Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene
|
|
- Ludvík Esterka
- před 7 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 Leona Leišová Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Metodika pro praxi Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
2 Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem řešení projektu: MZE Studium a využití biodiverzity, genetických mechanismů a nových metod pro zlepšování biologického potenciálu odrůd a setrvalý rozvoj zemědělství Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN
3 Leona Leišová Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
4 Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Předmětem metodiky je zavedení nové metody pro druhově specifickou detekci a stanovení fytopatogenní houby Pyrenophora teres, která je původcem hnědé listové skvrnitosti a způsobuje značné ekonomické ztráty na porostech ječmene. Metoda je založena na detekci Pyrenophora teres pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery. Aplikace metodiky předpokládá základní vybavení laboratoře molekulární biologie. Specifická a včasná detekce původce listové skvrnitosti umožní účinnou aplikaci příslušných fungicidů a tím pozitivně ovlivní výnos ječmene. Detekce a stanovení P. teres rovněž umožní lepší hodnocení odrůd ječmene v odrůdových zkouškách a při šlechtění ječmene na rezistenci k původcům listových skvrnitostí. Detection and quantification of Pyrenophora teres in barley leave tissue The aim of this methodology is to establish a new method of species specific detection and quantification of Pyrenophora teres causing leave spot disease of barley. It brings about high economic losses in barley. The methodology is based on polymerase chain reaction (PCR) with specific primers. The application of the method assumes moderately equipped laboratory of molecular biology. The specific and timely detection of P. teres allows the effective application of fungicides and also the better evaluation of barley varieties in variety trials and in barley breeding for resistance to pathogens causing leave spot diseases. Oponenti: Ing. S. Kozelská, CSc. Metodika je určena orgánům státní správy, šlechtitelským organizacím a zemědělské praxi. Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe pod č.j /2008. Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.
5 Obsah: Úvod 1 Podstata metody..5 Potřebné technické vybavení..7 Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat 10 Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti 15 Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití 16 Přednosti metody, možnosti rozšíření 16 Další doporučená literatura 16
6 Úvod Listové skvrnitosti na listech ječmene (Hordeum vulgare L.) patří mezi nejdůležitější choroby ve všech oblastech, kde je ječmen dominantní zemědělskou plodinou. Jsou způsobovány komplexem houbových patogenů, z nichž každý vytváří odlišné typy symptomů. Nejčastější z nich jsou síťovitá, hnědá a pruhovitá skvrnitost (net blotch, spot blotch a leaf stripe). Hnědá skvrnitost je způsobována houbami: Pyrenophora teres f. sp. maculata (anamorph. Drechslera teres f. sp. maculata) a Helminthosporium sativum (anamorph. Drechslera sorokiana syn. Bipolaris sorokiana). Původcem klasické síťovité skvrnitosti listů ječmene je houba Pyrenophora teres f. sp. teres (anamorph. Drechslera teres f. sp. teres). Za pruhovitou skvrnitost je zodpovědná houba Pyrenophora graminea (anamorph. Drechslera graminea) (Minaříková, 2002). Pyrenophora teres na rozdíl od např. Pyrenophora triticirepentis patří mezi monofágní organismy, je vázána na úzký okruh hostitelů. Jsou jimi různé druhy rodu Hordeum: Hordeum vulgare, Hordeum spontaneum, Hordeum murinum, Hordeum bulbosum a Hordeum marinum. Pouze u Pyrenophora teres f. sp. maculata byla jak ve skleníkových, tak i v polních podmínkách prokázána schopnost přechodu na pšenici (Triticum aestivum). Na listech pšenice vytváří nekrotické skvrny a dokonce sporuluje (Minaříková, 2002). Pyrenophora teres f. sp. maculata se vyskytuje častěji na ozimém šestiřadém ječmeni (Hordeum vulgare) než na jarním dvouřadém (Minaříková and Polišenská, 1999). Má větší konkurenční schopnost, je agresivnější a zřejmě potlačuje i rozvoj net typu (Pyrenophora teres f. sp. teres) (Scott, 1991; Ondřej, 2000). Klasický net typ, Pyrenophora teres f. sp. teres dominuje na jarních dvouřadých odrůdách ječmene (Hordeum vulgare) (Minaříková and Polišenská, 1999). Každý druh/ forma hub rodu Pyrenophora se projevuje typickými symptomy na listech hostitele. Pyrenophora teres f. sp. teres se projevuje protáhlými světle hnědými lézemi s tmavě hnědým síťováním. Nekrotické léze jsou vždy doprovázeny 1
7 chlorotickou zónou. S časem symptomy mění barvu až do tmavě šedo-hnědé nikoliv však tvar. Pyrenophora teres f. sp. maculata způsobuje na listech tmavě hnědé nekrotické skvrny oválného tvaru bez síťování obklopené různě širokou chlorotickou zónou (Shipton et al., 1973). Zatímco se Pyrenophora graminea šíří výhradně osivem, Pyrenophora teres se rozšiřuje jak osivem, tak i inokulací listů během vegetace. Přenos osivem má význam jen v dosud nezamořených oblastech. Je-li však přítomen jiný zdroj primárního inokula, nemá přenos osivem patrně velký význam (Shipton et al., 1973). Primárním zdrojem inokula jsou zejména posklizňové zbytky rostlin není však jisté, zda primárním inokulem jsou konidiospory nebo askospory. Askospory se tvoří během saprofytní fáze života patogena na posklizňových zbytcích, které zůstávají na povrchu půdy (Barrault, 1989). Doba zrání perithécií je 3 až 5 měsíců v