / str. 22/60

23 Rakovina prsu analýz vyprodukovala všeobecnou shodu 98,7 % s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 94,2 % a 99,9 %. Hodnota kappa byla 0,96 s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 0,89 a 1,00. P-hodnota pro McNemarův test byla 1,00, což znamená, že mezi těmito dvěma analýzami nebyla prokázána odchylka. ( ) P04090CZ_01_K / str. 23/60

24 Rakovina prsu Řešení problémů prs Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Žádné nebo slabé signály 1a. Souprava byla vystavena během přepravy nebo skladování vysokým teplotám. 1a. Zkontrolujte podmínky skladování. Zkontrolujte, zda byl přítomen suchý led, když byla zásilka přijata. Zkontrolujte, zda lahvička 3 byla skladována při teplotě -18 C v temnu. Zkontrolujte, zda lahvičky 2A a 5 byly skladovány při teplotě maximálně 2 8 C v temnu. 1b. Mikroskop nefunguje správně. - Nasazení nesprávného filtru - Nevhodná lampa - Rtuťová lampa je příliš stará - Špinavé nebo prasklé kolektorové čočky - Nevhodný imerzní olej 1b. Zkontrolujte mikroskop a ujistěte se, že použité filtry jsou vhodné pro sadu fluorochromů, a že rtuťová lampa je správná a nebyla použita po ukončení doby životnosti. (viz Příloha č. 3). V případě pochyb kontaktujte svého dodavatele mikroskopů. 1c. Vybledlé signály 1c. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 2. Žádné zelené signály 3. Žádné červené signály 1d. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1e. Vypařování směsi sond během hybridizace 2a. Nesprávné podmínky pro důkladné promytí 3a. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1d. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 1e. Zajistěte dostatečnou vlhkost v hybridizační komůrce 2a. Ujistěte se, že byla dodržena doporučená teplota a doba při důkladném promytí, a že byla krycí sklíčka odstraněna před provedením důkladného promytí. 3a. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 4. Oblasti bez signálu 4a. Příliš malý objem sondy 4a. Zajistěte, aby byl objem sond dostatečný k pokrytí plochy pod krycím sklíčkem 4b. Vzduchové bubliny zachycené během aplikace směsi sond nebo montování 4b. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud vzniknou, jemně je vyklepejte pomocí pinzety ( ) P04090CZ_01_K / str. 24/60

25 Rakovina prsu Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 5. Přílišné zabarvení pozadí 6. Špatná morfologie tkáně 5a. Nevhodná fixace tkáně 5a. Zajistěte, aby byly použity pouze formalínem fixované, do parafínu zalité tkáňové řezy 5b. Parafín není zcela odstraněn 5c. Příliš nízká teplota při důkladném promytí 5d. Příliš dlouhé vystavení hybridizovaného řezu silnému světlu 5b. Postupujte podle kroků odstranění parafínu a rehydratace uvedených v části B.2 5c. Zajistěte teplotu důkladného promytí 63 (±2) C 5d. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 6a. Špatná úprava pepsinem 6a. Používejte doporučené inkubační doby pepsinu. Viz odd. B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda je s pepsinem nakládáno při správné teplotě. Viz část B.1 6b. Nesprávné podmínky předběžné úpravy mohou způsobit nejasný nebo zakalený vzhled 6c. Příliš dlouhé zpracovávání pepsinu nebo velmi tenké řezy mohou způsobit výskyt průhledných buněk. 6b. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 6c. Zkraťte inkubační doby Pepsinu. Viz část B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda tloušťka řezů je v rozsahu 4 6 µm. 7. Vysoká úroveň zelené autofluorescence na sklíčku včetně oblastí bez tkáně FFPE 7. Použití prošlých nebo nevhodných podložních sklíček 7. Zkontrolujte, zda potažené sklíčko (Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo poly- L-lysinem potažené sklíčko) nemá prošlou dobu použitelnosti. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technické služby společnosti Dako. ( ) P04090CZ_01_K / str. 25/60

26 Rakovina prsu Příloha 1 prs HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Kontrolní list protokolu Datum provádění cyklu: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 šarže: Identifikační kód vzorku: Identifikační kód vybavení: Identifikační kód barvicího cyklu: Datum ředění/exspirace promývacího pufru Wash Buffer 1 x (lahvička 6, ředěno 1:20): / Tkáň fixovaná v neutrálním pufrovaném formalínu Ano Ne Krok 1: Předběžné zpracování Datum ředění/exspirace roztoku pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution (ampule 1 ředěná 1:20) Měřená teplota roztoku pro předběžnou úpravu Pre- Treatment Solution, jestliže je vodní lázeň používaná pro ohřívání (95 99 C) Předběžná úprava (10 minut) a chlazení (15 minut) Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Krok 2: Pepsin Trvání úpravy pepsinem (lahvička 2) při pokojové teplotě nebo Trvání úpravy pepsinem (lahvička 2) při pokojové teplotě (20 25 C) nebo Trvání pepsinového ponoření při teplotě 37 (±2) C Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 3: Směs sond HER2/CEN-17 Aplikujte směs sond Probe Mix (ampule 3), opatřete krycím sklíčkem a utěsněte těsnícím prostředkem Coverslip Sealant Naměřená teplota denaturace (66 (±1) C) C Denaturace po dobu 10 minut Naměřená teplota hybridizace (45 (±2) C) C Čas hybridizace ( minut) / C minut minut minut minut ( ) P04090CZ_01_K / str. 26/60

27 Rakovina prsu Krok 4: Stringentní promývání Datum ředění/použitelnosti pufru pro důkladné promytí (lahvička 4, ředěno v poměru 1:20) Naměřená teplota stringentního promývacího pufru Wash Buffer (63 (±2) C) Důkladné promytí (10 minut) po odstranění krycích sklíček Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 5: Montáž Aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média (lahvička 5) a překryjte krycím sklíčkem. / C C minut Poznámky: Datum a podpis, laborant: ( ) P04090CZ_01_K / str. 27/60

28 Rakovina prsu Příloha 2 prs HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Schéma posuzování Identifikační kód (ID) záznamu o cyklu barvení: Datum provádění cyklu: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 šarže: Identifikační kód vzorku: Spočítejte signály ve 20 jádrech Jádro Ć. HER2 skóre (červené) CEN-17 skóre (zelené) Jádro Ć Celkem (1-10) Celkem (11-20) HER2 skóre (červené) CEN-17 skóre (zelené) Pro stanovení poměru HER2/CEN-17 odečtěte počet signálů HER2 a počet signálů CEN-17 ve 20 stejných jádrech a celkový počet signálů HER2 vydělte celkovým počtem signálů CEN-17. Pokud je poměr HER2/CEN-17 hraniční (1,8 2,2), spočítejte dalších 20 jader a přepočítejte poměr. Poměr v mezní hodnotě nebo blízko ní (1,8 2,2) by měl být interpretován s opatrností (viz pokyny k výpočtu). Celkové skóre (1 20) HER2 CEN-17 poměr HER2/CEN-17 Poměr < 2: nebyla zjištěna amplifikace genu HER2 Poměr 2: byla zjištěna amplifikace genu HER2 Datum a podpis, laborant: Datum a podpis, patolog: Návod k hodnocení: viz Interpretace zabarvení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 28/60

