Zjišťování toxicity. Základy toxikologie a ekologie Marek Šír

Transkript

1 Zjišťování toxicity Základy toxikologie a ekologie Marek Šír sirm@vscht.cz

2 Souhrn Závislost účinku na dávce Od akutní přes chronickou toxicitu po testy karcinogenity experimentální toxikologie Zdroje dat, legislativa, expoziční limity, analýza rizika Expozice toxickým látkám v běžném životě

3 podíl odpovědí % podíl odpovědí % Závislost účinku na dávce Kumulativní závislost Diferenciální závislost log D Hormeze a homeostáze Práh účinku Opakovaná expozice log D

4 Testování toxicity In vitro v moderní toxikologii nejvýznamnější zdroj poznatků, na biomolekulách, buněčných preparátech, s využitím jednoduchých organismů (bakterie, prvoci) In vivo pokusy v živém organismu, na zvířatech Ex vivo mimo živý organismus, např. na tkáních z poraženého dobytka (In silico) SAR, QSAR

5 Testy akutní toxicity Cíl zjistit závislost akutního účinku na dávce testované látky Nejčastěji letální účinek mortalita Medián letální dávky LD 50, medián letální koncentrace LC 50 Tvar křivky v závislosti na obsazenosti receptoru S + R k 1 k 2 SR Stanovení LD 50, LC 50 Minimálně 3 dávky pod, blízko a nad očekávanou LD 50 Poté 2 týdny sledování latence, další projevy Testování nejčastěji na hlodavcích, skupiny mezi 5 10 Účel - klasifikace látek podle toxicity, např. pro silně toxické léčiva Problém - přenesení na jiné druhy (člověka)

6 5 zvířat 5 mg/kg 5 zvířat 50 mg/kg A B C A B C A T+ T+ T+ T T Metoda fixní dávky A alespoň 2 zvířata uhynou B uhyne 1, nebo 1 zjevné známky toxicity C žádné neuhyne ani známky toxicity T + - vysoce toxické T toxické Xn zdraví škodlivé N neklasifikované podle toxicity 5 zvířat 300 mg/kg B Xn C 5 zvířat 2000 mg/kg A B C Xn N N Pro klasifikaci látek podle toxicity Šetrnější na počet zvířat Neumožňuje stanovit LD 50 Neměří kvantitativně míru toxicity

7 podíl odpovědí % Subchronické testy Subakutní 2-4 týdny Subchronické dní Min. 3 dávkové hladiny, 1 neexponovaná skupina, někdy pozitivní kontrola, skupin zvířat Nejvyšší hladina max. 10% úhyn Měření odpovědí ztráta (přírůstku) hmotnosti, biochemické parametry, aktivity enzymů NOAEL Práh účinku LOAEL log D Posuzování bezpečnosti léčiv, potravinových aditiv, pesticidů NOAEL (no observed adverse effect level) nebyl pozorován účinek LOAEL (the lowes observed adverse effect level) nejnižší dávka, kdy byl pozorován

8 podíl odpovědí % Chronické testy Cíl stanovení dlouhodobého působení látek, kumulativních účinků Opakované dávky po dobu dospělého života myši (6 měsíců), potkana (2 roky) % odpovědí v kontrolní populaci Maximální tolerovaná dávka (MTD) ze subchronického testu (slabý pokles hmotnosti), 1/2 MTD, 1/4 MTD, neexponovaná skupina NOAEL Práh účinku LOAEL log D Kontrolní populace má zásadní význam LOAEL nejnižší dávková hladina, při které je podíl odpovědí statisticky odlišný od kontrolní populace

9 Testy karcinogenity Cíl identifikovat látky, které vyvolávají novotvary (benigní a maligní nádory) a získat tak podklady pro stanovení přijatelných denních dávek a pro analýzu rizika Nutné velké množství zvířat, myš, potkan, skupiny nejméně 100 zvířat (50 samců, 50 samic), často speciální kmeny transgenické myši např. s nedostatečně aktivními nebo nefunkčními opravnými mechanismy DNA 3 4 dávkové hladiny, MTD, 1/2MTD, 1/3MTD, 1/4MTD Problém poškození buněk v důsledku toxicity vysokých dávek látky

10 Zákon č. 246/1992 Zákon na ochranu zvířat proti týrání ČÁST TŘETÍ Ochrana pokusných zvířat Zejména: Cíle pokusů eticky opodstatněné a jsou nezbytné. Pokusy mohou být povoleny pouze po ověření, že při současném stavu nelze zajistit poznatky nebo jejich využití jinými metodami nebo postupem. Pokusy se smějí provádět jen v uživatelských zařízeních, kterým bylo Ústřední komisí pro ochranu zvířat uděleno oprávnění, mají potřebné odborně způsobilé pracovníky a zařízení vyhovující pro příslušný druh a množství pokusných zvířat.

