Obecný metabolismus. Biosyntéza aminokyselin (11).

Transkript

1 mezioborová integrace výuky zaměřená na rostlinnou biochemii a fytopatologii CZ.1.07/2.2.00/ becný metabolismus. Biosyntéza aminokyselin (11). Prof. RDr. Pavel Peč, CSc. Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta UP, lomouc

2 Základní schéma vstupu dusíku do metabolismu. C - 2 C C 2 3 C Glutamát

3 Fixace dusíku. Dusík aminokyselin, purinů, pyrimidinů a všech dalších biomolekul má původ ve vzdušném dusíku. Fixace dusíku spočívá v redukci 2 na 3 fixace dusíku. Vazba mezi atomy dusíku je extrémně silná, vazebná energie je 940 kj/mol. Vyšší organismy nejsou schopné fixovat dusík. Schopnost fixace mají některé bakterie a archaea. Symbiotická Rhizobia na kořenech bobovitých rostlin fixují dusík a zásobují 3 bakterie i rostliny. Podstatné pro všechny vyšší eukaryotní organismy jsou diazotrofní (dusík vážící) mikroorganismy, které ročně váží kg, což je 60% nově fixovaného dusíku na Zemi. Blesky a UV světlo poskytují dalších 15% a zbylých 25% je průmyslová výroba (aberova metoda, směs 2 a 2 za katalýzy Fe, při teplotě 500 o C a tlaku 300 atm). ).

4 Fixace dusíku. Tvorba 3 z 2 u mikroorganismů probíhá na nitrogenasovém komplexu. itrogenasový komplex je složen ze dvou částí. Reduktasa zdroj elektronů s vysokým redukčním potenciálem. itrogenasa využívá tyto elektrony k redukci 2 na 3. itrogenasový komplex musí být chráněn před 2. Bobovité rostliny mají velmi nízkou koncentraci kyslíku v nodulech, protože kyslík váží na leghemoglobin, analog hemoglobinu. Redukce 2 na 3 je šestielektronový proces. Biologická redukce produkuje 1 mol 2 vedle dvou molů 3 z jednoho molu 2 a proto spotřebuje 8 elektronů: 2 8 e sm potřebných elektronů má původ z redukovaného ferredoxinu (fotosyntéza) nebo z oxidativní fosforylace.

5 Fixace dusíku. Pro přenos každého elektronu jsou nutné 2 molekuly ATP: 2 8 e ATP ADP 16 P i ydrolýza ATP je využita k překonání aktivačních bariér (kinetická průchodnost) spíše než k termodynamické schůdnosti reakce. bě komponenty - reduktasa i nitrogenasa jsou proteiny železo-síra (klastry transfer elektronů). Reduktasa je homo dimer dvou identických jednotek (30 kd) vázaných 4Fe 4S klastrem. itrogenasa je a 2 b 2 tetramer (240 kd), obsahuje Mo a proto MoFe protein 3Fe 3S klastr.

6 Fixace dusíku. Elektrony redukov aný ferredoxin ATP ADP Pi 2 Reduktasa (Fe protein) itrogenasa (MoFe protein) 3

7 Asimilace amoniaku do aminokyselin. Aminokyseliny glutamát a glutamin hrají hlavní roli v přenosu dusíku na další aminokyseliny. Biosyntéza glutamátu - katalýza glutamátdehydrogenasa: 4 a-oxoglutarát ADP glutamát ADP 2 Reakce probíhá ve dvou stupních. ejdříve se vytváří Schiffova báze mezi aminem a karbonylem, která je posléze redukována hydridovým iontem z ADP: C - C C - C - AD(P) AD(P) 3 C - C - a - xoglutarát Glutamát

8 Asimilace amoniaku do aminokyselin. Redukce Schiffovy báze ADP vede k stereochemické konfiguraci na a uhlíku S (absolutní konfigurace) a L isomer!! Glutamát může přijímat další amoniak za katalýzy glutaminsynthetasou a tvorby glutaminu. 3 C - C - Glutamát ATP ADP 3 C - P - acylfosfátový meziprodukt - 3 Pi 3 C - glutamin 2 Glutamátdehydrogenasa a glutaminsynthtasa jsou enzymy přítomné ve všech organismech.

