Masarykova univerzita. Lékařská fakulta ZÁCHYT BORDETELLA PERTUSSIS V KLINICKÉM MATERIÁLU METODOU PCR. Bakalářská práce. v oboru zdravotní laborant

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta ZÁCHYT BORDETELLA PERTUSSIS V KLINICKÉM MATERIÁLU METODOU PCR Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Bednářová, Ph.D. Autor: Kateřina Lufinková Brno, duben 2014

2 Jméno a příjmení autora: Kateřina Lufinková Název bakalářské práce: Záchyt Bordetella pertussis v klinickém materiálu metodou PCR Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Bednářová, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Bordetella pertussis je původcem černého kašle. I přes zavedené očkování se onemocnění vyskytuje i v dnešní době, jak u dospělých pacientů, tak i u dětí. Průkaz etiologického agens spočívá v přímém průkazu (kultivace, molekulárně biologické metody) i v nepřímém průkazu (detekce protilátek). V práci bude zhodnocen přínos metody PCR ke klinické diagnostice. Klíčová slova: Bordetella pertussis, dávivý/černý kašel/pertuse, polymerázová řetězová reakce Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jany Bednářové, Ph.D., a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne (Kateřina Lufinková)

4 Mé velké a upřímné poděkování patří paní MUDr. Janě Bednářové, Ph.D., za její odborné vedení, profesionální a lidské jednání, cenné informace a pomoc při vypracování bakalářské práce. Děkuji celému týmu laboratoře OKM FN Brno za předané zkušenosti a trpělivost, stejně tak jako mým rodičům a partnerovi za podporu.

5 OBSAH 1. ÚVOD OBECNÁ ČÁST Bakterie Bordetella pertussis Charakteristika Historie Význam Patogenita a virulence Patogeneze Stadia onemocnění Komplikace Toxiny Prevence Léčba Imunitní odpověď Diagnostika pertuse Odběr materiálu Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na kultivační vyšetření Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na PCR Bronchoalveolární laváž Odběr materiálu pro sérologii Uchovávání a transport materiálu Transport vzorků pro kultivaci Transport vzorků pro PCR Uchovávání vzorků pro sérologickou detekci Přímá detekce patogenu

6 2.8.1 Mikroskopický průkaz Kultivační průkaz Přímá imunofluorescence (DFA) Polymerázová řetězová reakce (PCR) Princip PCR diagnostika B. pertussis Sérologie nepřímá detekce patogenu Aglutinace Charakteristika Diagnostika B.pertussis metodou aglutinace ELISA Charakteristika Diagnostika B.pertussis metodou ELISA Imunoblot CÍLE PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál a metody Pacienti a odběr vzorků Přístroje Pomůcky Přímý průkaz Real-time PCR pomocí komerční soupravy Pneumoplex Dynex Real-time PCR pomocí komerční soupravy B.pertussis/parapertussis Bio- Evolution Nepřímý průkaz ELISA

7 Detekce specifických protilátek pomocí komerční soupravy SERION ELISA classic Aglutinace Výsledky Rozdělení souboru Skupina A Skupina B Negativní Porovnání souboru podle věku a pohlaví ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY A POUŽITÝCH ZDROJŮ

8 SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK BP Bordetella pertussis DNA deoxyribonukleová kyselina DTP vakcína proti záškrtu, tetanu a pertusi ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU Evropská unie FHA filamentózní hemaglutinin IgG, M, A imunoglobulin G, M, A IKD inkubační doba KHS Krajská hygienická stanice LIS laboratorní informační systém OKM FN Brno Oddělení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno PCR polymerázová řetězová reakce PT pertusový toxin SZÚ Státní zdravotní ústav WHO Světová zdravotnická organizace

9 1. ÚVOD Práce má standardní členění do částí teoretická a experimentální, přičemž se v celém průběhu opírá především o literaturu a výzkum, které souvisejí s touto problematikou. V teoretické části je věnován prostor charakteristice bakterie Bordetella pertussis (obecná charakteristika bakterie, virulentní faktory, apod.), dále onemocnění, včetně jeho nezbytných charakteristik průběh, následky, diagnostika, prevence, očkování, očkovací kalendář, léčba, historie, epidemiologická situace, atd., které způsobuje. V další části je pozornost věnována metodě PCR a průkaznosti etiologického agens spočívajícího v přímém průkazu (kultivace, molekulárně biologické metody) i nepřímém průkazu (detekce protilátek). V experimentální části zpracovávám soubor pacientů, který mi byl poskytnut z laboratorního informačního systému Oddělení klinické mikrobiologie ve Fakultní nemocnici Brno. Využití metody PCR při identifikaci bakterie Bordetella pertussis v sobě skrývá obrovský potenciál i s ohledem na vážnost onemocnění černý kašel, který způsobuje a je i v těchto letech stále aktuálním tématem, neboť i přes zavedené očkování se druh tohoto onemocnění vyskytuje relativně hojně a to jak u dospělých pacientů, tak i u dětí. V závěru práce jsou shrnuty teoretické a praktické poznatky, na základě kterých jsou zhodnoceny přínosy metody PCR v případě klinické diagnostiky

10 2. OBECNÁ ČÁST 2.1 Bakterie Bordetella pertussis Charakteristika Bordetella pertussis je malá gramnegativní tyčinka způsobující černý kašel (též pertussis, pertuse, divý, zádušní, zajíkavý anebo dávivý kašel), což je vysoce nakažlivé onemocnění dýchacích cest postihující zejména humánní populaci (TestLine, 2013). Dle WHO je pertuse definována jako kašel trvající déle než 21 dní, současně potvrzený laboratorně. V České republice patří mezi povinně hlášená a dlouhodobě sledovaná infekční onemocnění. Souhrnná data o úmrtnosti na pertusi na území historických českých zemí od roku 1890 jsou v archivu SZÚ (PELC, 1929). Obr. 1: Bordetella pertussis Zdroj:[

11 2.1.2 Historie Pertuse je onemocnění známé již od 14. století, které postihuje celý svět. Odhaduje se, že každý rok onemocní pertusí více než 50 milionů osob a na tuto nemoc zemře (BENEŠ, 2010). Dříve byla pertuse jedním z nejčastějších dětských onemocnění, přičemž více než polovina dětí se nakazila před nástupem do školy. Ve 40. letech 20. století výskyt dramaticky poklesl s vývojem celobuněčné vakcíny, na základě čehož mnohé země včetně České republiky zavedly povinné vakcinační programy pro děti. Po zavedení očkování nemocnost dramaticky poklesla, z původních případů v roce 1958 na 5 40 v roce Navzdory tomu v současné době incidence tohoto onemocnění vzrůstá a současně se posouvá do vyšších věkových kategorií dětí, adolescentů a dokonce i dospělých, u kterých se ovšem vyskytuje bez typických záchvatů a zpravidla nemá fatální následky. V loňském roce bylo u nás zaznamenáno přes 880 případů nakažených (KŘÍŽ, 2003; CHLÍBEK, 2011). Obr. 2: Incidence pertuse v České republice v letech Zdroj:[CHLÍBEK.R., 2011, dostupné na:

12 2.1.3 Význam Rod Bordetella zahrnuje v současnosti 7 druhů velmi malých, opouzdřených, nepohyblivých, gramnegativních kokobacilů s fimbriemi, z nichž v humánním lékařství jsou významnými patogeny Bordetella pertussis a Bordetella parapertussis, obě původce dávivého kašle. Kromě původců dávivého kašle patří do rodu Bordetella zoopatogenní B. avium a B. bronchiseptica a další druhy, B. hinzii, B. holmensii a B. trematum, jejichž význam v přírodě dosud není dostatečně objasněn. Všechny druhy Bordetell mohou zvláště u imunosuprimovaných jedinců způsobit onemocnění respiračního aparátu, otitidu nebo rannou infekci (BENEŠ, 2010). Bordetella pertussis (BP) potřebuje ke kultivaci striktně aerobní podmínky, nicméně neroste na běžných kultivačních médiích (krevní agar, MacConkey agar), jelikož běžné agary obsahují některé toxické součásti. Ke kultivaci tedy používáme půdy obohacené aktivním uhlím, s přídavkem krve, albuminu nebo škrobu a nikotinamidu, jmenovitě Bordet-Gengou agar (resp. Charcoal agar). Ke kultivaci přistupujeme nejlépe na konci inkubační doby, v průběhu katarálního, případně na začátku paroxysmálního stadia, před začátkem antibiotické terapie (VOTAVA a kol., 2003). 2.2 Patogenita a virulence Patogeneze Černý kašel se přenáší kapénkovou infekcí vzduchem, ale i dotykem předmětů, které byly v kontaktu s nakaženou osobou. Nakažlivost je vysoká, nejvnímavější jsou kojenci do 3 měsíců věku, u kterých nebyla provedena či dokončena vakcinace. Závažný průběh onemocnění bývá sledován i u starých lidí. Onemocnění se vyskytuje častěji v podzimních a zimních měsících, spíše u dětí navštěvujících kolektivní zařízení (HAVLÍK, 2002)

13 2.2.2 Stadia onemocnění Typická forma onemocnění zahrnuje 4 stadia probíhající během 6 8 týdnů. První, bezpříznakové stadium, inkubační doba (IKD) trvá 6 až 21 dní. Ve druhém, katarálním stadiu, 1 2 týdny, již můžeme pozorovat počáteční netypické příznaky podobné běžnému nachlazení. Rýmu, rhinitidu, slzení, subfebrilie a zhoršující se suchý dráždivý kašel, který přechází z mírného do záchvatovitého stadia. Třetí, paroxysmální stadium, trvající většinou 1 4 týdny, se projevuje typickými epizodami dráždivého, záchvatovitého, zajíkavého kašle s přerývavým inspiriem, rudnutím, otoky víček, cyanotickým zabarvením v obličeji a někdy i subkonjunktiválními hematomy. Na konci záchvatů můžeme pozorovat apnoickou pauzu následovanou hlasitým, zajíkavým táhlým inspiriem (někdy připomíná kokrhání kohouta) nebo zvracení, což je život ohrožující obzvláště pro kojence. V konečném stadiu rekonvalescence, 1 3 týdny, příznaky postupně odeznívají, záchvaty kašle se snižují a zmírňují (BENEŠ, 2010; HOLČÍKOVÁ, 2003). Tab. 1: Tabulka přehledu stádií onemocnění IKD Katarální stádium Paroxysmální stádium Rekonvalescence Trvání 6-21 dní 1-2 týdny 1-4 týdny 1-3 týdny Symptomy žádné rýma, kašel, nechutenství dráždivý, záchvatovitý, zajíkavý kašel ústup záchvatů, nástup sekundárních komplikací Průkaz agens Zdroj: [

14 2.2.3 Komplikace Nejčastější komplikací tohoto onemocnění je pneumonie, která u malých dětí bývá příčinou fatálního konce. Bývá způsobena přímým účinkem pertusových toxinů nebo je následkem aspirace. Mezi další komplikace patří pneumotorax, prolaps rekta a nebývá vzácné poranění uzdičky jazyka zuby či subkonjunktivální hemoragie. Mnohdy je nemoc spjata s opakovaným zvracením, které může vést až k malnutrici, celkovým vyčerpáním a díky úpornému kašli může dojít až ke zlomeninám žeber, vzniku kýly či pomočování. K nejzávažnějším komplikacím ale patří poškození centrálního nervového systému, na kterém má podíl anoxie, hypoglykémie, krvácení a přímý účinek pertusového toxinu. Onemocnění může být proto provázeno křečemi a poruchami vědomí. Neobvyklostí nebývají ani trvalé následky v podobě hluchoty, slepoty a mentální retardace. V krajním případě může toto onemocnění skončit úmrtím (HOLČÍKOVÁ, 2003; HAVLÍK, 2002; KHS, 2008) Toxiny BP po vniknutí do horních cest dýchacích adheruje na povrch řasinkového epitelu sliznice nosohltanu, hltanu, průdušnice a průdušek a způsobuje onemocnění uvolněním svých toxinů, jimiž vyvolává celou řadu imunologických a patofyziologických odpovědí organismu. Hlavními virulentními faktory černého kašle jsou pertusové toxiny, které působí oslabení imunitního systému a dále adheziny jako filamentózní hemaglutinin (FHA) a fimbrie, pertactin a dermonektorický toxin, které umožňují přilnutí mikroba na hostiteli. Pertusový toxin (PT) je specifický pouze pro BP. Skládá se z aktivního enzymu a vazebných subjednotek. Aktivní enzym je polypeptid ADP-ribosyl transferáza. Vazebné subjednotky se skládají z minimálně tří různých polypeptidů, které se váží na specifické karbohydráty na buněčných površích a na glykoproteinech obsažených v krevním séru. Výsledným efektem PT je vazba na regulační protein vázaný na membránu, což způsobuje stimulaci adenylátcyklázy. Kromě toho způsobuje především hypoglykemii, zvyšuje citlivost na histamin a zesiluje permeabilitu kapilár. U experimentálních zvířat má vliv také na imunitní reakce, podněcuje lymfocytózu uvolňováním B a T lymfocytů z kostní dřeně, sleziny a mízních uzlin

15 Stimulace adenylátcyklázy je zajištěna taktéž adenylátcyklázovým toxinem, což napomáhá prvnímu stupni rozvoje infekce. Dalším produktem BP je dermonekrotický toxin (nověji letální toxin), který způsobuje lokální nekrózu po intradermálním vpichu. Epizody záchvatovitého kašle jsou pravděpodobně způsobeny tracheálním cytotoxinem, který je toxický pro řasinkový respirační epitel. Mezi adheziny patří filamentózní hemaglutinin a pertaktin, které jsou součástí acelulárních multikomplexních očkovacích látek. Dále sem patří dva odlišitelné sérotypy fimbrií, sérotyp 2 a 3, které zodpovídají za další stabilizaci přichycení na epitelie horních cest dýchacích (BEDNÁŘ, 1996). 2.3 Prevence V České republice se proti pertusi očkuje preventivně od roku Základní schéma zahrnovalo pět dávek celobuněčné vakcíny, tři základní dávky a dvě přeočkování (první dávka v 9. týdnu věku dítěte, druhá 6 8 týdnů po první, třetí 6 8 měsíců po druhé dávce a revakcinační dávky ve třech a šesti letech věku dítěte). Očkovací schéma bylo aktualizováno na základě výsledků sérologických přehledů a v roce 1994 došlo taktéž k záměně druhu používané československé trivakcíny DTP za zahraniční tetravakcínu DTP-Hib, která byla v roce 2007 nahrazena základní hexavakcínou Infanrix hexa (GlaxoSmithKline) s acelulární pertusovou složkou (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2012). V podstatě tedy existují dva typy vakcín, tzv. vakcíny celobuněčné, které obsahují inaktivovanou suspenzi B. pertussis, nebo vakcíny označované jako acelulární, které obsahují jen jednotlivé antigenní složky, např. vláknitý hemaglutinin, pertusový toxin a pertactin. Ta je součástí trivalentní (DTP) vakcíny registrované pod jménem Infanrix. Obě vakcíny mají schopnost navodit ochranu proti pertusi, u acelulární je však pozorován nižší výskyt nežádoucích reakcí po očkování. Konvenční celobuněčné vakcíny jsou vyráběny v mnoha zemích. Jejich nevýhodou je vysoká reaktogenita a možný vznik nežádoucích účinků a komplikací. Až u 22 procent dětí docházelo po očkování k lokálním reakcím zarudnutí, otok, bolestivost. Méně časté jsou

