Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Kpt. RNDr. Miroslav POHANKA, Ph.D. a kolektiv BIOLOGICKÉ ZBRANĚ.

Transkript

1 U č e b n í t e xt y Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové Kpt. RNDr. Miroslav POHANKA, Ph.D. a kolektiv BIOLOGICKÉ ZBRANĚ Svazek

2 Autorský kolektiv: kpt. RNDr. Miroslav Pohanka, Ph.D. Centrum pokročilých studií MVDr. Ladislav Novotný, Ph.D. Centrum pokročilých studií npor. PharmDr. Jana Ţďárová Karasová katedra toxikologie doc. Ing. Kamil Kuča, Ph.D. Centrum pokročilých studií Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Hradec Králové prof. MVDr. Jiří Pikula, Ph.D. Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Fakulta veterinární hygieny a ekologie Recenze: prof. RNDr. Miroslava Beklová, CSc. Ing. Vítězslav Vlček, Ph.D. Miroslav Pohanka, Ladislav Novotný, Jana Ţďárová Karasová, Kamil Kuča, Jiří Pikula, 2010 ISBN

3 OBSAH Seznam ustálených zkratek Úvod Historické aspekty a dopady na současnost Před rokem Dvacáté století do konce studené války Od devadesátých let dvacátého století do současnosti Biologická zbraň Doručení částic Odhad dopadu biologické zbraně Biologická agens Práce s virulentními organismy Kategorie biologických agens podle CDC Současné závazné členění Vybraní zástupci výzamných biologických agens Bacillus anthracis Brucella melitensis Francisella tularensis Yersinia pestis Vibrio cholerae Rickettsia prowazekii Orthopoxvirus variola Viry hemorhagických horeček Botulotoxin Ricin Metody detekce a identifikace biologických agens Kultivace Rychlá detekce aerosolu Hmotnostní spektrometrie PCR Imunologické metody Biosenzory

4 7. Přehled vybraných antibiotik Beta-laktamová antibiotika Tetracykliny Chloramfenikol Aminoglykosidy Polypeptidová antibiotika Glykopeptidová antibiotika Sulfonamidy Chinolonová chemoterapeutika Virostatika Doporučená literatura Citovaná literatura

5 SEZNAM USTÁLENÝCH ZKRATEK BW BWA CDC CFU CW CWA ECL ELISA HFV LD 50 NBC PCR PFU SEB SÚJB biological weapon (biologická zbraň) biological warfare agent (biologické agens) Centers for Disease Control and Prevention colony-forming unit (kolonie tvořící jednotka) chemical weapon (chemická zbraň) chemical warfare agent (chemická zbraň) electrochemiluminiscence (elektrochemiluminiscence) enzyme-linked immunosorbent assay hemorrhagic fever virus (virus hemorhagické horečky) median lethal dose (střední smrtná dávka) nuclear, biological, chemical warfare (jaderné, biologické a chemické zbraně) polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) plaque forming unit (částice schopné tvořit plaky) stafylokokový enterotoxin B Státní úřad pro jadernou bezpečnost České republiky TRF time-resolved fluorescence (časem rozlišená fluorescence) USAMRIID US Army Medical Research Institute for Infectious Diseases WHO World Health Organization (Světová zdravotnická organizace) 5

6 6

7 1. ÚVOD Problematika zbraní hromadného ničení je stále ţivá. Zatímco v době studené války byla tato oblast předmětem zbrojních aktivit velmocí, v dnešní době se mluví spíše o hrozbě útoku ze strany malých skupin nebo militantních reţimů. Vlastnictví zbraně hromadného ničení je pak povaţováno za jakousi alternativu ke konvenčním zbraním a můţe vytvořit silného soupeře i z relativně málo početné skupiny nebo menšího státu. Ne nadarmo se zbraně hromadného ničení spojují s přívlastkem weapons of poors zbraně chudých. Symbol prezentující biologické riziko biohazard (viz obr. 1) se do jisté míry stal nejen označením odborným, ale v rámci postupné popularizace problematiky i symbolem vnímaným laickou veřejností. Obr. 1: Symbol biologického rizika. V současné době za zbraně hromadného ničení povaţujeme chemické, biologické a jaderné zbraně. V odborné terminologii se tyto zbraně často vyskytují pod zkratkou NBC (Nuclear, Biological and Chemical). Zatímco ochrana před jadernými a chemickými zbraněmi je dlouhodobě řešena bezpečnostními sloţkami, hrozba biologickými zbraněmi byla dlouhodobě podceňována a do popředí zájmu se dostává zejména po roce 2001, kdy tzv. antraxové dopisy v USA poukázaly na špatnou připravenost vůči hrozbám tohoto druhu. Je třeba si uvědomit rozsáhlost problematiky a nároky na pracovníky, kteří se v ní pohybují. Hlubší proniknutí daného problému vyţaduje detailní znalosti především z oblasti mikrobiologie, lidské a veterinární medicíny, biochemie, molekulární biologie a imunologie. Tento text se pokouší srozu- 7

8 mitelnou formou sumarizovat některé důleţité informace o biologických zbraních, jejich významu a ochraně před nimi. Svým zaměřením je text určen pro pregraduální i postgraduální studenty Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany a měl by umoţnit rychlou a validní orientaci v problematice. Pro další rozšíření orientace v problematice lze doporučit česky psané monografie Biologický a chemický terorismus (Prymula et al., 2002) a Bioterorismus (Daneš, 2003). Z anglicky psaných textů lze doporučit např. Compendium biological warfare agents (Schulz-Kirchrath, 2008), Handbook of chemical and biological warfare agents (Ellison, 2007) a Biological warfare modern offense and defense (Zilinskas et al., 2000). 8

9 2. HISTORICKÉ ASPEKTY A DOPADY NA SOUČASNOST Na rozdíl od konvenčních válek konflikty nebo útoky drobných militantních skupin pomocí biologických či chemických zbraní nejsou příliš četné. Dalo by se říci, ţe se vyskytují spíše ojediněle. Pokud chceme adekvátně posoudit aktuální hrozbu, je třeba poučit se z událostí minulých. Na základě těchto znalostí pak budeme schopni odhadnout jejich nebezpečnost v současné době. Lze předpokládat, ţe útok jednotlivce nebo malé teroristické skupiny bude inspirován některou dřívější událostí. 2.1 Před rokem 1900 Koncept pouţití biologických zbraní je velmi starý. První zneuţití těchto zbraní bylo zaloţeno především na empirických poznatcích. Jednalo se např. o kontaminaci zdrojů vody nebo potravin s následným plánovaným rozšířením epidemie. Tato taktika byla v minulosti často pouţívána. Z dochovaných informací můţeme uvést některé příklady. Tímto způsobem válčil např. císař Barbarossa v bitvě o italské město Tortona v roce Obdobnou strategií bylo vhazování těl obětí moru do obléhaného města. Blechy opouštějící vychládající lidská těla pak představovaly vektory nemoci. V roce 1347 tatarská vojska za pomoci této strategie dobývala přístav Kaffa na území dnešní Ukrajiny. Zdá se být pravděpodobné, ţe janovští obchodníci uniknuvší z města Kaffa pravděpodobně zavlekli mor do západní Evropy (Derbes, 1966). Ruská vojska také uplatnila tento způsob dobývání v roce 1710 během války se Švédskem, konkrétně při dobývání estonského města Reval. Systematickou biologickou kampaň prováděli britští vojáci ve druhé polovině osmnáctého století ve snaze potlačit odbojné indiánské kmeny. Kdyţ v roce 1763 propukla v pevnosti Fort Pitt epidemie neštovic, vědomě ji rozšířili mezi indiánské kmeny pomocí kontaminovaných šátků a přikrývek. Následná epidemie neštovic mezi Indiány byla umocněna i díky jejich vyšší citlivosti vůči této nemoci, neţ bylo běţné u evropské populace (Poupard and Miller, 1992). Jak je patrné z výše uvedených příkladů, pouţití biologických zbraní nebylo zcela neznámou taktikou ve vedení dřívějších válek. Další rozvoj, nárůst nebezpečnosti a potenciálu zneuţití biologických zbraní byl podmíněn rozvojem vědních a technických oborů a především znalostí vědecké mikrobiologie. V neposlední řadě pak také objevy léčebných postupů a látek, 9