29 Rakovina prsu Příloha 3 prs HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Specifikace fluorescenčního mikroskopu Společnost Dako doporučuje pro použití s kitem HER2 IQFISH pharmdx, K5731 následující vybavení: 1. Typ mikroskopu Episkopický fluorescenční mikroskop. 2. Lampa 100 wattová rtuťová lampa (veďte si záznamy o době záření). 3. Objektivy Pro skrínink tkání jsou vhodné objektivy 10X suchá fluorescence nebo 16X fluorescence olejová imerziva. Pro velké rozlišení a hodnocení signálů se doporučují pouze fluorescenční objektivy olejová imerziva, např. 100X. 4. Filtry Filtry jsou navrženy pro konkrétní fluorochromy a jejich výběru je třeba věnovat náležitou pozornost. Společnost Dako doporučuje používání specifického filtru DAPI spolu s vysoce kvalitním dvojitým filtrem Texas Red/FITC. Filtr DAPI, např. Chroma filtr č Dvojitý filtr Texas Red/FITC, např. Chroma filtr č Texas Red a FITC jednoduché filtry mohou být použity po ověření. Fluorochrom Excitační vlnová délka Emisní vlnová délka FITC 495 nm 520 nm Texaská červeň 596 nm 615 nm Pro každý typ mikroskopu jsou určeny specifické filtry, proto je výběr filtru zásadní pro interpretaci výsledků. Pokud máte zájem o podrobnější informace, kontaktujte svého dodavatele mikroskopů nebo zástupce firmy Dako. 5. Olej Imerzní olej, který nemá vlastní fluorescenci. Bezpečnostní opatření 50-wattová rtuťová lampa se nedoporučuje. Rodaminové filtry nepoužívejte. Trojité filtry se nedoporučují. Neoptimalizovaný mikroskop může způsobit problémy při čtení fluorescenčních signálů. Je důležité, aby světelný zdroj neměl prošlou expirační dobu a aby byl správně nastaven a nasměrován. Zákazníci by měli sledovat a dodržovat pokyny výrobce rtuťové lampy. Mikroskop by měl být udržován a rtuťová lampa před hodnocením výsledků seřízena. Aby bylo zamezeno vyblednutí fluorescence je třeba vzorek vystavit excitačnímu světlu po co nejkratší dobu. Doporučujeme před započetím fluorescenční in situ hybridizace projednat seřízení konkrétního mikroskopu s výrobcem nebo odkazujeme na literaturu. ( ) P04090CZ_01_K / str. 29/60

30 Rakovina žaludku Souhrn a vysvětlení žaludek Lidský gen HER2 (známý také jako ERBB2 nebo NEU) je umístěn na chromosomu 17 a kóduje HER2 protein nebo p185 HER2. Protein HER2 je membránový receptor s tyrozin-kinázovou aktivitou s homologií na receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR nebo HER1) (1-2). Gen HER2 je ve všech normálních diploidních buňkách přítomný ve 2 kopiích. Nadměrná exprese proteinu HER2 a amplifikace genu HER2 v rakovině žaludku byla prokázána v řadě studií (recenze v (20)). Pozitivitu HER2 je možné prokázat buď metodou IHC nebo FISH u 20 % pacientů (20). Předklinické studie prokázaly, že trastuzumab (Herceptin ) je účinný u různých druhů rakoviny žaludku, a proto jejich výsledky vedly k zahájení klinických studií (20-24). Ve studii BO18255, ToGA, fáze III byli HER2-pozitivní pacienti s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce randomizováni do skupin léčených 5-FU nebo kapecitabinem a cisplatinou, buď v monoterapii, nebo v kombinaci s trastuzumabem. Statisticky významný přínos vyjádřený celkovou dobou přežití (overall survival, OS) byl prokázán u pacientů léčených kombinovanou léčbou trastuzumabem a chemoterapií (25). Trastuzumab je lidská monoklonální protilátka, která se vysokou afinitou váže na protein HER2 a prokázalo se, že inhibuje proliferaci lidských rakovinových buněk hyperexprimujících protein HER2 in vitro a in vivo (21-24). Princip metody žaludek HER2 IQFISH pharmdx obsahuje všechna základní činidla nezbytná k provedení metody FISH na formalínem fixovaných, do parafínu zalitých vzorcích tkáňových řezů. Po odstranění parafínu a rehydrataci jsou vzorky zahřívány v roztoku pro předběžné zpracování, následuje proteolytické natrávení za použití pepsinu. Po předběžné úpravě zahříváním a proteolytickým štěpením využívá kit směs netoxických sond IQISH k přímému použití, založenou na kombinaci technologií PNA (peptid nukleová kyselina) (12) a DNA. Směs sond je tvořena směsí DNA sond značených texaskou červení, pokrývajících oblast o 218 kb, včetně genu HER2, na chromosomu 17 a směsí fluoresceinem značených PNA sond zaměřených na centromerické oblasti chromosomu 17 (CEN-17). Výsledkem této specifické hybridizace zaměřené proti dvěma cílovým místům je tvorba zřetelného červeného fluorescenčního signálu v oblasti lokusu genu HER2 a zřetelného zeleného fluorescenčního signálu v každém centromeru chromozomu 17. Po důkladném promytí jsou vzorky montovány za použití fluorescenčního montovacího média Fluorescence Mounting Medium obsahujícího DAPI a zakryty krycím sklíčkem. Za použití fluorescenčního mikroskopu vybaveného vhodnými filtry (viz Příloha č. 3) jsou lokalizovány rakovinové buňky a je proveden výpočet červených (HER2) a zelených (CEN-17) signálů. Poté se vypočte poměr HER2/CEN-17. Normální buňky v analyzované tkáni poslouží jako vnitřní pozitivní kontrola předběžné úpravy a účinnosti hybridizace. Více informací naleznete v části Interpretace zabarvení. K interaktivnímu e-learningu použijte program HER2 IQFISH pharmdx vytvořený za účelem poskytnout laboratorním technikům, patologům a vědeckým pracovníkům přesné a rychlé informace, jak dosáhnout optimálních výsledků pomocí soupravy HER2 IQFISH pharmdx : Činidla žaludek Dodávané materiály Materiály uvedené níže postačí na 20 testů (jeden test je definován jako cílová oblast o velikosti 22 mm x 22 mm). Počet testů vychází z použití 250 µl na sklíčko lahvičky 2A (5 8 kapek), 10 µl na sklíčko lahvičky 3 a 15 µl na sklíčko lahvičky 5. Roztoky v lahvičce 3 a 5 jsou viskózní a je možné, že bude potřeba je krátce odstředit v mikrocentrifuze, aby se shromáždilo všechno dodané činidlo. Kit obsahuje dostatek materiálů na 10 samostatných cyklů barvení (čtyři oddělené cykly, pokud se používá pepsinová metoda ponořování).her2 IQFISH pharmdx se dodává na suchém ( ) P04090CZ_01_K / str. 30/60

31 Rakovina žaludku ledu. Suchý led musí být přítomen až do převzetí, aby bylo zajištěno, že komponenty kitu nebudou vystaveny vysokým teplotám během přepravy. Upozorňujeme, že některé součásti kitu mohou zůstat rozmražené, toto neovlivní výkonnost kitu HER2 IQFISH pharmdx. Lahvička 1 Lahvička 2A Lahvička 2B Lahvička 3 Lahvička 4 Lahvička 5 Lahvička 6 Roztok pro předběžné zpracování (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný Pufr MES (2-[N-morfolino]etansulfonická kyselina). Pepsin 4 x 6,0 ml, k okamžitému použití Roztok pepsinu, ph 2,0; obsahuje stabilizátor a antimikrobiální prostředek. Ředící roztok pepsinu (10x) 24 ml, 10x koncentrovaný Ředicí pufr, ph 2,0; obsahuje antimikrobiální látku. Směs sond HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, k přímému použití Směs sond značených texaskou červení HER2 DNA a sond značených fluoresceinem CEN-17 PNA; dodávané v hybridizačním pufru IQISH. Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný SSC (saline-sodium citrate) pufr s detergentem (Tween-20). Fluorescenční montovací médium 0,4 ml, k přímému použití Fluorescenční montovací médium s 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Promývací pufr Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentrovaný Tris/HCl pufr. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka 1 tuba, k přímému použití Roztok pro odstranitelné těsnění krycích sklíček. POZNÁMKA: Následující činidla z kitu: Roztok pro předběžnou úpravu (20x), pepsin, ředící roztok pepsinu (10x), stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), fluorescenční montovací médium, promývací pufr Wash Buffer (20x) a těsnící prostředek pro krycí sklíčka je možné nahradit odpovídajícími činidly z kitu Dako Histology FISH Accessory Kit, kód K5799. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Laboratorní činidla ( ) P04090CZ_01_K / str. 31/60