závislosti na teplotě (Barrault, 1989). Askospory představují velké nebezpečí z hlediska hostitele hlavně jako potencionální zdroj nových genotypů patogena spíš, než že by byly primárním inokulem. Nejčastějším primárním inokulem jsou konidie vytvářející se na infikovaných posklizňových zbytcích (Barrault, 1989). Konidie, které se tvoří na povrchu nekrotických lézí na listech infikovaných rostlin, a to i rezistentních, způsobují sekundární infekce dalších listů téže rostliny nebo dalších rostlin v okolí. Konidie se šíří větrem, dešťovými kapkami a větrným deštěm. Za příznivých podmínek může toto onemocnění vážně ohrozit výnos a sladovnickou kvalitu ječmene. Uvádí se výnosové ztráty 10-40% (Porta-Puglia et al., 1986; Steffenson and Webster, 1992). Vážné epidemie postihly mnoho oblastí České republiky v letech 1996 a 1997 (Minaříková and Polišenská, 1999). Ztráty mohou být redukovány kontrolou zdravotního stavu osiva, rotací plodin, zaoráváním posklizňových zbytků, aplikací listových fungicidů a pěstováním rezistentních odrůd ječmene (Shipton et al., 1973; Tekauz, 1990; Minaříková, 2002). Vzhledem k ekonomickému tlaku na co nejnižší vstupní náklady 2
8 je zvýšený zájem o vyšlechtění odrůd s rezistencí k listovým skvrnitostem. Šlechtění na rezistenci k tomuto patogenu je však značně obtížné pro jeho velkou intraspecifickou variabilitu. Klasická metodika detekce houbových patogenů zahrnuje pěstování na umělých živných médiích, imunologické testy (ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) a patologické testy na diferenciačních odrůdách hostitele (Afanasenko et al., 1995). Tyto metody selhávají tam, kde se jedná o vysoce variabilní populaci patogena a tam, kde existují druhy či formy geneticky si velmi blízké. To je případ houby Pyrenophora teres, jejíž populace vykazují vysokou míru variability, a která se vyskytuje ve dvou formách: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata. Obě formy produkují podobné kultury na umělých živných půdách, mají takřka identickou morfologii; liší se pouze typem symptomu na listech hostitele. Vzhledem k tomu, že se rezistence k oběma formám dědí nezávisle je důležité, aby byl patogen korektně identifikován. Nové možnosti detekce patogenů se otevřely s objevením polymerázové řetězové reakce. Avšak žádná z dosud publikovaných metod nedokázala spolehlivě rozlišit a tedy detekovat obě formy Pyrenophora teres vyskytující se v České republice. Byla tedy vyvinuta a optimalizována vlastní metodika pro detekci a stanovení obou forem Pyrenophora teres v listových pletivech rostlin založená na diagnostických AFLP markerech (Leisova et al., 2006). Kvantitativní stanovení vychází ze základní metody Real-time PCR se specifickými TaqMan sondami. Vývoj této metodiky byl publikován (Leišová et al., 2005; Leišová et al., 2006) a zde je kompletní protokol předkládán pro využití v rostlinolékařské, šlechtitelské a obecně zemědělské praxi. Literatura: AFANASENKO O.S., HARTLEB H., GUSEVA N.N., MINARIKOVA V., JANOSHEVA M. (1995): A set of differentials to characterize populations of Pyrenophora teres Drechs. for international use. Journal of Phytopathology 143:
9 BARRAULT G. (1989): L Helminthosporiose de l orge causée par Drechslera teres. Thèse de doctorat d État, L Institut National Polytechnique, Toulouse, LEIŠOVÁ L, MINAŘÍKOVÁ V., KUČERA L., OVESNÁ J. (2005): Genetic diversity of Pyrenophora teres isolates as detected by AFLP analys is. Journal of Phytopatholo gy 153: LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophora teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods 67: MINAŘÍKOVÁ V., LEIŠOVÁ L. (2005): Reakce odrůd jarního ječmene vůči síťovité skvrnitosti v lokalitě Kroměříž ( ) a detekce tohoto patogena pomocí specifických markerů. Obilnářské listy 2: 7-9. MINAŘÍKOVÁ V., POLIŠENSKÁ I. (1999): ANALYsis of populations of Pyrenophora teres on barley in the Czech Republic. Plant Protection Science 35: MINAŘÍKOVÁ V. (2002): Aktuálně k výskytu houbových chorob je čmene. Úroda 4: ONDŘEJ M. (2000): Problematika hub rodu Drechslera na ječmeni (Horde um). Agro 5: PORTA-PUGLIA A., DELOGU G., VANNACCI G. (1986): Pyrenophora graminea on winter barley seed: effect on disease incidence and yield losses. Journal of Phytopathology 117: SCOTT D.B. (1991): Identity of Pyrenophora isolates causing nettype and spot-type lesions on barley. Mycopathologia 116: SHIPTON W.A., KAHN T.N., BOYD W.J.R. (1973): Net blotch of barley. Reviews in Plant Pathology 52: STEFFENSON B.J., WEBSTER R.K. (1992): Pathotype diversity of Pyrenophora teres f. teres on barley. Phytopathology 82: TEKAUZ A. (1990): Characterization and distribution of pathogenic variation in Pyrenophora teres f. teres and P. teres f. maculata from western Canada. Canadian Journal of Plant Pathology 12:
10 Metodika detekce a stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele Podstata metody Metodika se skládá ze tří částí: první z nich je odběr vzorků a extrakce DNA; druhou částí je detekce Pyrenophora teres a třetí částí je kvantitativní stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele. I. Odběr vzorků a izolace DNA Podstatou první části je jednak odběr vzorků listových pletiv se symptomy nebo i bez symptomů podle zásad správného vzorkování tak, by výpověď o míře výskytu Pyrenophora teres v porostech byla statisticky významná. Vzorky jednotlivé listy mohou být uchovávány buď v papírových sáčcích za běžných teplot, budou-li dále zpracovávány podle metodiky detekce nebo v uzavřených igelitových sáčcích při teplotách -20 C a nižších budou-li dále zpracovávány podle metodiky kvantitativního stanovení Pyrenophora teres v pletivech hostitele. Postatou extrakce DNA je uvolnění DNA z buněk mechanickým rozdrcením a oddělení DNA od ostatních sloučenin, zejména proteinů, polysacharidů a barviv. Přidáním detergentu CTAB dochází za přítomnosti soli NaCl k vytvoření ve vodě rozpustného komplexu [CTAB-DNA], který je následně směsí chloroformu a izoamylalkoholu (24:1) extrahován do vodné fáze a oddělen takto od proteinů a polysacharidů, které jsou spolu s chloroformovou fází odstraněny. DNA je pak srážena absolutním etanolem a zbytky soli a detergentu jsou odstraněny pomocí 75% roztoku etanolu. DNA je rozpuštěna v pufru TE, který je velmi zředěným vodným roztokem Tris a EDTA, které stabilizují DNA v roztoku. Tris upravuje ph a EDTA vyvazuje Mg 2+ ionty a tím inhibuje činnost enzymů rozkládajících DNA. II. Detekce Pyrenophora teres Druhou částí je specifická detekce Pyrenophora teres ve vzorcích. Principem této metody je aplikace polymerázové 5
11 řetězové reakce (PCR) s páry primerů navrženými na základě specifických DNA sekvencí obou forem druhu Pyrenophora teres. Výsledkem je buď přítomnost nebo nepřítomnost PCR produktu podle toho, zda primery najdou svoji komplementární sekvenci ve vzorku DNA či nenajdou. Pokud tuto sekvenci najdou dochází k tak mnohonásobnému zmnožení úseku DNA uvozeného daným párem primerů, že je možné přítomnost tohoto úseku DNA a tedy i přítomnost dané formy Pyrenohora teres detekovat pomocí běžná analýzy produktů PCR, kterou je gelová elektroforéza. Produkty PCR jsou vizualizovány pomocí barviva EthidiumBromidu, které interkaluje do dvouřetězcové DNA produktů PCR. Pod UV světlem je pak možno přímo detekovat přítomnost či nepřítomnost produktů jednotlivých PCR reakcí. III. Stanovení Pyrenophora teres Principem třetí části, kterou je kvantitativní stanovení Pyrenophora teres je rovněž aplikace PCR reakce avšak v uspořádání v tzv. reálném čase. Základem je rovněž PCR se specifickými primery, ale pro stanovení PCR produktů jsou použity tzv. TaqMan sondy, což jsou oligonukleotidy, které se specificky hybridizují od oblasti mezi primery a tím zvyšují specifičnost reakce. Na 5 konci jsou značeny fluorescenční značkou (FAM, VIC, apod.) a na 3 konci je kovalentně navázán zhášeč fluorescence, kterým může být buď fluorescenční značka TAMRA nebo nefluorescenční kovalentně navázaný MGB (Minor Groove Binder) zhášeč. 5-3 exonukleázová aktivita Taq polymerázy v elongačních fázích PCR způsobuje degradaci sondy a tím dochází ke vzrůstu intenzity fluorescence, která je v každém cyklu PCR reakce detekována pomocí CCD kamery. Porovnáním odečtených hodnot Ct (Cycle treshold) s kalibrací lze stanovit kvantitativní zastoupení PCR produktu v reakční směsi. 6
12 Potřebné technické vybavení I. Odběr vzorků a izolace DNA Pro uchovávání vzorků a izolaci DNA je třeba následující zařízení: mrazák na teplotu -20 C a nižší homogenizátor QIAGEN centrifuga s otáčkami min otáčet/min. s rotorem na zkumavky z umělé hmoty (Ependorfky) o objemu 2 ml vodní lázeň nebo teplotní blok vortex zařízení na horizontální elektroforézu spektrofotometr (pouze v případě následné aplikace metodiky kvantitativního stanovení Pyrenophora teres) Automatické pipety Zkumavky na izolaci DNA 2ml Špičky na automatické pipety Pro izolaci DNA jsou potřebné následují roztoky a chemikálie: tekutý dusík 2 x CTAB PUFR: 2 M NaCl (SERVA) 40 ml 5 M roztoku 0,2 M Tris (SERVA) 20 ml 1 M rozt. o ph 8,0 50 mm EDTA (SERVA) 10 ml 0,5 M rozt. o ph 8,0 2 % CTAB (Sigma A ldrich) 2 g CTAB s do 100 ml H 2 O up TE PUFR: 10 mm Tris (SERVA) 2,5 ml 1 M roztoku o ph 8,0 1 mm EDTA (SERVA) 0,5 ml 0,5 M rozt. o p H 8,0 do 250 ml H 2 O up PVP = polyvinylpyrrolidon (Sigma Aldrich) Směs chloroform (SERVA): isoamylalkohol (Lachema Brno) ( (24:1) Absolutní tj. min. 96% roztok etanolu (SERVA) vymražený (-20 C) 70 % roztok etanolu (SERVA) 7
13 1 x TAE PUFR TRIS báze (s) (SERVA) 4,8 g 0,48% roztoku ledová CH 3 COOH ( Sigma-A ldrich) 1,5 ml 0,5M EDTA (ph = 8,0) 2,0 ml 1mM roztok do 1000ml H 2 O up Velikostní standard λ HindIII (Fermentas), vč. loading buffer II. Detekce Pyrenophora teres Pro detekci P. teres jsou potřebné následující chemikálie a zařízení: primery (syntéza firmou Applera) Primer P rimer forward Primer revers PTM494d 5 -TATTCTGCTAAGAGCTAGCATCCTA-3 5 -ACTGCGTACCAATTCTCTACAACTA-3 PTT429g 5 -CTTTTTGCAAGGGTCGTGC-3 5 -GCTGATGACATAAGTCGCTGC-3 PTT471h 5 -CCTGAGTAACTTGCCCCACC-3 5 -GAAAAGAGATGATGCGGACAC-3 PT194m 5 -CATCGATGCGGCGTAAATTG-3 5 -ACAACGCGACAAAGGGCAG-3 PT139m 5 -CATCGATGCGGCGTAAATTG-3 5 -TACAGCAGAAGGCAGTCGGC-3 PTM379d7 5 -TTTACCTCCTACACAGCCACACC-3 5 -AACATATTTCTTCGCCTACACATCG-3 Primery: T M Velikost amplikonu PTM494d 55 C 161 bp PTT429g 62 C 93 bp PTT471h 62 C 91 bp PT194m 62 C 194 bp PT139m 62 C 139 bp PTM379d7 62 C 379 bp dntp (Invitrogen) Tt h polymeráza vč. pufru a MgCl 2 (Biotools) H 2 O up (Sigma Aldrich) 8
14 Agaróza (SERVA) Ethidium-bromid (Sigma-Aldrich) 1 x TAE PUFR TRIS báze (s) (SERVA) 4,8 g... 0,48% roztoku ledová CH 3 COOH (Sigma-Aldrich) 1,5 ml... 0,5M E DTA (ph = 8,0) 2,0 ml...1m M roztok do 1000ml... H 2 O up Velikostní standard 100bp DNA Ladder (Fermentas), vč. loading buffer PCR destičky vč. víček či folie (AB gene), lze použít jednotlivé PCR zkumavky od různých výrobců Automatické pipety Špičky na automatické pipety Cykler Minicentrifuga Zařízení na horizontální elektroforézu Transiluminátor Fotodokumentační zařízení III. Stanovení Pyrenophora teres Pro stanovení P. teres jsou třeba následující chemikálie a zařízení: primery (syntéza firmou Applera) DTM340i DTT350j DT376b RacB-81 P rimer forward Primer revers Taq Man sonda 5 -TGATGCGCTGGAGTGAGACAC-3 5 -TGTACATACGCCGCATCACG-3 5 -TCGTGGATACTCTACATAGGT-3 5 -CTTGATGCGCTGGAGTGAGA-3 5 -TGCATTTCCACCTACTGGTATGTAC-3 5 -ACGTCTCATGGATACTC-3 5 -TACACCTACGCTTGACGCATG-3 5 -GATATCTTCATCTGCGGACCG-3 5 -AGTTGTTTGTGGTTTTC-3 5 -AGGCGCACCCTACTACATCG-3 5 -ACCACCTTTATTGCCGCATC-3 5 -AGCTCGAAGACCCAACT-3 9