10 které minimalizují ztráty útočníků, vedly k zvýšenému zneuţívání těchto agens. 2.2 Dvacáté století do konce studené války Akcelerace technického a vědeckého pokroku spolu se stupňujícím se zbrojením měla zásadní vliv na rozvoj zbraní hromadného ničení. Roky první světové války znamenaly závody v přípravě chemických zbraní, nicméně biologické zbraně jiţ byly v této době také intenzivně zkoumány. O tom, zda došlo k jejich pouţití jiţ v průběhu první světové války se dodnes diskutuje (Christopher et al., 1997). Významným milníkem byl rok 1925, kdy došlo k podpisu ţenevského protokolu o zákazu pouţití chemických a bakteriologických způsobů vedení války (Protocol for the prohibition of the use in war of asphyxiating, poisonous or other gases, and of bacteriological methods of warfare). Tento protokol vstoupil v platnost v únoru Protokol však nebyl v této době podepsán ani všemi významnými mocnostmi. Například Spojené státy jej ratifikovaly aţ v roce Protokol neřešil vlastnictví uvedených zbraní, ale pouze je zakazoval pouţít k nevyprovokovanému útoku. Ve třicátých a čtyřicátých letech dvacátého století dochází ke vzniku výzkumných institucí snaţících se konstruovat mj. biologické zbraně. Velká Británie, Kanada, Francie, Sovětský svaz a USA byly významnými hráči v rámci těchto snah. Porton Down ve Velké Británii, Suffield v Kanadě a Camp Detrick (dnes Fort Detrick) v USA se staly důleţitými centry, kde instituce zabývající se ochranou před zbraněmi hromadného ničení sídlí dodnes. Výraznou výjimkou bylo předválečné Německo, kde platila Hitlerova osobní direktiva o zákazu přípravy chemických a biologických zbraní hromadného ničení a německý výzkum v této oblasti byl minimální ve srovnání s jinými státy. Pravděpodobně nejrozsáhlejší zbrojní program rozvinulo Japonsko. Takzvaná Jednotka 731, lokalizovaná na území okupované Číny, zahrnovala okolo tří tisíc odborných pracovníků. V rámci aktivit byly prováděny krajně nehumánní pokusy a experimentální biologické útoky vůči místnímu obyvatelstvu (Harris, 1992). Dva čelní pracovníci Jednotky 731 Kitano Misaji a Shiro Ishi byly po skončení druhé světové války zatčeni vojáky USA a omilostněni pod podmínkou účasti na americkém zbrojním programu. Velká část výzkumných zpráv a vědeckých pracovníků Jednotky 731 byla získána Sovětským svazem a pouţita pro jejich vlastní zbrojní program. 10

11 Období po druhé světové válce bylo ve znamení intenzivního soupeření mezi dvěmi supervelmocemi USA a Sovětským svazem. Obě země vybudovaly značné výrobní kapacity a ve svém zbrojním arzenálu udrţovaly velké mnoţství munice. V Sovětském svazu bylo např. významné výrobní zařízení ve Sverdlovsku, proslaveném nehodou, při které došlo k úniku aerosolu Bacillus anthracis v roce 1979 s mnoţstvím váţných infekcí mezi zasahujícími jednotkami i civilním obyvatelstvem. Ve Spojených státech pak bylo zbrojní zařízení v Pine Bluff, kromě jiţ dříve zmíněného Fort Detricku. V roce 1953 byla zaloţena instituce zabývající se ochranou před infekčními riziky USAMRIID (US Army Medical Research Intitute for Infectious Diseases). Postupné zmírňování napětí mezi supervelmocemi vedlo k mezinárodní shodě o ukončení zbrojních aktivit v oblasti biologických prostředků a jejich postupnému znehodnocení. Dohoda byla podepsána v roce Tato dohoda (The United Nations Convention on the prohibition of the developmnent, production, and stockpiling of bacteriological and toxin weapons and their destruction) vstoupila v platnost v roce Zatímco Spojené státy, Velká Británie a ostatní země západního světa dohodu splnily, Sovětský svaz v utajení pokračoval ve zbrojních aktivitách. Tyto aktivity byly dlouho přehlíţeny. Postupné úniky informací však vedly k podezření o porušení dohody z roku Snad nejznámější svědectví poskytl Ken Alibek (vlastním jménem Kantanjan Alibekov) v knize Biohazard (Biohazard: the chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world) vydané v americké emigraci. 2.3 Od devadesátých let dvacátého století do současnosti Po rozpadu Sovětského svazu dochází k ukončení finančně náročných zbrojních programů. Útočné zbrojní programy se stávají doménou totalitních reţimů méně významných zemí a militantních skupin. Rozsáhlé aktivity ve snaze získat biologické zbraně byly zaznamenány v japonské sektě Óm Šinrikjó. Jejich snahy byly zaměřeny na získání Bacillus anthracis, Vibrio cholerae a botulotoxinu. S cílem splnit své záměry byla dokonce vyslána výprava do Afriky, kde měla za úkol shromaţďovat vzorky viru Ebola (Torok, et al. 1997). V roce 1993 byl proveden regulérní útok této sekty v centru Tokia za pouţití rozstřikování B. anthracis z výškové budovy v centru města. I přes váţnost útoku a hrozícím rizikům nedošlo k prokázaným úmrtím způsobeným tímto biologickým agens. Útok byl vlastně rozpoznán aţ díky vyšetřování dalších aktivit sekty Óm Šinrikjó. Efektivita 11