11 Amesův test Slouží ke stanovení mutagenního a karcinogenního potenciálu chemických sloučenin. Několik kmenů bakterie Salmonella typhimurium mutace v genech účastnících se syntézy aminokyseliny histidinu - vyžadují tedy externí zdroj histidinu. Sleduje se schopnost testované látky způsobit reverzní mutaci a obnovit růst bakterie v mediu bez přídavku histidinu. Jaterní enzymy Potenciální mutagen inkubace Vysoký počet změněných bakterií (hisna his+) udává, že látka způsobuje mutace kmeny Salmonella (vyžadující histidin) Média s minimálním množstvím histidinu inkubace Kontrola

12 Klasifikace karcinogenů Legislativa EU Direktiva 67/5448/EHS Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC International Agency for the Research on Cancer) Americký vládní Národní toxikologický program (NTP, National Toxicology Program) Americká agentura pro ochranu životního prostředí (US EPA, United States Environmental Protection Agency) Organizace spojených národů Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemikálií (GHS, Globally Harmonized Systém of Classification and Labeling of Chemicals)

13 Klasifikace karcinogenů EU 3 kategorie 1 Prokázané lidské karcinogeny 2 Podezřelé lidské karcinogeny 3 Látky, které nejsou zařaditelné mezi karcinogeny US EPA - 5 skupin A E, (B1 a B2), + také podrobnější slovní hodnocení NTP- 2 kategorie IARC 5 skupin 1 Karcinogenní pro člověka 2A Pravděpodobně karcinogenní pro člověka 2B S potenciálním karcinogenním účinkem pro člověka (možné lidské karcinogeny) 3 Nejsou klasifikovatelné jako lidské karcinogeny 4 Pravděpodobně nekarcinogenní pro člověka GHS - 2 skupiny (1. má 2 podskupiny) Látka EU IARC NTP US EPA vinylchlorid 1 1 A A azbest 1 1 A B2 chloroform 3 2B B B2 Ethanol neklasifikován 1 neklasifikován neklasifikován

14 Převod dat, prahový a bezprahový účinek Převedení dat z pokusných zvířat na člověka: vztažené na tělesnou hmotnost (m), na velikost povrchu těla (S = k m 2/3 ) nebo na energetické nároky (EN = k m 3/4 ). Prahový účinek: lze určit přípustnou denní dávku ADI acceptable daily intake, zanedbatelné nebo žádné riziko při celoživotní expozici ADI = NOAEL / (UF.MF) UF (uncertainty factor) faktor neurčitosti, hodnoty 1-10, MF (modifying factor) modifikující faktor, 0<MF<10 RfD = BMD10 / (UF.MF) Bezprahový účinek: např. genotoxické karcinogeny Vyjadřuje se statisticky významný nárůst výskytu nádorů, obvykle se volí přípustná míra rizika Extrapolace experimentálních dat k velmi nízkým hladinám řada matematických modelů

15 Predikční metody SAR, QSAR (quantitative structure-activity relationship) Kvantitativní vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou Toxikofor nitroareny, halogenalkeny, aromatické aminy Plánování nových léčiv 2-fenylethylamin adrenalin dopamin methamfetamin

16 Epidemiologické studie Kohortní sledování změn ve vybrané skupině exponované určité látce oproti kontrolní skupině, dlouhé časové období, srovnává se: výskyt určitých nemocí, úroveň expozice, počet úmrtí Případové skupina jedinců s určitou nemocí se srovnává s kontrolní skupinou zdravých jedinců (co nejvíce podobní věk, pohlaví), cíl: identifikace rizikových faktorů Průřezové náhodný výběr, jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice, pak následuje odpovídající vyšetření, cíl: popsat vztah mezi nemocí a faktory, které ji mohou vyvolat nebo ovlivnit Expozice Onemocnění Celkem ANO NE ANO a b a + b NE c d c + d Celkem a + c b + d n Relativní riziko: R = [a/(a+b)] / [c/(c+d)]

