9. KINETIKA ENZYMATICKÝCH REAKCÍ

Transkript

1 9. KNETKA ENZYMATCKÝCH REAKCÍ 9. ENZYMOVÁ KATALÝZA Mechanismus enzymových reakcí Vyhodnocení experimentálních dat...5 Příklad 9- Zpracování kinetických dat metodou počátečních reakčních rychlostí...6 Příklad 9-2 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Mentenové...8 Příklad 9-3 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Mentenové při nízkých koncentracích substrátu...9 Příklad 9-4 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Mentenové při vysokých koncentracích substrátu NHBCE Mechanismus inhibice Kinetické parametry inhibovaných reakcí Diagnostika inhibovaných reakcí...4 Příklad 9-5 Kinetika a mechanismus inhibice. Diagnostika inhibovaných reakcí Kinetika enzymatických reakcí

2 9. ENZYMOVÁ KATALÝZA Velmi početné a rozmanité katalytické děje probíhají v organismech, při kterých jako katalyzátor působí organické sloučeniny, z nichž nejdůležitější jsou enzymy. Jsou to poměrně složité organické sloučeniny, produkované živými organismy. Všechny enzymy patří mezi bílkoviny - některé mezi bílkoviny jednoduché, jiné mezi bílkoviny složené, jež obsahují ještě nebílkovinnou "prostetickou složku" (bílkovinná část se nazývá apoenzym, nebílkovinná koenzym a celek holoenzym). Koenzym může být na bílkovině vázán pevně a trvale, nebo jen labilně a pak ho lze oddělit např. dialýzou. Katalytickou funkci může vykonávat jen celistvý holoenzym. Velikost těchto molekul je důvodem, že vytvářejí koloidní roztoky a enzymovou katalýzu lze tak zařadit mezi katalýzu homogenní a heterogenní. Typickou vlastností enzymů je jejich specifita - schopnost enzymu katalysovat pouze určitou reakci daného substrátu (reagující látky). Tato specifita bývá velmi vyhraněná, což dovoluje buňce přesně rozhodovat o tom, které reakce daného substrátu budou v určitou chvíli preferovány; na druhou stranu to znamená, že pro každou reakci daného substrátu musí buňka synthetisovat jiný enzym. pecifita je v podstatě dvojí: substrátová a funkční. Tzv. substrátová specifita spočívá v tom, že enzym působí pouze na jeden substrát nebo skupinu substrátů. Enzymy s imální substrátovou specifitou působí na jedinou sloučeninu nebo dokonce na jediný z jejích izomerů. Většina enzymů však působí na několik blízce příbuzných látek a některé i na velkou skupinu sloučenin téhož typu (např. na řadu různých esterů, alkoholů apod.). ubstrátová specifita je určována bílkovinnou složkou (apoenzymem). Funkční specifita znamená, že enzym z několika možných přeměn substrátu katalyzuje pouze jedinou. Tak např. dekarboxyláza mění aminokyseliny na aminy, ne však na oxokyseliny, jiné aminokyseliny, amidy, estery a pod. - tyto přeměny uskutečňují opět jiné enzymy. Funkční specifita je určována především koenzymem (je-li přítomen), podílí se však na ní i složka bílkovinná. Jsou klasifikovány podle reakce, kterou katalyzují (oxidoreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy, ligázy). Pro enzymy je charakteristická vysoká katalytická účinnost. Např. jedna molekula enzymu je schopna při 20 až 38 C přeměnit 0 až 0 5 molekul substrátu za jedinou sekundu. To odpovídá značným rychlostem, které o mnoho řádů převyšují rychlosti dějů urychlovaných katalyzátory vyráběnými chemiky. 9.. MECHANMU ENZYMOVÝCH REAKCÍ Equation ection 9 Vysvětlení katalytického účinku enzymů je třeba hledat v jejich molekulární stavbě. Za katalytickou aktivitu je vesměs odpovědná relativně malá oblast molekuly, nazývaná aktivní centrum. Toto místo obsahuje skupinu nebo skupiny, schopné reagovat s molekulou substrátu. razí-li se molekula enzymu a molekula substrátu ve vhodné orientaci, je substrát v aktivním místě vázán a vzniká tzv. komplex enzym-substrát (E). Existence komplexu byla prokázána pomocí elektronové mikroskopie a rentgenostrukturní analýzou; v některých případech byl i izolován z reakční směsi. amo aktivní místo tvoří obvykle prohloubeninu povrchu bílkovinné molekuly a substrát do něj zapadá jako do určité "formy". Tím je zabráněno vazbě jiných látek a zaručena přesná orientace substrátové molekuly. Vazbou substrátu se současně mění struktura aktivního místa i substrátu samého. Vzniká labilní konfigurace, která vyvolává další strukturální změnu, tj. právě příslušnou katalyzovanou reakci. Jakmile je substrát chemicky změněn na produkt, ztrácí schopnost vazby na enzym, uvolňuje se a aktivní místo se vrací do původního stavu. tudiem mechanismů enzymových reakcí se zabývali Leonor Michaelis a Maud Mentenová již v r.93. Např. pro vysvětlení pozorované kinetiky enzymových reakcí typu P ( = substrát, P = produkt reakce) navrhli toto schéma: E + k + k E 2 P + E (9.) k Uvedený model je zjednodušení, v němž je zanedbána zpětná přeměna produktu na E, která je obvykle tak pomalá, že ji lze zanedbat; zanedbatelná je také ve všech případech kdy koncentrace produktu P je velmi nízká. Dovoluje však experimentálně získat kinetické parametry enzymové re- 9. Kinetika enzymatických reakcí 2

3 akce, Michaelisovu konstantu a limitní rychlost (viz dále) ze závislosti počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu. Na počátku reakce totiž (po smíchání enzymu a substrátu) není ve směsi obsažen žádný produkt a je tedy zajištěno, že zpětná reakce nemůže probíhat a veškeré parametry vypovídají pouze o přeměně substrátu na produkt. Mechanismus enzymatických reakcí se vždy řídí obecnými principy katalýzy - reakční cesta vede opět přes nestabilní meziprodukty. Protože na jedné molekule bývá zpravidla jen jedno aktivní místo, v kinetické rovnici používat místo neznámé veličiny L (v heterogenní katalýze celková koncentrace aktivních center) známou koncentraci enzymu. Rychlost reakce (v enzymologii je zvykem používat označení υ), tj. rychlost tvorby produktu, která je rovna rychlosti úbytku substrátu, je úměrná koncentraci komplexu E: dcp dc υ = k2 ce dτ = dτ = (9.2) Neměřitelná koncentrace meziproduktu c E může být vyjádřena různými způsoby:. Princip předřazené rovnováhy. Jestliže je možno předpokládat, že se v prvním kroku ustaví rovnováha a rychlost vzniku produktu P z komplexu E je proti rychlosti jeho zpětnému rozkladu na E + zanedbatelně malá, tedy že platí k 2 << k (tento předpoklad je základem teorie Michaelise a Mentenové), je koncentrace E dána rovnovážnou konstantou prvého kroku k ce K = + = (9.3) k c E c ce = KcE c (9.4) kde c je koncentrace výchozí látky substrátu a c E koncentrace enzymu ve volné formě. Ta není známa, ale platí, že součet koncentrací volného enzymu a enzymu v komplexu je konstantní a je roven celkové výchozí koncentraci enzymu c E0, takže c E = c E0 c E (9.5) KcE0 c ce0 c a ce = = (9.6) + Kc k + c Po dosazení do rovnice (9.2) dostaneme vztah pro rychlost enzymové reakce k2ce0c υ = k + c k + 2. Aproximace stacionárním stavem předpokládá, že celková rychlost vzniku komplexu enzym-substrát je rovna rychlosti jeho zániku a jeho koncentrace je dána Bodensteinovým principem: dce = k+ cec k ce k2 ce = 0 (9.8) dτ odkud s přihlédnutím k bilanci (9.5) pro koncentraci E plyne k+ ce0 c ce = (9.9) k + k + k c k Rychlostní rovnice má pak tvar k2ce0c υ = (9.0) k + k2 + c k + 3. Je-li rychlost rozkladu komplexu na produkt mnohem větší než zpětný rozklad na enzym a substrát, k 2 >> k, platí pro výslednou rychlost vztah: dce = k+ cec k ce k2 ce = 0 (9.) dτ (9.7) 9. Kinetika enzymatických reakcí 3

4 k c c υ = k + c 2 E0 2 k + (9.2) Ve všech případech může být tedy rychlost vyjádřena stejným typem vztahu, v němž jsou rychlostní konstanty nahrazeny novými kinetickými parametry, tvz. Michaelisovou konstantou K M a limitní rychlostí υ υ c υ = (9.3) + c který se v enzymologii nazývá rovnice Michaelise a Mentenové: Uvedený model je zjednodušení, v němž je zanedbána zpětná přeměna produktu na E, která je obvykle tak pomalá, že ji lze zanedbat; zanedbatelná je také ve všech případech kdy koncentrace produktu P je velmi nízká. Dovoluje však experimentálně získat kinetické parametry enzymové reakce, Michaelisovu konstantu a limitní rychlost ze závislosti počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu. Na počátku reakce totiž (po smíchání enzymu a substrátu) není ve směsi obsažen žádný produkt a je tedy zajištěno, že zpětná reakce nemůže probíhat a veškeré parametry vypovídají pouze o přeměně substrátu na produkt. Michaelisova konstanta je důležitá charakteristika enzymových reakcí. Její hodnoty se pohybují v širokém rozmezí 0, až 0 6 mol dm 3. Michaelisova konstanta má dvojí význam. Jak je patrné z rovnice (9.3), pro υ = υ /2 je K M = c. Michaelisova konstanta je tedy rovna koncentraci substrátu (proto má rozměr koncentrace), při níž je dosaženo polovičního nasycení enzymu a tím i poloviny limitní rychlosti. Hodnota K M rozděluje křivku závislosti rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu (saturační křivku, obr. 9-) na dvě oblasti, v nichž nastávají dva mezní případy: Při nízké koncentraci substrátu (c << K M ) υ c υ0 = = k c (9.4) je časový průběh enzymové reakce vystižen kinetickou rovnicí.řádu Při relativně vysokých koncentracích substrátu (c >> K M ) je reakční rychlost konstantní a enzymová reakce probíhá jako reakce nultého řádu: υ c υ0 = = υ (9.5) c 0 2 Obr. 9- aturační křivka Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu za konstantní koncentraci enzymu K M c 2. Michaelisova konstanta je ve vztahu k rychlostním konstantám jednotlivých reakcí ve schématu (9.): Je-li disociace komplexu E na E + mnohem rychlejší než tvorba P a regenerace enzymu, (k >> k 2 ), je K M rovna disociační konstantě komplexu E k K M = KE = (9.6) k+ a je nepřímou mírou pevnosti komplexu; vysoké K M ukazuje na slabou vazbu mezi enzymem a substrátem, nízké K M na vazbu silnou. Tato veličina tedy umožňuje odhadnout, zda je substrát štěpen enzymem dobře nebo špatně (tj. rychle nebo pomalu). 9. Kinetika enzymatických reakcí 4

5 V případě, že je možno použít aproximace ustáleného stavu, je Michaelisova konstanta dána výrazem k + k K 2 M = k + (9.7) Ve třetím případě, kdy k 2 >> k, platí K = k2 (9.8) M k + ymbolem υ je označován součin k 2 c E0. Má význam limitní rychlosti, které dosáhne reakce tehdy, je-li enzym nasycen substrátem, a je tedy prakticky úplně přítomen jako komplex E. Známe-li celkovou koncentraci enzymu c E0 (v mol dm 3 ), je možno vypočítat rychlostní konstantu k 2, υ mol dm 3 s k2 = s c = 3 E0 mol dm (9.9) která udává molekulární aktivitu enzymu (dříve číslo přeměny), vyjadřující počet molekul substrátu přeměněných za jednu sekundu jednou molekulou enzymu nebo veličinu stejného významu, mosoká hodnota molekulární aktivity namená, že katalyzovaná reakce probíhá velmi rychle. Nejčastěji lární aktivitu, tj. počet molů substrátu přeměněných jedním molem enzymu za jednu sekundu. Vy- se její hodnoty pohybují mezi několika sty až tisíci molekul substrátu na molekulu enzymu za sekundu VYHODNOCENÍ EXPERMENTÁLNÍCH DAT Kinetické parametry rovnice Michaelise a Mentenové K M a υ, jak z počátečních reakčních rych- tak z integrálních dat. lostí, Metoda počátečních reakčních rychlostí Známe-li počáteční rychlosti (tj. rychlosti, při nichž stupeň přeměny nepřekrocí hodnotu 0,05) pro sérii reakčních směsí obsahujících konstantní koncentraci enzymu a různé koncentrace substrátu, lze kinetické parametry získat Nelineární regresí s využitím počítače Pomocí linearizovaných tvarů rovnice Michaelise a Mentenové (Příklad 9-): Podle Lineweavera a Burka do grafu vynášíme /υ 0 proti /c. Získáme přímku, jejíž směrnice je K M /υ, úsek na svislé ose je roven /υ a úsek na vodorovné ose hodnotě /K M. = + (9.20) υ0 υ υ c Podle Eadiea z lineární závislosti υ 0 na υ 0 /c získáme K M jako směrnici a υ jako úsek na svislé ose (úsek na vodorovné ose je υ /K M): υ0 υ0 = υ (9.2) c Podle Hanese je poměr c /υ 0 lineární funkcí koncentrace c. Úsek na svislé ose je roven poměru K M /υ, úsek na vodorovné ose K M a směrnice je /υma x. c = + c (9.22) υ υ υ 0 Výpočet z integrálních dat Známe-li časovou závislost množství vznikajícího produktu P při konstantní koncentraci enzymu, je možno vyjádřit okamžitou koncentraci substrátu bilancí c = c 0 c 0 α = c 0 x, d c = c 0 d α = d x c P = c 0 α = x, d c P = c 0 d α = d x Po dosazení do diferenciální rovnice (9.3) dostaneme 9. Kinetika enzymatických reakcí 5

6 υ d x c0 x = υ dτ K + c x M + c0 x dτ d x d x c0 x c0 x + = = x 0 (9.23) (9.24) c0 υ τ = + d x= ln + x (9.25) c 0 0 x c0 x Ze směrnice linearizovaného tvaru této integrální rovnice, 0 ln c = υ x (9.26) τ c0 x τ dostaneme Michaelisovu konstantu, úsek na svislé ose je ro ven poměru υ /K M (Příklad 9-2). V oblasti nízkých koncentrací substrátu, kde c << K M, probíhá reakce kinetikou prvého řádu (Příklad 9-3). Časovou závislost koncentrace substrátu dostaneme integrací rovnice (9.4) c0 k2 ce0 ln = k τ, kde k = (9.27) c0 x Při relativně vysokých koncentracích substrátu (c >> K M ) je reakční rychlost konstantní a enzymová reakce probíhá jako reakce nultého řádu, popsaná diferenciální rovnicí (9.5). Množství vznikajících produktů se mění lineárně s časem; směrnice této přímky je rovna υ (Příklad 9-4): x = υ τ (9.28) Příklad 9- Zpracování kinetických dat metodou počátečních reakčních rychlostí Tryptofanosa katalyzuje reakci L-tryptofan + H 2 O = indol + pyrurvát + NH 3 Při studiu aktivity částečně přečištěného preparátu enzymu byly získány hodnoty počátečních rychlostí při různých koncentracích L-tryptofanu (substrát ). Vyhodnoťte Michaelisovu konstantu a limitní rychlost. Řešení:. Korelace rovnicí Michaelise a Mentenové linearizované podle Lineweavera a Burka = + υ υ υ c c 0 8 υ 0 mol dm 3 mol dm 3 s,22 2,267 2,45 2,703 4,90 3,575 9,79 4,098 4,69 4,098 9,59 3,974 24,48 4,2 Obr. 9-2 Linearizace podle Lineweavera a Burka 0 3 /c 0 7 /υ 0 dm 3 mol dm 3 mol s 8,97 4,4 4,082 3,700 2,04 2,797,02 2,440 0,68 2,440 0,50 2,56 0,408 2,375 Lineární regresí experimentálních dat: = 2, υ c 0 9. Kinetika enzymatických reakcí 6

7 Porovnáním obou rovnic dostaneme υ = = 4, mol dm 3 s 2, = 2723 K M = , =, mol dm 3 υ 2. Korelace rovnicí Michaelise a Mentenové linearizované podle Eadiea Obr. 9-3 Linearizace podle Eadiea Lineární regresí: υ υ 0 0 = υ K M c 8 4 υ υ0 = 4,3860,2250 c υ = 4, mol dm s K M =, mol dm υ 0 0 υ 0 / c 3 mol dm s s 2,267,858 2,703,03 3,575 0,730 4,098 0,49 4,098 0,279 3,974 0,203 4,2 0,72 3. Korelace rovnicí Michaelise a Mentenové linearizované podle Hanese Obr. 9-4 Linearizace podle Hanese 0 4 c 0 4 c /υ 0 mol dm 3 s,22 0,538 2,45 0,906 4,90,37 9,79 2,389 4,69 3, 585 9,59 4,930 24,48 5,83 Lineární regresí: K υ M c = + c υ υ υ 0 c 2624,9 2, c υ = + 0 υ = = 4, mol dm 3 s 2, = 2624,9 K M = 2624,9 4, =, mol dm 3 9. Kinetika enzymatických reakcí 7

8 Příklad 9-2 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Mentenové Pro enzymovou reakci, probíhající podle schematu E + k + k E k 2 E + P byla při počáteční koncentraci substrátu c = 0,22 mmol dm 3 a konstantní koncentraci enzymu zjištěna závislost koncentrace vznikajícího produktu P na čase, uvedená v následující tabulce. tanovte hodnoty Michaelisovy konstanty a limitní rychlosti υ. τ c P τ cp s mmol dm 3 s mmol dm , , , , , , , ,0549 Řešení: Ze známé časové závislosti množství vznikajícího pro duktu P při konstantní koncentraci enzymu, je možno vyjádřit okamžitou koncentraci substrátu bilancí c = c 0 x, d c = d x c P = x, d c P = d x Po dosazení z hmotnostní bilance do diferenciální rovnice Michaelise a Mentenové (9.3) dosta- neme vztah d x c0 x = υ dτ + c0 x [] který po integraci a úpravě vede k rovnici c0 υ c ln = P τ c c K K τ [2] 0 P M M která představuje rovnici přímky, jejíž směrnice je rovna ( /K M ) a úsek na svislé ose je poměru υ /K M. Ze zadaných hodnot vypočteme hodnoty levé strany rovnice [2] a hodnoty výrazu c P /τ. τ 0 5 c P 4 c0 P Y 0 ln X 08 c τ c0 cp τ s mol dm 3 s mol dm 3 s 0 2,2 580,22,8656 2, ,83, , ,44,8673 2, ,05, , ,66,9274, ,27,9589, ,88,98379, ,49 2,0767,85285 Obr. 9-5 ukazuje, že závislost je skutečně lineární. Porovnáním vztahu [2] s rovnicí přímky, získanou lineární regresí experimentálních dat Y = 3,5058 0,80323 X [3] 9. Kinetika enzymatických reakcí 8

9 dostaneme c0 4 c ln = 3, ,3 P τ c0 cp τ odkud K = 8032,3 dm3 mol M K M =, mol dm 3 υ 4 a = 3, odkud υ 0 4 = 3, ,245 υ = 4, mol dm 3 s Obr. 9-5 Grafické znázornění integrované rovnice Michaelise a Mentenové Příklad 9-3 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Men- tenové při nízkých koncentracích substrátu Enzym o molární hmotnosti 90 kg mol a molární aktivitě k 2 = 20 3 min působí v roztoku na substrát, který je na počátku přítomen v koncentraci 0 5 mol dm 3. Roztok obsahuje 0,27 mg enzymu v cm 3. Pro tento systém byla zjištěna hodnota Michaelisovy konstanty K M = 0,48 mol dm 3. Je možno předpokládat, že enzymová reakce probíhá podle schématu (9.). (a) Co můžete předpokládat o kinetice uvažované enzymové reakce v této koncentrační oblasti? (b) Odhadněte, za jak dlouho klesne koncentrace substrátu na 50 % původní hodnoty. Řešení: (a) Ze zadaných hodnot je patrno, že c 0 << K M. Jsme tedy v koncentrační oblasti, v níž enzymová reakce probíhá kinetikou prvého řádu. (b) V této koncentrační oblasti přechází rovnice Michaelise a Mentenové (9.3) na tvar. dc υ c υ υ = = c, kde υ = k2 ce0 dτ + c ntegrací dostaneme 0 2 E0 ln c k = c τ c D osadíme zadané hodnoty: k 2 = 20 3 min, c 0 = 0 5 mol dm 3, K M = 0,48 mol dm 3 c = 0,5 c 0 m E0 /V = 0,27 mg cm 3 = 0,27 g dm 3, M E = 90 kg mol me0 0,27 ce0 = M V = = 30 6 mol dm E 5 K 0 τ M c ln 0,48 = = ln 0 k c ce ,50 5 = 55,45 min 9. Kinetika enzymatických reakcí 9

10 Příklad 9-4 Zpracování kinetických dat pomocí integrované formy rovnice Michaelise a Mentenové při vysokých koncentracích substrátu Při působení xanthinoxidasy (K M =,70 6 mol dm 3 ) na xanthin (substrát), jehož počáteční 3 koncentrace byla 0,7 mol dm, se množství vznikajícího produktu měnilo lineárně s časem. Z výsledků tří pokusů při různých počátečních koncentracích enzymu stanovte molární aktivitu xanthinoxida sy. Enzymovou reakci je možno vystihnout schématem (9.). Řešení:. c E0 = 3,50 7 mol dm 3. c E0 = 6,80 7 mol dm 3. c E0 =,40 6 mol dm 3 τ c P τ c P τ c P s mol dm 3 s mol dm 3 s mol dm , , , , , , , , , , , ,547 Jsme v koncent rační oblasti, kde c 0 > > K M a reakce tedy probíhá kinetikou nultého řádu, která je popsána diferenciální rychlostní rovnicí (9.5): dc dcp υ c υ= = = υ = k2 ce0 dτ dτ + c Po integraci dostaneme lineární závislost koncentrace produktu na čase c = k c τ P 2 E0 Vynesením c P proti času získáme pro jednotlivé pokusy svazek příme k procházejících počátkem (obr. 9-6), jejichž směrnice jsou rovny součinům k 2 c E0. Obr. 9-6 Časová závislost koncentrace produktu měrnice jednotlivých přímek mají hodnoty. c E0 = 3,70 7 mol dm 3 k 2 c E0. = 3, mol dm 3 s (k 2 ) = 3, , = 95,82 s 5 k 2 c E0. = 6, mol dm 3 s 6,79580 (k 2 ) = 7 7,0 = 95,72 s. c E0 = 7,0 7 mol dm c E0 = 4,60 mol dm k 2 c E0. =, mol dm 3 s,400 5 (k 2 ) = = 95,97 s 6 4,60 Průměr hodnot (k 2 ), (k 2 ) a (k 2 ) je průměrná hodnota molární aktivity xanthinoxidasy : k 2 = 95,84 s 9. Kinetika enzymatických reakcí 0

11 9.2 NHBCE nhibice je děj, při němž je schopnost enzymu katalyzovat reakci snížena vazbou určité látky, inhibitoru MECHANMU NHBCE Podle mechanismu působení rozlišujeme několik typů inhibice: Při nevratné inhibici je enzym nevratně modifikován chemickou reakcí s inhibitorem. Obvykle dochází ke změně chemické struktury vazebných nebo katalytických skupin v aktivním centru enzymu. Vratnou inhibici vyvolává inhibitor, který může být z (nekovalentní) vazby na enzym odstraněn a enzym tak může nabýt své původní aktivity; při analyse reversibilní inhibice vycházíme obvykle z modelu Michaelise a Mentenové a rozlišujeme tzv. čisté inhibice - kompetitivní, nekompetitivní a akompetitivní - a inhibice smíšené, které nelze popsat jednoduchým kinetickým modelem. U každého typu můžeme rozlišit ještě plnou inhibici - rychlost enzymové reakce při dostatečné koncentraci inhibitoru klesá při každém zvýšení koncentrace substrátu k nule, a částečnou inhibici - rychlost neklesá k nule, ale blíží se ke konečné asymptotě. Různé typy inhibice je možno vyjádřit obecným schematem k + k 2 E + E + k + E + P k 3+ k 3 k 5+ k 5 (9.29) k 4+ k 6 E + E E + P k 4 ymbol E znamená opět enzym, substrát, P produkt reakce. ymbol značí inhibitor. Za nepřítomnosti inhibitoru exi stuje enzym p ouze ve volné form ě E a ve formě komplexu E, za přítomnosti inhibitoru tvoří ještě komp lexy E, případ ně E *. Získání nejobecnějšího výrazu pro veškeré typy jednoduché inhibice bez zjednodušujících předpokladů je značně pracné. V mnoha případěch lze však vycházet z předpokladu, že mezi substrátem, enzymem a inhibitorem se ustavuje rychle rovnováha, kterou je možno popsat disociačními konstantami: c c k = = (9.30), E K ce k+ E 3 K ce k3+ c c k = = (9.3) E 4 K ce k4+ c c k ce c k5 = = (9.32), = K = (9.33) c k E 5+ ubstrátová konstanta K je mírou pevnosti komplexu vytvořeného mezi enzymem a substrátem. Analogicky definovaných inhibičních konstant K a K lze použít jako kvantitativní míry účinku inhibitorů. * Předpokládáme, že komplex vznikající z E a je stejný jako komplex vznikající z E a. 9. Kinetika enzymatických reakcí

12 9.2.. Kompetitivní inhibice nhibitor a substrát soutěží o volný enzym. truktura inhibitoru je natolik podobná struktuře substrátu, že se může vázat na totéž vazebné místo. Zvýší-li se však koncentrace substrátu natolik, že je vyšší než koncentrace inhibitoru, dojde k vytěsnění inhibitoru a navázání substrátu. Při plně kompetitivní inhibici místo komplexu E vzniká inaktivní komplex E, který se nepřeměňuje na produkt. Tím je enzym blokován. Uskutečňují se tedy pouze tyto dílčí reakce obecného schematu: k + k 2 E + + k E E + P k 3+ k (9.34) E 3 Při částečně kompetitivní inhibici se inhibitor opět váže na místo blízké vazebnému místu, ale vznikající komplex E se rozkládá na produkt a inaktivní komplex E, v němž zůstává vázána část en- nhibice je popsána schématem (9.29). Rychlostní konstanty rozpadu komplexů E a E jsou zymu. stejné, k 2 = k 6. Protože vazba inhibitoru ovlivňuje vazbu substrátu, platí pro poměr disociačních konstant (označíme α) K K = = α > (9.35) K K Nekompetitivní inhibice Při plně nekompetitivní inhibici neovlivňuje vazba inhibitoru vazbu substrátu, ale snižuje rychlost jeo přeměny na produkt. Z kinetického hlediska se systém chová tak, jako by bylo přítomno menší h množství enzymu, neboť část je ho inaktivována vazbou inhibitoru; hodnota Michaelisovy konstanty není tímto typem inhibice ovlivněna, je však snížena hodnota limitní rychlosti. Uplatňují se reakce: k + k 2 E + E + k + E + P k 3+ k 3 k 5+ k 5 (9.36) k 4+ E + E k 4 9. Kinetika enzymatických reakcí 2

13 Předpoklad, že afinita enzymu a substrátu je nezávislá na tom, zda je enzym volný nebo vázán na sub- znamená, že strát K = K a K = K (α = ) (9.37) Při částečně nekompetitivní inhibici vazba inhibitoru opět neovlivňuje vazbu substrátu, tedy K = K a K = K, ternární komplex se však rozpadá na produkt (reakční schéma (9.29)), ale poma- než komplex E (k 2 > k 6 leji ): Akompetitivní inhibice snižuje limitní rychlost i K M, ale nemění jejich vzájemné poměry. nhibitor nereaguje s volným enzymem, může se vázat teprve až když vazba substrátu na enzym vhodně pozmění jeho konformaci. Při plně akompetitivní inhibice inhibitor reaguje s komplexem E a zabraňuje jeho přeměně na pro- dukt a enzym: k + k 2 E + E k + E + P k 5+ k 5 (9.38) E T aké při částečně akompetitivní inhibici se inhibitor váže na komplex E, avšak E se pomalu štěpí za vzniku produktu (k 2 > k 6 ): k + k 2 E + E k + E + P k 5+ k 5 (9.39) E E + P míšená inhibice Pod tento pojem jsou zahrnovány různé typy i nhibice, při nichž inhibitor mění jak afinitu enzymu k substrátu, tak katalytickou rychlo st přeměny substrátu na produkt. Do této kategorie spadá i akom- a nekompetitivní inhibice v podmínkách stacionárního (tj. nerovnovážného) stavu. Termín petitivní smíšená je obvykle používán pro případ, kdy se sice uplatňují stejné reakce, avšak, zatímco při nekom- petitivní inhibici platí K = K, K = K, platí zde K > K a K > K. k 6 9. Kinetika enzymatických reakcí 3

14 9.2.2 KNETCKÉ PARAMETRY NHBOVANÝCH REAKCÍ Řešením reakčních schémat pro jednotlivé typy inhibice získáme závislost rychlosti inhibované reakce υ i na koncentraci substrátu c za přítomnosti konstantního množství inhibitoru c, kterou je možno zapsat stejnou formou, jakou má rovnice Michaelise a Mentenové: υ c υi = (9.40) K + c M Kinetické parametry, zdánlivá imální rychlost υ a zdánlivá Michaelisova konstanta K M vždy pro určitou koncentraci inhibitoru (viz tabulka ) platí Tabulka Kinetické parametry inhibovaných enzymových reakcí K k6 K k 2 K α = =, K typ inhibice β =, υ = k c 2 E0 υ K M kompetitivní nekompetitivní akompetitivní typicky smíšená pln ě υ K + c K částečně plně υ υ K K + c částečně K + β c υ K + c plně υ K K + c částečně K + β c υ K + c υ K K + c/ α K K + c K + c/ α K K M M M K M K M K K + c K K + c K + c K + c/ α DAGNOTKA NHBOVANÝCH REAKCÍ Při diagnostice inhibovaných reakcí se obvykle používá hodnot počátečních reakčních rychlostí, naměřených při různých koncentracích inhibitorů a substrátů. Využíváme grafických nebo numer- popsaných pro stanovení υ a K M neinhibovaných ických metod reakcí: vynesení /υ i proti /c (Lineweaver a Burk), c /υ i proti c (Hanes) nebo υ i proti υ i /c (Eadie) a dále speciálních grafů pro inhibované reakce vynesení /υ i proti c za konstantní koncentrace substrátu (Dixonův graf), cυi υ υ i proti c za konstantní koncentrace inhibitoru (graf podle Huntera a Downse) Typické tvary jednotlivých závislostí jsou shrnuty na obr. 9-7 až Kinetika enzymatických reakcí 4

15 Obr. 9-7 Kompetitivní inhibice Obr. 9-8 Nekompetitivní inhibice 9. Kinetika enzymatických reakcí 5

16 Obr. 9-9 Akompetitivní inhibice Obr. 9-0 Typicky smíšená inhibice 9. Kinetika enzymatických reakcí 6

17 Obr. 9- Dixonův graf Obr. 9-2 Graf podle Huntera a Downse 9. Kinetika enzymatických reakcí 7

18 Příklad 9-5 Kinetika a mechanismus inhibice. Diagnostika inhibovaných reakcí Pro jistou enzymovou reakci, o níž se předpokládá, že za přítomnosti inhibitoru probíhá podle schematu (9.39), byly naměřeny hodnoty počátečních reakčních rychlostí při různých koncentracích substrátu jednak za nepřítomnosti inhibitoru a jednak pro různé koncentrace inhibitoru. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Ověřte navrhovaný mechanismus a stanovte hodnoty konstant v rovnicích, popisujících závislost rychlosti reakce na koncentraci substrátu a inhibitoru. Řešení: c 0 5 υ i /( mol dm 3 s ) c = 0 c = 0,05 c = 0,0 c = 0,8 dm 3 mol dm 3 c = 0,32 0,00 0,69 0,403 0,487 0,546 0,589 0,003 0,440 0,595 0,622 0,637 0,646 0,004 0,550 0,630 0,644 0,65 0,654 0,005 0,647 0,657 0,658 0,659 0,659 0,02,00 0,723 0,694 0,680 0,67 0,020,375 0,745 0,705 0,686 0,674 0,030,570 0,756 0,70 0,689 0,676 0,040,690 0,762 0,73 0,690 0,677 0,065,860 0,768 0,77 0,692 0,678 0,085,930 0,77 0,78 0,693 0,678 Na obr. 9-3 jsou vyneseny saturační křivky. Z porovnání průběhu závislosti počáteční rychlosti na koncentraci substrátu pro enzymovou reakci bez přítomnosti a za přítomnosti inhibitoru je patrné, že nejpravděpodobnější je předpoklad, že jde o akompetitivní inhibici (srovnej obr. 9-9a). Obr. 9-3 aturační křivky Křivka : c = 0 (neinhibovaná reakce) Křivka 2 : c = 0,05 mol dm 3 Křivka 3 : c = 0,0 mol dm 3 Křivka 4 : c = 0,8 mol dm 3 Křivka 5 : c = 0,32 mol dm 3 Rychlost neinhibované reakce je popsána rovnicí Michaelise a Mentenové (9.3). υ c υ = K + c M [] 9. Kinetika enzymatických reakcí 8

19 Při odvození výrazu pro rychlost inhibované reakce předpokládáme, že mezi substrátem, enzymem a inhibitorem se rychle ustavuje rovnováha, popsaná disociačními konstantami K a K (konstanta K = K M neinhibované reakce) a rychlost reakce je dána vztahem υi = k2 ce+ k6 ce [2] Koncentrace komplexů E a E vyjádříme z rovnic (9.30) a (9.33): c c c c c c c c E E E E =, ce = = K K K K [3], [4] Pro celkovou koncentraci enzymu platí bilance c c c c E0 = c E + c E + c E = c E + + [5] K K K Z rovnic [3] až [5] dosadíme do rychlostní rovnice [2]: cec cec k6 k2 c c c E0c υi = k2 + k6 = + [6] K K c k2 cc K K + + K K K Poměr rychlostních konstant k 6 /k 2 oz načíme jako β a rov nici [6] upravíme do tvaru rovnice Michaelise a Mentenové: υ c υi = [7] + c kde K + β c K + β c υ = k2 ce0 K = υ [8] K + c K + c (k 2 c E0 = υ neinhibované reakce; protože β <, je < υ ) a υ K K K K K M = M K + c = K + c Abychom mohli ověřit platnost navrhovaného mechan ismu, převedeme rovnici [7] na lineární tvar. podle Lineweavera a Burka K + c K K = + = + υ υ υ c υ ( K + βc ) υ ( K + βc ) c i [9] [0] 2. podle Hanese c K K K + c = + c = + c υ υ υ υ ( K + βc ) υ ( K + βc ) i i i M 3. nebo podle Eadiea υ = υ K υ K + β c K K υ = υ i c K + c K + c [] [2] Zvolíme např. třetí způsob. Do grafu (obr. 9-4) vyneseme hodnoty rychlostí υ ol dm 3 s i (v m ) proti poměru υ i /c (s ) pro různé koncentrace inhibitoru. 9. Kinetika enzymatických reakcí 9

20 Korelace pomocí rovnice [2] c = 0 c = 0,05 c = 0,0 c = 0,8 c = 0,32 05 υ i 03 υ i 05 υ i 03 υ i 05 υ i 03 υi c c c 0,69 0,440 0,550,6900,4667,3750 0,647,2940 0,657,340 0,658,00,375,570 0,967 0,6875 0,5233 0,723 0,756 0,6025 0,2520 0,694 0,70,690 0,4225 0,762 0,905 0,73 0,,860 0,2862 0,768 0,82 0,77,930 0,2706 0,77 0,0907 0,78 05 υ i 0 υ 05 υ i 3 i c 3 i 0 υ c 0,403 0,595 0,630 4,0300,9833,5750 0,487 0, 622 0,644 4,8700 2,0733,600 0,546 0,637 0,65 5,4600 2,233,6275 0,589 0,646 0,654 5,8900 2,533,6350,360 0,659,380 0,659,380 0,5783 0,680 0,5667 0,67 0,5592 0,745 0,3725 0,705 0,3525 0,686 0,3430 0,674 0,3370 0,2367 0,689 0,2297 0,676 0, ,690 0,725 0,677 0,693 0,03 0,692 0,065 0,678 0,043 0,0845 0,693 0,085 0,678 0,0798 Obr. 9-4 Korelace pomocí rovnice (2) ouřadnice průsečíku všech přímek, [,280 3 ; 0,660 5 ] souhlasí s teoretickými hodnotami [υ ( β)/k M; β υ ] pro částečně akompetitivní inhibici (viz obr. 9-9d) Z obr. 9-4 je patrné, že rovnice [2] velmi dobře vyhovuje experimentálním datům a charakter závislostí odpovídá částečně akompetitivní inhibici (srovnej obr. 9-9d). Lineární regresí byly pro jednotlivé koncentrace inhibitoru zjištěny tyto rovnice přímkových závislostí υ i na υ i /c : p ro c = 0 (neinhibovaná reakce) υ 5 2 i = 2,2790,2450 ( υ i/ c) [3] 6 4 pro c = 0,05 mol dm 3 υ = 7, ,3450 ( υ / c ) [4] i pro c = 0,0 mol dm 3 υ 6 4 i = 7,2840 4,82370 ( υi/ c ) [5] 6 4 pro c = 0,8 mol dm 3 υi = 6,9550 2,7330 ( υi/ c ) [6] 6 4 pro c = 0,32 mol dm 3 υi = 6,79370,5370 ( υi/ c ) [7] Tento předpoklad potvrdíme ještě konstrukcí Dixonova grafu (tj. vynesením hodnot /υ i proti c pro různé hodnoty c ) obr. 9-5). i 9. Kinetika enzymatických reakcí 20

21 Obr. 9-5 Dixonův graf K ( + c) + cc = υ υ c ( K + β c ) i [8] lim = == c υ υ β 0 i 0,32, =,55 0 dm 3 m ol s [9] Hyperbolický tvar závislosti potvrzuje, že jde o inhibici částečně akompeti- Pro plně akomp etitivní inhibici by závislost byla lineární. tivní. Kin etické parametry, υ ma x a K M, υma x zjistíme por ovnáním rovnice Michaelise a Mentenové linearizované podle Eadiea (rov nice [2]) s rovnicemi [3] až [7], jejichž směrnice jsou rovny K M, resp. K M a úseky na svislé ose jsou rovny υ, resp. υ : Pro c = 0 (neinhibovaná reakce) tak dostaneme υ = 2, mol dm 3 s a K M =, mol dm 3. Pro reakce za přítomnosti inhibitoru v různých koncentracích mají kinetické parametry tyto hodnoty: c υ K M mol dm 3 mol dm 3 s mol dm 3 0,05 7, , ,0 7, , ,8 6, ,7330 0,32 6, , Konstantu K vypočítáme ze známých hodnot K M a při různých koncentracích inhibitoru. Vztah [9] upravíme do lineárního tvaru = + c [9] K a konstantu K určíme jako reciprokou hodnotu směrnice přímky (obr. 9-6) K M K M = + 242,79 c [20] K = 4,90 4 mol dm 3 Poměr rychlostních konstant, k 6 /k 2 = β Obr. 9-6 tanovení K vyjádříme ze vztahu [8]: υ K K β = υ + c [2] c Průměrná hodnota poměru rychlostních konstant, vypočtená z hodnot υ a υ pro jednotlivé koncentrace inhibitoru (viz předcházející tabulku) je β = 0,35 9. Kinetika enzymatických reakcí 2