12 útoku byla sníţena díky záměně uţitých kmenů. Pro útok byl omylem vybrán kmen Sterne 34F2, pouţívaný ve veterinární medicíně k očkování. Óm Šinrikjó na základě svých zkušeností s biologickými agens posléze upřednostnila pouţití chemických zbraní k prosazování svých cílů. V roce 1994 byl proveden útok v japonském městě Matsumoto nervově paralytickou látkou sarin, v roce 1995 byl sarinový útok opakován v tokijském metru. Sektě se však naštěstí nepodařilo připravit čistou látku a nebyla ani dostatečně vyřešena distribuce této noxy do ovzduší. Na následky intoxikace sarinem v tokijském metru pak zemřelo pouze 12 lidí a u necelých 4000 lidí byly zaznamenány příznaky otravy způsobené touto noxou. K závaţným událostem, které se zapsaly do novodobé historie zneuţití biologických agens, došlo krátce po teroristickém útoku na World Trade Center v roce Celkem pět dopisů obsahujících ţivé spory B. anthracis bylo anonymně rozesláno v průběhu roku Pět dopisů bylo odesláno 18. září 2001 do televize NBC News a na New York Post a dopisy do The Sun, ABC News, CBS News. Dne 9. října byly odeslány dva dopisy senátorům Patricku Leahyovi a Tomu Daschleovi do Washingtonu. Fotografie jednoho z dopisů je přiloţena jako obrázek 2. Texty v dopisech byly následující: Text dopisu do New York post a NBC News: THIS IS NEXT TAKE PENACILIN NOW DEATH TO AMERICA DEATH TO ISRAEL ALLAH IS GREAG Dopisy odeslané senátorům Daschleovi a Leahyovi: YOU CAN NOT STOP US WE HAVE THIS ANTHRAX YOU DIE NOW ARE YOU AFRAID? DEATH TO AMERICA DEATH TO ISRAEL ALLAH IS GREAT 12

13 Kvalita spor se postupně zvyšovala. Zatímco první dopis obsahoval relativně nečistou směs spor, v dalších dopisech se jiţ nacházely spory ve formě striktně definovaných částic s udávanou velikostí 10 m. Na jejich přípravu byla pravděpodobně pouţita sofistikovaná technika spray-drying. Zatímco při kontaktu s prvními dopisy převaţovala koţní forma onemocnění, u druhého to byla forma plicní. Papírová obálka slouţila jako filtr pro postupné uvolňování částic do vzduchu. Následná analýza identifikovala mikroorganismus jako Amesův kmen B. antracis na základě DNA sekvenace v The Institute for Genomic Research. Je zajímavé, ţe tento kmen není v přírodě běţný a k dispozici je jen v omezeném mnoţství laboratoří zabývajících se jeho studiem. Kmen byl poprvé popsán v USAMRIID. Od té doby byl odeslán do 15 laboratoří v USA a 6 laboratoří v jiných zemích. Odesílatel nebyl doposud vypátrán. Hlavní podezřelý Steven Hatfill musel být dokonce v roce 2008 odškodněn pro křivé obvinění. Nebyl prokázán podíl ţádné teroristické organizace na útoku. Dalším viníkem mohl být také vědec Bruce Ivins. Ten však těsně před svým zatčením v létě 2008 spáchal sebevraţdu ve věku 62 let. Předpokládaný důvod útoků byla msta za nedostatek podpory výzkumu v oblasti vakcinace proti antraxu, kterou Ivins vedl. I nadále vládnou pochybnosti o těchto vysvětleních. Ivins navíc neměl osobně zkušenosti s přípravou částic a ve své vědecké kariéře se této problematice nevěnoval. I díky těmto faktům vznikají různé konspirační teorie. Celkový počet obětí dopisových útoků byl 5 a u dalších 18 se rozvinulo onemocnění. Obětmi byli převáţně pracovníci pošty a úředníci adresáta zajišťující poštovní korespondenci. Panika, která následovala, byla neočekávaná a poukázala na naprostou celosvětovou nepřipravenost. Následovalo zavádění nákladných technologií pro preventivní dezinfekci listovních zásilek a rychlou detekci biologických agens. 13

14 Obr. 2: Jeden z antraxových dopisů zaslaných do televizní stanice NBC. Zdroj 14

15 3. BIOLOGICKÁ ZBRAŇ Biologická zbraň (podle definice) je zbraň hromadného ničení, která je schopna poškodit nebo zabít lidi, zvířata, ale i rostliny protivníka. Za biologickou zbraň je povaţováno zařízení sestávající se z biologického agens (patogen, biologický toxin) a technického prostředku zajišťujícího jeho doručení. Například samotná suspenze B. anthracis v láhvi není biologická zbraň, ale tato suspenze spolu s rozstřikovacím zařízením uţ biologickou zbraní je. Biologická zbraň můţe být konstruována jako dělostřelecký granát nebo rozstřikovací zařízení. Při vyuţití těchto technik přenosu biologického agens, však můţe snadno dojít i k účinku na vlastní síly útočníka. Před podpisem dohody o zákazu biologických zbraní z roku 1972 byly ve výzbroji mj. modifikované sovětské rakety SS-18 a americké bomby M-114. V současné době se povaţují za potenciální hrozbu jak sofistikované biologické zbraně (granáty, rakety, bomby), tak i velmi jednoduchá zařízení, jako jsou práškovací nebo rozstřikovací zařízení. 3.1 Doručení částic Pro účinnost biologické zbraně je důleţitý způsob vniknutí infekčního agens do organismu. Vysoce rizikové je vdechnutí. Při inhalaci dochází nejlépe k interakci s povrchem alveol, pokud jsou částice velké 1 10 m. Někteří autoři uvádějí optimální velikost pod 5 m (Tellier, 2006). Při velikosti nad 10 m dochází k usazovaní aerosolových částic v horních cestách dýchacích. Prostup biologických agens přes horní cesty dýchací je prakticky nemoţný. Částice pod 1 m nejsou zadrţovány v dýchacích cestách a plicích, jsou ve velké míře opět vydechnuty. Transdermální přechod u neporaněné kůţe nehraje u biologických agens významnou roli. Letální dávky jsou vyšší aţ o několik řádů. Větší význam pro vstup těchto agens do organismu má spojivka. Rozvinutí nemoci při pozření biologického agens bylo také popsáno, ale rizikovost této cesty vstupu do organismu ve srovnání s inhalací není tak vysoká. Nicméně, pro některé biologické toxiny můţe představovat dominantní cestu. Po usednutí aerosolu na povrch předmětů nemůţeme vyloučit mimo transdermální kontaminaci také moţnost rozvinutí infekce inhalační cestou. Usedlý aerosol se snadno znovu zvíří. Podcenění tohoto efektu bylo zaznamenáno v roce 1979 ve Sverdlovsku. Při likvidaci havárie ve zbrojním zaří- 15