15 Primery a Taq Man sondy: T M Velikost pr oduktu DTM340 F + R + sonda-fam 60 C 81 bp DTT350 F + R + sonda-fam 60 C 66 bp DT376 F + R + sonda-fam 60 C 91 bp RacB81 F + R + sonda-vic 60 C 81 bp AmpliTag GOLD polymeráza vč. pufru a MgCl 2 (Applera) dntp mix vč. dutp (Applera) UNG (uracil N-glykosylá za) ( Appler a) H 2 O up (Sigma Aldrich) Optické PCR destičky (Applera - PN ) lze použít i jednotlivé optické zkumavky Víčka v provedení stripů po 8 (Applera - PN ) lze použít i folii na PCR destičky Automatické pipety Špičky na automatické pipety Cykler pro provádění PCR v reálném čase, např. ABI PRISM 7700 (Applera), ABI PRISM 7900 (Applera); lze použít i jakýkoliv typ Light-cycleru. Minicentrifuga Centrifuga na destičky Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat I. O ě db r vzorků a izolace DNA Odebrané listy jsou umístěny mezi listy filtračního papíru, opatřeny popisem: místem sběru, datem sběru, odrůdou hostitele, příp. určením druhu a formy patogena a odhadem míry napadení ve stupnici 1 9 a usušeny. K asi 0,5 mg suchého materiálu v 2ml ependorfce je přidáno 700μl 2% roztoku CTAB a 1 karbidová kulička. Ependorfky jsou umístěny do adapteru homogenizátoru a třepány při frekvenci 30Hz 1,5 minuty. Poté jsou vzorky 30 minut inkubovány ve vodní lázni při teplotě 60 C. 10
16 Během inkubace je přidáno 10mg PVP. Pak je směs ochlazena na laboratorní teplotu. Ke směsi je přidán 1x objem směsi chloroformu a izoamylalkoholu (24:1). Po asi 5 minutách třepání jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 10 minut a je odebrána vodná fáze. Tento krok je ještě jednou zopakován. K roztoku vzorku je přidáno 50μl 3M roztoku CH 3 COONa (ph = 4,8) a min. 1x objem 99% vychlazeného etanolu. Nedojde-li k precipitaci DNA, jsou vzorky inkubovány po dobu asi 30 minut v mrazáku při teplotě -20 C. Poté jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 5 minut. Supernatant je odstraněn a k peletce precipitované DNA je přidáno 500μl 70% roztoku etanolu. Vzorky jsou inkubovány min. 1 hodinu při teplotě 4 C. Supernatant je odstraněn, k peletce DNA je přidáno 500 μl 70% roztoku etanolu a vzorky jsou inkubovány alespoň 1 hodinu při teplotě 4 C. Supernatant je odstraněn včetně zbytků etanolu pomocí vakuové odparky (dokud peletka neskáče při poklepu na uzavřenou! ependorfku). DNA je rozpuštěna v odpovídajícím množství TE pufru přes noc při teplotě 4 C. K roztokům DNA je přidáno 20μl roztoku RNázy (20mg/ml) a vzorky jsou inkubovány 10 minut při 37 C. Kvalita a koncentrace izolované DNA je ověřena elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu. K 1 μl vzorku DNA je přidáno 10μl H 2 O a 3μl loading pufru a směs je nanesena na gel. DNA je vizualizována ethidiumbromidem (0,3μl/ 60 ml gelu) a detekována pod UV lampou. Koncentrace DNA vzorku je odhadnuta srovnáním se standardem λ Hind III (6μl - podle koncentrace standardu). Vzorky DNA jsou naředěny na pracovní koncentraci 50ng/μl; tato koncentrace je ověřena spektrofotometricky 11
17 na přístroji Quant Pro stanovení). (nutné pouze pro kvantitativní II. Detekce Pyrenophora teres Do PCR zkumavek nebo PCR destičky je napipetována reakční směs. Doporučuje se připravit si nejprve mastermix do zvláštní zkumavky, ten rozpipetovat a k němu nakonec přidat po 2μl roztoku vzorků DNA naředěných na konc. 50ng/μl. Reakční směs: primer mix (5μM) 1,0μl 0,33 μm dntp (2,5 mm) 1,5μl 0,25 mm pufr (BioTools) (10x)1,5μl 1 x MgCl 2 (15mM) 2,0μl 2,0 mm Tth polymeráza (BioTools) ( 5U/μl)0,2μl 1 U templátová DNA (50ng/μl) 2,0μl 100ng H 2 O 6,8μl reakční objem 15,0μl Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centriguze na PCR destičky a jsou umístěny v cykleru. PCR reakce se sestává z následujících kroků: 1 cyklu s: 95 C... 5 min. 35 cyklů: 95 C sec. T M sec. 72 C sec. 1 cyklus: 72 C... 5 min. 10 C... Produkty reakce jsou separovány elektroforeticky v 2,5% agarózovém gelu, vizualizovány ethidiumbromidem a detekovány pod UV lampou. Velikost produktů je odečítána porovnáním s velikostním standardem λ Eco1471/PvuI (100bp). Každá analýza obsahuje vždy pozitivní kontrolu (templátovou DNA extrahovanou z čistých kultur hub P. 12
18 teres f. sp. teres a P. teres f. sp. maculata ředěnou na koncentraci 50ng/μl) negativní kontrolu (reakční směs bez templátové DNA) a vzorky. Výstupem analýzy je vypracovaný protokol s dokumentačními obrázky elektroforetogramů a tabulkou, kde jsou výsledky analýzy přehledně shrnuty. III. Stanovení Pyrenophora teres PCR reakce s primerovými páry a Taq Man sondami PTM340-FAM, PTT350-FAM, PT376-FAM a Acl379- VIC či RacB81-VIC jsou prováděny jako uniplex. Taq Man sondy pro detekci houbového patogena jsou značeny fluorescenční barvou FAM a sondy detekující DNA rostlinného hostitele fluorescenční barvou VIC. Detekce patogena je prováděna metodou relativní kvantifikace: obsah patogena v listovém pletivu hostitelské rostliny je získán z kalibrační křivky (osa x:počáteční koncentrace DNA standardů/ osa y: Ct reakcí se standardy) a je vztažen k obsahu rostlinné DNA. Hodnota Ct je definována jako cyklus PCR, ve kterém dojde ke statisticky významnému vzrůstu fluorescence. Reakce jsou prováděny podle protokolu č : Taq Man PCR Reagent Kit with AmpliTag Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). Reakční směs: Primer m ix [5μM] 1,5 μl 0,3 μm Taq Man sonda [ 5μ M] 1,0 μl 0,3 μm Pufr 10x 2,5 μl 1x MgCl 2 [25mM] 2,5 μl 2,5 mm dntp mix 4,0 μl 0,8/0,4mM UNG (uracil N-glykosyláza) [1U/1μl] 0,25 μl 0,25 U AmpliTag Gold DNA polymeráza [5U/ 1μl] 0,25 μl 1U H 2 O 8,0 μl Templátová DNA [50ng/1μl] 5,0 μl 250 ng Reakční objem 25,0 μl 13