32 Rakovina žaludku Destilovaná nebo deionizovaná voda Etanol, 96% Xylen nebo substituty xylenu Laboratorní vybavení Absorpční ubrousky Nastavitelné pipety Kalibrovaný imerzní teploměr (rozsah C) Kalibrovaný povrchový teploměr (rozsah C) Krycí sklíčka (22 mm x 22 mm) Kleště Digestoř Dako Hybridizer (kód S2450 nebo S2451)* Topný blok nebo hybridizace* Vlhkostní hybridizační komora* Mikrocentrifuga Sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem (viz Příprava vzorků) Barvící nádoby nebo lázně Časový spínač (umožňující intervaly 2 15 minut) Vířivý mixér Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat teplotu 37(±2) C, 63 (± 2) C a od 95 C do 99 C) Mikrovlnná trouba se schopností snímání, v případě, že je předběžné zpracování prováděno pomocí mikrovlnné trouby (viz B3. Protokol barvení Krok 1: Předběžná úprava, metoda B) * Jako alternativní metoda k hybridizéru Dako Hybridizer je použití topného bloku nebo hybridizační trouby k denaturaci (66 (±1) C) a hybridizaci (45 (±2) C ) společně s vlhkostní hybridizační komorou. Mikroskopické vybavení a příslušenství Filtry pro fluorescenční mikroskop: Dvojitý filtr DAPI a FITC/texaská červeň nebo jednoduché filtry FITC a jednoduché filtry na texaskou červeň - viz Příloha č. 3 pro další podrobnosti Jako světelný zdroj by se měl použít fluorescenční mikroskop se 100wattovou rtuťovou lampou. S těmito filtry se nedoporučuje používat jiné světelné zdroje. Složka na mikroskopická sklíčka (kartonová přihrádka pro 20 sklíček se sklápěcím víkem nebo podobně) Bezpečnostní opatření žaludek 1. In vitro diagnostikum. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Roztok Pre-Treatment Solution (20x), nevyžaduje označení nebezpečnosti. Bezpečnostní list (Safety Data Sheet (SDS)) pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 4. Lahvička 2A, Pepsin, obsahuje 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, a <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one a 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Lahvička 2A je označen: Nebezpečí H314 Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. ( ) P04090CZ_01_K / str. 32/60

33 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Rakovina žaludku Může vyvolat alergickou kožní reakci. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste osobu na čerstvý vzduch a ponechte ji v poloze usnadňující dýchání. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 5. Lahvička 2B, Roztok Pepsin Diluent (10x) obsahuje 50-<75% propan-2-ol a 5-<10% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 2B je označen: Nebezpečí H225 H319 H336 P280 P210 Vysoce hořlavá kapalina a páry. Způsobuje vážné podráždění očí. Může způsobit ospalost nebo závratě. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. 6. Lahvička 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, obsahuje 10-<25% ethylene carbonate a 3- <5% sodium chloride. Lahvička 2B je označen: Varování H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 7. Lahvička 4, Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 4 je označen: H319 H315 P280 P264 Varování Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. ( ) P04090CZ_01_K / str. 33/60

34 P305 + P351 + P338 Rakovina žaludku PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 8. Lahvička 6, Promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje ), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% trometamol. Lahvička 6 je označen: H319 H315 P280 Varování P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 9. Coverlip Sealant, Těsnící prostředek pro krycí sklíčka, obsahuje 100% benzinová frakce (ropná), hydrogenovaná lehká a má označení: Nebezpečí H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Vysoce hořlavá kapalina a páry. Při požití a vniknutí do dýchacích cest může způsobit smrt. Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. Používejte elektrická, ventilační, osvětlovací zařízení a všechna zařízení pro manipulaci s materiálem vhodná do výbušného prostředí. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Uchovávejte v chladu. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 10. Se vzorky před a po fixaci a veškerým materiálem jim vystaveným by mělo být nakládáno jako s možným zdrojem přenosu infekce a měly by být zneškodňovány za dodržení příslušných bezpečnostních opatření (16). Nikdy nenabírejte činidla do pipety ústy a zamezte styku činidel a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se činidla dostanou do styku s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 11. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, abyste zabránili chybným výsledkům. 12. Nedodržení inkubačních dob, teplot nebo metod může vést k chybným výsledkům. 13. Jiné než předepsané metody fixace tkáně a tloušťky vzorků mohou způsobit ztrátu morfologie tkáně nebo změnit intenzitu signálu. 14. Zamezte vypařování směsi sond HER2/CEN-17 během hybridizace zajištěním dostatečné vlhkosti v hybridizační komůrce. ( ) P04090CZ_01_K / str. 34/60

35 Rakovina žaludku 15. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit chybnou účinnost. 16. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. Další informace naleznete v Bezpečnostním listu o materiálech (MSDS). 17. Vzhledem k heterogenní podstatě vzorků rakoviny žaludku je důležité provést důkladné skenování celého vzorku, aby se před výběrem oblasti k sčítání signálu dobře vyhodnotilo rozložení signálů. 18. Nedoporučuje se hodnotit příliš malé vzorky (tj. vzorky musí mít intaktní morfologii a dostatečný počet jader ke sčítání). 19. Jestliže se provádí analýza s HER2 FISH na bioptických vzorcích, je pro zajištění spolehlivého určení stavu HER2 potřeba analyzovat několik bioptických vzorků (7 8) z různých oblastí nádoru. 20. K identifikaci všech jader tkáně v bioptických vzorcích je důležité vyšetřit sklíčka barvená H a E. 21. Pro metodu pepsinového ponoření se musí používat pouze čisté barvicí nádoby (krok 2, metoda C). Skladování žaludek Směs sond HER2/CEN-17 IQISH (lahvička 3) uchovávejte při teplotě -18 C v temnu. Všechna ostatní činidla uchovávejte při teplotě 2 8 C v temnu. Všechna činidla snáší uchovávání v mrazničce. Zmrazování a rozmrazování činidel až 10krát neovlivňuje výkonnost. Pepsin, směs sond HER2/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 2A, 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny působením tepla. Neponechávejte tyto komponenty při pokojové teplotě. Směs sond HER2/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny při vystavení nadměrnému působení světla. Neuchovávejte tyto součásti nebo neprovádějte analýzu při silném světle, jako je přímé sluneční světlo. Nepoužívejte soupravu po uplynutí data exspirace, které je vyznačené na krabici soupravy. Pokud jsou činidla uchovávána za jiných podmínek, než jsou stanoveny v příbalovém letáku v tomto balení, musí uživatel validovat jejich výkonnost (13). Neexistují žádné zjevné známky toho, že by byl tento produkt nestabilní. Proto je důležité vyhodnotit normální buňky v analyzovaném tkáňovém řezu. Pokud dojde k nečekanému vzoru fluorescence, který nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech a máte-li podezření na problém s kitem HER2 IQFISH pharmdx, kontaktujte technické služby společnosti Dako. Příprava vzorku žaludek Se vzorky s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení pro biopsie, excize a resekce je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro FISH analýzy. U všech vzorků by měly být použity standardní metody zpracování tkání pro imunocytochemické barvení (14). Při testování malých vzorků biopsie zajistěte pro sčítání signálů intaktní morfologii nádoru a přítomnost dostatečného množství nádorových buněk. Jestliže se provádí analýza s HER2 FISH na bioptických vzorcích, je pro zajištění spolehlivého určení stavu HER2 potřeba analyzovat několik bioptických vzorků (7 8) z různých oblastí nádoru. Řezy zalité v parafínu K použití jsou vhodné pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu. Vzorky by měly být například bločkovány na tloušťku 3 nebo 4 mm a fixovány po dobu hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Ve studii ToGA byly vzorky z biopsie fixovány po dobu 6 8 hodin (odkazy na studii, viz (25)). Tkáně jsou poté dehydrovány vzestupnou etanolovou a xylenovou řadou a následně infiltrovány rozpuštěným parafínem za teploty nižší než 60 C. Pokud jsou správně fixované a zalité tkáně uchovávány na chladném místě (15 25 C), vydrží před krájením a montováním na sklíčko neomezeně dlouhou dobu (14, 15). Jiná fixativa nejsou vhodná. ( ) P04090CZ_01_K / str. 35/60

36 Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce asi 3 6 µm. Rakovina žaludku Sklíčka pro analýzu amplifikace HER2 genu a ověření přítomnosti nádoru by měla být připravována zároveň. Je doporučeno provést nejméně 2 řezy, 1 řez na přítomnost nádoru, barvený hematoxylinem a eosinem (H a E barvení) a 1 řez pro analýzu amplifikace HER2 genu. Tkáňové řezy je doporučeno montovat na silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003, nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem. Pokud jsou vzorky uchovávány za pokojové teploty (20 25 C), měly by být analyzovány do 4 6 měsíců po krájení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 36/60