16 zení byly spory B. anthracis opětovně zvířeny při pokusu o omývání kontaminovaných ploch proudem vody. Následkem bylo rozšíření antraxu mezi příslušníky likvidačních čet. Tyto zkušenosti prokázaly, ţe dezinfekce povrchů po pouţití biologické zbraně je náročný proces a je třeba ji realizovat za přísných bezpečnostních opatření. 3.2 Odhad dopadu biologické zbraně Význam biologických zbraní můţe být patrný i z předpokládaných nákladů na jejich nasazení. Podle příručky NATO jsou náklady na zničení 50 % ţivé síly na území jeden kilometr čtvereční $2000 pro konvenční zbraně, $800 pro nukleární, $600 pro chemické a $1 pro biologické zbraně. To znamená například, ţe celkově je pak třeba doručit na místo účinku cca 500 kg chemické zbraně ve srovnání s 1 kg zbraně biologické (NATO, 1996). Dopad pouţití biologické zbraně vůči civilnímu obyvatelstvu se pokusil predikovat kolektiv autorů pod vedením prof. Kufmanna (1997) ze CDC v Atlantě (Centers for Disease Control and Prevention; Jedná se pouze o hypotetické plánování řešení krizové situace při útoku na civilní obyvatelstvo biologickými agens: předměstí se obyvateli bylo vystaveno útoku biologické zbraně s původci antraxu, tularémie nebo brucelózy: B. anthracis, F. tularensis nebo B. melitensis. Předpokládaná profylaktická opatření by se týkala aţ obyvatel v okolních oblastech. V případě B. anthracis by se inhalační formou antraxu nakazilo obyvatel s následným moţným počtem úmrtí téměř třetiny, tj obyvatel předměstí. Plicní formou tularémie a brucelózou by se nakazilo shodně obyvatel s předpokládaným počtem úmrtí 6188 pro tularémii a 413 pro brucelózu. Celkový ekonomický dopad by byl 0,6 miliard dolarů pro brucelózu, 5,4 miliard dolarů pro tularémii a přes 26 miliard dolarů pro antrax. Tyto údaje jsou však pouze orientační a byly získány in silico. Nicméně dokreslují vysokou nebezpečnost zneuţití biologických zbraní. USAMRIID vypracoval schéma, které lze vyuţít pro odlišení přirozené infekce a pouţití biologických agens jako zbraně. Jedná se o: výskyt velkých epidemií s podobnými příznaky, zvláště u oddělených populací; mnoho případů neobjasněných chorob či úmrtí obyvatel; váţnější příznaky choroby, neţ které lze u daného agens běţně předpokládat, nebo selhání běţné, dosud účinné terapie; 16

17 neobvyklé cesty vstupu agens do organismu, zejména inhalační cestou; výskyt chorob v neobvyklých geografických oblastech nebo v neobvyklém ročním období; nepřítomnost vektora v oblasti vzplanutí choroby, která běţně pro své šíření vektorů vyuţívá; četné podobné nebo za sebou jdoucí epidemie různých chorob u stejné populace; jednotlivé případy neobvyklých chorob (neštovice, hemorhagické horečky, plicní antrax a mor); choroba neobvyklá pro postiţenou věkovou skupinu; neobvyklý kmen nebo varianta původce nebo neobvyklá antimikrobiální rezistence; podobný nebo shodný genetický typ původce z různých časových období či různých lokalit; vyšší prevalence nebo míra postiţení u obyvatel exponovaných v určitém typu prostředí (např. uvnitř budov nebo venku v závislosti na zneuţití agens v interiéru nebo exteriéru); vzplanutí stejné choroby v oblasti, kde nehrozí infekce; vzplanutí zoonóz; zprávy o potenciálním útoku teroristy nebo objevení zařízení vhodného k šíření biologických agens. 17

18 4. BIOLOGICKÁ AGENS 4.1 Práce s virulentními organismy Pro práci s virulentními organismy se dodrţují přísné standardy práce, tzv. standardní operační postupy. V standardních operačních postupech musí být splněny podmínky pro bezpečnost práce, k tomu jsou vyuţívány primární bariéry (laminární boxy, oddělení pracovníka od zpracovávaného vzorku) a sekundární bariéry (stavebně technické úpravy spočívající v separaci laboratoře od veřejně přístupných míst). Běţnou součástí ventilace v laboratořích, případně i ochranných oděvech, jsou také tzv. HEPA filtry (high efficiency particulate air). Při kaţdé práci se vzorky je potřeba především zabránit vzniku aerosolu. Hodnotí se úrovně biologické ochrany (BSL biosafety level) v rozmezí 1 4. Ukázka laboratorního vybavení pro nakládání s vysoce nebezpečnými mikroorganismy je patrná z obrázku 3. V současné době je potřebné vybavení laboratoří BSL definováno direktivou Evropské unie 90/979/EEC (Council Directive of 206 November 1990 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work). BSL 1 do této skupiny patří výukové a jiné laboratoře pracující s kmeny, které nejsou původci nemocí. V tomto reţimu je obvykle dostačující dodrţovat základní hygienické normy a obecné zásady manipulace s biologickým a chemickým materiálem. BSL 2 laboratoře umoţňují práci s některými patogenními mikroorganismy za pouţití takových organismů a postupů, kde lze pracovat na otevřených pracovních deskách. Tyto mikroorganismy jsou běţné v ţivotním prostředí. Jsou virulentní pouze vůči oslabeným jedincům. Pokud vznikne onemocnění, lze je léčit, nebo mu dokonce předcházet vakcinací. Technické vybavení laboratoří BSL 2 je obdobné jako BSL 1. V těchto laboratořích je však kladen větší důraz na osobní ochranu důsledným pouţíváním ochranných pomůcek, zejména rukavic, a pravidelnou dezinfekci pracovních ploch. BSL 3 laboratoře předpokládají práci s patogeny šířícími se aerosolem. Tyto laboratoře jsou kaţdoročně akreditovány. Laboratoře jsou udrţovány v permanentním podtlaku a vystupující vzduch z ventilačního zařízení prochází HEPA filtry. Laboratoře jsou vybaveny prokládacím autoklávem. BSL 4 koncepčně vychází z BSL 3, ale pracuje se zde jiţ s patogeny šířícími se aerosolem, které způsobují neléčitelné nemoci nebo nemoci 18

19 s velmi váţným průběhem a vysokou předpokládanou úmrtností. Veškeré práce probíhají v laminárních boxech a za pouţití filtroventilačního tlakového oděvu. Vstup do laboratoře je moţný jen přes dvoje dveře elektronicky jištěné, aby je nebylo moţné otevřít současně. V mezidveřním prostoru je stanoviště osobní očisty. Materiál vstupující nebo vystupující z laboratoře je sterilizován v prokládacích autoklávech. Obr. 3: Digestoř použitá v BSL 4 laboratoři. Manipulace se vzorkem je od zbylého prostoru laboratoře oddělena pevnou přepážkou. V prostoru digestoře je podtlak z důvodu zabránění průniku agens do okolí při netěsnosti. 4.2 Kategorie biologických agens podle CDC Pro konstrukci biologické zbraně lze teoreticky pouţít jakýkoli patogen nebo toxin. Taylor et al. (2001) uvádí existenci celkem 1400 lidských patogenů. Z toho je 200 virových a 500 bakteriálních. Pro členění biologických agens se můţeme přidrţet členění podle CDC na kategorie A, B a C. 19