16 komplikace jako encefalopatie, křeče, psychomotorická retardace, ale i možnost irreverzibilního poškození CNS. To vedlo v některých státech (Japonsko, Švédsko) k poklesu proočkovanosti populace s následným vzestupem počtu onemocnění, a dokonce i k úmrtím. (BENEŠ, 2010; VOTAVA, 2009; FABIÁNOVÁ, KŘÍŽ, 2007) V současné době se u nás používají vakcíny, které kombinují očkování proti pertusi s očkováním proti záškrtu a tetanu, případně i proti infekcím, které působí Haemophilus influenzae sérotypu b a dětské přenosné obrně. Očkovací kalendář černého kašle je zahájen od 9. týdne věku dítěte, kdy je podána očkovací látka Infanrix hexa. Očkovací schéma pokračuje druhou, třetí a čtvrtou dávkou ve třetím, čtvrtém a osmnáctém měsíci života. První přeočkování je doporučeno mezi pátým a šestým rokem stále stejnou vakcínou, druhé potom v desátém až jedenáctém roce očkovací látkou Boostrix polio. Očkování proti černému kašli se řadí mezi povinná očkování, je tedy plně hrazené za zdravotního pojištění (Česká vakcinologická společnost ČLS JEP). Imunita proti černému kašli ovšem není celoživotní, vymizí zpravidla po 4 12 letech po očkování. Tzn., že v dospělém věku již ani očkovaní jedinci nejsou chráněni (BENEŠ, 2009). Do dospělosti přetrvávají pouze protilátky proti pertusovému toxinu, protilátky proti hemaglutininu postupně vymizí. Postvakcinační a postinfekční imunita získaná po onemocnění způsobeném B. pertussis nechrání před onemocněním způsobeným B. parapertussis. Kontraindikováno je očkování proti pertusi u pacientů s anafylaktickými reakcemi na vakcinační nebo pomocnou složku očkovací látky, v případě akutních onemocnění, pacientů s progresivními neurologickými nebo metabolickými onemocněními a encefalopatiemi. (Očkovací látky, Dostupné na:

17 Obr. 3: Vakcína Infanrix hexa Obr. 4: Vakcína Boostrix polio Zdroj:[ [ Obr. 5: Očkovací kalendář v ČR platný k od 4. dne 6. týdne Tuberkulóza (pouze u rizikových dětí s indikací) BCG vaccine SSI od 6. týdne Rotavirové nákazy Rotarix, Rotateq (1. dávka) od 9. týdne (2. měsíc) Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna, žloutenka typu B, onemocnění vyvolaná Haemophilus influenzae typu B Infanrix hexa (1. dávka) Pneumokoková onemocnění* Synflorix, Prevenar 13 (1. dávka) Rotavirové nákazy Rotarix, Rotateq (2. dávka-za měsíc po 1. dávce) 3. měsíc Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna, žloutenka typu B, onemocnění vyvolaná Haemophilus influenzae typu B Infanrix hexa (2. dávka-za měsíc po 1. dávce) Pneumokoková onemocnění* Synflorix, Prevenar 13 (2. dávka-za měsíc po 1. dávce) Rotavirové nákazy Rotateq (3. dávka-za měsíc po 2. dávce)

18 4. měsíc Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna, žloutenka typu B, onemocnění vyvolaná Haemophilus influenzae typu B Infanrix hexa (3. dávka-za měsíc po 2. dávce) Pneumokoková onemocnění* Synflorix, Prevenar 13 (3. dávka-za měsíc po 2. dávce) měsíc Pneumokoková onemocnění* Synflorix, Prevenar 13 (přeočkování) 15. měsíc Spalničky, zarděnky, příušnice Priorix (1. dávka) Plané neštovice, spalničky, zarděnky, příušnice Priorix-Tetra (1. dávka) do 18. měsíce Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna, žloutenka typu B, onemocnění vyvolaná Haemophilus influenzae typu B Infanrix hexa (4. dávka) 21. až 25. měsíc Spalničky, zarděnky, příušnice Priorix (2. dávka-za 6-10 měsíců po 1. dávce) Plané neštovice, spalničky, zarděnky, příušnice Priorix-Tetra (2. dávka) rok Záškrt, tetanus, černý kašel Infanrix (přeočkování) rok Záškrt, tetanus, černý kašel, dětská obrna Boostrix polio (přeočkování) 13. rok (jen dívky) Onemocnění lidským papilomavirem (karcinom děložního čípku)* Cervarix, Silgard (celkem 3 dávky) 14. rok (u neočkovaných v letech) Tetanus Tetavax, Tetanol Pur (přeočkování) Záškrt, tetanus, černý kašel Boostrix, Adacel (přeočkování) Zdroj:[ Léčba Ačkoliv je dávivý kašel bakteriální onemocnění, jakmile se rozvine a uplatní vliv toxinů, antibiotika již průběh pertuse příliš neovlivní. Tato klinická neúčinnost je vysvětlována již existující fixaci toxinů v respiračním aparátu. Antimikrobní terapie je však indikována i v této

19 fázi onemocnění za účelem eliminace šíření toxického agens v populaci. Pacienti by měli být taktéž izolováni po několik týdnů nebo do doby, kdy je jejich kultivační nález negativní. Na druhé straně právě v katarálním stádiu, kdy by bylo podávání antibiotik žádoucí a nejúčinnější, většinou pertuse ještě rozpoznána není. (BENEŠ, 2010; VOTAVA a kol., 2009). Zejména v katarálním stadiu je bakterie in vitro dobře citlivá na řadu antimikrobních látek. Lékem první volby jsou makrolidová antibiotika, zejména erytromycin, který může být použit i profylakticky u osob, které přišly do kontaktu s nakaženým. Účinné jsou také tetracykliny, co-trimoxazol nebo chloramfenikol. Beta-laktamová antibiotika nejsou vhodná, protože nedosahují účinných koncentrací na sliznici cest dýchacích. Léčba antibiotiky rychle zbaví pacienta bakterií, avšak záchvaty kašle ovlivní jen málo nebo vůbec ne. Doporučené dávkovací schéma u erytromycinu pro bronchitis acuta vyvolanou Bordetella pertussis nebo parapertussis je: dospělí 500 mg per os každých 6 hodin, děti mg/kg/den ve čtyřech dávkách taktéž po 6 hodinách. Aplikuje se po dobu 10 dní. V České republice není erytromycin dostupný, využívá se klaritromycin. (BÉBROVÁ a kol., 2003) Nebyla prokázána žádná symptomatická léčba, která by pozitivně ovlivnila průběh onemocnění (trvání a intenzitu záchvatů, dobu hospitalizace atd.). 2.5 Imunitní odpověď Imunita po proběhlém onemocnění ani po očkování není celoživotní (4 20 let). Hladina protilátek po očkování postupně klesá s věkem (3 12 let). Imunita po očkování acelulární vakcínou je kratší než po očkování celobuněčnou vakcínou. Transplacentárně přenesené protilátky mizí v průběhu týdne života a 95% dětí ve věku 2 měsíců již nemá žádné protilátky. Vysoké hladiny mateřských protilátek nemají vliv na délku jejich přetrvávání a u dětí negativně ovlivňují tvorbu vlastních protilátek po očkování. (FABIÁNOVÁ, 2011)

20 Imunitní odpověď na infekci pertuse je zaměřena proti různým antigenům. Nejspolehlivější je ale reakce protilátek IgG proti PT, které jsou změřitelné u 90% nakažených lidí a mohou perzistovat několik let. V séru se vyskytují nejdříve po 2 3 týdnech od počátku onemocnění a svého maxima dosahují po 6 8 týdnech, kdy dochází k typickým projevům záchvatovitého kašle. V případě primární infekce obvykle začíná produkce protilátek ve druhém týdnu paroxysmálního stadia. Nejdříve jsou detekovatelné IgM, které se podílí na primární imunitní odpovědi, mají krátký poločas a přetrvávají v krevním séru po dobu 2 3 měsíců. Analyzujeme je již 5 10 dní po začátku infekce. Po 1 2 týdnech mohou být stanoveny taktéž IgA protilátky, které perzistují 6 24 měsíců. Rozvoj antigenní odpovědi u dětí může být opožděn. 2.6 Diagnostika pertuse Odběr materiálu Klinické projevy infekce dýchacích cest napodobující pertusi mohou vyvolat i jiné mikroorganismy, zejména další druhy Bordetel, Haemophilus influenzae a různé typy adenovirů, proto je nesmírně nezbytná rychlá a správná diagnostika. Laboratorní diagnostika pertuse se opírá o přímý průkaz (kultivace, izolace agens a PCR detekce) a nepřímý průkaz (sérologie, průkaz specifických protilátek). Optimální načasování pro diagnostiku B. pertussis je v akutní fázi onemocnění od objevení klinických příznaků kašel Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na kultivační vyšetření Odběr materiálu pro kultivaci je nutné provést před zahájením antibiotické léčby. Ke kultivačnímu vyšetření se odebírá výtěr z nazofaryngu. Stěr se provádí nosem ze zadní stěny nosohltanu tamponem na krátkém drátku (obr. 6). Orofaryngeální výtěr neobsahuje dostatečný počet buněk řasinkového epitelu. Používají se tampony calcium alginat nebo Dacron fiber, bavlněné tampony nejsou vhodné, jelikož obsahují mastné kyseliny, které jsou