37 Rakovina žaludku NÁVOD K POUŽITÍ žaludek A. Příprava činidla žaludek Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Roztok pro předběžnou úpravu V lahvičce 1 se mohou objevit krystaly, ale ty se při pokojové teplotě rozpustí. Před přípravou činidel zkontrolujte, zda se v nich nevyskytují krystaly. Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 1 (roztok pro předběžné zpracování 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Stringentní promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 4 (stringentní promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.3 Promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 6 (promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Naředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.4 Etanolová řada Z roztoku 96% etanolu připravte 3 nádobky o koncentracích etanolu 70 %, 85 %, resp. 96 %. Zakryté nádoby skladujte při pokojové teplotě nebo při 2 8 C a použijte pro maximálně 200 podložních skel. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. A.5 Roztok pepsinu Roztok pepsinu je potřebný pouze, když se používá pepsinová metoda ponořování (metoda C). Pepsinový roztok se připravuje následujícím způsobem. Pro nádobu s kapacitou šesti sklíček připravte 60 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 48 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Pro nádobu s kapacitou 24 sklíček připravte 240 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 192 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zahřátý roztok pepsinu se musí použít během 5 hodin. ( ) P04090CZ_01_K / str. 37/60

38 B. Postup barvení žaludek Rakovina žaludku B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl pečlivě přečíst tyto pokyny a před použitím se dobře seznámit se všemi součástmi. (viz Bezpečnostní upozornění). U všech činidel by mělo dojít před použitím k vyvážení na odpovídající teplotu následujícím způsobem: Lahvička 1: Zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na C, je-li použita vodní lázeň pro předběžné zpracování (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžná úprava, metoda A). Je-li pro předběžnou úpravu používána mikrovlnná trouba se schopností snímání (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda B) zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Lahvička 2A: Pepsin by měl být aplikován při 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2 metoda A a B) a průběžně udržován v chladu. Lahvička 2B: Ředicí roztok pepsinu (10x) se aplikuje při teplotě 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2 metoda C. Lahvička 3: HER2/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C ) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. Lahvička 4: Naředěný stringentní promývací pufr Wash Buffer; před použitím by jedna nádobka měla být vyvážena na pokojovou teplotu, další nádobka na 63 (±2) C. Lahvička 5: Fluorescenční montovací médium může být aplikováno při jakékoli teplotě od 2 25 C. Lahvička 6: Zředěný promývací pufr Wash Buffer by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka může být aplikován při teplotě od 2 25 C. Všechny kroky musí být prováděny při uvedené teplotě. Postup zahrnuje počet dehydrací následovaných vysoušením tkáňových řezů. Ujistěte se, že tkáňové řezy jsou před provedením dalšího kroku úplně suché. V průběhu dalších kroků nenechejte tkáňové řezy vyschnout. Pokud musí být proces barvení přerušen, mohou být sklíčka po odstranění parafínu v kroku 1 uchovávána v promývacím pufru Wash Buffer až 1 hodinu při pokojové teplotě (20 25 C), aniž by došlo k ovlivnění výsledků. B.2 Úprava tkání před barvením Odstraňovaní parafínu a rehydratace: Před provedením analýzy musí být ze sklíček s tkáněmi odstraněn parafín, aby se odstranilo zalévací médium, a potom sklíčka rehydratovat. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní sklíčka do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 96 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 70 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Odklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl A.3) na minimálně 2 minuty. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.3, krok 1, Předběžné zpracování. Roztoky xylenu a alkoholu by měly být vyměněny po zpracování 200 nebo méně sklíček. ( ) P04090CZ_01_K / str. 38/60

39 Mohou být použity substituty xylenu. Rakovina žaludku POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie. B.3 Protokol barvení Krok 1: Předběžné zpracování Předběžná úprava může být prováděna ve vodní lázni, viz metoda A) nebo jako alternativa, mikrovlnná trouba se schopností snímání, metoda B). Metoda A: Předběžné zpracování při použití vodní lázně Naplňte barvící nádobky, např. Coplinovy nádobky, zředěným roztokem pro předběžné zpracování (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvicí nádoby obsahující zředěný roztok pro předběžné zpracování do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný roztok pro předběžné zpracování na C. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín, při pokojové teplotě do předehřátého roztoku pro předběžné zpracování v nádobách na barvení. Zkontrolujte teplotu a inkubujte po dobu 10 (±1) minut při teplotě C. Vyjměte celou nádobku se sklíčky z vodní lázně. Odstraňte víčko a nechte sklíčka po dobu 15 minut chladit v roztoku pro předběžné zpracování při pokojové teplotě. Přemístěte sklíčka do nádobky se zředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. POZNÁMKA: Roztok pro předběžné zpracování je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Metoda B: Předběžné zpracování prováděné v mikrovlnné troubě se schopností snímání Naplňte plastovou nádobu naředěným roztokem pro předběžné zpracování pokojové teploty (20 25 C). Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku pro předběžné zpracování, zakryjte nádobu víkem s otvory a umístěte ji do mikrovlnné trouby. Zvolte funkci vaření se snímačem a program, který běží po dobu 10 minut poté, co bylo dosaženo teploty bodu varu*. Po 10 minutách inkubace vyjměte nádobu se sklíčky z trouby, sejměte víko a nechejte ochladit 15 minut při pokojové teplotě. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným promývacím pufrem Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. * Použití mikrovlnné trouby s funkcí snímání znamená, že trouba musí obsahovat snímač a program, který nejprve zahřeje roztok pro předběžné zpracování k bodu varu a potom udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) a zároveň odečítá nastavený čas (10 (±1) minut). Některé modely mikrovlnných trub s funkcí snímání nemají možnost nastavení odečítání času. Pokud model zahrnuje pouze předem nastavené programy, je potřeba zvolit program, který udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) po dobu nejméně 10 (±1) minut a manuálně ukončit program po 10 (±1) minutách. POZNÁMKA: Roztok k předběžnému zpracování je určen k aplikaci pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Pepsin, připravený k okamžitému použití (ready-to-use, RTU) nebo roztok pepsinu Inkubace pepsinem se může provádět přímo použitím kapek pepsinu RTU na sklíčka při pokojové teplotě (20 25 C) (metoda A) nebo při teplotě 37 C (metoda B). Sklíčka se také mohou ponořit do roztoku pepsinu a inkubovat při 37 (±2) C (metoda C) ( ) P04090CZ_01_K / str. 39/60

40 Metoda A a metoda B: Rakovina žaludku Přebytek pufru oklepejte. Použijte materiál nezanechávající chloupky (jako např. absorpční ubrousek nebo gázový tampon), opatrně otřete okolí vzorku k odstranění zbývající tekutiny a k udržení činidel v předepsané oblasti. K zakrytí vzorku aplikujte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Pepsin uchovávejte vždy při 2 8 C. Metoda A: Pepsin, RTU inkubace při teplotě C Inkubujte po dobu 5 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Inkubační doba 5 15 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Metoda B: Pepsin, RTU inkubace při teplotě 37 C Vzorky s pepsinem vložte na topný blok při 37 C např. Dako Hybridizer a inkubujte 3 5 minut. Inkubační doba 3 5 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85 % etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Metoda C: Roztok pepsinu - ponoření sklíček do pepsinového roztoku o teplotě 37 C Kit obsahuje činidla postačující na čtyři jednotlivé cykly (60 ml roztoku pepsinu, malá nádobka na šest sklíček) nebo na jeden cyklus (240 ml roztoku pepsinu, velká nádoba na 24 sklíček). Roztok pepsinu připravte podle návodu v části A.5. Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zkontrol ujte, zda je teplota stabilní. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přebytek promývacího pufru Wash Buffer oklepejte. Sklíčka ponořte do pepsinového roztoku o teplotě 37 (±2) C a inkubujte po dobu minut. Inkubační doba minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na fixaci tkání nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70 % etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Krok 3: Směs sond HER2/CEN-17 IQISH Směs sond HER2/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. ( ) P04090CZ_01_K / str. 40/60