20 Kategorie A V kategorii A jsou vysoce virulentní patogeny snadno přenosné na člověka nebo z člověka na člověka. Při pouţití se dá očekávat vysoká úmrtnost, rychlé šíření v populaci a pro její zamezení je třeba provést náročná opatření, která však nemusí být účinná. Je brána v úvahu i moţnost vzniku paniky. Tyto organismy se dají jednoduše kultivovat. Do kategorie A jsou řazeny: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, resp. botulotoxin, Yersinia pestis, Variola major, Francisella tularensis a původci hemorhagických horeček (Ebola, Marburg, Lassa a Machupo viry etc.). Kategorie B Nemoci způsobené agens kategorie B nejsou tak snadno šiřitelné jako v případě agens kategorie A. Úmrtnost způsobených nemocí také není tak vysoká jako u kategorie A, nicméně při jejich zneuţití je stále třeba pouţít rozsáhlá protiepidemická opatření. Jako zástupci jsou uváděni Brucella sp., Clostridium perfringens, Salmonella sp., Escherichia coli O157:H7, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, ricin, stafylokokální enterotoxin B (SEB), Rickettsia prowazekii, původci virové encefalitidy, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum. Kategorie C Do této kategorie jsou řazena biologická agens, která v současné době nejsou povaţována za riziková. Nicméně z hlediska jejich dostupnosti a virulence je jejich zneuţití moţné. Do této kategorie CDC řadí např. virus Nipah nebo Hantavirus. 4.3 Současné závazné členění Jako reakce na iránsko-iráckou válku vznikla v roce 1984 tzv. Australská skupina. V současné době je v Australské skupině čtyřicet zemí včetně zemí Evropské unie, Japonska, USA, Kanady a Austrálie. Byla sestavena rozsáhlá databáze biologických agens, která podléhají mezinárodnímu dohledu. Tomuto dohledu podléhají rovněţ zařízení, která by mohla být pouţita pro šíření biologických agens nebo pro jejich kultivaci (fermentory, separátory buněk, aerosolové komory, rozstřikovače produkující více neţ 2 litry za minutu při velikosti částic menší neţ 50 m, vybavení pro laboratoře BSL3 a BSL4 ). V České republice je zodpovědnou institucí Oddělení pro kontrolu zákazu biologických zbraní, náleţící pod Státní úřad pro 20

21 jadernou bezpečnost (SÚJB). Tato instituce se zabývá výkonem státního dozoru. Ochrana civilního obyvatelstva před případným působením biologických agens je úkolem, na jehoţ řešení se podílí více státních a zdravotnických institucí. Dohoda Australské skupiny spolu s konvencí z roku 1972 byly převzaty do právního systému České republiky. Jde zejména o zákon 281/2002 Sb. a vyhlášku 474/2002 Sb. Agens jsou členěna do tří základních skupin: Biologická agens (Biological agents), Zvířecí patogeny (Animal pathogens) a Rostlinné patogeny (Plant pathogens). Mezi sledované organismy patří i nepatogenní organismy, do kterých byla vloţena genetická informace z mikroorganismů vedených v seznamu agens či patogenů. Za biologická agens jsou považovány: Viry (32 poloţek): Chikungunya virus, Congo-Crimean haemorrhagic fever virus, Dengue fever virus, eastern equine encephalitis virus, Ebola virus, Hantaan virus, Junin virus, Lassa fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Machupo virus, Marburg virus, monkey pox virus, Rift valley fever virus, virus ruské jaro-letní encefalitidy, variola virus, Venezuelan equine encephalitis virus, white pox, yellow fever virus, Japanese encephalitis virus, kyasanur forest virus, louping ill virus, Murray valley encephalitis virus, Omsk haemorrhagic fever virus, Oropouche virus, Powassan virus, Rocio virus, St Louis encephalitis virus, Hendra virus, South American haemorrhagic fever, pulmonary-renal syndrome-haemorrhagic fever viruses, Nipah virus. Rickettsie (4 poloţky): Coxiella burnetii, Bartonella quintana, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii. Bakterie (15 poloţek): Bacillus anthracis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Francisella tularensis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Clostridium perfringens (produkující epsilon toxin), Escherichia coli sérotyp O

22 Toxiny (19 poloţek): Botulotoxin (botulinum toxin), Clostridium perfringens toxin, conotoxin, ricin, saxitoxin, shiga toxin, Staphylococcus aureus toxin, tetrodotoxin, verotoxin, microcystin, aflatoxiny, abrin, cholera toxin, diacetoxyscirpenol toxin, T-2 toxin, HT-2 toxin, modeccin toxin, volkensin toxin, viscumin. Houby Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii. Organismy představující částečné riziko (Warning list): Bakterie: Clostridium tetani, Legionella pneumophila, Yersinia pseudotuberculosis. 22

23 5. VYBRANÍ ZÁSTUPCI VÝZNAMNÝCH BIOLOGICKÝCH AGENS V následující tabulce jsou přehledně prezentována významná biologická agens. V navazujícím textu jsou pak vybraná agens detailněji popsána. Biologické agens Způsobená nemoc Infekční dávka (aerosol) Původ Bacillus anthracis antrax CFU bakterie Brucella melitensis brucelóza CFU bakterie Francisella tularensis tularémie CFU bakterie Yersinia pestis mor méně neţ 100 CFU bakterie Rickettsia prowazekii tyfus šíření vektorem rickettsie Orthopoxvirus variola neštovice PFU virus Virové hemorhagické horečky Botulotoxin (z Clostridium botulinum) Ricin (z Ricinus communis) Ebola, Marburg, Lassa, Dengue etc otrava botulotoxinem 1 10 PFU virus LD 50 0,001 g/kg bakteriální toxin otrava ricinem LD g/kg rostlinný toxin 5.1 Bacillus anthracis Agens B. anthracis je gram-pozitivní, endosporulující bakterie. Spory jsou dlouhodobě stabilní. Uvádí se zachování virulence aţ 200 let, je proto doporučeno kadavery raději spalovat neţ pohřbívat. Vegetativní stadium má formu tyčky, je fakultativně anaerobní a snadno kultivovatelné v širokém rozpětí teplot. Byl vědecky zkoumán jako jeden z prvních patogenů jiţ roku 1877 Robertem Kochem. 23

24 Onemocnění B. anthracis je původce velmi nebezpečného onemocnění antraxu. Tato bakterie produkuje toxin, který má tři proteinové sloţky: protektivní antigen (PA nebo také faktor II), který se váţe na specifický receptor na eukaryotické buňce a vytváří sekundární receptory pro další dva proteiny edemogenní faktor (EF, faktor I) a letální faktor. Je to zoonóza vyskytující se v přírodě u divokých zvířat a také u domestikovaných zvířat. Jsou známy případy tohoto onemocnění u krav, koní, ovcí, slonů atd. Je snadno přenosné na člověka. Dokreslující je také anglický název woolsorters disease (onemocnění střihačů vlny) pro inhalační formu nemoci. Hmyz můţe být mechanickým vektorem původce. Antrax se můţe vyskytnout ve třech formách: koţní projevuje se hnisavě nekrotickým zánětem v místě infekce (pustula maligna). Při špatném léčebném postupu můţe dojít k celkové sepsi organismu. Tato forma je nejméně závaţná. Po pozření kontaminované potravy můţe dojít k rozvoji střevní formy se symptomy náhlé příhody břišní. Tato forma můţe mít velice váţný průběh, avšak v současné době při dodrţování hygienických zásad nemá příliš velkou incidenci. Nejváţnější onemocněním je forma inhalační (plicní). Tato forma vykazuje vysokou smrtnost i u léčených případů. Léčba a profylaxe Lze pouţít antibiotika doxycyklin, ciprofloxacin, levofloxacin, streptomycin, penicilin. Vţdy je třeba provést test citlivosti daného kmene na antibiotika. Nevýhodou penicilinu je fakt, ţe byly izolovány kmeny s beta-laktamasovou aktivitou. To znamená, ţe tyto kmeny jsou schopny tvořit destrukční enzymy, tzv. beta-laktamasy, které jsou schopny rozkládat v terapii běţně uţívaná beta-laktamová antibiotika peniciliny, cefalosporiny, monobaktamy a karbapenemy. Existují i vakcíny zaloţené na aplikaci nevirulentních kmenů. Za zmínku stojí, ţe první experimenty s vakcinací prováděl jiţ Louis Pasteur. 5.2 Brucella melitensis Agens B. melitensis je gram-negativní tyčka. Není u ní pozorována tvorba spor. Podle CDC je B. melitensis řazena do kategorie B jako jediný zástupce rodu. Ostatní virulentní zástupci: B. suis, B. abortus a B. canis mohou také vyvolat onemocnění brucelózu, jejich virulence vůči člověku je však mnohem menší ve srovnání s B. melitensis. 24