9 Asimilace amoniaku do aminokyselin. Většina prokaryot má enzym glutamátsynthasu, který katalyzuje redukční aminaci oxoglutarátu na glutamát: a xoglutarát glutamin ADP 2 glutamát ADP Za nedostatku 4 je většina glutamátu syntetizována za katalýzy glutaminsynthtasy a glutamátsynthasy: 4 a-oxoglutarát ADP ATP glutamát ADP ADP P i Tato cesta je náročnější na energii, ale prokaryota ji využívají, protože K m glutamátdehydrogenasy pro 4 je vysoké ( 1 mm) a enzym není při nízkých hladinách 4 saturován. Glutaminsynthasa má naopak vysokou afinitu k 4. Potřebná je však hydrolýza ATP.

10 Uhlíkatý skelet aminokyselin. Biosyntéza uhlíkaté kostry aminokyselin má šest společných metabolických drah: Uhlíkatý skelet má původ v meziproduktech glykolýzy, pentosafosfátové dráhy nebo citrátového cyklu. xaloacetát Pyruv át Aspartát Alanin Valin Leucin Asparagin Methionin Threonin Lysin Ribosa fosfát istidin Isoleucin

11 Uhlíkatý skelet aminokyselin. Fosfoenolpyruv át Erythrosa fosfát 3 - Fosfoglycerát Serin Fenylalanin Tyrosin Tyrosin Tryptofan a - xoglutarát Glycin Cystein Glutamát Glutamin Prolin Leucin

12 Esenciální a neesenciální aminokyseliny. Většina mikroorganismů syntetizuje všech 20 proteinogeních aminokyselin. Člověk jen 9. Aminokyseliny, které musí být přijímány v potravě se nazývají esenciální. statní neesenciální. Arginin syntetizovaný v močovinovém cyklu je dostatečný pro dospělého člověka, ale ne pro dítě. Deficit, dokonce jen jedné aminokyseliny, má za výsledek negativní dusíkovou bilanci. Syntéza neesenciálních aminokyselin je jednoduchá, kdežto biosyntéza esenciálních je složitá. V průměru je třeba deseti stupňů.

13 Aminokyseliny esenciální a neesenciální. eesenciální AMIKYSELIY Esenciální Alanin Arginin Asparagin Aspartát Cystein Glutamát Glutamin Glycin Prolin Serin Tyrosin istidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Fenylalanin Threonin Tryptofan Valin

14 Biosyntéza aminokyselin transaminací. Tři oxokyseliny - a-oxoglutarát (glutamát), oxaloacetát (aspartát) a pyruvát (alanin) lze převést na aminokyseliny transaminací. Donorem aminoskupiny je glutamát. Prosthetickou skupinou aminotransferas je pyridoxalfosfát (PLP). Asparagin: Aspartát 4 ATP asparagin AMP PP i U savců je donorem aminoskupiny asparaginu spíše glutamin než 4, což je typické pro bakterie. Motiv hydrolýzy glutaminu má obecnější platnost při biosyntézách. Glutamát je prekurzorem glutaminu, prolinu a argininu.

15 Mechanismus transaminace při biosyntéze. enzym R C - R C - P Glu 2 - oxoglutarát P P C 3 Interní aldimin C 3 Pyridoxaminfosfát (PMP) C 3 Ketimin R C - 3 L - Aminokyselina R C - R C - P P C 3 Externíaldimin C 3 Chinoidní meziprodukt

16 Chiralita všech aminokyselin. ejdůležitějším krokem při transaminaci je protonizace chinoidního meziproduktu za vzniku externího aldiminu. U všech aminotransferas jsou zakonzervována dvě rezidua. Lys tvořící Schiffovu bázi s PLP a arginin, který vstupuje do interakce s a-karboxylátovou skupinou ketokyseliny. Chiralita tvořených aminokyselin je dána směrem odkud je tento proton přidán na chinoidní formu. Interakce mezi stabilním (konzervovaným) Arg a a- karboxylátovou skupinou napomáhá orientaci substrátu tak, že proton z lysinového zbytku vstupuje na chinoidní meziprodukt ze spodní strany za tvorby aldiminu s L-konfigurací na C a místě.

