Sérologie. Prezentace pro obor: Jan Smíš. íšek

Transkript

1 Sérologie Prezentace pro obor: Všeobecné lékařství Jan Smíš íšek ÚLM 3. LF UK 2007

2 Základní pojmy Antigen specifická povrchová struktura schopná vyvolat imunitní reakci Často proteinová,, ale i polysacharidová, glykoproteinová,, lipoproteinová atd. Epitop prostorová část molekuly antigenu, která vyvolává imunitní reakci (jeden antigen můžm ůže e mít m t víc v epitopů)

3 Základní pojmy Hapten a semihapten antigenní struktura schopná vyvolat imunitní reakci jen po vazbě na většív molekulu (protein) Specifická protilátka tka protilátka tka (obvykle vyrobená hybridomovou technikou) určen ená proti konkrétn tnímu antigenu (antigenům) Monovalentní váže e epitop 1 antigenu Polyvalentní váže e epitopy více v antigenů

4 Základní pojmy Hybridomová technika Metodika tvorby specifických protilátek tek Hlodavci se podá antigen proti němuž chceme vytvořit specifickou protilátku tku

5 Základní pojmy Hybridomová technika Po uběhnut hnutí doby nezbytné pro aktivaci hlodavcovy imunity se hlodavec usmrtí a z jeho sleziny nebo kostní dřeně se izolují aktivované plasmatické buňky Jejich jádra j injikují do nesmrtelné buňky lidského myelomu (nádor tvořící imunoglobuliny) Fůzní buňka (hybridom) produkuje protilátky tky

6 Hybridomová technika Antigen Plasmatická buňka Specifické protilátky tky Hybridomová buňka Myelomová buňka

7 Základní pojmy Aglutinace shlukování antigenu specifickou protilátkou tkou Precipitace totéž v gelovém m prostřed edí Titr převrácená hodnota ředění Konjugát protilátka tka značen ená markerem Marker obvykle enzym, který dokáže e po přidání specifické směsi si obsahující substrát vyvíjet konkrétn tní zbarvení jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci markeru

8 Přímá aglutinace Princip: Protilátky, tky, které se vytvoří v séru s pacienta v průběhu onemocnění se dají prokázat pomocí přímé aglutinace Dochází k vazbě komplexu antigen-protil protilátka tka a jeho následnn sledné aglutinaci, kterou lze pozorovat pouhým okem nebo hodnotit speciáln lními přístrojip

9 Přímá aglutinace Protilátky tky IgM se tvoří přibližně po 1 týdnu přítomnosti mikroba organismu vrcholu jejich množstv ství dosahuje v polovině druhého ho týdne poté jejich koncentrace v séru s klesá.. IgG naproti tomu dosahují vrcholu aža v polovině třetího týdne (viz. graf).

10 Přímá aglutinace Sérum nařed edíme aža na titr 2560 podle tabulky. PřidP idáme antigen mikroba (konkrétn tní antigen proti danému sérotypu) a po 2 24 hodinách hodnotíme poslední zkumavku, kde došlo k aglutinaci. PřevrP evrácená hodnota ředění séra v nín představuje titr protilátek tek (kvantifikaci jejich množstv ství v séru). s Fyz. roztok (ml) Sérum (ml) Antigen (ml) Ředění 1 0,9 0,1 1:20 2 ml se přenáší z předchozí zkumavky do následující 1:40 3 1:80 4 1:160 Zkumavka 5 1: : : :2560 K 0 0

11 Přímá aglutinace Výsledek Aglutinace H antigenu (bičík) je jemnější Aglutinace O antigenu (bakt( bakt.stěna) je hrubší

12 Přímá aglutinace Použit ití Widalova reakce Průkaz protilátek tek proti Salmonelám Wrightova reakce Průkaz protilátek tek proti Franciselám a Brucelám Weilova-Felixova reakce Průkaz protilátek tek proti Listeriím