25 Onemocnění B. melitensis (pův. Micrococcus melitensis) jako původce brucelózy maltské horečky, byla popsána Davidem Brucem v roce Brucelóza je zoonóza nejčastěji přirozeně rozšířena mezi hospodářskými zvířaty, ale i lovnou zvěří. Člověk se můţe nakazit poţitím špatně tepelně ošetřených potravin ţivočišného původu. Asi nejznámější jsou případy infekce přenesené poţitím kozího mléka. Šíření z člověka na člověka je vzácné. Inkubační doba je značně dlouhá, 5 60 dní. I díky tomu je brucelóza řazena do kategorie B. Úmrtnost se pohybuje do 2 %. Ve většině případů převaţují projevy chronického onemocnění, které je charakterizováno bolestí kloubů a zad. Symptomy jsou většinou nespecifické. Diagnostika Vyuţívá se detekce protilátek v séru. Kultivace je obtíţná. Histopatologicky nacházíme granulomatózní zánět v různých lokalizacích (játra, kosti, varlata). Léčba a profylaxe Moţná léčba je tetracykliny, streptomycinem, gentamycinem. V současné době není dostupná vakcína pro ochranu obyvatel. K dispozici jsou veterinární vakcinační kmeny RB-51, RB-19 a REV-1. Brucella jako biologická zbraň Poprvé byla bakterie rodu Brucella pouţita jako biologická zbraň americkou armádou v roce 1954 v Arkansasu. Byla pouţita B. suis, protoţe dobře přeţívala v aerosolu a odolávala vysušení. Americký výzkum byl tehdy zaměřen na B. suis (původce brucelózy prasat Agent US), B. abortus (brucelóza skotu Agent AB) a B. melitensis (brucelóza ovcí a koz Agent AM). Pro přenos agens byla vyvinuta bomba M114, která se pouţívala i pro šíření B. anthracis. Infekční dávka byla u zbraně US a AB 500 buněk na osobu a u AM 300 buněk na osobu. Efekt byl očekáván do dvou týdnů s trváním několika měsíců. Předpokládala se aţ 3% mortalita. 5.3 Francisella tularensis Agens F. tularensis je drobná, optickou mikroskopií jen obtíţně pozorovatelná, gram-negativní tyčka aţ kokotyčka bez aktivního pohybu a prokázané sporulace. Je to fakultativně anaerobní mikroorganismus a intracelulární 25

26 patogen. Poprvé byla izolována v roce 1911 poblíţ kalifornského města Tulare. Lidská forma nemoci byla popsána aţ v roce 1922 Edwardem Francisem. Podle města prvního izolátu a doktora Francise nese mikroorganismus své rodové jméno. Jsou známy čtyři poddruhy s rozdílnou virulencí. Poddruh tularensis (známá téţ jako subtyp A nebo neoarctica) je nejvíce virulentní. Dříve rozpoznávaný podle schopnosti metabolizovat L-citrulin a glycerol. Vyskytuje se na severoamerickém kontinentu. Méně viruletní poddruh je holarctica (subtyp B, palaeartica), je rozšířena v Eurasii a Severní Americe. Úmrtnost u tohoto subtypu je desetkrát niţší neţ u subtypu A. Poslední dva poddruhy F.t. mediasiatica a F.t. novicida jsou jen velmi málo virulentní a jejich význam jako moţných biologických agens je minimální. Tularémie je nákaza s přírodní ohniskovostí přenášená zejména členovci (nejčastěji klíšťaty, případně krev sajícím hmyzem). Hlodavci, zajíci a divocí králíci jsou častými rezervoárovými hostiteli. V bioterorismu se vyuţívá aerosolů obsahujících F. tularensis, kdy díky malé infekční dávce (10 50 buněk) je snadno šiřitelná ovzduším. Onemocnění F. tularensis způsobuje velmi infekční onemocnění tularémii. Dennis et al. (2001) uvádí průměrnou úmrtnost pro USA 1,4 % z celkového počtu zasaţených jedinců. Přirozeným rezervoárem v přírodě jsou hlodavci a zajíci. Přenos na člověka se děje manipulací s nakaţenými zvířaty nebo prostřednictvím vektoru (klíště, savý hmyz). Přenos z člověka na člověka není prokázán. Moţné formy nemoci jsou ulceroglandulární, oroglandulární, okuloglandulární. V případě poţití kontaminované stravy i intestinální. K rozvoji plicní formy dochází také velmi často. Je popsán i případ hromadného nakaţení poté, co se infikovaný pes otřepal v uzavřené místnosti během společné večeře (Siret et al., 2006). Diagnostika Prokazují se protilátky v séru a lze také vyuţít PCR detekci. Léčba a profylaxe Lékem první volby je streptomycin, dále se pouţívá gentamycin, tetracykliny a chloramfenikol. V současné době není komerčně dostupná vakcína. Je k dispozici ţivý očkovací kmen F. tularensis LVS připravený v padesátých letech minulého století. Toto očkování však není schváleno pro humánní medicínu. 26

27 F. tularensis jako biologická zbraň F. tularensis byla zahrnuta do programu biologických zbraní v USA, Rusku a Japonsku. Ruský vědec Kanatjan Alibekov (dnes ţijící v USA jako Kenneth Alibek) tvrdí, ţe tularémie byla šířena ruskou armádou mezi německými vojáky krátce před obléháním Stalingradu za druhé světové války. F. tularensis (Agent UL) byla v programu biologických zbraní USA v roce 1954, pro její šíření byla vyvinuta bomba M Yersinia pestis Agens Y. pestis je nepohyblivá, špatně rostoucí gram-negativní kokobacilární tyčka. Jen ojediněle tvoří řetízky. Je fakultativně anaerobní. Roste při širokém spektru teplot. Onemocnění Y. pestis způsobuje velmi váţné onemocnění mor (pestis). Rezervoárem onemocnění jsou drobní savci, především hlodavci. Vektorem přenosu je blecha, nejčastěji Xenopsylla cheopis. Nemoc se můţe projevit v bubonické (lymfadenitida), septické, koţní nebo plicní formě. Onemocnění se rozvíjí po inkubační době 2 6 dnů. První symptomy jsou horečka, zvracení, průjmy, malátnost (Reyn et al., 1977). Morové epidemie jiţ v minulosti ovlivnily lidské civilizace. Jmenujme některé velké historicky doloţené epidemie. V roce 541 se rozšířila rozsáhlá epidemie z Egypta do celé středomořské oblasti. V letech černá smrt vyhladila téměř polovinu evropské populace. V devatenáctém století se rozšířil mor ze střední Číny (provincie Yunnan, počátek v roce 1855) do Hong Kongu a následně lodní dopravou do celého světa. Důsledkem této celosvětové pandemie byl např. vznik nových přírodních ohnisek moru na rozsáhlém geografickém území Severní Ameriky, kde se mor před rokem 1899 vůbec nevyskytoval. Působením bakteriálního toxinu při septikemické formě dochází k rozvoji DIC (diseminovaná intravaskulární koagulopatie) a vzniku mikrotrombů, které způsobí ischemickou nekrózu zejména apikálních části končetin (tak vzniklo označení černá smrt). Po spotřebování sráţecích faktorů dochází k fatálnímu krvácivému stavu. Léčba a profylaxe Léčba moru je moţná streptomyciny a tetracykliny. Penicilin je účinný in vitro, ale pro rozvinuté onemocnění není vhodný. Moţná je i vakcinace 27