21 pro B. pertussis toxické. Ideální provedení výtěru je ráno na lačno, pacient by taktéž před odběrem neměl minimálně 2 3 hodiny žvýkat, kouřit ani si čistit zuby. Odběr může být pro pacienta velmi nepříjemný, je obtížně proveditelný a vyžaduje trénink, provádí ho tedy školený ORL specialista. Vzorek je uchováván při pokojové teplotě, zpracován ideálně do 4 hodin po odběru. Vyšetřující laboratoře jsou povinny podle Vyhlášky č.473/2008 Sb. zasílat každý izolovaný kmen B. pertussis a B. parapertussis do Národní referenční laboratoře pro pertusi a difterii v SZÚ. (MAREŠOVÁ, 2008) Nazofaryngeální výtěr nebo aspirát na PCR Na rozdíl od odběru klinického materiálu na kultivační vyšetření pro metodu PCR lze výtěr provézt i při probíhající antibiotické terapii. Tato metoda je rychlým a vysoce citlivým řešením průkazu B. pertussis, avšak můžeme k ní přistoupit pouze v časné fázi onemocnění. Obr. 6: Výtěr z nosohltanu zdroj: [

22 Bronchoalveolární laváž Odběr materiálu bronchoalveolární laváží je taktéž nutné provést na počátku onemocnění, před zahájením antibiotické léčby. Bronchoalveolární laváž, zkráceně BAL, je diagnostická metoda, při níž je získána bronchoalveolární tekutina ze segmentálních bronchů, bronchiol a plicních alveol, která se použije k další diagnostice. Tato metoda se provádí aplikací ml fyziologického roztoku do segmentálního bronchu, který je následně aspirován. Vzhledem k provedení metody je nutné zvážit riziko komplikací jako krvácení, pneumotorax nebo poškození hlasových vazů a sliznice dýchacích cest. (Česká pneumologická a ftizeologická společnost, 2004) Odběr materiálu pro sérologii Krev k sérologické diagnostice se odebírá sterilními jehlami po dezinfekci místa odběru do sterilních uzavřených nádobek s vakuem, případně do sterilní stříkačky, ze které se později vstříkne do zkumavky (TOMAN, 2009). Doporučuje se provést dva odběry séra, první co nejdříve v akutní fázi a druhý s odstupem 3-4 týdnů. Vzorky je třeba vyšetřit současně a k průkazu infekce je třeba prokázat signifikantní (alespoň čtyřnásobný) vzestup titru protilátek. 2.7 Uchovávání a transport materiálu Transport vzorků pro kultivaci Optimální pro transport vzorku je jeho přímé naočkování na kultivační plotnu. Tampon je třeba po odběru ihned zanořit do transportního média, např. AMIES s aktivním uhlím). Odebraný materiál se přepravuje a uchovává při pokojové teplotě, ne v lednici. Materiál je třeba po odběru zpracovat co nejrychleji, ideálně do 4 hodin, maximálně do 24 hodin. Bordetelly jsou velmi citlivé na vyschnutí, při použití tamponu bez transportního média je tedy třeba nejpozději do hodiny přímo vyočkovat bakterii na kultivační plotnu (ZAVADILOVÁ, SZU, 2011)

23 2.7.2 Transport vzorků pro PCR Materiál pro vyšetření metodou PCR je taktéž vhodné zpracovat co nejrychleji, případně lze skladovat při -20 C. Přepravování odebraného vzorku je vhodné při teplotě 2 8 C. Narozdíl od přepravy vzorku pro kultivační diagnostiku, tampon může být po odběru přepravován suchý (ZAVADILOVÁ, 2011) Uchovávání vzorků pro sérologickou detekci V ideálním případě je sérum zpracováno bezprostředně po získání. Pokud je zpracováno během jednoho týdne, je nutné jej uchovávat v chladničce při 2 8 C, při delším uchovávání uložit při teplotě -18 C a nižší. 2.8 Přímá detekce patogenu Mikroskopický průkaz Pro svou malou citlivost a specifitu není využíván Kultivační průkaz Kultivační průkaz je považován za zlatý standard průkazu B. pertussis (AVDIČOVÁ, KRIŠTÚFKOVÁ, 2009) Tento patogen potřebuje ke kultivaci striktně aerobní podmínky, nicméně neroste na běžných kultivačních médiích (krevní agar, MacConkey agar), jelikož běžné agary obsahují některé toxické součásti. Ke kultivaci tedy používáme půdy obohacené aktivním uhlím, s přídavkem krve, albuminu nebo škrobu a nikotinamidu, jmenovitě neselektivní půdy jako Bordet-Gengou agar, což je půda obsahující bramborový extrakt s glycerinem a 25% beraní krve (výrobce Difco), dále Charcoal agar, Regan-Lowe charcoal agar a selektivní půdy s přídavkem 40mg/l cephalexinu (Charcoal agar se suplementem). Půda musí být v misce dostatečně vysoko vylitá, aby během dlouhé doby inkubace nevysychala (výška 7 10 mm). B. pertussis roste v normální atmosféře při teplotě C

24 po dobu 7 dní při ph půdy 7,4 ± 0,2. Každý den odečteme plotny. Ke kultivaci přistupujeme nejlépe na konci inkubační doby, v průběhu katarálního, případně na začátku paroxysmálního stadia, před začátkem antibiotické terapie (VOTAVA a kol., 2003). B. pertussis roste hodin, na agaru najdeme drobné, stříbrošedé, hladké, lesklé, polokulovité, kličkou dobře roztíratelné kolonie, u kterých se na Bordet-Gengou agaru objevuje slabá zóna hemolýzy (viz obr. 7). Na rozdíl od toho větší, šedostříbrné kolonie B. parapertussis vyrůstají již po 24 hod, tvoří hnědý pigment a při delší inkubaci jsou vpadlé do půdy. Na Bordet-Gengou agaru je výrazná zóna hemolýzy a černohnědý pigment. Tato bakterie roste také na krevním agaru (VOTAVA a kol., 2003). K největším výhodám kultivačního průkazu se řadí vysoká specifičnost (100%) a sledování rezistence a genetických změn izolátů kolujících v populaci. Tato metoda má však i své nevýhody, nízkou citlivost (12-60%), potřebu speciálních kultivačních médií a délku kultivace (7 10 dní). (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2012) Mezi nejčastější příčiny neúspěchu kultivace patří špatně provedený odběr, nedodržení transportních podmínek, špatná volba kultivační půdy, použití kultivačního média jen s cefalosporinem (je třeba použít oba dva druhy medií, jak s cefalosporinem, tak bez něj), stará krev nebo nedostatečně vylitá plotna. Vyšetřující laboratoře jsou povinny podle Vyhlášky č.473/2008 Sb. zasílat každý izolovaný kmen B. pertussis a B. parapertussis do Národní referenční laboratoře pro pertusi a difterii v SZÚ (VOTAVA a kol., 2009; ZAVADILOVÁ, SZÚ)