17 Glutamát prekurzor prolinu a argininu. g-karboxyl Glu reaguje s ATP za tvorby acylfosfátu (směsný anhydrid), který je redukován ADP na semialdehyd. Semialdehyd se cyklizuje (ztráta 2 ) na D 1 -pyrrolin-5- karboxylát, který poskytne po redukci prolin. Semialdehyd může být podroben transaminaci za tvorby ornithinu a ten v několika stupních převeden na arginin. - P - C - ATP ADP Pi Pi ADP ADP 3 C - 3 C - 3 C - Glutamát Acylfosfát (meziprodukt) Glutamát - g - semialdehyd

18 3-Fosfoglycerát prekurzor serinu, cysteinu a glycinu. 3- Fosfoglycerát, meziprodukt glykolýzy, je prekurzorem serinu, cysteinu a glycinu. Serin je prekurzorem cysteinu a glycinu. Konverze serinu na cystein vyžaduje substituci atomu kyslíku za atom síry. Donorem je methionin. Při tvorbě glycinu je methylenová skupina serinu přenesena na tetrahydrofolát. Serin tetrahydrofolát glycin 5, 10 -methylentetrahydrofolát 2 P - - AD AD P - - Glu 2 - oxoglutarát P Pi 3 3 C - C - C - C Fosfoglycerát 3 - Fosfoserin Serin

19 Tetrahydrofolát (TF). 2 Pteridin 5 10 p - Aminobenzoan C - C - n n = 0-4 Glutamát C -

20 Jednouhlíkaté skupiny. Tetrahydrofolát (TF), také tetrahydropteroylglutamát, je nositelem aktivovaných jednouhlíkatých skupin. Savci syntetizují pteridinový kruh, ale nespojí ho s ostatními dvěma v TF. Získávání TF z potravy nebo ho produkují střevní mikroorganismy. Jednouhlíkatá jednotka je vázána v poloze -5 nebo -10 (označeno 5 a 10 ) nebo na obě. ejvíce redukovanou jednouhlíkatou skupinou je methyl. Vyšší oxidační stav mají formyl, formimino nebo methenyl. Plně oxidovaná jednouhlíkatá skupina je karboxyl, který je přenášen biotinem. Jednouhlíkaté skupiny přenášené TF jsou mezi sebou vzájemně převoditelné.

21 Přeměny jednouhlíkaté skupiny navázané na tetrahydrofolát (TF). Pyr Pyr TF 5 Ser Gly C 2 10 R Mrav enčan ATP Pyr Pyr 2 C ADP ADP Pyr C 2 C 2 Pyr C R 3 ADP R ADP Pi ADP Pyr Pyr C 2 R 2 Pyr Pyr C C 2 R 3 Pyr Pyr C C 2 R ADP Pi Pyr C 2 ATP Pyr C R

22 Jednouhlíkaté skupiny. Alternativní syntéza glycinu z C 2 a 4 za katalýzy glycinsynthasy (v opačném směru glycin štěpící enzym): C 2 4 5, 10 -TF AD glycin TF AD lavním zdrojem jednouhlíkatých jednotek je přeměna serinu na glycin. Produktem je 5, 10 -methylentf. Prekurzorem serinu je 3-fosfoglycerát (meziprodukt glykolýzy). Jednouhlíkaté skupiny jsou tak produkty sacharidů.

23 S-Adenosylmethionin (SAM). TF má methylskupinu navázanou v poloze -5 její potenciál přenosu není dosti vysoký pro většinu biosyntéz. Funkci aktivovaného methylu plní S-adenosylmethionin (SAM). 3 C - ATP 3 C - 2 Pi PPi S C 3 3 C S Methionin S - Adenosylmethionin (SAM)

24 S-Adenosylmethionin (SAM). Po transferu methylu na substrát přejde SAM na S-adenosylhomocystein, který je hydrolyzován na homocystein a adenosin. Regenerace methioninu je realizována transferem methylu z 5 methyltf na homocystein. Enzym homocysteinmethyltransferasa má jako koenzym methylkobalamin (derivát vitaminu B 12 ). S C - 3 Pyr Pyr C 3 R C - S C 3 3 omocystein 5 - methyltf Methionin TF Pyr Pyr R