41 Rakovina žaludku Aplikujte 10 µl směsi sond HER2/CEN-17 IQISH (lahvička 3) do středu tkáňového řezu. Ihned překryjte směs sond krycím sklíčkem 22 mm x 22 mm a nechejte směs pod sklíčkem rovnoměrně rozprostřít. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud se vytvoří bublinky vzduchu, jemně je vyklepejte pomocí pinzety. Nezapomeňte ihned po použití uložit lahvičku 3 při teplotě -18 C. Krycí sklíčko utěsněte těsnícím prostředkem vytlačením těsnícího prostředku podél obvodu krycího sklíčka. Překryjte těsnícím prostředkem krycí sklíčko k podložnímu uhnětením těsnícího prostředku kolem krycího sklíčka. Zajistěte, aby těsnící prostředek pro krycí sklíčka pokryl celou hranu krycího sklíčka. Připravte Dako Hybridizer* (kód S2450 nebo S2451) na hybridizační cyklus. Zkontrolujte, zda jsou kontrolní proužky Humidity Control Strips (kód S2452) saturované a optimální pro použití. Spusťte hybridizér a zvolte program, který: bude denaturovat při teplotě 66 C po dobu 10 minut a potom hybridizovat při teplotě 45 C po dobu minut. Sklíčka umístěte do hybridizéru, zkontrolujte, zda je víko dobře uzavřené a spusťte program. Podrobné informace naleznete v návodu k použití hybridizéru Dako Hybridizer. * K denaturaci a hybridizaci lze použít vybavení odpovídající výše popsaným podmínkám: Umístěte sklíčka na rovnou kovovou nebo kamennou plochu (topný blok nebo do hybridizační trouby) předehřátou na 66 (±1) C. Denaturujte po dobu přesně 10 minut. Umístěte podložní skla do předehřáté vlhkostní hybridizační komory. Zakryjte komůrku víčkem a inkubujte při teplotě 45 (±2) C po dobu minut. Teplota hybridiza ce 37 C není vhodná pro použití se sondami v tomto kitu. Krok 4: Stringentní promývání Naplňte dvě barvící nádobky, např. Coplinovy, zředěným pufrem pro důkladné promytí (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Pro každé sklíčko v každé nádobce je doporučen minimální objem 100 ml nebo 15 ml. Umístěte jednu z barvících nádobek se zředěným stringentním promývacím pufrem Wash Buffer při pokojové teplotě do digestoře a druhou do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný stringentní promývací pufr Wash Buffer na 63 (±2) C. Zajistěte ustálení teploty. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Kalibrovaným teploměrem měřte teplotu v nádobce s vodní lázní, aby dosáhla správné výše. Stringentní promývací pufr Wash Buffer obsahuje detergent a při 63 C se může zkalit; toto neovlivní výsledek. Použijte pinzetu nebo rukavice a vyndejte sklíčka z hybridizační komůrky a opatrně odstraňte těsnící prostředek a krycí sklíčko a umístěte sklíčka jedno po druhém do předmývací nádobky o pokojové teplotě. Jakmile byla odstraněna všechna krycí sklíčka, přeneste podložní sklíčka z pokojové teploty, předmývací nádobu do nádoby s teplotou 63 (±2) C do vodní lázně. Ihned po přenesení sklíček do lázně zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer o teplotě 63 (±2) C je třeba spustit časovač. Prověďte stringentní promývání přesně po dobu 10 minut. Vyndejte sklíčka ze zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer a po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C) řezy máčejte ve zředěném promývacím pufru Wash Buffer. Vyměňte naředěný Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy úplně vyschnout. Krok 5: Montáž Na cílovou oblast sklíčka aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média obsahujícího DAPI (lahvička 5) a přikryjte krycím sklíčkem. ( ) P04090CZ_01_K / str. 41/60

42 Rakovina žaludku POZNÁMKA: Podložní skla lze číst po 15 minutách nebo během 7 dnů po montáži. Pokud jsou však sklíčka vystavena světlu nebo vysokým teplotám, může se objevit vyblednutí. Pro minimalizaci blednutí sklíček je uchovávejte ve tmě při teplotě C. ( ) P04090CZ_01_K / str. 42/60

43 Rakovina žaludku Kontrola kvality žaludek 1. Signály musí být světlé, výrazné a snadno hodnotitelné. 2. Normální buňky umožňují vnitřní kontrolu barvicího cyklu. Normální buňky by měly mít 1 2 jasně zřetelné zelené signály poukazující na to, že sonda CEN-17 PNA byla úspěšně hybridizována na centromerickou oblast chromozomu 17. Normální buňky by měly také mít 1 2 jasně zřetelné červené signály poukazující na to, že sonda HER2 DNA byla úspěšně hybridizována na amplikon HER2. V důsledku krájení tkáně budou mít některé normální buňky méně než 2 očekávané signály každé barvy. Selhání detekce signálů v normálních buňkách indikuje selhání testu a výsledky by měly být považovány za neplatné. 3. Pokud se při hodnocení používá filtr DAPI, musí být jaderná morfologie intaktní. Četné jakoby průhledné buňky a obecně špatná jaderná morfologie indikují nadměrné natrávení vzorku, což může mít za následek ztrátu nebo fragmentaci signálů. Takové vzorky by měly být považovány za neplatné. 4. Minimální počet nádorových buněk pro hodnocení je Rozdíly ve fixaci tkání, zpracování a zalití tkání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Interpretace zabarvení žaludek Hodnotitelná tkáň Lokalizujte nádor v rámci celého sklíčka barveného H a E a zhodnoťte stejnou oblast na sklíčku barveném FISH (filtr DAPI). Hodnotí se pouze vzorky pacientů s adenokarcinomem žaludku, včetně gastroezofageálního spojení. V případě výskytu metaplazie tenkého střeva a adenokarcinomu žaludku ve stejném vzorku se hodnotí pouze komponenta karcinomu. Vyhněte se nekrotickým oblastem a oblastem, kde jsou nukleové hranice nejasné. Nezahrnujte jádra, která vyžadují subjektivní posouzení. Vynechejte jádra se slabou intenzitou signálu a nespecifickým nebo přílišným pozadím. Začněte mikroskopickým vyhodnocením celého barveného řezu FISH, resp. oblastí řezu barvenou H a E. Před hodnocením sklíčka barveného FISH nejprve poznamenejte distribuci jednotlivých signálů (homogenní nebo heterogenní) do formuláře sčítání signálů. V případě heterogenní distribuce poznamenejte, zda se jedná o fokální amplifikaci nebo amplifikaci jednotlivé buňky (mozaiková). 1) Homogenní distribuce signálů V případě, že je distribuce signálů homogenní spočítejte počet centromerů chromozomu (zelené signály) a počet genů HER2 (červené signály) ze 20 jader v 1 2 reprezentativních oblastech nádoru. 2) Heterogenní distribuce signálů V případě, že je distribuce signálů heterogenní, hodnotí se celkem 20 buněk ze zvolené oblasti podle návodu níže: A) Jestliže je přítomna fokální amplifikace, měly by se vybrat oblasti s amplifikovanými buňkami. B) Jestliže je přítomna mozaiková distribuce nebo amplifikované, polysomální a disomální buňky, sčítejte v oblastech s amplifikovanými buňkami. V těchto oblastech se do celkového počtu 20 buněk musí kromě amplifikovaných buněk sečíst i neamplifikované sousedící buňky. Je-li to možné nevybírejte překrývající se oblasti. Ignorováni zabarvení bakteriálních DNA Řada specializovaných buněk (mastocyty a makrofágy) je v rozptýleně přítomné v tkáni žaludku a vykazují zabarvení sondou HER2 ve vysoké intenzitě z důvodu přítomnosti bakteriální DNA. To má za následek silně červené fluorescenční buňky, které se zřetelně odlišují od nádorových buněk s vysokou amplifikací genu HER2. ( ) P04090CZ_01_K / str. 43/60