25 Obr. 7: Kultivace Bordetella pertussis zdroj:[ Přímá imunofluorescence (DFA) Tato metoda se používá pouze v rychlé diagnostice pertuse. Jelikož má nízkou citlivost, v současné době je nahrazována PCR diagnostikou (MATTOO, CHERRY, 2005)

26 2.8.4 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Princip PCR je zkratka pro anglický název polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce), což je metoda sloužící k mnohonásobnému zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro. Princip syntézy DNA touto metodou je velmi podobný replikaci DNA. Kopie úseku DNA jsou syntetizovány prostřednictvím enzymu DNA-polymerázy podle templátu ve formě jednořetězcové DNA na principu komplementarity bazí. Reakce je zahájena dvěma primery, což jsou chemicky syntetizované krátké oligonukleotidy, které se připojují ke komplementárním úsekům protilehlých řetězců DNA tím způsobem, že 3-OH-konce směřují proti sobě. Primery vymezují úsek DNA, který bude amplifikován z templátů dvouřetězcové DNA. PCR je třífázová metoda zmnožení určitého úseku DNA, jejíž tři děje se cyklicky opakují. Reakce začíná denaturací DNA, zahřátím na teplotu C při které se rozpadnou vodíkové můstky mezi vlákny dvouřetězcové DNA a jsou separovány řetězce. Tato reakce trvá asi sekund. Po ní následuje hybridizace, označovaná anglickým termínem annealing (tzn. po rozpálení prudce ochladit). Tato reakce probíhá při teplotě C a trvá sekund. Molekuly jednořetězcové DNA se po ochlazení opět renaturují. Je nutné dodržet přesně stanovenou teplotu, při příliš nízké teplotě by primery mohly nasedat i na ostatní sekvence, které nejsou plně komplementární, a naopak při vyšší teplotě by nedošlo k dostatečné hybridizaci, což by vedlo k nedostatečné produkci. Třetím krokem je již vlastní polymerační reakce, která zahajuje prodlužování řetězců pomocí DNA-polymerázy, jež syntetizuje komplementární řetězce DNA z volných nukleotidů. Při této elongaci je nutné zajistit teplotu C po dobu trvání sekund. V tomto kroku slouží jako nový templát oligonukleotidy, které dosedly na jednořetězcovou DNA v předchozím kroku. Syntéza nového řetězce začíná od 3 - konce. Cyklické opakování jednotlivých kroků (25 30 cyklů) umožňuje speciální přístroj termocykler, který umožňuje střídání teploty reakční směsi

27 Výsledný produkt PCR je tedy amplifikovaný úsek DNA, který můžeme dále analyzovat např. stanovením velikosti produktu gelovou elektroforézou, štěpením produktu restrikčními enzymy a posouzením spektra vznikajících restrikčních fragmentů, hybridizací se značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku nebo stanovením sekvence DNA (MULLER, HOPPE, KONIG, 1997). Variantou PCR je polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase (real-time PCR), která umožňuje přímou kvantifikaci PCR produktu. Provádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje cyklické střídání teplot, detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky. Výhodou této metody je zvláště možnost získat ohromné množství kopií z minimálního množství DNA. Princip zmnožení DNA je znázorněn na obr. 8. Mimo to je to metoda velice rychlá (do 8 hodin), vysoce citlivá (70 99 %) a specifická ( %). I PCR má ale své nevýhody, v průběhu metody se může objevit potenciálně mylná pozitivita nebo zkřížená kontaminace DNA (HUČKOVÁ, KOLLÁROVÁ, 2009)

28 Obr. 8: Princip PCR upraveno dle:

29 PCR diagnostika B. pertussis PCR diagnostika je důležitá zejména pro diagnostiku B. pertussis a jiných patogenů, kteří se obtížně kultivují. Pro tuto metodu se používá laryngeální výtěr nebo aspirát k primovyšetření, případně izolovaná DNA ke konfirmaci nebo k vyšetření detekci PtxA-pr, které se zasílají do Národní referenční laboratoře. Metoda má vysokou specifitu, i když mnohdy se nepodaří odlišit B. pertussis od ostatních druhů Bordetel. Pro diagnostiku B.pertussis se nejčastěji využívá inzertní sekvence IS481, která se v genomu B.pertussis vyskytuje v kopiích. Tato sekvence však není specifická pouze pro tento druh, nachází se rovněž u druhu B. holmesii a u některých kmenů B. bronchiseptica. Jako druhá nejvhodnější oblast je používána sekvence promotoru S1 podjednotky pertusového toxinu (PT promoter, PtxA-pr), která je však v porovnání s IS481 specifická pro druh B. pertussis, avšak vyskytuje se pouze v 1 kopii, proto je detekována s nižší senzitivitou než IS481. K detekci PtxA-pr přikročíme tedy teprve v případě negativity IS481. Stanovujeme jej vždy u pacientů v kojeneckém věku, u starších pacientů pak selektivně podle klinických a epidemiologických okolností (ZAVADILOVÁ, SZÚ). Lze použít i další specifické úseky jako např. gen pro pertaktin, porin či adenylát cyklázu (NEČAS, 2006). Pro diagnostiku B. parapertussis se využívá specifická inzerční sekvence IS1001 (ZAVADILOVÁ, SZÚ). Interpretace výsledků je založena na pozitivitě nebo negativitě výsledků IS481, PtxA-pr, případně IS1001. V případě, že je IS481 negativní, ve vyšetřovaném materiálu není průkaz DNA B. pertussis. K dalším testům přistupujeme jen v závažných případech (kojenci, nebo kontakt s neočkovanými dětmi). Až poté, pokud je negativní i PtxA-pr, lze průkazně prohlásit, že ve vyšetřovaném materiálu není prokázána DNA B. pertussis. Pokud by PtxA-pr vyšlo pozitivně, jednalo by se o dubiózní výsledek, při kterém je doporučeno zopakovat první test. V případě pozitivity IS481, případně i PtxA-pr, je ve vyšetřovaném vzorku prokázána DNA B. pertussis. V případě pozitivity IS1001 je infekce pravděpodobně způsobená B. parapertussis (ZAVADILOVÁ, SZÚ)

30 2.9 Sérologie nepřímá detekce patogenu Sérologických metod je využíváno k pozdní, retrospektivní diagnóze, používají se k průkazu specifických protilátek nebo antigenu. Pro sérologický průkaz infekční choroby není obvykle významná absolutní koncentrace specifických protilátek, ale především dynamika jejich změn. Vyšetřují se dva vzorky sér akutní a rekonvalescentní s odstupem 3-4 týdnů. Tento interval je nejvhodnější, ukáže až čtyřnásobný vzestup nebo pokles protilátek. U těchto metod nelze odlišit protilátky postinfekční od postvakcinačních, lze prokázat pouze signifikantní vzestup nebo pokles množství protilátek nebo sérokonverzi (zvýšení hladiny specifických protilátek) z negativity do pozitivity. Séra se stanovují vždy současně, stejnou metodou, v téže laboratoři, tzv. párová séra. Aby nedošlo k záměně vzorků, je nutné mít vždy označené dva vzorky séra s datem odběru, znát údaje o očkování pacienta a datum narození pacienta (ZAVADILOVÁ, SZÚ, 2011; KHS Karlovy Vary, 2013; MULLER, 1997). Základem všech sérologických metod je reakce protilátek s antigenem, u níž se využívá specifické vazby příslušných antigenních determinant antigenu k vazebnému místu odpovídající protilátky. Vlastní reakce není viditelná, probíhá na submikroskopické úrovni, kdy se pomocí nekovalentních sil krátkého dosahu váže antigen s protilátkou. Pro B. pertussis jsou specifické pouze protilátky proti pertusovému toxinu (HOŘEJŠÍ, BARTŮŇKOVÁ, 2008). Na doporučení EU Pertstrain group z roku 2010 se k sérologické diagnostice B. pertussis používají komerční ELISA soupravy ke stanovení IgG protilátek proti pertusovému toxinu, IgA protilátky se stanovují pouze při nejasném výsledku prvního testu nebo není-li možné odebrat druhý vzorek. Pro rutinní laboratorní diagnostiku naopak není doporučeno používat komerční ELISA soupravy se směsnými antigeny, které jsou nízce specifické a je u nich patrná zkřížená reaktivita s B. parapertussis, Haemophilus sp., Mycoplasma pneumoniae a Escherichia coli