19 Vzorky: Vzorky a standardy jsou pipetovány do optických PCR destiček (PN ) a překryty optickými víčky v provedení stripů po 8 víčkách (PN ) fy Applied Biosystems. Uspořádání vzork ů v destičce je následující: A st1 st1 st1 vz1 vz1 vz1 vz9 vz9 vz9 vz17 vz17 vz17 B st2 st2 st2 vz2 vz2 vz2 vz10 vz10 vz10 vz18 vz18 vz18 C st3 st3 st3 vz3 vz3 vz3 vz11 vz11 vz11 vz19 vz19 vz19 D st4 st4 st4 vz4 vz4 vz4 vz12 vz12 vz12 vz20 vz20 vz20 E st5 st5 st5 vz5 vz5 vz5 vz13 vz13 vz13 vz21 vz21 vz21 F st6 st6 st6 vz6 vz6 vz6 vz14 vz14 vz14 vz22 vz23 nk G st7 st7 st7 vz7 vz7 vz7 vz15 vz15 vz15 vz22 vz23 nk H st8 st8 st8 vz8 vz8 vz8 vz16 vz16 vz16 vz22 vz23 nk o st1 - st8 je ředicí řada směsi standardů patogena a rostliny o nk je negativní kontrola mastermix bez templátové DNA o vz1 - vz23 představují vzorky s neznámým obsahem DNA Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centriguze na PCR destičky a jsou umístěny v cykleru ABI PRISM7700 (Applera). PCR reakce se sestává z následujících kroků: PCR reakce: 50 C. 2 min. 95 C.. 10 min. 40 cyklů: 95 C.. 15 sec. 60 C 1 min. 14
20 Ke sběru a analýze dat slouží program ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. Na základě hodnot počátečních koncentrací DNA standardů ředicí řady, měřených spektrofotometricky a hodnot Ct reakcí s DNA ředicí řady je vytvořena kalibrační křivka. Z ní a z naměřených hodnot C T reakcí se vzorky jsou programem ABI PRISM 7700 Sequence Detection System odečteny hodnoty počátečního obsahu DNA. Z hodnot počátečního množství DNA hostitele (Hordeum vulgare) a houbového patogena (P. teres f.sp. teres a/nebo P. teres f. sp. maculata) je vypočítán hmotnostní zlomek obsahu DNA rostliny ku obsahu DNA obou forem patogena P. teres. Výstupem analýzy je vypracovaný protokol s dokumentačními obrázky kalibračních křivek a tabulkou, kde jsou uvedeny hodnoty Ct, odvozené hodnoty počátečního množství DNA a vypočtený hmotnostní zlomek obsahu DNA rostliny ku obsahu DNA obou forem. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Oba typy analýz jak detekce, tak i kvantitativní stanovení Pyrenophora teres jsou založeny na PCR reakci. Před vlastní analýzou je nutné extrahovat DNA z napadených listů ječmene. Tato extrakce je časově nejnáročnější, vzhledem k obvyklé kapacitě centrifugy lze extrahovat 40 vzorků denně. Analýza 96 vzorků (počet pozic v PCR destičce) včetně extrakce DNA a obou analýz (detekce i stanovení) trvá 4 dny v případě, že na analýze pracuje 1 člověk. Kvantitativní stanovení Pyrenophora teres je výrazně finančně náročnější než detekce tedy určení je-li některá z forem Pyrenophora teres ve vzorku přítomna či není. Detekce Pyrenophora teres v 96 vzorcích činí 11000,-Kč nepočítaje mzdu pracovníka a cena kvantitativní detekce je pro 96 vzorků 53000,- Kč bez mzdy pracovníka. Celková cena obou analýz je 61000,-Kč nepočítaje mzdu pracovníka. 15
21 Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Jak detekce tak i stanovení Pyrenophora teres v napadených listech ječmene jsou dobře aplikovatelné pro rutinní využití. Jediným úskalím metody je jsou-li analyzovány vzorky, kde je listová čepel již téměř zničena houbami způsobujícími listové skvrnitosti. Tyto patogeny totiž produkují toxiny a další sekundární metabolity, které mohou inhibovat PCR reakci; a tak přestože je Pyrenophora teres ve vzorku přítomna může být nedetekována (falešný negativní výsledek). Přednosti metody, možnosti rozšíření Základní předností metody je přesná druhově specifická detekce obou forem Pyrenophora teres. Rozpoznání původce pouze podle symptomů na listech je někdy zavádějící a i zkušený fytopatolog se může zmýlit. Další předností je, že lze přítomnost houby zjistit už v ranných fázích infekce. Je tedy možné včas aplikovat postřiky. Rovněž testování linií ječmene v případě šlechtění na rezistenci nemusí trvat tak dlouho apod. Další doporučená literatura LEIŠOVÁ L, MINAŘÍKOVÁ V., KUČERA L., OVESNÁ J. (2005b): Genetic diversity of Pyrenophora teres isolates as detected by AFLP analysis. Journal of Phytopathology 153: LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophora teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods 67: ROSYPAL S., DOŠKAŘ J., PETRZIK K., RŮŽIČKOVÁ V. (2002): Úvod do molekulární biologie, Díl čtvrtý: Výklad základních metod molekulární biologie, 3. inovované vydání, Brno 2002,
22 VONDREJS V., STORCHOVÁ Z. (2000): Genové inženýrství, 1. díl, Karolinum, Praha VONDREJS V. (2001): Genové inženýrství, 2. díl, Karolinum, Praha
23 Autor: Název: Vydal: Tisk a vazba: Mgr. Leona Leišová, Ph.D. Detekce a stanovení Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: Autor fotografií: leisova@vurv.cz L. Leišová Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN
24 Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie
Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie Leona Leišová Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2009 Metody kvantifikace: Nepřímé metody odhad míry
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv
Národní referenční laboratoř Strana KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GENETICKÝCH MODIFIKACÍ METODOU qpcr POMOCÍ ROTOR-GENE PROBE PCR KITU Účel a rozsah Postup slouží ke kvantitativnímu stanovení genetických modifikací
VíceLeona Leišová a kol.