25 Cyklus aktivovaného methylu. S - Adenosylmethionin ATP Methionin S - Adenosylhomocystein Aktiv ní - C C 3 omocystein

26 Biosyntéza ethylenu. 3 C 3 S C - 2 ACCsynthasa 2C C2 3 C - ACCoxidasa 2 C C 2 SAM 1 - Aminocyklopropan karboxylv á kyselina (ACC) Ethylen SAM je prekurzorem ethylenu, který má funkci plynného rostlinného hormonu. Ethylen indukuje zrání.

27 Biosyntéza cysteinu. Cystein je syntetizován ze serinu a homocysteinu. Serin se kondenzuje s homocysteinem za tvorby cystathioninu. Enzym cystathionin-b-synthasa. Cystathionin je deaminován a štěpen na cystein a 2-oxobutyrát. Enzym cystathionin-g-lyasa. ba enzymy mají prosthetickou skupinu PLP. 3 S C S C C C S omocystein Serin Cystathionin 2 - xobutyrát Cystein

28 omocystein a srdeční onemocnění. Lidé se zvýšenou hladinou homocysteinu nebo jeho disulfidového dimeru homocystinu mají vysoké riziko arteriosklerosy a srdečních onemocnění. Důvod je v mutovaném genu pro cystathionin-b-synthasu. U některých pacientů se daří onemocnění zmírnit podáváním vitaminů. Podáváním vitaminů se sleduje rychlejší degradace homocysteinu. Vitamin B 6 a jeho deriváty (PLP) zvyšuje aktivitu cystathionin-bsynthasy (přeměna homocysteinu na cystathionin) a vitamin B 12, který podporuje methylaci homocysteinu na methionin.

29 Biosyntéza aromatických aminokyselin. Fenylalanin, tyrosin a tryptofan jsou esenciální aminokyseliny syntetizované společnou drahou u E. coli. Člověk získává většinu esenciálních aminokyselin z rostlinné potravy. Biosyntéza esenciálních aminokyselin je složitější a komplexnější než biosyntéza neesenciálních. Prekurzory jsou fosfoenolpyruvát (meziprodukt glykolýzy) a erythrosa-4-fosfát (meziprodukt pentosafosfátové dráhy). Chorismátje klíčovým produktem na kterém se další dráhy dělí na prefenátovou (produkty fenylalanin a tyrosin) a anthranilátovou (tryptofan).

30 Chorismátová biosyntetická dráha. P 3 2- Erythrosa 4 - fosfát P P 3 C C 2 Fosfoenolpyruv át C - 2 C C - P i 2 P i C 2 AD AD C - P i P 3 2- C - C 2 P 3 2- P 3 2- C - C - C - 2 ADP ADP C - ADP ATP Šikimát P i C - C - 2 C Chorismát

31 erbicid glyfosát inhibice biosyntézy aromatických aminokyselin. Biosyntéza aromatických aminokyselin je inhibována širokospetrálním herbicidem glyfosátem (Roundup). Pro zvířata a hmyz netoxický. Glyfosát je akompetitivním inhibitorem enzym, který katalyzuje tvorbu 5-enoylpyruvylšikimát-3-fosfátu. Prefenátová dráha: Mutasa převádí chorismát na prefenát, prekurzor aromatického kruhu fenylalaninu a tyrosinu. Reakce analogická v organické chemii známé Diels-Alderově kondenzaci. - C 2 P - - Glyfosát (Roundup)

32 Prefenátová dráha biosyntézy Phe a Tyr. C - C - C - C - 2 C C C C2 C 2 Glu 2 - xoglutarát 3 Chorismát Prefenát AD Fenylpyruv át C - Glu AD C xoglutarát Fenylalanin C - 3 p - ydroxyfenyl pyruv át Tyrosin

33 Biosyntéza tryptofanu chorismátovou drahou přes anthranilát. C - C - 2 C Chorismát Gln 2 Glutamát Pyruv át PRPP = 5 - Fosforibosyl pyrofosfát C - Anthranilát PRPP PP i 2-3 P C - - C Indol Glyceraldehyd fosfát Serin P Indol glycerol fosfát C P C - 3 Tryptofan

34 Biosyntéza tryptofanu. Tryptofansynthasa v E. coli je a 2 b 2 heterotetramer. Podjednotka a katalyzuje tvorbu indol-3-glycerolfosfátu. Každá b podjednotka má PLP v aktivním místě. Katalyzuje kondenzaci idolu se serinem za vzniku tryptofanu. Indol difunduje od jednoho aktivního místa ke druhému. Prochází specifickým kanálkem a nemůže difundovat mimo dráhu kondenzace se serinem. bě reakce jsou koordinovány. Indol čeká na serin. Serin vytváří s PLP Schiffovu bázi, která je dehydratována za tvorby Schiffovy báze aminoakrylátu což je reaktivní intermediát reagující s indolem. Enzym je odlišný od známých aminotransferas.

35 Schiffova báze aminoakrylátu ze serinu. ukleofilní reakce s aminoakrylátem. 2 C C P - C 3

36 Regulace biosyntézy aminokyselin. Rychlost biosyntézy aminokyselin závisí první řadě na množství a aktivitě biosyntetických enzymů. Regulace aktivity enzymů. V biosyntetické dráze se vyskytuje tak zvaný klíčový krok, prakticky ireverzibiloní reakce. Takový krok obvykle inhibuje výsledný produkt dráhy inhibice konečným produktem. Zůstávají zachovány všechny meziprodukty. Tak např. serin (produkt dráhy) při jehož biosyntéza je klíčovým krokem oxidace 3-fosfoglycerátu katalyzovaná 3-fosfoglycerátdehydrogenasou. Enzym je homotetramer, kde každá podjednotka má aktivní a regulační místo. Vazba serinu vede k jeho inaktivaci.

37 Regulace biosyntézy aminokyselin. Při regulaci biosyntézy větvených aminokyselin hraje významnou roli společný meziprodukt hydroxyethylthiaminpyrofosfát (hydroxyethyl TPP). Při syntéze isoleucinu reaguje s a-oxobutyrátem, při syntéze valinu a leucinu reaguje s pyruvátem. Koncentrace a-oxobutyrátu a pyruvátu určují množství isoleucinu na jedné straně a leucinu a valinu na straně druhé. Threonindeaminasa (PLP) katalyzující tvorbu a-oxobutyrátu je allostericky inhibována valinem! Valin je produkt kompetující dráhy. Regulace vede k vyrovnanému množství větvených aminokyselin. Mnohočetnost enzymů. Klíčová reakce dráhy může být katalyzována více enzymy. Enzymy reagují různou aktivitou na substráty a produkty.

38 Regulace biosyntézy aminokyselin. Kumulativní zpětnovazebná inhibice. Společný stupeň dráhy je inhibován každým finálním produktem nezávisle. Bakteriální glutaminsynthetasa katalyzuje syntézu Gln z Glu, 4 a ATP. Amidoskupina Gln je zdrojem dusíku pro mnoho sloučenin jako např. karbamoylfosfát, Trp, CT, AMP atd. Glutaminsynthetasa je kumulativně inhibována všemi těmito konečnými produkty. Enzym je úplně inhibován, když se na něj naváží všechny konečné produkty. Glutaminsynthetasa je také regulována reversibilní kovalentní modifikací. AMP se váže na specifický Tyr každé podjednotky (fosfodiesterová vazba). Adenylovaný enzym je méně aktivní a více citlivý na inhibitory. Kovalentně navázaný AMP se odštěpuje fosfátolytickou reakcí.

39 ěkteré biomolekuly odvozené od aminokyselin. 2 2 Adenin Cytosin istamin 2 Adrenalin I C C - Serotonin R ikotinamid I I 3 I Thyroxin (tetraiodthyronin)

40 - C 3 S C - g Glutamát Cystein Glutathion (GS) Glycin Glutathion je tripeptid obsahující sulfhydrylovou skupinu (g-glutamylcysteinylglycin). Redukovaná forma se označuje GS, oxidovaní GSSG. Glutathion o buněčné koncentraci v živočišných buňkách, asi 5 mm, chrání erythrocyty před oxidativní destrukcí a chová se tak jako sulfhydrylový pufr. 2 GS R GSSG 2 R GSSG je redukován na GS glutathionreduktasou (flavoprotein s koenzymem ADP). Poměr GS / GSSG je ve většině buněk 500. Glutathion hraje významnou roli při detoxifikaci reakcí s 2 2 nebo organickými peroxidy. Glutathionperoxidasa katalyzující tuto reakci obsahuje v aktivním místě aminokyselinu se selenem (selenový analog Cys).

41 Katalytický cyklus glutathionperoxidasy. GSSG GS E - Se - Selenát R R E - Se - S - G Selenosulfid E - Se - Selenatá kyselina 2 GS

42 Tvorba oxidací argininu. synthasa, ADP a 2. se váže na guanylátcyklasu (analog adenylátcyklasy) aktivace přenosu signálu ADP 2 0 ADP C 2 2 ADP 2 0 ADP 2 C Arginin - - ydroxyarginin Citrullin

43 Porfyriny. Porfyrinový skelet je základem hemů a chlorofylů. Prvním krokem biosyntézy porfyrinů u savců je kondenzace glycinu se sukcinyl CoA za vzniku d-aminolevulinátu katalyzovaná d-aminolevulinátsynthasou. Základem tvorby porfyrinů je aminokyselina glycin a meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA (kataplerotická reakce). - C CoA C 2 - C S - C 3 CoA 3 Sukcinyl CoA Glycin d - Aminolev ulinát

44 Biosyntéza porfyrinů. Tvorba porfobilinogenu (2 molekuly d-aminolevulinátu kondenzují na porfobilinogen). Čtyři molekuly porfobilinogenu kondenzují na lineární tetrapyrrol (katalyzuje porfobilinogendeaminasa) - C 8 x 3 d - Aminolev ulinát Acetát (A) C - Propionát (P) C - (A) (P) (A) (P) (A) (P) (A) (P) 4 x 3 Porfobilinogen Enzym Lineární tetrapyrrol

45 Uroporfobilinogen III je klíčovým meziproduktem při syntéze vitaminu B 12 v bakteriích a chlorofyllu, tak v bakteriích a rostlinách (porfyrinový skelet). (A) (P) (A) (P) (A) (P) (A) (P) (A) (P) (A) (A) Enzym C 3 (P) (P) (P) (A) Uroporfobilinogen III

46 Další reakce modifikují vedlejší řetězce a stupeň saturace porfyrinového kruhu. Koproporfyrinogen III (KoIII) je tvořen dekarboxylcí acetátů uroporfirinogenu III. Protoporfyrin IX je tvořen desaturací a převoden dvou propionátů KoIII na vinyly. (V) = Vinyl M = Methyl (M) (V) (M) (P) (M) (M) (M) (M) (P) (V) (P) (P) (P) (M) (P) (M) Protoporfyrin IX Koproporfyrinogen III

47 Degradace hemu. Vstupem Fe 2 (chelatací, enzym ferrochelatasa) se vytvoří hem, což je prosthetická skupina proteinů jako jsou myoglobin, hemoglobin, katalasa, peroxidasa a cytochrom c. Železo je transportováno plasmou navázáno na transferrin, který váže 2 Fe 3 a je skladováno v tkáních ve ferritinu. Degradace hemu. ormální lidský erythrocyt má životnost asi 120 dnů. Prvním krokem degradace hemu je štěpení a-methinového můstku za tvorby zeleného lineárního tetrapyrrolu biliverdinu. Prostřední methinový můstek biliverdinu je poté redukován biliverdinreduktasou za tvorby červeného pigmentu bilirubinu

48 Degradace hemu. EM 2 2 ADP 2 C Fe ADP (M) (V) (M) (P) C (P) (M) Biliv erdin (M) (V) ADP ADP (M) (V) (M) (P) C (P) (M) Bilirubin (M) (V)

49