31 2.9.1 Aglutinace Charakteristika Aglutinace patří mezi tradiční, osvědčené a levné vyšetření v diagnostice infekce B.pertussis. Výhodou této metody je možnost použití jak k průkazu akutního onemocnění, tak k průkazu přetrvávání protilátek po očkování celobuněčnou vakcínou proti pertusi. Nicméně Doporučení EU Pertstrain group z roku 2010 nedoporučuje aglutinační testy k diagnostice pertuse, označuje je za vhodné pouze pro sledování promořenosti populace antigeny B. pertussis (ŠTĚPÁNÍKOVÁ, 2012). Principem aglutinace je stanovení koncentrace aglutininu (protilátek) proti korpuskulárním antigenům (aglutinogenům), což vede ke vzniku viditelných shluků jemného vločkovitého aglutinátu aglutinaci. Na vzniku aglutinátu se mimo vzájemné navázání Fab fragmentů specifických protilátek a jednotlivých částic antigenu podílí i neutralizace povrchového náboje, který zajišťuje stálost roztoku v suspenzi. Testem je možné prokázat protilátky ze všech imunoglobulinových tříd. Rychlost reakce je různá a záleží především na teplotě. V aglutinaci jsou nejúčinnější protilátky izotopu IgM. K průběhu reakce je důležité použít vhodný poměr protilátek a antigenu, přebytek protilátek může způsobit útlum aglutinace, který se nazývá prozónou. Aglutinační reakce dělíme na přímé (rychlé a pomalé), nepřímé (Coombsův antiglobulinový test) a pasivní (hemaglutinace, latexová aglutinace). V případě přímé aglutinace se shlukuje antigen s protilátkou. Podle rychlosti mohou být rychlé, prováděné v laboratoři na sklíčku nebo pomalé, zkumavkové. Nepřímé metody slouží k průkazu inkompletních protilátek, tzn. protilátek, které nejsou schopné samy vyvolat aglutinaci. Prokazují se pomocí druhově specifického antiglobulinového séra, tj. sérum proti imunoglobulinům druhu, v jehož séru prokazujeme inkompletní protilátky. Pasivní, neboli latexová aglutinace, je reakce, při níž je nahrazována málo citlivá precipitace dobře pozorovatelnou aglutinací. Používá se solubilní antigen, který pokryje povrch opracovaných krvinek nebo latexových částic a následně reaguje se sérem proti tomuto antigenu (TOMAN, 2009; MULLER, 1997; NEČAS, 2006)

32 Obr. 10: Aglutinace na mikrotitrační destičce upraveno dle: Diagnostika B.pertussis metodou aglutinace V současné době jsou na trhu k dispozici aglutinogeny vyráběné pro B.pertussis i B. parapertussis firmou TestLine s.r.o.. K provedení testu potřebujeme aglutinogen Bordetella pertussis, což je koncentrovaný roztok inaktivovaných bakterií konzervovaný např. 0,01% methiolátem sodným. Další potřebné vybavení zahrnuje pozitivní kontrolu B.pertussis, fyziologický roztok, mikrotitrační destičky a termostat 37 C s vlhkou komůrkou na inkubaci destiček. K sérologickému vyšetření se odebírají párové vzorky séra akutní a rekonvalescentní. Průkazným výsledkem, který svědčí o akutní infekci organismu, je minimálně čtyřnásobný vzestup titru protilátek v párových vzorcích. Jestliže dojde k poklesu protilátek ve druhém vzorku, jedná se o rekonvalescenci po proběhlém onemocnění. Jestliže nedojde k vzestupu, jedná se o postvakcinační titr protilátek pacienta (ZAVADILOVÁ, 2011; TestLine, 2013)

33 2.9.2 ELISA Charakteristika ELISA test je zkratka pro anglický název enzyme linked imunosorbent assay (enzymová imunosorpční kvantitativní analýza). Řadí se mezi jednu z nejcitlivějších metod na bázi imunoenzymatické reakce, která je používána jak k detekci protilátek, tak pro zjištění přítomnosti antigenu. ELISA slouží ke stanovení IgA, IgM a IgG protilátek nejčastěji proti pertusovému toxinu, filamentóznímu hemaglutininu, pertaktinu, popř. směsi antigenů. Reakce je založena na specifické interakci protilátek s příslušným antigenem, přičemž na jednu z těchto složek je navázán vhodný enzym. Tento kovalentně vázaný enzym působí na v dalším kroku přidaný substrát a výsledkem je barevná reakce. ELISA test existuje v řadě modifikací, nejčastěji používaná sendvičková metoda k průkazu protilátek nebo antigenu a její modifikace, přímá a double sandwich metoda. Sendvičová metoda pro průkaz specifických protilátek začíná navázáním známého antigenu na plastovou mikrotitrační plotnu, v dalších krocích se postupně přidává testované sérum, protilátka proti druhově specifickým imunoglobulinům konjugovaná s enzymem a nakonec detekční systém, což je substrát reagující s enzymem, který pod vlivem enzymatické reakce buď změní barvu, nebo odštěpuje produkty, které s další přidanou látkou, chromogenem, vytváří barevnou reakci. Mezi jednotlivými kroky přidávání substancí je třeba plotny promýt, čímž se zbaví přebytečných reagujících látek. V pozitivním případě, tedy pokud jsou ve vyšetřovaném séru přítomny specifické protilátky, dojde k postupnému navázání všech složek a jamka se zbarví podle charakteru použitého substrátu. Vyhodnocení se provádí nejčastěji spektrofotometricky, přičemž se měří absorbance standardních a vyšetřovaných vzorků. K vyhodnocení je možné sestrojit kalibrační křivku nebo určit tzv. titr, což je poslední ředění vzorku, při němž jamka mikrotitrační destičky ještě vykazuje pozitivní reakci. Vizuální vyhodnocení poskytne pouze kvalitativní porovnání s výsledky negativních kontrol. Za pozitivní považujeme vzorky s tmavším zbarvením než negativní kontrola. Sendvičová metoda pro průkaz antigenu se liší pouze v pořadí navazovaných reagencií. Na mikrotitrační plotnu se nejprve naváže známá protilátka specifická pro daný hledaný antigen a pak se postupně přidává tekutina testovaná na přítomnost antigenu, detekční protilátka specifická pro daný antigen konjugovaná s enzymem a nakonec detekční systém obsahující substrát

34 U této metody je nutné, aby hledaný antigen měl dvě vazebná místa, pro navázání protilátky na mikroplotně a druhé, detekční protilátky (TOMAN, 2009; SCHNEIDERKA, 2004). Obr. 11: Sendvičová ELISA pro průkaz antigenu zdroj: [ Obr. 12: Sendvičová ELISA pro průkaz protilátky zdroj: [