Leona Leišová a kol. Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví METODIKA PRO
VíceUrčeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO.
Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. PCR Nucleotide Mix Předem připravený roztok ultračistých PCR deoxynukleotidů (datp,
VíceUniverzita Pardubice SEMESTRÁLNÍ PRÁCE. Tvorba nelineárních regresních modelů v analýze dat. 2015/2016 RNDr. Mgr. Leona Svobodová, Ph.D.
Univerzita Pardubice SEMESTRÁLNÍ PRÁCE Tvorba nelineárních regresních modelů v analýze dat 2015/2016 RNDr. Mgr. Leona Svobodová, Ph.D. Úloha Nalezení vhodného modelu pro popis reakce TaqMan real-time PCR
VícePCR IN DETECTION OF FUNGAL CONTAMINATIONS IN POWDERED PEPPER
PCR IN DETECTION OF FUNGAL CONTAMINATIONS IN POWDERED PEPPER Trojan V., Hanáček P., Havel L. Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, Zemedelska
VíceYi TPMT. Diagnostická souprava. Návod k použití. Haasova 27 Brno Česká republika. tel.:
Yi TPMT Diagnostická souprava Návod k použití Výrobce: YBUX s.r.o. Haasova 27 Brno 616 00 Česká republika IČ 63487951 tel.: +420 541 423 710 e-mail: ybux@ybux.eu Název: Yi TPMT Popis: Diagnostická souprava
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace laboratorních úloh genetických předmětů metodikami pracujícími s ribonukleovými kyselinami pšenice Metodické návody pro laboratorní
VíceIZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)
17.1 Izolace DNA (kit DNeasy Plant Mini) Strana 1 IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu DNeasy Plant
VíceNÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT
IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER DNA QUANTIFICATION KIT IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu OBSAH Návod k použití pro HER DNA QUANTIFICATION KIT.... Úvod.... Označení.... Rozsah
VíceDNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová
DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit
VíceIzolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie
Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny
Více5. Úloha: Stanovení počtu kopií plazmidů (plasmid copy number PCN) v buňce
5. Úloha: Stanovení počtu kopií plazmidů (plasmid copy number PCN) v buňce pomocí Q Cílem této úlohy bude stanovit počet kopií penicilinázového plazmidu u Staphylococcus aureus (pusa300houmr like) na bakteriální
VíceODLIŠENÍ ODRŮD PŠENICE OBECNÉ TRITICUM AESTIVUM L. METODOU RAPD
ODLIŠENÍ ODRŮD PŠENICE OBECNÉ TRITICUM AESTIVUM L. METODOU RAPD Distinguishing of Wheat Varieties (Tritium aestivum L.) by Method RAPD Zuzana Kohutová, Zuzana Kocourková, Hana Vlastníková, Petr Sedlák
VíceTESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin
Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně
VíceBraf V600E StripAssay
Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci
VícePolymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.
Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje
Vícecdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2
cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)
VíceEGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C
EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo
VíceIng. Kristýna Bezděková Vliv vybraných faktorů na výskyt patogenů Fusarium spp. v zrnu ječmene
Ing. Kristýna Bezděková Vliv vybraných faktorů na výskyt patogenů Fusarium spp. v zrnu ječmene 24. května 2013, od 9.00 hod, A34 MENDELU AF (budova A) Akce je realizována vrámci klíčové aktivity 02 Interdisciplinární
VíceIzolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
Víceα-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C
α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction
VíceUSING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION
USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION VYUŽITÍ AUTOMATICKÉHO SEKVENOVÁNÍ DNA PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ KANDIDÁTNÍCH GENŮ U PRASAT Vykoukalová Z., Knoll A.,
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace praktických cvičení molekulárně-biologických předmětů o sekvenční úlohy PRACOVNÍ PROTOKOL PRO PŘEDMĚT GENETCKÁ DIVERZITA Vypracováno
VícePísemná zpráva zadavatele
Písemná zpráva zadavatele veřejné zakázky zadávané dle zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách, ve znění účinném ke dni zahájení zadávacího řízení (dále jen ZVZ ). Veřejná zakázka Název: Ostatní
VíceOptimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD
Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD Dana Vejmelková, Milan Šída, Kateřina Jarošová, Jana Říhová Ambrožová VODÁRENSKÁ BIOLOGIE, 1. 2. 2017 ÚVOD Sledované parametry,
VíceKatarína Mitrová, Leona Svobodová, Jaroslava Ovesná. Detekce pěti virů česneku kuchyňského metodou SYBR Green real-time PCR METODIKA PRO PRAXI
Katarína Mitrová, Leona Svobodová, Jaroslava Ovesná Detekce pěti virů česneku kuchyňského metodou SYBR Green real-time PCR METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2017 Metodika byla
VíceDETEKCE VNITŘNÍHO GENU RÝŽE FOSFOLIPÁZY D POMOCÍ PCR
Mgr. Jan Hodek RNDr. Jaroslava Ovesná, CSc. DETEKCE VNITŘNÍHO GENU RÝŽE FOSFOLIPÁZY D POMOCÍ PCR METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007 Metodika byla vypracována pracovníky Národní
VíceMagPurix Forensic DNA Extraction Kit
MagPurix Forensic DNA Extraction Kit Kat. č. ZP02010 Doba zpracování: 40-50 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Forensic DNA Extraction Kit je určena pro izolátor
VíceUživatelská příručka
PGM Barcoding Set 1-8 Navrženo pro PGM ION-TORRENT KÓD PRODUKTU: 2001 (1-8) BALEN9: 32 testů Uživatelská příručka Rev02.2015 Str. 1 Rejstřík 1. POUŽITÍ VÝROBKU 3 2. OBSAH KITU 4 3. SKLADOVÁNÍ 4 4. STABILITA
VíceTkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche
Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního
VíceRNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)
RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) Upozornění: RNA Blue obsahuje fenol a další toxické komponenty. Při kontaktu s kůží je nutné omytí velkým
VíceGENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI
GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.
VíceNRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C
NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte
VíceBraf 600/601 StripAssay
Braf 600/601 StripAssay Kat. číslo 5-560 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup Kit umožňuje detekci 9 mutací v genu BRAF (kodón 600 a 601) Další informace najdete v OMIM Online Mendelian Inheritance
VíceSeminář izolačních technologií
Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html
VíceDiagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení
Diagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení Mgr. Klára Vilimovská Dědečková, Ph.D. Synlab genetics s.r.o. Molekulární
VícePraktický kurz Příprava buněčného lyzátu, izolace celkové RNA pomocí kolonek/tripure reagent, stanovení koncentrace RNA
Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Příprava buněčného lyzátu, izolace celkové RNA pomocí kolonek/tripure reagent, stanovení koncentrace RNA Vyučující: Mgr. Monika Holubová, Bc. Petr
VíceSeznam použitých chemikálií
PŘÍLOHY Tabulky Tabulka č. 1. Přehled výsledků teplot tání pro amplifikáty primeru G3010A. Testování teplot tání rozředěného zásobího roztoku o koncentraci ndna 1ng / 1μl, ředění uvedeno v tabulce. Tabulka
VíceSure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz
Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována
VíceUniverzita Pardubice SEMESTRÁLNÍ PRÁCE. Tvorba lineárních regresních modelů. 2015/2016 RNDr. Mgr. Leona Svobodová, Ph.D.
Univerzita Pardubice SEMESTRÁLNÍ PRÁCE Tvorba lineárních regresních modelů 2015/2016 RNDr. Mgr. Leona Svobodová, Ph.D. Úloha 1 Porovnání regresních přímek u jednoduchého lineárního regresního modelu Porovnání
VíceMagPurix Blood DNA Extraction Kit 200
MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 Kat. č. ZP02001-48 Doba zpracování: 50-60 minut pro MagPurix 12S 50-70 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 je určena pro izolátor
VíceIzolace nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které
VíceJan Hodek, Jaroslava Ovesná, Lucie Pavlátová. METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉ PAPÁJI LINIÍ 55-1 a 63-1 METODIKA PRO PRAXI
Jan Hodek, Jaroslava Ovesná, Lucie Pavlátová METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉ PAPÁJI LINIÍ 55-1 a 63-1 METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 Metodika byla vypracována pracovníky
VícePopis výsledku QC1156/01/2004 Identifikace projektu:
Popis výsledku QC1156/01/2004 Identifikace projektu: ČÍSLO PROJEKTU QC1156 PROGRAM TÉMA PRIORITA Program I B) Zlepšování biologického potenciálu rostlin a zvířat a jeho efektivní využívání 3) Metody charakterizace
Vícenový postřikový fungicid se zcela unikátním mechanismem účinku a bezkonkurenčně dlouhodobým účinkem na ochranu pšenice a ječmene proti padlí travnímu
Talius nový postřikový fungicid se zcela unikátním mechanismem účinku a bezkonkurenčně dlouhodobým účinkem na ochranu pšenice a ječmene proti padlí travnímu 1 Přednosti použití dlouhodobá účinnost na padlí
VíceDUSÍKATÁ VÝŽIVA JARNÍHO JEČMENE - VÝSLEDKY POKUSŮ V ROCE 2006 NA ÚRODNÝCH PŮDÁCH A MOŽNOSTI DIAGNOSTIKY VÝŽIVNÉHO STAVU
DUSÍKATÁ VÝŽIVA JARNÍHO JEČMENE - VÝSLEDKY POKUSŮ V ROCE 2006 NA ÚRODNÝCH PŮDÁCH A MOŽNOSTI DIAGNOSTIKY VÝŽIVNÉHO STAVU Karel KLEM, Jiří BABUŠNÍK, Eva BAJEROVÁ Agrotest Fyto, s.r.o. Po předplodině ozimé
VíceImunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky
Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny
VíceC V C. Návod k použití pro Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02. Revize 2. Červenec 2014
DOT130v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02 Strana 1 / 7 Návod k použití pro Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02 Revize 2 Červenec 2014 DOT130v1
VíceDYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.
DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod. Od 1.1.2014 DYNEX jediným OFICIÁLNÍM (autorizovaným) distributorem společnosti
VíceMagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B
MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B Kat. č. ZP02012 Doba zpracování: 45-60 minut pro MagPurix 12S 45-65 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction
VíceKonečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche
Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských
VíceMolekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014
Molekulárně biologické metody v mikrobiologii Mgr. Martina Sittová Jaro 2014 Harmonogram 1. den Izolace DNA 2. den Měření koncentrace DNA spektrofotometricky, real-time PCR 3. den Elektroforéza Molekulární
VíceIZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek
IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení
VícePraktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu
Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Toto blokové praktické cvičení spočívá v teoretickém i praktickém seznámení s rekombinantními proteiny, jejich izolací, purifikací a využitím.
Více1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru
Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující
VícePolymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1. LF UK Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Martin Vejražka 2017/18 Obsah POLYMORFISMUS
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Využití techniky RACE (Rapid amplification of complementary DNA ends) pro identifikaci genů pro metalothioneiny Metodické návody pro
VícePokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii
Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/1 Proč biofyzikální metody? Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů Poskytují kvantitativní
VíceNávod k použití souprav. Wipe test. Kontaminační kontrola. Testovací souprava pro kontrolu kontaminace využívající molekulárně - biologické metody
Návod k použití souprav Wipe test Kontaminační kontrola Testovací souprava pro kontrolu kontaminace využívající molekulárně - biologické metody REF 7091 40 reakcí 1. Popis výrobku V posledních letech se
VíceMagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit
MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit Kat. č. ZP02003 Doba zpracování: 40-55 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit je určena
Více2 Inkompatibilita v systému Rhesus. Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia
2 Inkompatibilita v systému Rhesus Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia 3 Inkompatibilita v systému Rhesus Úkol 7, str.119 Které z uvedených genotypových kombinací Rh systému u manželů s sebou nesou
VíceSTANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM
STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM ANTIOXIDAČNÍ KAPACITA RŮZNÝCH DRUHŮ MASA (drůbeží, rybí) Princip metodiky: Analyzátor Photochem je určen pro stanovení
VíceSTAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXINY. Zdravotní nezávadnost potravin. Veronika Talianová, FPBT, kruh: 346 Angelina Anufrieva, FPBT, kruh: 336
STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXINY Zdravotní nezávadnost potravin Veronika Talianová, FPBT, kruh: 346 Angelina Anufrieva, FPBT, kruh: 336 OBSAH: Základní charakteristika Staphylococcus aureus Stafylokokové enterotoxiny
VíceDY D NE N X Hana Vlastníková
DYNEX Hana Vlastníková Molekulární biologie: Vybavení laboratoře na klíč Přístrojová technika Kompatibilní diagnostické soupravy Profesionální přístup SOP Technická podpora Servis Přístrojové vybavení:
VíceCVD-T StripAssay. Kat. číslo 4-360. 20 testů 2-8 C
CVD-T StripAssay Kat. číslo 4-360 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup Izolace DNA Použijte čerstvou nebo zmraženou krev s EDTA nebo citrátem, jako antikoagulans, vyhněte se krvi s obsahem heparinu.
