PLATELIA ASPERGILLUS EIA TESTŮ

Transkript

1 PLATELIA ASPERGILLUS EIA TESTŮ PLATELIA ASPERGILLUS EIA JE IMUNOENZYMATICKÝ SENDVIČOVÝ TEST PRO DETEKCI ASPERGILOVÉHO GALAKTOMANANOVÉHO ANTIGENU V SÉRU PROVÁDĚNÝ NA MIKROTITRAČNÍCH DESTIČKÁCH. 1 POUŽITÍ Platelia Aspergillus EIA je imunoenzymatický sendvičový test pro detekci Aspergilového galaktomananového antigenu ve vzorcích séra prováděný na mikrotitračních destičkách. 2 INDIKACE K POUŽITÍ Platelia Aspergillus EIA je test, který lze společně s jinými diagnostickými postupy, jako je mikrobiologická kultivace, histologické vyšetření bioptických vzorků a radiografické zobrazení, použít při diagnóze invazivní aspergilózy. 3 SOUHRN A VYSVĚTLENÍ Aspergilové infekce se obyčejně objeví po inhalaci aspergilových spór, přítomných v okolí. Invazivní formy, které jsou posledních 10 let na vzestupu, představují nejzávažnější infekce. Dochází k nim hlavně u neutropenických pacientů (po protinádorové léčbě) a u pacientů léčených imunosupresivy (transplantace orgánů, zejména transplantace kostní dřeně) a kortikosteroidy 7. Aspergillus je vzácně izolován z hemokultury. Diagnóza často vychází z nespecifického diagnostického nebo radiologického zobrazení (klinické symptomy, CT snímek, RTG hrudníku, atd.). V současné době se test na solubilní antigen galaktomanan v séru jeví jako sérologická metoda, která je schopna pomoci při diagnostice invazivní aspergilózy 6, 9, 14, 34, PRINCIP TESTU 27 Platelia Aspergillus EIA je jednostupňová imunoenzymatická sendvičová mikrodestičková metoda, která detekuje galaktomanan v lidském séru. Metoda využívá krysí monoklonální protilátky EBA-2 proti galaktomananu plísně Aspergillus, které byly popsány v předchozích studiích 16, 28. Tyto monoklonální protilátky se používají (1) k potažení jamek mikrotitrační destičky, navázání antigenu a (2) k detekci antigenu navázaného na senzibilizovanou mikrodestičku (aktivní složka konjugátu: peroxidázou vázané monoklonální protilátky). Vzorky séra jsou tepelně upraveny za přítomnosti EDTA za účelem disociace imunokomplexů a precipitace sérových proteinů, které by případně mohly interferovat s testem 15. Upravené vzorky séra a konjugát se přidají do jamek pokrytých monoklonálními protilátkami a inkubují. V přítomnosti galaktomananového antigenu se vytváří komplex monoklonální protilátka - galaktomanan - monoklonální protilátka / peroxidáza. Stripy se omyjí, aby se odstranil veškerý nenavázaný materiál. Poté se přidá roztok substrátu, který bude reagovat s komplexy navázanými na jamku za vzniku modře zbarvené reakce. Enzymatická reakce se zastaví přidáním kyseliny, která změní modrou barvu na žlutou. Optická absorbance vzorků a kontrol se určí pomocí spektrofotometru nastaveného na vlnovou délku 450 a 620 nm. 5 REAGENCIE Platelia Aspergillus: číslo produktu (96 testů) Sadu uchovávejte při teplotě 2-8 C. Před použitím nechte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu (18-25 C). Ihned po použití všechna činidla (s výjimkou kontrol) vraťte do teploty 2-8 C. Po rekonstituci je nutno veškerou nepoužitou negativní kontrolu, cut-off kontrolu a pozitivní kontrolu zmrazit na -20 C. Nepoužité stripy nebo destičky vraťte do obalu a obal uzavřete. Neodstraňujte desikant. Stripy se musí použít do 5 týdnů od otevření a opětovného uzavření obalu. Po naředění lze promývací roztok uchovávat po dobu 14 dní při teplotě 2-8 C. Všechny další činidla jsou po otevření stabilní až do ukončení doby použitelnosti. Činidla se dodávají v dostatečném množství na provedení 96 testů v maximálně 9 dávkách. 1