44 Rakovina žaludku Odečtení signálu Po zvolení oblasti k odečítání signálů začněte analyzovat jedno ze 20 zvolených jader a potom sčítejte buňku po buňce, přičemž vynechávejte buňky, které nesplňují kritéria kvality. Sečtěte počet signálů nacházejících se na okrajích zvolené oblasti k hodnocení podle pokynů uvedených níže (viz Příloha 7). - Postupujte shora dolů a hledejte všechny signály v jednotlivých jádrech. - Počítejte dva signály, které jsou stejně velké a vzdálené od sebe stejně nebo méně než je průměr signálu, jako pouze jeden signál. Vzdálenost by měla být alespoň rovna průměru jednoho signálu normální velikosti, aby bylo možné počítat dva jednotlivé signály. Pokud je vzdálenost mezi dvěma signály menší než průměr signálu, musí se počítat pouze jako jeden signál. - V jádrech s vysokými hladinami amplifikace genu HER2 mohou být signály HER2 lokalizovány těsně vedle sebe a mohou vytvářet shluk signálů. V těchto případech není možno množství signálů HER2 spočítat, ale musí se odhadnout. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zeleným signálům, protože shluky červených signálů HER2 mohou překrýt zelené signály a učinit je tak neviditelnými. V případě pochybností prosím zkontrolujte zelené signály použitím specifického filtru FITC. Nezaznamenávejte jádra bez signálů nebo se signály jen jedné barvy. Zaznamenejte pouze ta jádra, která vykazují jeden nebo více FISH signálů každé barvy. Návod pro počítání signálů 1 Nepočítejte. Jádra se překrývají, nejsou viditelné všechny oblasti jader. 2 Dva zelené signály, nezaznamenávejte jádra se signály jen jedné barvy. 3 Počítejte jako 3 zelené a 12 červených signálů (odhadování shluku) 4 Počítejte jako 1 zelený a 1 červený signál. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 5 Nepočítejte (jádra s nadměrným nebo malým neb proteolytickým štěpením). Chybějící signály ve středu jádra (jádro ve tvaru koblihy). 6 Počítejte jako 2 zelené a 3 červené signály. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 7 Počítejte jako 1 zelený a 5 červených signálů 8 Počítejte jako 3 zelené (1 zelený mimo ohnisko) a 3 červené signály 9 Shluk červených signálů skrývající zelené signály, zkontrolujte zelené signály specifickým filtrem FITC nebo nepočítejte. Zapište počty do tabulky, jak je ukázáno v Příloze č. 5 a 6. Spočítejte 20 jader u každého tkáňového vzorku, pokud možno z jasných nádorových oblastí. ( ) P04090CZ_01_K / str. 44/60

45 Rakovina žaludku Spočítejte poměr HER2/CEN-17 vydělením celkového počtu červených signálů HER2 celkovým počtem zelených signálů CEN-17. Vzorky s poměrem HER2/CEN-17 vyšším nebo rovným 2 by měly být pokládány za pozitivní pro amplifikaci genu HER2 (26). Výsledky odpovídající mezní hodnotě nebo se k ní blížící (1,8 2,2) by měly být interpretovány s opatrností. Pokud je poměr hraniční (1,8 2,2), spočítejte dalších 40 jader a přepočítejte poměr pro 40 jader. Jestliže je další výpočet opět hraniční, je platný výsledek druhého sčítání. Pokud je k dispozici, mělo by se pro lepší orientaci během druhého sčítání zahrnout imunohistochemické barvení HER2. V případě pochybností by mělo být sklíčko se vzorkem znovu zhodnoceno. U hraničních případů je odůvodněna konzultace patologa s ošetřujícím lékařem. Omezení žaludek 1. FISH je vícestupňový proces, který vyžaduje specializovaný zácvik ve výběru vhodných činidel, stejně jako výběru tkáně, fixace, zpracování a přípravě FISH sklíčka a interpretaci výsledků barvení. 2. Výsledky FISH závisejí na zacházení s tkání a jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, promývání, vysoušení, zahřívání, prořezávání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může ovlivnit hybridizaci sond. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Pro dosažení optimálních a reprodukovatelných výsledků musí být ze sklíček s tkání úplně odstraněn parafín. Odstranění parafínu musí být dokončeno na začátku procesu barvení. (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl B.2). 4. Používána by měla být pouze teplotně kalibrovaná vodní lázeň, topný blok a hybridizační pec. Použití vybavení jiného typu může vést k odpaření směsi sond HER2/CEN-17 během hybridizace a musí být validováno uživatelem. Charakteristiky účinnosti žaludek Pozadí Bezpečnost a účinnost trastuzumabu (Herceptin ) byla prokázána v klinické studii (zkouška ToGA) (25). Studie byla navržená jako otevřená, randomizovaná, multicentrická studie fáze III u HER2-pozitivních pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Ve studii ToGA byla HER2 pozitivita definována jako buď IHC-pozitivní (3+) (HercepTest, Dako) a/nebo pozitivní při HER2 FISH (HER2/CEN-17 2,0)(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako (kód K5331)). Po začlenění do studie byli pacienti randomizováni do skupiny léčené chemoterapií (5-FU nebo capecitabin a cisplatin) nebo chemoterapií plus trastuzumabem. Hlavním hlediskem úspěšnosti léčby bylo celkové přežití (overall survival, OS). V této studii bylo randomizováno celkem 594 pacientů, 584 pacientů dostávalo studiový lék a bylo zahrnuto do skupiny kompletních analýz (full analyses set, FAS). Primární endpoint ukázal, že kombinace chemoterapie a trastuzumabu vychází statisticky lépe než samotná chemoterapie. Median OS se zvýšil z 11,1 měsíců na 13,8 měsíců (p=0,0046) s mírou rizika 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) jsou zobrazeny na obrázku 3. ( ) P04090CZ_01_K / str. 45/60

46 Rakovina žaludku Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 Log-rank test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Čas (měsíce) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 3. Kaplan-Meierova křivka OS (n=584). Jakmile byla k dispozici data, byly provedeny předem určené exploratorní analýzy podskupin podle stavu HER2. Následně byly definovány dvě nové podskupiny HER2 na základě skóre IHC: Skupina 1 (skupina s nízkou expresí HER2): Skupina 2 (skupina s vysokou expresí HER2): IHC 0/FISH+ a IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ a IHC 3+ (FISH+ nebo FISH - nebo FISH bez výsledku)(n=446) Po následném opakování primární analýzy celkového přežití (OS) u skupiny s vysokou expresí HER2 (n=446) byl přínos kombinované léčby dokonce vyšší. Medián celkového přežití ve skupině pacientů léčených kombinací chemoterapie a trastuzumabu se zvýšil na 16,0 měsíců v porovnání s 11,8 měsíci u pacientů léčených samotnou chemoterapií. Míra rizika se v této analýze snížila na 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meierovy křivky přežití (OS) pro skupinu s vysokou expresí HER2 jsou zobrazeny na obrázku 4. ( ) P04090CZ_01_K / str. 46/60

47 Rakovina žaludku Pravděpodobnost přežití 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Čas (měsíce) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Léčebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázek 4. Kaplan-Meierova křivka OS pro skupinu s vysokou expresí HER2 (n=446). Studie BO18255 prokázala klinické využití obou testů, HercepTest ad HER2 FISH pharmdx Kit, při hodnocení stavu HER2 u pacientů s inoperabilním, lokálně pokročilým, rekurentním nebo metastazujícím adenokarcinomem žaludku nebo gastroezofageální junkce. Analytická citlivost Analytická citlivost směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byla zkoumána za použití 18 vzorků adenokarcinomu žaludku. Poměr mezi počtem signálů HER2 a CEN-17 signálů byl počítán na základě hodnocení 20 jader normálních buněk obklopujících nádor. Poměr HER2/CEN-17 pro 18 vzorků adenokarcinomu žaludku byl v rozmezí 0,95 a 1,06. Analytická specifičnost HER2 DNA sondy ve směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byly koncově setříděny a zmapovány, aby bylo potvrzeno celkové pokrytí v rozsahu 218 kb včetně genu HER2. CEN-17 PNA sondy ve směsi sond HER2/CEN-17 IQISH byly testovány jednotlivě a v kombinaci, aby byla potvrzena jejich specifická hybridizace na centromerickou oblast chromosomu 17. K vyhodnocení schopnosti testu identifikovat pouze cílové substance HER2 a CEN-17 bez interference s jinými substancemi byly provedeny studie na tkáňových vzorcích adenokarcinomu žaludku za použití lahvičky 3, která obsahuje hybridizační pufr, ale bez směsi sond. Bylo hodnoceno celkem 18 vzorků na přítomnost signálů, které nesouvisejí se směsí sond. V žádném z 18 vzorků nebyla zjištěna detekce jiných cílových chromozomů ani interference s úzce souvisejícími látkami. Studie odolnosti Odolnost analýzy HER2 IQFISH pharmdx byla testována za různých časů, teplot a metod ohřevu pufru pro předběžné zpracování (mikrovlnná trouba nebo vodní lázeň), časů a metod inkubace s pepsinem (pepsin RTU nebo ponoření), denaturačních časů a teplot, časů hybridizace a časů a teplot stringentního promývání. Při níže popsaných experimentálních podmínkách nebyly zaznamenány žádné významné rozdíly ve výsledcích: Metoda A) předběžného zpracování, vodní lázeň 10 minut v kombinaci s každou z teplot 95 C, C a 99 C spole čně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě C. Metoda B) předběžného zpracování, mikrovlnná trouba po dobu 9, 10 a 11 minut při teplotě >95 C. ( ) P04090CZ_01_K / str. 47/60