17 Klinické studie Záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků Státní ústav pro kontrolu léčiv V několika fázích, jejichž cílem je získat pro navržený účel použití léku dostatek informací, aby se mohl vyhodnotit poměr mezi jeho prospěchem a riziky: I. Fáze představuje studie/klinická hodnocení nejčastěji prováděná na zdravých dobrovolnících. Výzkum na zdravých dobrovolnících se neprovádí, je-li podání látky zdravému člověku vysoce nevhodné (např. u cytostatik). Zjištění působení v organismu, dávkování pro minimalizaci nežádoucích účinků, od nízkých dávek, NE hodnocení účinnosti léčivého přípravku. II. Fáze Látka podávána v dané indikaci malému počtu vybraných nemocných (desítky až stovky). Ověřují se léčebné účinky. III. Fáze Studie s velkým souborem testovaných osob (stovky až tisíce pacientů) pak žádost o registraci a používání. IV. Fáze Shromažďování informací.

18 TOXNET Volně přístupné Informace o toxicitě látek, životním prostředí, lékařství Využívá řadu databází: TOXLINE Toxicology Literature On Line DART - Developmental and Reproductive Toxicology Database HSDB - Hazardous Substances Data Bank CCRIS - Chemical Carcinogenesis Research Information Systém GENETOX - Genetic Toxicology Data Bank IRIS - Integrated Risk Information Systém ITER - International Toxicity Estimates for Risk LactMed - Drugs and Lactation Database Household product Database

19 Zdroje toxikologických dat Web of Science (WoS) přístupné z VŠCHT Praha, přírodní a technické vědy Scopus přístupné z VŠCHT Praha, široké zaměření přírodní, technické, lékařské a humanitní vědy PubMed volně přístupné, medicína, farmakologie MedScape volně přístupné, medicína, toxikologie z pohledu medicíny

20 Informace o toxicitě Státní zdravotní ústav Centrum toxikologie a zdravotní bezpečnosti (CTZB) - toxikologické metody, biomedicína, chemická bezpečnost výrobků, toxikogenomika, + Národní referenční laboratoře a centra (NRL, NRC) Toxikologické informační středisko (TIS) Co dělat při akutní otravě volejte nebo Klinika pracovního lékařství 1. LF UK a VFN např. Centrum pracovního lékařství, Laboratoř průmyslové toxikologie možnost vyšetření biologického materiálu

21 Zákon 350/2011 Sb o chemických látkách a chemických směsích a o změně některých zákonů (chemický zákon) Upravuje práva a povinnosti právnických osob a podnikajících fyzických osob při výrobě, klasifikaci, zkoušení nebezpečných vlastností, balení, označování, uvádění na trh, používání, vývozu a dovozu chemických látek (a směsí) Definuje vlastnosti látek a směsí a skupiny nebezpečnosti: Výbušné Oxidující Vysoce toxické Toxické Karcinogenní 3 kategorie dle EU Extrémně hořlavé Vysoce hořlavé Zdraví škodlivé Žíravé Mutagenní Toxické pro reprodukci Hořlavé Dráždivé Nebezpečné pro životní Senzibilizující prostředí Výrobce, dovozce nebo následný uživatel, který uvádí na trh látku nebo směs, ji v závislosti na intenzitě jejích nebezpečných vlastností při klasifikaci zařazuje do jedné nebo více skupin nebezpečnosti.

22 Vyhláška č. 402/2011 o hodnocení nebezpečných vlastností chemických látek a chemických směsí a balení a označování nebezpečných chemických směsí Prováděcí předpis k zákonu 350/2011 Sb Obsahuje obecné postupy pro hodnocení nebezpečných vlastností látky a směsí, popis výstražných symbolů, standardní věty označující specifickou rizikovost a standardní pokyny pro bezpečné zacházení. R věty (R 41 Nebezpečí vážného poškození očí) S věty (S 25 Zamezte styku s očima, S 26 Při zasažení očí důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc) Zrušena od

23 Nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci a označování látek a směsí = nařízení CLP (classification, labelling and packaging) Obsáhlý předpis, včetně příloh již přes 2000 stran, mnohokrát novelizován Nadřazen národním legislativním předpisům Obsahuje Standardní věty o nebezpečnosti podle nařízení GHS a Pokyny pro bezpečné zacházení

