Enzymy biologické katalyzátory. regulovatelnost účinnosti (aktivity) Platí o nich totéž co o chemických katalyzátorech, ale mají něco navíc:

Transkript

1 Enzymy biologické katalyzátory Platí o nich totéž co o chemických katalyzátorech, ale mají něco navíc: účinné snížení aktivační energie specifita regulovatelnost účinnosti (aktivity)

2 Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: multifunkční enzym multienzymový komplex membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)

3 Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)

4 2. Odštěpení částí řetězců - příklad

5 Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad trypsin, chymotrypsin) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)

6 Vratná kovalentní modifikace - fosforylace

7 Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory) Kinetika enzymových reakcí

8 Kinetika enzymové katalysy invertasa sacharosa + H 2 O glukosa + fruktosa hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát [S] a [P] [mol/ 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1[P] 2[P] 2[S] 1[S] t [s] Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S P. k 1 = 0,01 s -1, k -1 = 0 s -1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k 1 = 0,006 s -1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce) v = d[ P] dt = - d[ S] dt k = rychlostní konstanta je konstatntou úměrnosti mezi rychlostí reakce a koncentrací reaktantu Reakce 0.řádu Reakce 1.řádu v = k v = k [S]

9 Základní model - Michaelis & Mentenová k +1 k +2 E + S ES E + P k -1 (k -2 ) Vazba substrátu Rychlá, vratná reakce Katalytická reakce Pomalá, nevratná reakce Předpoklady: Koncentrace [ES] je v ustáleném stavu Koncentrace [S] je mnohem vyšší než [E] Tvorba produktu P určuje rychlost celého děje Tvorba produktu P je přímo úměrná koncentraci [ES], tudíž v 0 = k 2 [ES] Zpětnou reakci tvorby ES z P lze zanedbat? počáteční koncentrace [P] =0 - platí jen pro pokusy in vitro Odvozujeme za podmínky, že reakce běží počáteční reakční rychlostí v 0

10 Rovnice Michaelise a Mentenové v o = k 2. [ Eo]. [ S] k k 2 [ S] k1 v o = V lim [S] K m + [S] [S] >> K m : v o = k 2. [E o ] = V lim (=V max ) reakce 0. řádu [S] << K m : reakce 1. řádu v o V lim =. [ S] = k. [ S] KM [S] = K m : v 0 = V lim /2

11 K m??? Je rovna koncentraci substrátu při níž reakce probíhá rychlostí odpovídající ½ V lim K m má rozměr koncentrace ( M) Charakterizuje určitý enzym a substrát ale pouze za definovaných podmínek Není to rovnovážná konstanta - zahrnuje více rychlostních konstant, pro různé reakční mechanismy různé rychl.konst. Vliv koncentrace enzymu na reakční rychlost!! Pomocí hodnot K m lze porovnat afinitu enzymu k různým substrátům a odhadnout fyziologické koncentrace substrátů

12 Jak určit hodnoty K m a V lim? metoda počátečních reakčních rychlostí: změřit závislost v o na [S] - metoda nelineární regrese: Např. program EnzFitter vo [mmol/l/min] 2 1,6 1,2 0,8 0, [S] [mmol/l] - metoda linearisovaných výnosů: dvojnásobný reciproký výnos podle Lineweavera a Burka (1934)

13 Příklad ze nedávné minulosti: Methanol je vysoce toxický, protože je oxidován jaterní alkoholdehydrogenasou na formaldehyd a ten se v těle dále oxiduje na kyselinu mravenčí: CH 3 OH + NAD + CH 2 O + NADH + + H + HCOOH Pacienti jsou mimo jiné léčeni intravenózním podáváním čistého ethanolu. Vysvětlete, proč je tento postup účinný, víte-li že hodnoty Km pro oba substráty jsou následující: Km (ethanol) = 2.1 x 10-3 M Km (methanol) = 1.3 x 10-1 M

14 Další důležité pojmy: v 0 = k 2 [ES] reakce probíhá limitní rychlostí když [ES] = [E t ] Z definice limitní rychlosti: V lim = k 2. [E t ] V [ E lim t ] 2 k k cat číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednotku času K s = [E].[S]/[ES] = k -1 /k 1 Substrátová konstanta Katalytická aktivita enzymového preparátu Jednotky : unit (U), katal (kat), nkat Specifická aktivita - Celková aktivita -

15 VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA A + B P + Q - následný mechanismus (postupný, sekvenční) - náhodný - uspořádaný - "ping-pongový mechanismus

16 Nemichaelisovské enzymy Více aktivních center počáteční reakční rychlost [mol/l/min] 1 0,8 0,6 0,4 0, , [S] [mmol/l] v o = V K lim.[ S] + [ S] n n Positivní homotropní allosterický efekt allosterické enzymy

17 Faktory ovlivňující aktivitu enzymů Závislost počáteční reakční rychlosti na ph a teplotě

18 Faktory ovlivňující enzymovou aktivitu: Inhibitory Kompetitivní inhibice E I KI = [ ].[ ] [ EI ] v o = K M V lim.[ S] I. + [ ] 1 [ S] KI K M = K M I. + [ ] 1 K I K M K M V lim = V lim

19 Podukt Substrát Kompetitivní inhibitory fumarát sukcinát glutarát malonát oxalát COO - COO - COO - COO - COO - C-H H-C-H H-C-H H-C-H COO - C-H H-C-H H-C-H COO - COO - COO - H-C-H COO - Sukcinátdehydrogenasa

20 Vliv kompetitivního inhibitoru na enzymovou kinetiku grafické znázornění K m K m V lim = V lim

21 Inhibice nekompetitivní (noncompetitive)

22 Vliv nekompetitivního inhibitoru na enzymovou kinetiku K m = K m V lim V lim

23 Akompetitivní inhibice (acompetitive) K m K m V lim V lim V lim /K m = V lim /K m

24 Allosterická inhibice (aktivace) v o = V K lim.[ S] + [ S] n n

25 Imobilizované enzymy Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně Imobilizace enzymů Vazba na nosič Zachycení (entrapment) sorpcí Kovalentní vazbou V matrici gelu Opouzdření (encapsulation)

26 Typy nosičů - přírodní polymery (polysacharidy, proteiny) - syntetické polymery (polystyren, polyakryláty, hydroxylakylmethakryláty, atd.) - anorganické nosiče ( minerály, aktivní uhlí, porézní sklo, porézní oxidy kovů)

27 Vliv imobilizace na vlastnosti enzymů: 1. Inaktivace reaktanty nebo produkty imobilizační reakce 2. Podmínky imobilizační reakce 3. Vazebné síly fixují enzym v neaktivní konfiguraci 4. vazebná reakce s fčními skupinami AK v aktivním centru 5. Orientace enzymové molekuly na povrchu limituje přístup substrátu 6. Vliv funkčních skupin nosiče a) Nosič s kladným nábojem b) Nativní enzym c) Nosič se záporným nábojem

28 Biotechnologie Definice? Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě. Přednosti: surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí Nevýhody: Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?

29 Biotechnologické směry 1. Průmyslová mikrobiologie a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová) b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery), c) Biotransformace d) Biomasa 2. Průmyslové biotechnologie 3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace) 4. Živočišné biotechnologie 5. Biotechnologie užitkových rostlin 6. Veterinární a medicínské biotechnologie

30 Využití enzymů aplikovaná enzymologie využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk: průmysl potravinářský a nepotravinářský klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů) farmaceutika Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12%!) Ostatní (5-7%) - Oxidoreduktasy (GOD - analytika) Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie živočišné a rostlinné a plísně) - extremofilní MO rekombinantní technologie

31 Příklady ze života Biodetergenty (proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy) Mlékárenství (chymosin) Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy) Hydrolýza proteinů úprava krmných směsí. až po biostoning (celulasy)

32 Mlékárenství - výroba sýra Mléko - suspenze kaseinových mycel Specifita chymosinu Aspartátová proteasa, ph optimum 3,5-6,5 Povrch kaseinové mycely -glu-..-his-(pro-his) 2 -leu-ser-phe-met-ala val Para-κ-kasein hydrofobní kaseinmakropeptid hydrofilní Rekombinantní: mrna z mukosy předžaludků - produkční MO - E.coli, B. subtilis, S.cerevisiae, K. lactis, A. niger

33 Koagulace kaseinových micel - 1.fáze sladkého srážení mléka 2.fáze koagulace probíhá jen v přítomnosti Ca 2+ 3.fáze postupující hydrolysa, nežádoucí

34 Prokřížení proteinů transglutaminasa (protein-glutamin gammaglutamyltransferasa) potravinářské lepidlo - změna textury proteinů - tvorba gelů

35 Biotransformace: Enzymy: Biochemické modifikace látek i v organismu Celé buňky: Přeměna prekursorů na jiné látky vedlejší produkty metabolismu (na rozdíl od fermentací přeměna živin na produkty)

36 Příprava L-aminokyselin 1. Enzymové rozlišení racemické směsi α-aminokaprolaktam

37 Vliv organických rozpouštědel na biokatalysu + Vyšší rozpustnost hydrofobních látek Změna specifity Nižší aktivita vody potlačení hydrolysy Snažší separace produktů, vyšší výtěžek Menší riziko mikrobiální kontaminace Potlačení vedlejších reakcí Vyšší termostabilita enzymů v nepolárním prostředí - Nižší aktivita enzymů vyšší spotřeba Denaturace proteinů Reversní micely (voda v apolárním prostředí) - lipasy