2 Složka Obsah Množství 1 destička / 12 x 8 jamek R1 Microwell Strip Plate R2 R3 R4 R5 Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Mikrotitrační destička: -96 jamek (12 stripů po 8 jamkách) potažených monoklonálními protilátkami proti galaktomananu Koncentrovaný promývací roztok (10X): -Tris NaCl pufr -1 % Tween 20-0,01 % thiomerosal Negativní kontrolní sérum: -Lyofilizované lidské sérum negativní na galaktomanan -Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátky a na HBs antigen Cut-off kontrolní sérum: - Lyofilizované lidské sérum obsahující galaktomanan -Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátky a na HBs antigen Pozitivní kontrolní sérum: -Lyofilizované lidské sérum obsahující galaktomanan -Negativní na anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátky a na HBs antigen R6 Conjugate Konjugát (hotový k použití): -Monoklonální protilátka proti galaktomananu značená peroxidázou -Konzervační činidlo: 0,01 % thiomerosal R7 R8 R9 Serum Treatment Solution TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution Ředící roztok pro úpravu séra (hotový k použití): -roztok EDTA bez TMB substrátový pufr (hotový k použití): -Roztok kyseliny citrónové a octanu sodného -0,009 % peroxid vodíku -4 % dimethylsulfoxid (DMSO) Chromogen TMB roztok (koncentrovaný): -90% roztok dimethylsulfoxidu (DMSO) obsahující 0,6 % tetramethylbenzidinu (TMB) Zastavovací roztok (hotový k použití): 1 x 100 ml 3 x dm* 1 ml 3 x dm* 1 ml 3 x dm* 1 ml 1 x 8 ml 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml R10 Stopping 1 x 12 ml Solution -1,5 N kyselina sírová (H 2 SO 4 ) Plate sealers -Adhezívní fólie na mikrotitrační destičky 1 x 8 listů Poznámka: TMB (tetramethylbenzidin) je nekarcinogenní a nemutagenní chromogen pro peroxidázu. *Poznámka: dm: Dostatečné množství 6 UPOZORNĚNÍ PRO UŽIVATELE 1. Určeno pro diagnostické použití in vitro. 2. Určeno pouze pro profesionální použití. 3. Použití tohoto testu s jinými vzorky než lidského séra není doporučeno. 4. Testy Positive Control, Cut-off Control a Negative Control jsou vyráběny z lidského séra, které na základě provedených testů s označením CE nereaguje na HBsAg a protilátky proti HIV-1, HIV-2 a HCV. Se všemi reagenciemi musí být zacházeno, jako kdyby byly schopny přenášet infekci. Všechny testy by měly být prováděny v souladu se standardy OSHA pro krví přenosné patogeny, biologické bezpečnosti úrovně 2 nebo jinými provozními předpisy s odpovídající biologickou bezpečností. 5. Používejte ochranné oblečení, včetně laboratorního pláště, ochrany zraku/obličeje a rukavic na jedno použití (doporučeny jsou syntetické rukavice neobsahující latex) a při zacházení s reagenciemi ze sady a se vzorky pacienta postupujte v souladu se správnou laboratorní praxí. Po provedení testu si důkladně umyjte ruce. 6. Nenasávejte obsah do pipety ústy. 7. Nekuřte, nepijte ani nejezte v prostorách, ve kterých se manipuluje se vzorky nebo reagenciemi ze sady. 8. Zabraňte potřísnění vzorky nebo roztoky. 9. Biologická potřísnění neobsahující kyselinu by měla být důkladně otřena účinným desinfekčním prostředkem. Desinfekční prostředky, které mohou být použity, zahrnují (ale nejsou omezeny na) 10% roztok chlorového vápna (0,5% roztok chlornanu sodného), 70% etanol nebo 0,5% Wescodyne Plus. Materiály použité pro otření potřísnění mohou vyžadovat likvidaci jako biologicky nebezpečný materiál. VÝSTRAHA: Roztoky obsahující chlorové vápno nedávejte do autoklávu. 2