48 Rakovina žaludku Metoda A) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 5, 10 a 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Metoda B) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 3, 4 a 5 minut při teplotě 37 C. Metoda C) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 20, 25 a 30 minut v kombinaci s každou z teplot 35, 37 a 39 C. Denaturace po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 65, 66 a 67 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 66 C. Časy hybridizace 60, 90 a 120 minut při teplotě 45 C. Stringentní promývání po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 61, 63 a 65 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 63 C. Poznámka: Aby byl test důkladný, změnil se v postupu barvení vždy pouze jeden parametr, zatímco ostatní parametry byly konstantní. Doporučujeme držet se časů a teplot uváděných v postupu barvení. Postup barvení s HER2 IQFISH pharmdx nabízí proměnné protokolu pro teplotu předběžného zpracování, natrávení pepsinem a časy hybridizace. Každá jednotlivá možnost kombinace byla validována s ohledem na stav genu HER2. Validace byla provedena na 10 vzorcích lidského adenokarcinomu žaludku a gastroezofageální junkce FFPE pro všech 12 možných kombinací. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) byl použit jako reference. Poměr HER2/CEN-17 pro každý jednotlivý vzorek je zobrazen na obrázku 5. Křížová srovnání v tabulkách mezi těmito 12 testy a referenčním barvením prokázala všeobecnou shodu ve stavu genu HER2 ve 100 % (10/10) s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 78,3 %, resp. 100 %. Hodnota kappa byla 1,00 a McNemarův test neprokázal odchylku (oboustranná p-hodnota 1,00). Obrázek 5. Jednotlivé poměry HER2/CEN-17 pro 10 lidských vzorků adenokarcinomu žaludku barvených za použití 12 možných variant kombinací protokolu pomocí HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731) (test 1 12) a HER2 FISH pharmdx Kit (kód K5331) reference (R). Horizontální přímka zobrazuje mezní hodnotu 2,0. Opakovatelnost Byl zkoumán poměr HER2/CEN-17 za použití analýzy HER2 IQFISH pharmdx na konsekutivních řezech z devíti různých vzorků adenokarcinomu žaludku s neamplifikovaným nebo amplifikovaným stavem genu HER2. Ve stejném cyklu byl každý vzorek testován trojmo. Průměrný variační koeficient byl 3,5 % u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 1 % do 5 %) a 2,8 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 1 % do 5 %). ( ) P04090CZ_01_K / str. 48/60

49 Rakovina žaludku Za použití HER2 IQFISH pharmdx byla testována opakovatelnost na konsekutivních řezech vzorků adenokarcinomu žaludku o různé tloušťce (2, 3, 4, 5, 6 a 7 µm). Průměrný variační koeficient HER2/CEN-17 byl 4,5 % (rozmezí od 3 % do 6 %), tj. ve stejném rozmezí jako u tkání se stejnou tloušťkou a v rámci předem nastavených kriterií přijatelnosti. Reprodukovatelnost Reprodukovatelnot analýzy HER2 IQFISH pharmdx byla testována mezi jednotlivými šaržemi a mezi jednotlivými vyšetřovateli za použití tří šarží HER2 IQFISH pharmdx a tří vyšetřovatelů. Reprodukovatelnost byla testována na devíti různých vzorcích adenokarcinomu žaludku s neamplifikovaným nebo amplifikovaným stavem genu HER2. Průměrný variační koeficient reprodukovatelnosti mezi šaržemi byl 3,8 % u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 2 % do 7 %) a 1,8 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 1 % do 3 %). Průměrný variační koeficient mezi vyšetřovateli byl 4,3 % u neamplifikovaných vzorků (rozmezí od 3 % do 5 %) a 4,4 % u amplifikovaných vzorků (rozmezí od 2 % do 7 %). Vzorky adenokarcinomu žaludku se skládaly z 78,8 % resekcí a 22,2 % biopsií. Ze žaludku bylo získáno 55,6 % a 44,4 % vzorků bylo z gastroezofageální junkce. Klinické využití Klinické využití Dako HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731) bylo zkoumáno ve srovnávací studii s kitem Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kód K5331). Studie zahrnovala 79 vzorků rakoviny žaludku, které obsahovaly různé typy tkání adenokarcinomu žaludku nebo adenokarcinomu gastro-ezofageální junkce a resekce nebo biopsie s homogenní nebo heterogenní distribucí signálu (fokální nebo mozaikovou). Všechny vzorky byly hodnoceny na stav exprese genu HER2 za použití Dako HercepTest (kód K5207). Do studie byly zahrnuty vzorky ze všech čtyř skupin skóre IHC (0, 1+, 2+, 3+). Křížová srovnání stavu HER2 v tabulce získaná z těchto dvou analýz vyprodukovala všeobecnou shodu 98,7 % s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 94,2 % a 99,9 %. Hodnota kappa byla 0,97 s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 0,92 a 1,00. P-hodnota pro McNemarův test byla 1,00, což znamená, že mezi těmito dvěma analýzami nebyla prokázána odchylka. ( ) P04090CZ_01_K / str. 49/60

50 Rakovina žaludku Řešení problémů žaludek Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Žádné nebo slabé signály 1a. Souprava byla vystavena během přepravy nebo skladování vysokým teplotám 1b. Mikroskop nefunguje správně. - Nasazení nesprávného filtru - Nevhodná lampa - Rtuťová lampa je příliš stará - Špinavé nebo prasklé kolektorové čočky - Nevhodný imerzní olej 1a. Zkontrolujte podmínky skladování. Zkontrolujte, zda byl přítomen suchý led, když byla zásilka přijata. Zkontrolujte, zda lahvička 3 byla skladována při teplotě -18 C v temnu. Zkontrolujte, zda lahvičky 2A a 5 byly skladovány při teplotě maximálně 2 8 C v temnu. 1b. Zkontrolujte mikroskop a ujistěte se, že použité filtry jsou vhodné pro sadu fluorochromů, a že rtuťová lampa je správná a nebyla použita po ukončení doby životnosti. (viz Příloha č. 7). V případě pochyb kontaktujte svého dodavatele mikroskopů. 1c. Vybledlé signály 1c. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 1d. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1d. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 2. Žádné zelené signály 3. Žádné červené signály 1e. Vypařování směsi sond během hybridizace 2a. Nesprávné podmínky pro důkladné promytí 3a. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1e. Zajistěte dostatečnou vlhkost v hybridizační komůrce 2a. Ujistěte se, že byla dodržena doporučená teplota a doba při důkladném promytí, a že byla krycí sklíčka odstraněna před provedením důkladného promytí. 3a. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 4. Oblasti bez signálu 4a. Příliš malý objem sondy 4a. Zajistěte, aby byl objem sond dostatečný k pokrytí plochy pod krycím sklíčkem 4b. Vzduchové bubliny zachycené během aplikace směsi sond nebo montování 4b. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud vzniknou, jemně je vyklepejte pomocí pinzety ( ) P04090CZ_01_K / str. 50/60

51 Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 5. Přílišné zabarvení pozadí Rakovina žaludku 5a. Nevhodná fixace tkáně 5a. Zajistěte, aby byly použity pouze formalínem fixované, do parafínu zalité tkáňové řezy 6. Špatná morfologie tkáně 5b. Parafín není zcela odstraněn 5c. Příliš nízká teplota při důkladném promytí 5d. Příliš dlouhé vystavení hybridizovaného řezu silnému světlu 5b. Postupujte podle kroků odstranění parafínu a rehydratace uvedených v části B.2 5c. Zajistěte teplotu důkladného promytí 63 (±2) C 5d. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 6a. Špatná úprava pepsinem 6a. Používejte doporučené inkubační doby pepsinu. Viz část B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda je s pepsinem nakládáno při správné teplotě. Viz část B.1 7. Vysoká úroveň zelené autofluorescence na sklíčku včetně oblastí bez tkáně FFPE 6b. Nesprávné podmínky předběžné úpravy mohou způsobit nejasný nebo zakalený vzhled 6c. Příliš dlouhé zpracovávání pepsinem nebo velmi tenké řezy mohou způsobit výskyt průhledných buněk. 7. Použití prošlých nebo nevhodných podložních sklíček 6b. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 6c. Zkraťte inkubační doby Pepsinu. Viz část B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda tloušťka řezů je v rozsahu 3 6 µm. 7. Zkontrolujte, zda potažené sklíčko (Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo poly-l-lysinem potažené sklíčko) nemá prošlou dobu použitelnosti. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technické služby společnosti Dako. ( ) P04090CZ_01_K / str. 51/60