28 zaloţená na oslabených (atenuovaných) buňkách, její účinnost však není detailně známá díky malé incidenci moru ve světě. Při pouţití Y. pestis jako biologické zbraně je třeba důsledně dbát hygienických zásad a zabránit kontaktu s vektorem. Poslední epidemie moru proběhla v Indii (Surat) v roce 1994, kde za příznaků plicní formy moru zemřelo 52 lidí. Y. pestis jako biologická zbraň Mor byl vyuţíván jako biologická zbraň uţ ve starověké Číně a středověké Evropě. Během druhé světové války pouţila japonská armáda k šíření moru velké mnoţství blech. Během japonské okupace Mandţuska japonská Jednotka 731 vědomě nakazila morem čínské, korejské a mandţuské vězně a studovala průběh choroby. Po druhé světové válce pracovala americká i sovětská armáda na vývoji infekčního aerosolu schopného vyvolat plicní formu moru. 5.5 Vibrio cholerae Agens V. cholerae je gram-negativní bakterie. Při pozorování pod mikroskopem je patrný tvar zakřivených tyčinek. Podle CDC je řazena do kategorie B. Poprvé ji izoloval z infikované tkáně roku 1854 italský vědec Filippo Pacini. V. cholerae existuje v řadě sérotypů. Z celkem 155 známých séroskupin je patogenní sérotyp O1 (biotypy Clasica I. A El Tor). V devadesátých letech dvacátého století byla popsána onemocnění sérotypy O139 a O140. Faktorem patogenity této bakterie je cholerový enterotoxin váţící se na enterocyty tenkého střeva se vznikem profuzních průjmů vedoucích k rychlé dehydrataci, hypovolemickému šoku a smrti. Onemocnění Nejčastější přenos na člověka je poţitím vody nebo potravin kontaminovaných fekáliemi. Zdrojem šíření nemoci v lidské společnosti je pak člověk v akutní fázi onemocnění. Výjimkou nejsou případy subklinického bacilonosičství. Při nemoci dochází k četným silným průjmům, které jsou provázeny tenezmy a ztrátou tekutin. Při onemocnění je do organismu hostitele uvolňován cholera toxin. Jedná se o protein se šesti podjednotkami: 5krát B a 1krát A. Zatímco B části hrají roli při interakci s povrchem buněk (usnadňují průnik molekuly proteinu do buňky), A část má katalytickou 28

29 aktivitu (je to část, která nese vlastní toxicitu). Cholera toxin po distribuci do tkání ADP-ribozyluje protein G a tím jej inhibuje. Diagnostika Provádí se kultivace a PCR detekce V. cholerae ze stolice. Léčba a profylaxe U nemocného je třeba nahradit nadměrné ztráty tekutin a iontů. Při pravidelném doplňování tekutin je smrtnost menší neţ 1 %. Je moţné nasadit i antibiotika nejčastěji tetracykliny. Dostupná je rovněţ vakcína. Ta je doporučována před cestou do oblastí s horší hygienickou situací. V. cholerae jako biologická zbraň Z historie je známo mnoho pandemií cholery. Poslední epidemie proběhla v Zimbabwe v roce Bylo nakaţeno lidí a zemřelo 3700 lidí. Prezident Mugabe obvinil britskou vládu z pouţití biologické zbraně s V. cholerae. Epidemie cholery probíhají dodnes, zejména v zemích třetího světa. 5.6 Rickettsia prowazekii Agens Rickettsie je malý organismus. Dlouho byla povaţována za gram-negativní bakterii, ale vyskytuje se u ní mnoho odchylek. Čtvrtina genomu je tvořena introny. Je to intracelulární patogen, který je zcela závislý na metabolických pochodech hostitelské buňky. Při kultivacích jsou nutné postupy běţné ve virologii. R. prowazekii je nejvíce virulentní zástupce ze známých biologických agens. Ovšem i další zástupci R. typhi a R. felis mohou způsobit onemocnění. Je zde třeba upozornit na zmatečnou nomenklaturu: Salmonella typhmurium a S. typhi jsou původci váţných onemocnění podobných tyfu, ale nejedná se o pravý tyfus. Onemocnění R. prowazekii způsobuje tzv. skvrnitý tyf. Je to striktně intracelulární patogen. Přenáší se výkaly vši Pediculus humanus corporis. Inkubační doba je kratší neţ čtrnáct dnů, pro začátek onemocnění je charakteristická vysoká horečka. Následně se objevuje tmavý exantém. Epidemický tyfus je provázen vysokou smrtností okolo 30 % a dokonce aţ 70 %, pokud je léčba 29

30 zanedbána (Raoult et al., 1998). Tyfus se šíří především v místech se špatnými hygienickými podmínkami, kde je současně ubytováno větší mnoţství lidí. Diagnostika Detekce protilátek ze séra a průkaz pomocí PCR. Léčba a profylaxe Účinnými antibiotiky jsou tetracyklin a chloramfenikol. Vakcinace se běţně neprovádí, ale je moţno ji realizovat za pouţití ţivých atenuovaných buněk. R. prowazekii jako biologická zbraň Tato bakterie je vedena jako potencionání biologická zbraň. Reálný útok však dosud nebyl zaznamenán. 5.7 Orthopoxvirus variola Agens Orthopoxvirus variola je DNA virus tvořící velké částice chráněné membránou. Infekční jsou však i částice bez mebránových struktur, které se uvolňují z infikovaných buněk v rámci lytického cyklu. Vyskytuje se ve dvou formách major a minor. Forma major způsobuje pravé neštovice s vyšší letalitou. Tato forma je také povaţována za biologické agens kategorie A podle CDC. Onemocnění Pravé neštovice (variola) mají relativně dlouhou inkubační dobu, a to aţ dva týdny. Poté se začnou projevovat první příznaky onemocnění, v této fázi mohou být příznaky zaměněny za chřipkovou infekci. Po několika dnech od prvních symptomů však vznikají typické léze v klasickém pořadí makula papula vesikula pustula. Na rozdíl od varicely (planých neštovic) léze poškozují tkáň do hloubky a dochází k četným malformacím. Pod odborným dohledem WHO byly neštovice eradikovány. Eradikace byla slavnostně vyhlášena dne Po tomto datu měly být uchovány vzorky virů pro vědecké účely v USA a Sovětském svazu. Po rozpadu Sovětského svazu pak v Ruské federaci. V současné době existují obavy, zda se variola nedostala do nepravých rukou v období těsně po ukončení Sovětského biologického zbrojního programu. 30