35 U přímé metody se hledaný antigen navazuje na mikroplotnu a na něj se přímo působí protilátkou s již navázaným enzymem. K vizualizaci reakce se používá celá řada systémů enzym, substrát, chromogen. Jedním z nich je enzym křenová peroxidáza, která reaguje se substrátem peroxidem vodíku, který rozloží na kyslík a vodu. Kyslík dále reaguje s jedním z chromogenů např. tetramethylbenzidinem, diaminobenzidinem nebo 5aminosalycilovou kyselinou za vzniku barevné reakce. Jiný systém využívá enzym alkalickou fosfatázu a substrát paranitrofenylfosfát. Metoda stanovuje výsledky protilátek IgA, IgM nebo IgG proti pertusovému toxinu. Jako signifikantní se hodnotí vzestup koncentrace protilátek v séru o 100 % počáteční hodnoty naměřené v prvním vzorku párových sér nebo pokles koncentrace protilátek o 50 % počáteční hodnoty. Výsledná koncentrace protilátek je nejčastěji udávána v mezinárodních jednotkách IU/ml. Při vyhodnocování testu je nezbytně nutné znát dobu očkování a typ použité vakcíny. Pokud je použita celobuněčná vakcína, protilátky IgG proti pertusovému toxinu se nemusí vždy vytvořit, je tedy nutno stanovovat je metodou pomalé aglutinace. Naopak při použití acelulární vakcíny je nutný průkaz ELISA proti pertusovému toxinu. Nejdříve detekovatelné jsou protilátky IgM, 5 10 dní po vzniku infekce. Nicméně v organismu přetrvávají pouze 6 12 týdnů, významnější je tedy průkaz protilátek ze třídy IgA a IgG, které s velkou pravděpodobností svědčí o akutní infekci v období delším než 1 rok po očkování. IgA-PT je možné prokázat již 11 dní od nástupu infekce, u vakcinovaných dospělých se tvoří i u zdravých jedinců po přirozené reinfekci. Naopak u dětí ve věku 1 roku se IgA-PT netvoří. V čase klesající IgG-PT se tvoří později, nejdříve 2 3 týdny od počátku infekce a jsou hlavní složkou odpovědi proti infekci (KHS Karlovy Vary) Diagnostika B.pertussis metodou ELISA V současné době použití ELISA testů k detekci specifických protilátek je metodou první volby pro diagnostiku Bordetella pertussis. V současné době je na trhu řada komerčních souprav pro detekci protilátek proti pertusovému toxinu. Detekce protilátek IgG a IgM je možná brzy po vakcinaci, přičemž protilátky IgG přetrvávají zpravidla několik let. Na rozdíl od toho protilátky typu IgA jsou důležitým diagnostickým markerem v případě akutních

36 infekcí, jsou detekovatelné po vakcinaci, nicméně u kojenců mladších šesti měsíců na ně neexistuje žádná odezva (SERION ELISA, manuál) Imunoblot Imunoblot, někdy nazývaný Western blot, je široce rozšířená analytická metoda užívaná k detekci specifických proteinů v části tkáně nebo homogenního extraktu. V sérologii se využívá jako konfirmační metoda pro stanovení ELISA testem. Touto metodou je možné kvalitativně detekovat jednotlivé třídy imunoglobulinů IgG, IgA a IgM, avšak v diagnostice B. pertussis není v současné době doporučován. B. pertussis nelze touto metodou kvantifikovat a je možnost zkřížené reaktivity protilátek proti některým antigenům (ŠTĚPÁNÍKOVÁ, 2012)

37 3. CÍLE PRÁCE 1. Posouzení diagnostiky akutní infekce pertuse u dětí do půl roku věku metodou PCR. 2. Porovnání diagnostiky pertuse sérologickým průkazem a metodou real-time PCR. 3. Prohloubení všeobecné informovanosti o problematice černého kašle, hlavně v oblasti diagnostiky

38 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Materiál a metody Pracovní postupy vycházejí z příslušných Standardních operačních postupů Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno Pacienti a odběr vzorků V roce 2013 bylo v sérologické laboratoři Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno vyšetřeno 46 pacientů na přítomnost původce onemocnění pertuse metodou PCR, kteří byli vybraní podle celosvětově platných kritérií WHO, tzn. jedinci s kašlem perzistujícím déle než 14 dní. Do souboru byli zahrnuti zástupci všech věkových kategorií, tzn. děti od 1 měsíce věku po dospělé ve věku 78 let. Nejednalo se o zcela náhodnou skupinu celoplošného výběru, nýbrž o pacienty Fakultní nemocnice Brno, tedy pacienty z jihomoravského kraje. Studie byla zaměřena především na děti do půl roku věku. Přímý průkaz metodou real-time PCR byl vyšetřen z následujících materiálů: stěr, výtěr, brochoalveolární laváž nebo ze vzorků odsátého materiálu, slin a sputa. U nepřímého stanovení původce metodami přímé aglutinace nebo ELISA bylo použito sérum pacientů. (MAREŠOVÁ, 2008; KHS Karlovy Vary, 2013) Přístroje Rotor-Gene Q výrobce Quiagen (viz obr. 13) Smartcycler výrobce Cepheid (viz obr. 14)

39 Obr. 13: Rotor Gene Q zdroj: [ Obr. 14: Smartcycler zdroj: [

40 suchá lázeň laminární box centrifuga termostat třepačka fotometr Pomůcky automatické pipety (0, μl) sterilní špičky s filtrem pro mikropipety PCR zkumavky / destičky sterilní mikrozkumavky chladící bloček stojánek na nosič PCR zkumavek rukavice na jedno použití, bez pudru kontejner na biologický odpad sterilní fyziologický roztok sterilní odběrové tampony včetně transportního média mikrotitrační destičky běžné laboratorní sklo

41 4.1.4 Přímý průkaz Real-time PCR pomocí komerční soupravy Pneumoplex Dynex Real-time Multiplex assay od firmy Dynex (Česká republika) slouží nejen k detekci Bordetella pertussis, ale také dalších patogenních bakterií zahrnujících Legionella pneumophila, Legionella micdadei, Mycoplasma pneumoniae a Chlamydia pneumoniae. Ke stanovení jsou doporučené vzorky získané bronchoalveolární laváží nebo výtěrem z nosohltanu. Souprava je optimalizována jak pro přístroj RotorGene, tak pro Smart Cycler. Souprava obsahuje pozitivní kontrolu, Mastermix 1, ve které jsou obsaženy cílové sekvence všech detekovaných agens. Mastermix 2 zahrnuje interní kontrolu, jejíž signál je sledován v oddělené zkumavce, aby nedocházelo ke snížení citlivosti reakce. Reakce začíná napipetováním mastermixů do dvou sad SMART zkumavek, poté je pipetována negativní kontrola, pufr nebo destilovaná voda a izolované vzorky. Nakonec je dávkována pozitivní kontrola, plazmid, který obsahuje cílové sekvence DNA všech detekovaných bakterií. Vzorky se centrifugují ve Smart centrifuze a umístí se do cykleru k analýze. Pozitivní výsledek přítomnosti B. pertussis je sledován ve 4. optickém kanálu, Cy5. Výsledek považujeme za validní v případě, že k danému vzorku existuje pozitivní signál mastermixu interní kontroly a signál pozitivní kontroly je pozitivní ve všech detekčních kanálech Real-time PCR pomocí komerční soupravy B.pertussis/parapertussis Bio- Evolution Tato komerční souprava od firmy Bio-Evolution (Francie) slouží ke stanovení přítomnosti Bordetella pertussis, inzertní sekvence IS481 a Bordetella parapertussis, inzertní sekvence IS1001 v biologických vzorcích pomocí přístroje Rotor-Gene Q. Ke stanovení lze použít všechny druhy respiračních vzorků: sputum, bronchoalveolární tekutinu, nasofaryngeální výplach i výtěr. Výtěry je třeba nejprve vytřepat do fosfátového

42 pufru (dále PBS), zahájit centrifugaci a pokud nelze vzorek bezprostředně poté zpracovat, uchovávat při -20 C v temnu, chráněný před světlem. Souprava real-time PCR kitu B. pertussis/parapertussis obsahuje Bordetella mix, pozitivní kontrolu, tj. plazmidová DNA obou druhů Bordetel a PCR vodu. Všechny reagencie jsou označeny barevnými uzávěry pro lepší orientaci. Pro předejití opakovanému rozmrazování a zamrazování je doporučené po prvním otevření pozitivní kontroly rozdělit směs do jednotlivých alikvotů po 10 μl, které uchováváme při -20 C. Reakce začíná izolací DNA kitem QIAamp a následnou centrifugací. Následuje detekce DNA. Do dvou zkumavek se stejně jako v předchozí metodě napipetují 2 Mastermixy, pozitivní kontroly značené růžovým uzávěrem a nakonec negativní kontroly PCR voda. Vzorky musí být kompletně rozmraženy, promíchány a krátce stočeny. Po nadávkování do PCR zkumavek je promícháme a centrifugujeme. Detekce amplifikačního produktu B. pertussis je prováděna pomocí fluorimetru užívajícího FAM kanál, Green channel a detekce B. parapertussis na VIC kanálu, Yellow channel. Kit obsahu navíc vnitřní kontrolu, tzv. housekeeping gen vypovídající o úspěšné izolaci lidské buněčné nukleové kyseliny, detekovatelnou v kanále Cy5, Red channel. Tato vnitřní kontrola slouží jako pozitivní kontrola správného průběhu reakce. Pro pozitivní vyhodnocení B. pertussis musí být signál detekovaný v kanále Green v rozmezí nižším než 38. Pozitivní výsledek přítomnosti Bordetella parapertussis detekujeme v kanále Yellow se stejným Ct. Vzorek nelze jednoznačně hodnotit, pokud je v kanále Green nebo Yellow detekován signál v rozmezí Ct 38 až 40. Při detekci jediného signálu v kanále Red, jehož Ct je nižší než 32, vzorek hodnotíme jako negativní. Pokud není signál zjištěn v žádném z kanálů, vzorek je inhibován (TOMAN, 2009)