VíceColumn DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)
Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého
VíceJaroslava Ovesná, Jan Hodek, Lucie Pavlátová,
Jaroslava Ovesná, Jan Hodek, Lucie Pavlátová, METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉHO TABÁKU VIRŽINSKÉHO (Nicotina tabacum L. cv. Samsun) S VNESENÝM KVASINKOVÝM MITOTICKÝM AKTIVÁTOREM (gen SpCdc25 z
VíceCYCLER CHECK. Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů. Připraveno k použití, prealiquotováno. REF 7104 (10 testů) REF (4 testy)
CZ Návod k použití CYCLER CHECK Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů Připraveno k použití, prealiquotováno REF 7104 (10 testů) REF 71044 (4 testy) Obsah 1. Popis výrobku... 2 2. Materiál... 3
VíceZjišťování přítomnosti houby Ramularia collo-cygni v listových pletivech ječmene z vybraných lokalit České republiky v letech Souhrn
Zjišťování přítomnosti houby Ramularia collo cygni v listových pletivech ječmene z vybraných lokalit České republiky v letech 2009 2011 /Detecting the fungus Ramularia collo cygni in leaf tissues of barley
VíceZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN
ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN Možnosti stanovení Listeria monocytogenes popis metod a jejich princip Mária Strážiková Aleš Holfeld Obsah Charakteristika Listeria monocytogenes Listerióza Metody detekce
VíceVÝVOJ DNA ČIPŮ PRO DETEKCI GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ORGANISMŮ
VÝVOJ DNA ČIPŮ PRO DETEKCI GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ORGANISMŮ Lucie Vištejnová 2, Jan Hodek 1, Patrik Sekerka 2, Jaroslava Ovesná 1, Kateřina Demnerová 2 1. Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507,
VíceKVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE
KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE Northern bloty Genové čipy pracné a zdlouhavé nákladné Semikvantitativní RT-PCR nepřesné qpcr vysoké dynamické rozpětí metodiky real-time PCR Vysokoučinné sekvenování transkriptomu
VíceMgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita
Mgr. et Mgr. Lenka Falková Laboratoř agrogenomiky Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita 9. 9. 2015 Šlechtění Užitek hospodářská zvířata X zájmová zvířata Zemědělství X chovatelství
VíceIZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR
1253.1 Izolace DNA pomocí CTAB pro stanovení GMO Strana 1 IZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorků krmiv
VíceUSING MOLECULAR MARKERS FOR GENETIC DIVERSITY TESTING IN SPRING BARLEY WITH DIFFERENT SENSITIVITY AGAINST FHB
USING MOLECULAR MARKERS FOR GENETIC DIVERSITY TESTING IN SPRING BARLEY WITH DIFFERENT SENSITIVITY AGAINST FHB TESTOVÁNÍ GENETICKÉ DIVERZITY JEČMENE JARNÍHO S RŮZNOU CITLIVOSTÍ VŮČI FHB MOLEKULÁRNÍMI MARKERY
VíceHybridizace nukleových kyselin
Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních
VíceSněti rodu Tilletia spp. Ing. Barbora Dobiášová ÚKZÚZ Odbor osiv a sadby
Sněti rodu Tilletia spp. Ing. Barbora Dobiášová ÚKZÚZ Odbor osiv a sadby Tilletia spp. V ČR se vyskytují nejčastějidva druhy tohoto rodu: Sněť zakrslá - Tilletia controversa Sněť mazlavá pšeničná Tilletia
Více1.4 ANOVA. Vliv druhu plodiny na míru napadení houbami Fusarium culmorum a Fusarium graminearum v systému ekologického hospodaření
1.4 ANOVA Úloha 1 Jednofaktorová ANOVA Vliv druhu plodiny na míru napadení houbami Fusarium culmorum a Fusarium graminearum v systému ekologického hospodaření Bylo měřeno množství DNA hub Fusarium culmorum
VícePolymerázová řetězová reakce
Polymerázová řetězová reakce doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 Obsah přednášky 1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky 2) Technické provedení PCR 3) Fyzikální
VíceSTANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM
STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM ANTIOXIDAČNÍ KAPACITA ČAJŮ Princip metodiky: Analyzátor Photochem je určen pro stanovení antioxidační kapacity vybraných
VíceMolekulární diagnostika
Molekulární diagnostika Odry 11. 11. 2010 Michal Pohludka, Ph.D. Buňka základní jednotka živé hmoty Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8
VíceMOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční
VíceDiagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny
Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha 6 - Ruzyně Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny Odborný seminář 9. 11. 2006. Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2006 161 06 Praha 6 Ruzyně,
VíceDETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP
DETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP Polymerázová řetězová reakce (PCR) je in vitro metoda pro enzymatickou syntézu definované sekvence DNA. Reakce využívá dvou oligonukleotidových
VíceReal time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis
Real time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-PPX-050 Viz. obal POPIS
VíceMetodika detekce hub Penicillium expansum, Monilia fructigena, Botrytis cinerea a Neofabraea alba pomocí multiplex PCR
Metodika detekce hub Penicillium expansum, Monilia fructigena, Botrytis cinerea a Neofabraea alba pomocí multiplex PCR Taťána Sumíková, Ludmila Gabrielová, Martin Žabka Výzkumný ústav rostlinné výroby
VíceAplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse
Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse Mgr. Jana Ždychová, Ph.D. IKEM PLM - LLG Sepse je častou příčinou úmrtí během hospitalizace. Včasné nasazení odpovídající ATB terapie je
VíceSuchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot)
Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot) Kapka kapilární krve nanesena na testovací kartičku filtračního papíru a vysušena odběr z prstu ušního lalůčku z patičky (u novorozenců) odběrová
VíceIZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE)
Strana 1 IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu GenElute. 2 Princip Proces izolace
VícePolymorfismus délky restrikčních fragmentů
Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,
VíceOBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14
OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases
VíceUrčení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách
Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho
VíceReal time PCR detekce Borrelia burgdorferi Sensu Lato
Real time PCR detekce Borrelia burgdorferi Sensu Lato In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-BBSL-050 Viz. obal POPIS SOUPRAVY Real Time PCR souprava pro detekci Borrelia burgdorferi Sensu Lato
VíceIZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD)
1252.1 Izolace DNA pro stanovení GMO metodou Strana 1 IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC
Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie
VíceKořenový systém plodin jako adaptační opatření na sucho
Sucho a degradace půd v České republice - 2014 Brno 7. 10. 2014 Kořenový systém plodin jako adaptační opatření na sucho Vodní provoz polních plodin Ing. Jana Klimešová Ing. Tomáš Středa, Ph.D. Mendelova
Více