52 Příloha 4 žaludek HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Kontrolní list protokolu Datum provádění cyklu: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 šarže: Identifikační kód vzorku: Identifikační kód vybavení: Rakovina žaludku Identifikační kód barvicího cyklu: Datum ředění/exspirace promývacího pufru Wash Buffer 1 x (lahvička 6, ředěno 1:20): / Tkáň fixovaná v neutrálním pufrovaném formalínu Ano Ne Krok 1: Předběžné zpracování Datum ředění/exspirace roztoku pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution (ampule 1 ředěná 1:20) Měřená teplota roztoku pro předběžnou úpravu Pre- Treatment Solution, jestliže je vodní lázeň používaná pro ohřívání (95 99 C) Předběžná úprava (10 minut) a chlazení (15 minut) Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Krok 2: Pepsin Trvání úpravy pepsinem (lahvička 2) při teplotě 37 C nebo Trvání úpravy pepsinem (lahvička 2) při teplotě 37 C nebo Trvání ponoření do pepsin 37 (±2) C Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 3: Směs sond HER2/CEN-17 Aplikujte směs sond Probe Mix (ampule 3), opatřete krycím sklíčkem a utěsněte těsnícím prostředkem Coverslip Sealant Naměřená teplota denaturace (66 (±1) C) C Denaturace po dobu 10 minut Naměřená teplota hybridizace (45 (±2) C) C Čas hybridizace (60 až 120 minut) / C minut minut minut minut ( ) P04090CZ_01_K / str. 52/60

53 Rakovina žaludku Krok 4: Stringentní promývání Datum ředění/použitelnosti pufru pro důkladné promytí (lahvička 4, ředěno v poměru 1:20) Naměřená teplota stringentního promývacího pufru Wash Buffer (63 (±2) C) Důkladné promytí (10 minut) po odstranění krycích sklíček Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 5: Montáž Aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média (lahvička 5) a překryjte krycím sklíčkem. C C minut Poznámky: Datum a podpis, laborant: ( ) P04090CZ_01_K / str. 53/60

54 Rakovina žaludku Příloha 5 žaludek HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Schéma posuzování HER2 IQFISH pharmdx, K5731 šarže: Identifikační kód (ID) záznamu o cyklu barvení: Datum provádění cyklu: Identifikační kód vzorku: Charakteristika rozložení signálů ve tkáni: Homogenní: Heterogenní fokální: nebo Heterogenní mozaikové: Spočítejte signály ve 20 jádrech Jádro č. červený (HER2) zelený (CEN-17) Jádro č Celkem 1-10 Celkem červený (HER2) zelený (CEN-17) Pro stanovení poměru HER2/CEN-17 odečtěte počet signálů HER2 a počet signálů CEN-17 ve 20 stejných jádrech a celkový počet signálů HER2 vydělte celkovým počtem signálů CEN-17. Pokud je poměr HER2/CEN-17 hraniční (1,8 2,2), spočítejte dalších 40 jader a přepočítejte poměr (viz schéma posuzování přepočítaných výsledků). Poměr v mezní hodnotě nebo blízko ní (1,8 2,2) by měl být interpretován s opatrností (viz pokyny k výpočtu). ( ) P04090CZ_01_K / str. 54/60

55 Rakovina žaludku HER2 FISH HER2 CEN-17 poměr HER2/CEN-17 CELKOVÉ SKÓRE (1-20) Poměr < 2: nebyla zjištěna amplifikace genu HER2 Poměr 2: byla zjištěna amplifikace genu HER2 Datum a podpis, laborant: Datum a podpis, patolog: Návod k hodnocení: viz Interpretace zabarvení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 55/60

56 Rakovina žaludku Příloha 6 žaludek HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Schéma posuzování přepočítaných výsledků HER2 IQFISH pharmdx, K5731 šarže: Identifikační kód (ID) záznamu o cyklu barvení: Datum provádění cyklu: Identifikační kód vzorku: Signály v dalších 40 jádrech (1-40) Jádro č. červený HER2 Zelený CEN-17 Jádro č. červený HER2 Zelený CEN-17 Jádro č. červený HER2 Zelený CEN-17 Jádro č Celkem Celkem Celkem Celkem červený HER2 Zelený CEN-17 Pro stanovení poměru HER2/CEN-17 odečtěte počet signálů HER2 a počet signálů CEN-17 ve 40 stejných jádrech a celkový počet signálů HER2 vydělte celkovým počtem signálů CEN-17. Celkové skóre jader 1-40 je uvedeno v tabulce níže. HER2 FISH HER2 CEN-17 poměr HER2/CEN-17 Celkové skóre (1-40) Poměr < 2: nebyla zjištěna amplifikace genu HER2 Poměr 2: byla zjištěna amplifikace genu HER2 Datum a podpis, laborant: Datum a podpis, patolog: Návod k hodnocení: viz Interpretace zabarvení. ( ) P04090CZ_01_K / str. 56/60

57 Rakovina žaludku Příloha 7 žaludek HER2 IQFISH pharmdx, kód K5731 Specifikace fluorescenčního mikroskopu Společnost Dako doporučuje pro použití s kitem HER2 IQFISH pharmdx, K5731 následující vybavení: 1. Typ mikroskopu Episkopický fluorescenční mikroskop. 2. Lampa 100 wattová rtuťová lampa (veďte si záznamy o době záření). 3. Objektivy Pro skrínink tkání jsou vhodné objektivy 10X suchá fluorescence nebo 16X fluorescence olejová imerziva. Pro velké rozlišení a hodnocení signálů se doporučují pouze fluorescenční objektivy olejová imerziva, např. 100X. 4. Filtry Filtry jsou navrženy pro konkrétní fluorochromy a jejich výběru je třeba věnovat náležitou pozornost. Společnost Dako doporučuje používání specifického filtru DAPI spolu s vysoce kvalitním dvojitým filtrem Texas Red/FITC. Filtr DAPI, např. Chroma filtr č Dvojitý filtr Texas Red/FITC, např. Chroma filtr č Texas Red a FITC jednoduché filtry mohou být použity po ověření. Fluorochrom Excitační vlnová délka Emisní vlnová délka FITC 495 nm 520 nm Texaská červeň 596 nm 615 nm Pro každý typ mikroskopu jsou určeny specifické filtry, proto je výběr filtru zásadní pro interpretaci výsledků. Pokud máte zájem o podrobnější informace, kontaktujte svého dodavatele mikroskopů nebo zástupce firmy Dako. 5. Olej Imerzní olej, který nemá vlastní fluorescenci. Bezpečnostní opatření 50-wattová rtuťová lampa se nedoporučuje. Rodaminové filtry nepoužívejte. Trojité filtry se nedoporučují. Neoptimalizovaný mikroskop může způsobit problémy při čtení fluorescenčních signálů. Je důležité, aby světelný zdroj neměl prošlou expirační dobu a aby byl správně nastaven a nasměrován. Zákazníci by měli sledovat a dodržovat pokyny výrobce rtuťové lampy. Mikroskop by měl být udržován a rtuťová lampa před hodnocením výsledků seřízena. Aby bylo zamezeno vyblednutí fluorescence je třeba vzorek vystavit excitačnímu světlu po co nejkratší dobu. Doporučujeme před započetím fluorescenční in situ hybridizace projednat seřízení konkrétního mikroskopu s výrobcem nebo odkazujeme na literaturu. ( ) P04090CZ_01_K / str. 57/60

58 Literatura 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): ( ) P04090CZ_01_K / str. 58/60

59 25. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): ( ) P04090CZ_01_K / str. 59/60

60 Vysvětlení symbolů Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Čislo šarže In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Chraňte před slunečním světlem (viz sekci o skladování) Použitelné do Viz Návod k použití Lze použit pro <n> testů Výrobce Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Výrobce: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánsko Tel Fax ( ) P04090CZ_01_K / str. 60/60