43 4.1.5 Nepřímý průkaz ELISA Detekce specifických protilátek pomocí komerční soupravy SERION ELISA classic Testy SERION ELISA (Německo) classic Bordetella pertussis Toxin IgG a IgA jsou kvalitativní a kvantitativní imunoanalýzy k detekci humánních protilátek proti toxinu Bordetella pertussis v séru nebo plazmě. Pomocí této soupravy se tedy detekují protilátky proti pertusovému toxinu ve třídě IgG nebo IgA. Eseje je možné použít v kombinaci s testy SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgA, IgG a IgM pro diferenciální diagnostiku pneumonie. Reakce k průkazu protilátek je založena na specifické interakci protilátek s příslušným antigenem. Test SERION ELISA je založený na sendvičové metodě průkazu specifických protilátek. Jako detekční systém se používá enzym alkalická fosfatáza, bezbarvý substrát p- nitrofenylfosfát, který je přeměněn na barevný produkt p-nitrofenol. Mezi komponenty k vyšetření dodávané firmou patří oddělené proužky mikrotitračního testu, standardní lidské sérum ve fosfátovém pufru s proteinem, negativní kontrolní sérum, protilátkový konjugát proti humánním IgA, IgG nebo IgM, koncentrát promývacího roztoku (roztok chloridu sodného), ředící fosfátový pufr, zastavovací roztok hydroxid sodný (slouží k zastavení výsledné barevné reakce), substrát para-nitrofenylfosfát a osvědčení o kontrole kvality se standardní křivkou a vyhodnocovací tabulkou (SERION ELISA manuál). Výsledky průkazu pertusového toxinu ve třídě IgG metodou ELISA jsou uváděny v IU/ml, z anglického International Unit, což je mezinárodní měrná jednotka pro množství účinné látky založená na naměřeném biologickém účinku (ONDREJKOVÁ a spol., 2013). Protilátky IgG proti toxinu Bordetella pertussis jsou hodnoceny jako pozitivní při hodnotě vyšší než 100 IU/ml, hodnota IU/ml je považována za hraniční a výsledek nižší než 40 IU/ml je negativní

44 Aglutinace Principem aglutinační reakce je reakce aglutinogenů (antigenů) a aglutininů (protilátek), která vede ke vzniku obvykle pouhým okem detekovatelných shluků aglutinaci. Testem jsou prokazovány protilátky všech imunoglobulinových tříd (nelze samostatně prokázat jeden typ imunoglobulinů, např. IgG). K průkazu infekce se používá vyšetření párových vzorků. Test od firmy TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. (Česká republika) obsahuje koncentrované roztoky inaktivovaných bakterií dávivého kašle, určené k diagnostickým účelům in vitro. Tyto aglutinogeny, Bordetella pertussis AR Ag a Bordetella parapertussis AR Ag, slouží k průkazu specifických protilátek Bordetella pertussis a Bordetella parapertussis v lidském séru. Jsou to 10x koncentrované roztoky konzervované 0,01% merthiolátem sodným. Mezi další komponenty dodávané firmou patří pozitivní kontroly B. pertussis i B. parapertussis a fyziologický roztok (0,9 % roztok NaCl). Vlastní průběh reakce začíná přípravou pracovních roztoků, kdy jsou aglutinogeny Bordetella pertussis AR Ag nebo Bordetella parapertussis AR Ag ředěny fyziologickým roztokem v poměru 1:10 (1 díl aglutinogenu + 9 dílů fyziologického roztoku). Pracovní roztok je třeba používat vždy čerstvě naředěný. Dále se rozmístí kontroly aglutinogenů a vzorků dle pracovního schématu (viz obr. 15). Do všech jamek mikrotitrační destičky je třeba pipetovat 50 µl fyziologického roztoku, dále do prvního sloupce, řada A, pipetovat 50 µl pozitivní kontroly a v do dalších řad, B G, pipetovat 50 µl vyšetřovaných sér, čímž získáme ředění 1:2. V řadě H se provádí kontrola aglutinogenu. V dalším kroku se 8 kanálovou pipetou přenáší 50 µl takto naředěných sér ze sloupce 1 do sloupce 2, čímž je získáno ředění 1:4. V tomto postupu se analogicky pokračuje až do ředění 1:4096 ve sloupci 12. Z jamek v posledním sloupci je odebráno 50 µl roztoku. Posléze se do všech jamek destičky pipetuje 50 µl Bordetella pertussis AR Ag nebo Bordetella parapertussis AR Ag v pracovním ředění a destička je protřepána v třepačce po dobu 15 vteřin. Vzorky se dále inkubují po dobu 2,5 hodiny v termostatu ve vlhké komůrce při teplotě 37 C a potom při laboratorní teplotě po dobu hodin (TestLine, 2013)

45 Obr. 15: Pracovní schéma aglutinační reakce Po ukončení inkubace je hodnocen vznik aglutinátu v jamkách. V případě pozitivní reakce je přítomen zřetelný aglutinát ve vyčeřené tekutině až do dvoukřížkové reakce (tj. cca 50%). Negativní reakce se vyznačuje přítomností terčíku na dně jamky (TestLine, 2013). Výsledky aglutinační reakce jsou uváděny v titru (1:8, 1:16, 1:32, ). Titr je převrácená hodnota nejvyššího ředění, které dává ještě pozitivní reakci (TOMAN, 2009), v sérologii bývá užívaný k vyjádření stupně zředění vyšetřovaného krevního séra, v němž přítomné sérové protilátky jsou schopné viditelně reagovat s příslušným antigenem za vzniku aglutinátu. Např. titr 32 znamená, že ředění séra 1:32 bylo poslední, které dávalo ještě pozitivní reakci v testu. Čím vyšší je titr, tím více je třeba zředit sérum a docílit příslušné reakce. Z toho vyplývá, že čím je titr vyšší, tím větší množství protilátek je obsaženo v séru. Průkazným výsledkem, který svědčí o akutní infekci, je minimálně čtyřnásobný vzestup titru protilátek v párových vzorcích

46 4.2 Výsledky Rozdělení souboru Do souboru bylo zahrnuto 46 pacientů Fakultní nemocnice Brno (22 mužů a 24 žen) viz graf 1. Vyšetření byla provedená v období od Graf 1: Rozdělení pacientů dle pohlaví Pozitivní průkaz původce onemocnění metodou PCR byl detekován u 10 pacientů, z toho 4 muži a 6 žen (viz graf 2). U 36 pacientů byl výsledek vyšetření metodou PCR negativní. Pacienti s pozitivitou průkazu PCR byli rozděleni do skupiny A, u které byl požadován sérologický průkaz protilátek a skupiny B, která nebyla dále sérologicky diagnostikována

47 Graf 2: Rozdělení pozitivních pacientů dle pohlaví Porovnání vyšetřeného materiálu Z celkového počtu 46 vyšetřených pacientů byla u 18 osob provedena diagnostika metodou PCR Dynex a u 28 jedinců průkaz metodou PCR Bio Evolution (viz graf 3). Graf 3: Počty vyšetření jednotlivými komerčními soupravami