13 Zpětn tná aglutinace serotypizace Princip Pokud k suspenzi mikroba obsahující známý antigen přidp idáme protilátky tky proti známému mu antigenu dojde k aglutinaci Tímto způsobem můžm ůžeme určit konkrétn tní antigenní složen ení stěny neznámého mikroba a tím m ho podle známých schémat (pro Salmonelly jde o Kaufmann-Whiteovo schéma) druhově či i dokonce kmenově určit

14 Zpětn tná aglutinace serotypizace Postup Na první podložní sklíčko ko kápneme k kapku protilátek tek proti O antigenu 9 a 12 a na druhé podložní sklíčko ko protilátky tky proti H antigenu g,m. V kapce rozmích cháme bakteriologickou kličkou kou kolonii mikroba sebranou z pevné kultivační půdy aža vznikne homogenní suspenze Poté se kývavým pohybem snažíme vyvolat aglutinaci kterou odečítáme proti tmavému mu pozadí.. Pokud k nín dojde kompletuje se známý antigen mikroba se známou protilátkou tkou

15 Zpětn tná aglutinace serotypizace Výsledek viditelná aglutinace

16 Zpětn tná aglutinace serotypizace Použit ití: Serotypizace kmenů Salmonella typhi + Určen ení povrchových antigenů většiny lékařsky významných bakterií,, které dosahují diagnosticky významného polymorfismu (Streptokoky, Stafylokoky, Hemofily a mnoho další ších)

17 Hemaglutinace Princip Heterofilní protilátky tky (protilátky, tky, které dokážou ou aglutinovat i některn které antigeny na nehumánn nních erytrocytech) přímo p aglutinují beraní erytrocyty v závislosti z na svém m titru

18 Hemaglutinace Postup V mikrotitrační destičce nařed edíme sérum s pacienta podle tabulky tak aby došlo k vytvořen ení známého titru a přidp idáme roztok beraních erytrocytů Necháme reagovat hodin v chladu a pozorujeme poslední jamku, kde došlo k aglutinaci Její titr představuje p titr hledaných protilátek tek Jamka číslo Fyz. roztok (ul) 0 Sérum (ul) 0 0 ul se přenáší z předchozí jamky Beraní ery Ředění 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024

19 Hemaglutinace Výsledek Aglutinované erytrocyty pokryjí v hrudkách dno zkumavky, neaglutinované pokryjí dno v normáln lním m jasně ohraničen eném m sedimentu

20 Hemaglutinace Použit ití Paul Bunnelova reakce Stanovení heterofilních protilátek tek proti EBV (Virus Epstein Barrové původce infekční mononukleózy) pomocí aglutinace 2 % roztoku beraních erytrocytů

21 Latexová aglutinace Princip: Některé mikroby uvolňuj ují v tekutém růstovém m prostřed edí antigeny (tzv. solubilní Ag) ze svého povrchu Tyto antigeny lze prokazovat pomocí specifických protilátek tek navázaných na latexových částicíchch

22 Latexová aglutinace Postup: Na podložní sklíčko ko kápneme k kapku latexových částic obalených protilátkami tkami V kapce rozmích cháme bakteriologickou kličkou kou kapku tekutiny obsahující solubilní antigeny Poté se kývavým pohybem snažíme vyvolat aglutinaci kterou odečítáme proti tmavému mu pozadí

23 Latexová aglutinace Použit ití: Zejména k průkazu solubilních antigenů Haemophillus influenzae, Neisseria gonorhoae, Streptocoocus pneumoniae Vzhledem k tomu, že e se jedná o 3 nejčast astější původce bakteriáln lních meningitid, používá se latexová aglutinace jako bed side test k rychlému průkazu meningitidy z likvoru

24 Latexová aglutinace Výsledek zřetelná aglutinace

25 Průkaz značenými protilátkami tkami Protilátka tka můžm ůže e být značena Radionuklidem Reakci označujeme jako RIA (Radio( immuno assay) prokazujeme denzitometricky Enzymem Reakce EIA (Enzyme immuno assay) prokazujeme barevnou reakcí se specifickým barvivo obsahujícím m substrátem tem enzymu Fluorescenčním m barvivem Reakce FIA (Flouorscent( immuno assay) prokazujeme pomocí fluorescenčního zářenz ení