24 Nařízení (ES) č. 1272/2008 H318 Způsobuje vážné poškození očí P262 Zabraňte styku s očima, kůží nebo oděvem P305+P351+P313 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření Výstražné symboly nebezpečnosti Fyzikální nebezpečnost Nebezpečnost pro zdraví Nebezpečnost pro ŽP

25 Bezpečnostní listy Material Safety Data Sheets (MSDS) Pokud je daná látka klasifikována jako nebezpečná podle nařízení (ES) č. 1272/2008, je povinností osoby (výrobce i dovozce), která uvádí látku na trh, vypracovat Bezpečnostní list (u nás např. Penta, Sigma-Aldrich) Skládá se z několika oddílů Identifikace látky/směsi a společnosti, Identifikace nebezpečnosti, Složení/Informace o složkách, Pokyny pro první pomoc, Opatření pro hašení požáru, Opatření v případě náhodného úniku, Zacházení a skladování, Osobní ochranné prostředky, Fyzikální a chemické vlastnosti, Stálost a reaktivita, Toxikologické informace, Ekologické informace, Pokyny pro odstraňování, Informace o přepravě, Informace o předpisech

26 Inhalační expozice Ventilace plic D i = R V i c i t R = (c i c e ) / c i V závislosti na stupni fyzické zátěže. NPK nejvyšší přípustná koncentrace PEL přípustný expoziční limit Imisní limity Nařízení č. 361/2007 Sb. kterým se stanoví podmínky ochrany zdraví při práci Látka NPK - P (mg/m3) PEL (mg/m3) Imisní limit (mg/m3) benzen ,005 olovo 0,2 0,05 0,00005 ethanol

27 Expozice požitím a expozice kontaktem s kůží Pracovní prostředí X Běžný život US EPA definuje průměrné a maximální hodnoty příjmu potravy, pitné vody a další veličiny pro stanovení míry expozice, ADI, RfD [mg/kg.den] a stanovení míry rizika (např. HQ hazard quotient a HI hazard index) HQ = E/RfD E průměrná denní absorbovaná dávka (ADD) nebo průměrná celoživotní denní absorbovaná dávka (LADD), resp. chronický denní příjem CDI [mg/kg.den] Látka Pitná voda Zelenina Půda (vstup ústy) Odhad průměrné hodnoty 1,4 l za den (dospělí), 1 l za den (děti) 200 g za den 100 mg za den (dospělí), 200 mg za den (děti) Kombinovaná expozice např. při užívání vody kontaminované těkavou látkou ústy, inhalačně (sprchování - teplá voda), přes kůži

28 Biologické indikátory Indikátorem expozice je samotná látka, metabolit, produkt reakce s biomolekulami, biochemický parametr Biologický expoziční limit (BEL) limitní hodnota, z epidemiologické studie, z PEL Využití - hodnocení expozice z pracovního prostředí Biologický indikátor dostatečná citlivost, neinvazivnost odběru, specifičnost, znalost kvantitativní závislosti Škodlivá látka Biologický indikátor BEL Vzorek toluen Hippuronová kyselina 1600 mg/g kreatininu moč, konec směny Vztaženo na koncentraci kreatininu - standardizace

29 Další informační zdroje US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) - Protects Our Health, Environment & Economy Rozsáhlé studie: např. EPA-823-R Water Quality Criterion for the Protection of Human Health: Methylmercury 303 stran US FDA (U.S. Food and Drug Administration) - Protecting and Promoting Your Health WHO- World Health Organization IPCS - International Programme on Chemical Safety Vliv chemických látek na lidské zdraví, hodnocení rizika, posílení chemické bezpečnosti, management Evropská Agentura pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci

30 RISC Software RISC (Risk-Integrated Software for Cleanups) Odhad nepříznivých vlivů toxických látek na lidské zdraví, karcinogenních i nekarcinogenních, možnost volit z čtrnácti expozičních cest. Potřebné údaje pochází z databází US EPA.

31 Knihy o toxikologii Články WoS, Scopus, PubMed Bezpečnostní listy (MSDS) Databáze - TOXNET H věty P - věty SZÚ, TIS, Klinika pracovního lékařství PEL, NPK, NPK-P Zákon 350/2011 Sb Nařízení (ES) č. 1272/2008 Nařízení vlády 361/2007 Sb. Hg Testy toxicity IARC, NTP, US EPA, GHS RfD, ADI, TDI, ARfD Aktuální Studie (WHO, IPEN, NGOs, BRI) RISC - software