31 Léčba a profylaxe Po prodělaném onemocnění zůstává dlouhodobá imunita. Pro léčbu je moţné pouţít adenin arabinosid nebo cytosin arabinosid, účinnost je však jen omezená (Koplan et al., 1975; Monsur et al., 1975). Proti neštovicím je moţné provádět očkování. První vakcinace byla realizována kravskými neštovicemi. Tento objev spadá do konce osmnáctého století, kdy byl popsán lékařem Edwardem Jennerem. Díky eradikaci není jiţ nutné drţet ve zdravotnických rezervách vakcíny proti neštovicím, proto pokud by vypukla rozsáhlá epidemie neštovic po pouţití biologické zbraně obsahující virus neštovic, nebude moţné dostatečně chránit civilní obyvatelstvo. Orthopoxvirus variola jako biologická zbraň Někteří vojenští historici tvrdí, ţe Britové pouţili virus pravých neštovic ve válce s Francouzi a Indiány v letech ve Fort Pitt v západní Pennsylvánii. Informace o podobných zneuţitích tohoto agens jsou zaznamenány i z období bojů o nezávislost v Americe v letech Během druhé světové války vyvíjeli britští, američtí a japonští vědci biologickou zbraň s vyuţitím viru neštovic. Tato zbraň však nebyla pouţita, neboť se předpokládala malá účinnost vzhledem k plošné vakcinaci. Vývoj biologické zbraně s virem neštovic probíhal po druhé světové válce v SSSR. Není známo, zdali je tato zbraň v Rusku připravena k pouţití. Vakcinace proti neštovicím se v současnosti neprovádí. 5.8 Viry hemorhagických horeček Agens Jedná se o širokou skupinu obalených RNA-virů způsobujících onemocnění s podobnými symptomy. Jedná se o viry čeledi Filoviridae (Ebola, Marburg), Arenaviridae (Lassa, virus horečky Nového světa), Bunyaviridae (virus krymsko-konţské hemorhagické horečky, Rift Valley Fever virus), Flaviviridae (Dengue, viry ţluté zimnice a omské hemorhagické horečky). Onemocnění Onemocnění způsobená těmito agens jsou typická rychlou progresí. Dochází ke zvýšení krvácivosti. Mortalita je značná. Na druhou stranu je přirozený výskyt nemocí v oblastech s limitovanou lékařskou péčí. Je tedy otázkou, zda by rozšíření nemoci v zemi s rozvinutým zdravotním systémem dosahovalo obdobně vysoké úmrtnosti. Přenos nemoci můţe být způsoben kontaktem s nemocným, potřísněním krví, ale také pohlavním stykem. 31

32 Některé hemorhagické horečky mohou být šířeny vektory komáry a klíšťaty. Rezervoárem jsou hlodavci. Léčba a profylaxe Doporučuje se aplikace antivirotik, nejčastějí ribavirinu. Nicméně účinnost zmíněné léčby je jen omezená (Huggins, 1989). Vakcíny nejsou dostatečně účinné. Hemorhagické horečky jako biologická zbraň Epidemie hemorhagické horečky různého původu občas vzplanou zejména v tropických oblastech. Byly však také zavlečeny do Evropy Ebola v Německu (Marburg) a v bývalé Jugoslávii. Oficiálně nebylo dosud prokázáno, ţe by některý z původců hemorhagické horečky byl pouţit jako biologická zbraň. 5.9 Botulotoxin Agens Jedná se o toxin produkovaný mikroorganismem Clostridium botulinum, v menší míře C. baratii a C. butyricum. Botulotoxin se vyskytuje ve formách A, B, C, D, E, F, G. Ve všech případech se jedná o ZnII+ endopeptidasu sestávající ze dvou podjednotek: 100 kda a 50 kda. Botulotoxin brání uvolnění acetylcholinu do prostoru synaptické štěrbiny. Formy A, C a F působí cestou hydrolýzy receptoru SNAP-25. Formy C, D, F a G pak poškozují synaptobrevin. C. botulinum ani jimi produkované neurotoxiny neztrácejí svou aktivitu v kyselém prostředí, spory přeţívají i několikahodinový var. Intoxikace Příznaky botulismu se objevují za hodin po pozření kontaminované potravy. Patří mezi ně nauzea, zvracení, průjem (někdy zácpa) a částečná obrna svalů. Mezi další komplikace patří dvojité nebo rozostřené vidění, poklesnutí očního víčka jako důsledek ochrnutí, náhlá aţ prudká ztráta hlasu, rychlý nástup paralýzy dýchacích svalů. Smrtelná dávka pro člověka je 0,1 ng/kg hmotnosti. Léčba a profylaxe Při nakládání s podezřelými potravinami nebo nápoji lze vyuţít faktu, ţe botulotoxin je tepelně labilní. Zatímco při pokojových teplotách je ve vodném roztoku stabilní několik dní, zahřátí na 85 C po dobu 5 minut je 32

33 dostatečné pro jeho inaktivaci. Je moţné provádět vakcinaci za pouţití pentavalentní vakcíny obsahující toxoidy forem A, B, C, D, E. Botulotoxin jako biologická zbraň Botulotoxin byl upraven pro vojenské vyuţití v USA. V Iráku byla Spojenými národy objevena munice s l botulotoxinu. O zneuţití botulotoxinu pro teroristické účely se pokoušela i skupina Óm Šinrikjó Ricin Agens Ricin je toxický sekundární metabolit rostliny skočce obecného (Ricinus communis). Jedná se o makromolekulu proteinu sestávající ze dvou částí. A a B jednotky jsou spojené sulfidickým můstkem. Blokuje syntézu proteinů v buňce vazbou na rrna. Intoxikace Zatímco část B má význam pro vstup do buněk, část A má enzymatickou aktivitu. Ricin proniká do 60S podjednotky ribozomů a v podjednotce 30 S hydrolyzuje adenin v pozici Je velmi účinný, jedna molekula ricinu je schopna inaktivovat aţ 1500 ribozomů během jedné minuty. Intoxikace se projevuje za několik desítek minut aţ hodin gastrointestinálními obtíţemi: nauzeou, zvracením. Charakteristické jsou také obtíţe s dýcháním. Postupně dochází k selhávání orgánů. Léčba a profylaxe V současné době není k dispozici účinná léčba jiţ rozvinuté otravy. Ricin jako biologická zbraň Ricin je snadno dostupná biologická zbraň, jeţ byla v minulosti mnohokrát pouţita. Ricin byl pouţit i pro atentát na bulharského emigranta v Londýně Georgie Markova pomocí speciálně upraveného deštníku, kterým byly do těla injikovány pelety obsahující ricin. V říjnu 2003 byl objeven ricinový prášek na poště v Jiţní Karolíně a v únoru 2004 v kanceláři senátora USA. V roce 2003 byla zatčena skupina Alţířanů připravující teroristický útok v londýnském metru za pouţití ricinu. 33