26 Průkaz značenými protilátkami tkami Použit ití Průkaz libovolných antigenů Používá se nejen v sérologii, s ale například v biochemii k průkazu antigenů např. konkrétn tních proteinů krevního séra s atd. FIA se používá často ve virologii k průkazu antigenů virů přímo ve tkáňov ovém m vzorku

27 ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay Je v současn asné době společně s Westernblotem nejsofistikovanější sérologickou reakcí Je modifikací metodiky EIA Používá se ve 3 variantách Sandwichový průkaz Ag Sandwichový průkaz Ig Kompetitivní průkaz Ig

28 ELISA Sandwichový typ reakce průkaz Ag Princip Na stěně mikrotitrační destičky navázána protilátka tka Přidá se sérum s s antigenem Přidá se značený konjugát Vytvoří se sandwichový komplex

29 ELISA Protilátka tka na stěně destičky Přidá se sérum s obsahující antigen Přidá se konjugát t značený enzymem Enzym přemp eměňuje substrát na barevný produkt

30 ELISA Sandwichový typ reakce průkaz Ig Princip Na stěně mikrotitrační destičky navázán antigen Přidá se sérum s s protilátkami tkami Přidá se značený konjugát Vytvoří se sandwichový komplex

31 ELISA Protilátka tka na stěně destičky Přidá se sérum s obsahující protilátky tky Přidá se konjugát t značený enzymem Enzym přemp eměňuje substrát na barevný produkt

32 ELISA Kompetitivní typ reakce průkaz Ig Princip Na stěně mikrotitrační destičky navázán antigen Přidá se sérum s s protilátkami tkami a zárovez roveň se přidá značený konjugát Dochází ke kompetici o vazbu na antigen

33 ELISA Konjugát Hledaná protilátka tka

34 ELISA Kompetitivní typ reakce průkaz Ig Princip Na stěně mikrotitrační destičky navázán antigen Přidá se sérum s s protilátkami tkami a zárovez roveň se přidá značený konjugát Dochází ke kompetici o vazbu na antigen

35 Western blot Princip: Celá řada mikrobů obsahuje na svém m povrchů mnoho diagnosticky významných antigenů Konkrétn tní kombinace antigenního složen ení je nejlepší ším m znakem konkrétn tního kmene Člověk k při p i infekci obvykle tvoří protilátky tky proti většinv ině antigenů mikroba Průkaz všech v konkrétn tních protilátek tek proti konkrétn tní kombinaci antigenů původce je diagnosticky velmi výhodný, protože e určí konkrétn tní kmen původcep

36 Western blot Postup: Směs s antigenů původce se elektroforeticky rozdělí a poté se aplikuje na celulózový papír Z tohoto papíru se vytvoří tenké proužky (stripy( stripy) Tyto proužky se inkubují se sérem s pacienta Při i inkubaci dojde k navázání konkrétn tních protilátek tek na konkrétn tní antigeny Strip se dále d inkubuje s konjugátem značeným enzymem, který se naváže e na všechny v oblasti obsahující navázanou protilátku tku Po inkubaci s barvivo obsahující substrátem tem enzymu dochází k místnm stní barevné reakci v oblastech komplexů

37 Komplement fixační reakce Princip 3 kroky 1) přidp idá se sérum s s antigenem komplementárn rním m k hledaným protilátk tkám 2) přidp idá se komplement 3) přidp idá se hemolytický komplex (beraní erytrocyty a králi ličí protilátky tky proti nim)

38 Komplement fixační reakce 2 možnosti 1) Komplement se všechen v váže v e na primárn rní imunokomplex a nezbude žádný aby rozložil hemolytický komplex 2) Sérum S neobsahuje protilátky, tky, primárn rní imunokomplex nevznikne a všechen v komplement se váže v e na hemolytický komplex, který rozloží HEMOLÝZA

39 Komplement fixační reakce Hemolytický komplex Antigen Hledaná protilátka tka Komplement

40 Komplement fixační reakce Hemolytický komplex Komplement Antigen

41 Více informací o Serotypizaci Latexové aglutinaci ELISA Westernblotu KFR najdete na CD: