GENETICKÁ TRANSFORMACE OBILOVIN

Transkript

1 GENETICKÁ TRANSFORMACE OBILOVIN Pokročilé biochemické a biotechnologické metody K. Holubová

2 ÚVOD Kukuřice pšenice rýže - ječmen Obiloviny: potrava, krmivo, průmyslní výroba Klimatické změny: poptávka po odolnějších odrůdách Klasické šlechtění: časová náročnost Genové inženýrství: rychlejší, efektivnější Cíl: vnesení požadovaní genetické informace (DNA) do genomu rostliny První genetické transformace: 80 léta 20. století Agrobacterium tumefaciens: dvouděložní rostliny, pro obiloviny dlouhou dobu nevyužitelný Vývoj alternativních přímých metod transformace (DGT)

3 ÚVOD Faktory ovlivňující úspěšnost transformaci: A) dostupnost vysoce účinné a reprodukovatelné metody přenosu genu (přímé, nepřímé) B) volba cílového explantátu, který bude lehce regenerovat (listy, embrya, protoplasty, atd.) C) dostupnost metody regenerace pro danu rostlinu a kultivar D) vhodná screeningová metoda pro selekci transgenních rostlin

4 ÚVOD Další důležité faktory při transformaci: promotor (řídi expresi genu), terminátor (ukončuje transkripci), selekční gen Konstitutivní promotory: exprese konstantní ve všech pletivech a po celou dobu života rostliny Vírové promotory: CaMV 35S (35S RNA vír květákové mozaiky, slabší exprese u obiloví); CmYLCV (vír žluté kudrnatosti listů cestrum aurantiacum) a RTBV (pararetrovirus rýže) Rostlinné promotory: Ubi (kukuřiční ubiquitinový promotor s prvním intronem), Act1 (aktinový promotor s prvním intronem z rýže), Ubi4 a Ubi9 (ubiquitinové promotory z cukrové třtin), atd.

5 ÚVOD Pletivově-specifické promotory: exprese specifická v určitém orgáne anebo pletivu v závislosti na funkci daného genu Zrnově-specifické promotory: AsGlo (ovesný globulinový, v endospermu a aleur. vrstvě, Hor1-Hor3 (hordeinové promotory z ječmene), GLUB-1 (gluteninový, rýže), β-amy (amylasa z ječmene) Kořenově-specifické promotory: NAS1 (nikotinaminsyntasa z ječmene), IDS (dioxygenasa z ječmene), PHT (fosfátový transportér z ječmene) Listově-specifické promotory: BTH7 (thionin, ječmen)

6 ÚVOD Inducibilné promotory: exprese genu se zapíná a vypíná v závislosti na podnětu Chemicky-inducibilné promotory: glukokortikoidy, estradiol, etanol Abiotický/biotický stres-inducibilné promotory: chlad, tepelný šok, vodný stres, atd. Terminátor: NOS (nopalinsyntasa z A.tumefaciens), CaMV 35S (35S RNA vír květakové mozaiky), atd. Testování promotorů a exprese: reportérové gény

7 REPORTÉROVÉ GENY Produkty netoxické Snadná a levná detekce, ideálně in vivo Nízká, příp. žádná endogenní exprese v transformovaných rostlinách ß-glukuronidáza (GUS) Nejčastěji používaný reportérovy gen v rostlinných transformačních vektorech Štěpí substrát na barevný anebo fluoreskující podukt Snadná detekce v živých i neživých rostlinách, vysoká citlivost Kvantitativní (míra exprese) a kvalitativní analýzy (lokalizace exprese) Minimální exprese v rostlinách Detekce histochemicky, spektrofotometricky nebo pomocí fluorogenního substrátu

8 Fluorescenční proteiny REPORTÉROVÉ GENY Geneticky upravený zelený fluorescenční protein (GFP) z medúzy Odvozené žlté a modré fluorescenční proteiny Z korálu Discosoma červený fluorescenční protein DsRed Není nutný substrát (kyslík a modré světlo) Detekce: zařízení pro detekci zeleného světla, fluorescenční anebo konfokální mikroskop Možnost detekce genové exprese, lokalizace proteinů a studium proteinových in vivo Kvantifikace fluorescence pomocí spektrofluorimetru na základě fluorescence čistého fluorescenčního proteinu.

9 REPORTÉROVÉ GENY Luciferáza (LUC) Enzymy podílející se na bioluminiscenci Pro transformaci rostlin: geneticky upravená luciferáza světlušky (LUC, produkuje jasnější světlo než přirozená forma enzymu), luciferázy korálu Renilla (rluc), bakteriální luciferázy (LUXA a LUXB z Vibrio harvei) Detekce v buněčných extraktech (luminometr, scintilační detektor) anebo in planta (speciální a nákladné zařízení s CCD systémem zobrazování) Menší využití vzhledem k nákladnosti Sledování dynamických změn genové exprese, studium proteinových interakcí a tranzientní exprese jako součást duálního reportérového systému spolu s GUS Výhoda: oproti fluorescenčním proteinům nízké pozadí (nespecifická bioluminiscence) v rostlinách.

10 REPORTÉROVÉ GENY Akumulace antokyaninu Ve vodě rozpustné flavonoidní pigmenty, které se mohou ve velkém množství akumulovat ve vakuole buňky Vizuální detekce (bez nutnosti substrátu) - sledování tranzientní exprese Nutná přítomnost dvou skupin transkripčních faktorů - MYB a bhlh Detekce antokyaninů - v rostlinách, u kterých byla narušena přirozená dráha syntézy těchto pigmentů (nejsou pro rostlinu esenciální) Výhoda metody: přímé počítání individuálních pozitivních buněk

11 SELEKCE TRANSGENNÍCH ROSTLIN OBILOVINA SELEKČNÍ MARKER SELEKČNÍ LÁTKA Pšenice bar (phosphinothricinacetyltransferasa) L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy) hptii (hygromycinphosphotransferasa) Hygromycin B (ATB) cah (cayanamidhydratasa) Cyanamid nptii (neomycin phosphotransferasa) Geneticin (aminoglykosidové ATB) mana (phosphomannosaisomerasa) Manosa (alternativní zdroj uhlíku) CP4 epsps (5-enolpyruvylshikimát-3-fosfatsynthasa) Glyfosát (herbicid) Ječmen coda (cytosindeaminasa) 5-fluorocytosin pat (phosphinothricinacetyltransferasa) L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy) bar hpt mana nptii Oves nptii bar hpt

12 Přímé metody transformace (DGT) Cílový explantát: protoplasty odvozené z různých pletiv, mikrospory Transformace pomocí polyethylenglykolu Destabilizace plazmatické membrány protoplastů v přítomnosti Ca 2+ umožní proniknutí požadované DNA do buňky Nutná izolace protoplastů, problematická regenerace rostlin Tranzietní exprese: lokalizace proteinů, testování promotorů Elektroporace Transformace rostlinných buněk a protoplastů Elektrický impuls o vysokém napětí póry v cytoplazmatické membráně Množství DNA, které se dostane touto metodou do buněk je malé nízký počet integrací požadované DNA Účinnost elektroporace je srovnatelná s biolistickou transformací

13 Silikon karbidová vlákna Přímé metody transformace (DGT) K suspenzi obsahující rostlinný materiál a DNA se přidají silikon-karbidová vlákna, která pronikají buněčnou stěnou a umožní vstup DNA do buňky Nevýhoda: nízká efektivita transformace a poškození buněk, které negativně ovlivní jejich regenerační schopnost Mikroinjekce zavedení DNA do jádra nebo cytoplazmy prostřednictvím skleněné mikrokapilární injekční pipety za užití mikromanipulátoru Využití zejména pro živočišné buňky, jelikož rostlinné buňky obsahují buněční stěnu, která tvoří bariéru pro mikroinjekci Mikroinjekce protoplastů po odstranění vakuol snižuje schopnost regenerace.

14 Biolistická transformace Vnesení požadované DNA do buněk, ze kterých je možné nejsnáze regenerovat celou rostlinu (kalusové kultury nebo embryonální tkáň skutela) Uplatnění pro transformaci obilovin Studium tranzietní exprese různých genových konstruktů Testování promotorů Nižší nároky na vektor, explantát a genotyp rostliny Nevýhody: nižší efektivita transformaci ve srovnání s A. tumefaciens, nestabilita exprese genů, vyšší počet integrací může vést k umlčení exprese, ztráta transgenů v potomstvu

15 Biolistická transformace První transgenní rostlina kukuřice v roku významný krok na poli gen. modifikace obilovin Poprvé připraven transgenní ječmen a pšenice (Obr.1) Obr. 1 Chronologické řazení transformací hlavních obilovin pomocí biolistických metod a A. tumefaciens

16 Biolistická transformace Biolistické metody jsou založeny na urychlení kovových částic (nejčastěji zlatých) o průměru kolem 1 µm obalených požadovanou DNA pro přímé vnesení do rostlinných buněk Genové dělo PDS 1000/He od firmy BioRad, genová pistole Evakuace přístroje a puštění helia (1 100 psi) praskne rupture disk náraz plynu do makronosiče s kovovými čás cemi s navázanou DNA vystřelení čás c, které vniknou do pletiva embrya. Transformační účinnost do 10 %

17 Biolistická transformace Ideální explantát pro transformaci - nezralá embrya nebo skutelum (největší schopnost regenerace) pěstování donorové rostliny až do fáze vývoje nezralých semen Regenerace rostliny na čtyřech odlišných médiích: kalus-indukční médium (dediferenciace buněk působením auxinu dicamby) kalus-indukční médium s manitolem (osmotické působení manitolu) tranzitní médium (indukce diferenciace vlivem auxinu 2,4-D a cytokininu BAP) regenerační médium bez hormonů. A B Obr. 2 Nezralé zrno pšenice (A), vyizolovaná skutela (B)

18 Biolistická transformace 8 hod před a 16 hod po bombardování kultivace na médiu s manitolem při 25 C ve tmě 6 týdnů kultivace na kalus-indukujícím médiu se selekčním tlakem (25 C, tma) 2 týdny kultivace na tranzitním médiu v polotme začína růst listů (Obr. 3A) 2-4 týdní regenerace při plném svetle na médiu bez hormonů (Obr. 3B) Přesazení rostlin do hlíny A B B Obr. 3 Diferenciace buněk na povrchu kalusu (A), zregenerovaná rostlina (B)

19 Transformace pomocí A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens: tumor u rostlin Schopnost vnést cizorodou DNA do genomu hostitele Hostitelská tkáň: exprese genů, kódujících auxiny, cytokininy, a enzymy řídící syntézu derivátu aminokyselina cukrů vznik tumoru Ti plazmid, T-DNA využití v gen. inženýrství po odstranění genů, způsobujících tumor První pokusy přímá transformace Ti plazmidu do rostlinných buněk První transgenní rostliny (dvouděložné) připravené v r První jednoděložní rostlina chřest 1993 transg. rýže, 1998 transg. kukuřice B V posledních 10 letech úspěšné vyvinuté protokoly pro transformaci obilovín (rýže Japonica, Indica a Javanica, jarní a zimní odrůdy pšenice a ječmene, hybridní kukuřice, čiroku, žita a několika pícnin a travin)

20 Agrobacterium tumefaciens Rostlinná buňka Pomocný plazmid Regenerace rostlin Binární plazmid T- DNA Vnášený gen Vnesení T-DNA s požadovaným genem do genomu rostlinných buněk T-DNA integrovaná v T-DNA rostlinném chromozomu Rostlina se změněnou genetickou informací

21 Transformace pomocí A. tumefaciens Kmene: AGL1 nebo AGL0, případně LBA 4404 Cílový explantát: nezralé embryo, mikrospory Značné množství binárních plazmidových konstruktů pro transformaci obilovin, např. vektory série pbract Výhody: vysoká transformační účinnost (až 30 %), nízký počet integraci transgenu, stabilnější dědičnost, nízká míra umlčení transgenu Produkce velkého množství nezávislých transgenních linií schopných reprodukce Studium funkce genů v obilovinách B

22 PROVEDENÍ: 1. Klonování genu Transformace pomocí A. tumefaciens Vnesení požadovaného genu do jednoduché plazmidové DNA podporujicí nejlépe tzv. Gateway technologii klonování Rekombinace požadovaného genu do cílového - binárního vektoru (dvojí selekce) Často používané cílové binární vektory odvozené od vektoru pgreen (malé, snadná manipulace v E. coli) Transformace binárního vektoru s požadovaným B genem do A.tumefaciens (AGL1) spolu s vektorem psoup pomocí elektroporace.

23 Transformace pomocí A. tumefaciens npt1 psa-ori LB colei ori RB StuI (7154) SacI (6752) nosterm 3' Reverse primer nos terminator attr2 ccdb SmaI (6004) pbract bp 35S-Hyg-nos SacI (2315) XhoI (2653) HindIII (2674 XmaI (6002) Cm(R) attr1 XhoI (3383) Ubi promoter ApaI (3742) pah Ubi promd primer forward Vstupní vektor Rekombinace Cílový vektor

24 PROVEDENÍ: Transformace pomocí A. tumefaciens 2. Transformace ječmene Sterilizace zrn ječmene hypochloridem. Izolace nezralých embryí (velikost embrya mm) a oddělení osy embrya pod stereoskopem ve sterilních podmínkách laminárního boxu. Umístění embryí na kalus-indukční médium (CIM) -dediferenciace buněk a růst kalusů (Dicamba) Kultivační média: tří základní složky a stužovací látka (phytagel) na báze agaru: esenciální prvky nebo minerální ionty (makroelementy, B mikroelementy a zdroj železa ) organické látky (vitamíny a aminokyseliny) zdroj vázaného uhlíku - pletivo kalusu nefotosyntetizuje - zdroj uhlíku 3% maltosa.

25 Transformace pomocí A. tumefaciens epicotyl radicle Zrno ječmene

26 Transformace pomocí A. tumefaciens PROVEDENÍ: 3. Inokulace Do 24 hod po izolaci Nutná přítomnost fenolických látek (acetosyringone) spouštění virulace Ko-kultivace v přítomností A.tumefaciens 3 dni B

27 PROVEDENÍ: Transformace pomocí A. tumefaciens 3. Selekce transgenních buněk Kalus-indukující medium obsahující selekční prvek (fosfinotricin,hygromycín 100 % selekce) a antibiotikum timentin (zabíjí agrobakterium) 6 týdnů ve tmě, pasáž po dvou týdnech Tvorba kalusů beztvárná masa volně uspořádaných parenchymatických buněk B

28 PROVEDENÍ: 4. Regenerace rostlin Transformace pomocí A. tumefaciens 2 týdny na tranzitním médiu diferenciace buněk (BAP, 2,4-dichlorofenoxyoctová kyselina), slabé světlo, růst prýtu 2-4 týdny: regenerační médium bez hormonu, plné osvětlení, vývoj kořenů a listů Transgenní rostliny přenesené zpět na kalus-indukující medium bez hormonu růst a vývoj rostliny, kořenů Přenos rostlin do rašelinových disků (2 týdny) a přesazení do hlíny B

29 Transformace pomocí A. tumefaciens Izolace a ko-kultivace Selekce Tranzitní médium Regenerace Osvětlení: μmol/m 2 /s 500 μmol/m 2 /s Izolované skutelum nezralých embryí na kalus-indukujícím médiu Ko-kultivace s A. tumefaciens, přesun na kalus-indukujícím médiu s antibiotikem 6-ti týdenní selekce transformovaných embryí/ kalusů na antibiotiku 2-týdenní kultivace na tranzitním médiu s rostlinnými hormony Regenerace rostlin na médiu bez hormonů

30 Transformace pomocí A. tumefaciens Přesun rostlin s 2-3 cm listy Přesazení do disků se zeminou Přesazení do květináčů se zeminou Zregenerované rostliny s listy a kořeny Kultivace jednotlivých rostlin na základním médiu bez hormonů Pěstování rostlin v hlíně ve skleníku

31 Příklady využití transgenních obilovin Molekulární farmaření, produkce farmaceuticky účinných látek (antimikrobiální peptidy) Obohacení esenciálních aminokyselin v zrnech rostlin (kukuřice s vyšším obsahem lyzinu) Transgenní rostliny s vyšší kvalitou škrobu v zrnech Zlepšení sladovnické kvality ječmene Zlepšení rezistenci rostlin vůči škůdcům: Bt kukuřice Zlepšení tolerance vůči abiotickým stresům: kukuřice odolná vůči suchu (nadprodukce cold shock proteinu B) Zvýšení tolerance obilovin vůči herbicidům