3 10. Potřísnění obsahující kyselinu by měla být vhodným způsobem absorbována (vytřena) nebo neutralizována pomocí hydrouhličitanu sodného, a plocha opláchnuta a vytřena dosucha; pokud obsahoval biologicky nebezpečný materiál, otřete plochu některým z chemických desinfekčních prostředků. 11. Všechny vzorky a materiály použité pro provedení testů likvidujte, jako by obsahovaly infekční agens. Zacházet s a likvidovat laboratorní chemikálie a biologicky nebezpečný odpad musíte v souladu se všemi místními, regionálními a národními předpisy. 12. VÝSTRAHA: Následuje seznam potenciálně nebezpečných chemikálií, obsažených v některých složkách sad (viz část 5- REAGENCIE): 1,5 N kyselina sírová (7,2% H 2 SO 4 ) zastavovací roztok je korozivní, může způsobit popálení očí a kůže; může být škodlivý, pokud je spolknut. Nebo pokud přijde do styku s kůží; může způsobit závažné poškození zraku, včetně trvalého poškození vidění nebo oslepnutí. Držte mimo silné zásady a redukční činidla. C- Žíravý R34-41 Způsobuje popálení. Riziko závažného poškození zraku. S24/ /37/ Zabraňte kontaktu s kůží a zrakem. Pokud dojde ke kontaktu se zrakem, vyplachujte ihned velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Nikdy nepřidávejte vodu do tohoto přípravku. Používejte vhodné ochranné oblečení, rukavice a ochranu zraku/obličeje. Tento materiál a nádoba, ve které je obsažen, musí být likvidován jako nebezpečný odpad. Odpad vzniklý z tohoto materiálu je považován za nebezpečný kyselý odpad, ale pokud je místními, regionálními nebo národními předpisy povoleno, může být neutralizován na ph 6 9 a likvidován jako bezpečný odpad, pokud k tomu máte vybavení a odbornost. 0,01% thiomersal (merthiolát sodný), organická sloučenina rtuti je biocidní konzervační látka, která působí na centrální nervový systém (CNS), jedná se o reprodukčně toxickou látku a významný senzibilizátor; dlouhodobé nebo opakované působení může vyvolat alergickou reakci u některých citlivých jedinců; existuje značný počet případů alergizace způsobené působením zředěných roztoků thiomersalu. Zabraňte úniku do životního prostředí, nebezpečí kumulativního působení. Použitý roztok obsahující rtuť v koncentraci vyšší než 0,2 ppm musí být likvidován jako nebezpečný odpad (US Federal RCRA D009), v souladu s místními, regionálními a národními předpisy. (Poznámky: rtuť (Hg) tvoří až 49,55% molekuly thiomersalu, takže složka obsahující 0,01% thimersalu obsahuje ~ 0,005 objemových % (~ 50 ppm) rtuti). V případě, že dojde ke kontaktu s kůží, opláchněte ihned zasažené místo velkým množstvím vody. Upozornění: podle státu Kalifornie je thiomersal reprodukčně toxický. 13. Bezpečnostní list obdržíte na požádání. 7 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PRO UŽIVATELE 1. ZMRAZENÉ VZORKY SÉRA UCHOVÁVANÉ V NEZNÁMÝCH PODMÍNKÁCH MOHOU VYKAZOVAT FALEŠNĚ POZITIVNÍ VÝSLEDKY VZHLEDEM K MOŽNOSTI KONTAMINACE PLÍSNĚMI A/NEBO BAKTERIEMI. 2. Sadu nebo činidla v ní obsažené nepoužívejte po uplynutí vyznačené doby použitelnosti. 3. S výjimkou koncentrovaného promývacího roztoku (R2) a zastavovacího roztoku (R10) nemíchejte činidla z různých sad a různých čísel šarží. 4. Před použitím nechte všechna činidla temperovat na pokojovou teplotu na dobu nejméně 15 minut. 5. Reagencie při rekonstituci důkladně míchejte, přičemž dávejte pozor, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. 6. Neprovádějte test v prostředí s reaktivními výpary (výpary kyselin, zásad, aldehydů) nebo v prašném prostředí, které by mohlo změnit enzymoatickou aktivitu konjugátu. 7. Při přípravě substrát-chromogen reakčního roztoku použijte čisté, jednorázové polypropylénové plastové nádobky. Jestliže je nutné použít skleněné nádobí, nejdřív se musí umýt v 1N kyselině chlorovodíkové, opláchnout v destilované vodě a poté vysušit. 8. Při manuálním pipetování kontrol a vzorků používejte vždy nové pipetovací špičky, abyste zamezili kontaminaci vzorků. 9. Pro zajištění dostatečného promytí jamek dodržte doporučený počet promývacích cyklů a zajistěte, aby se všechny jamky zcela zaplnily a poté zcela vyprázdnily. Promývání se nesmí provádět manuálně pomocí laboratorní promývačky. 10. Nedovolte, aby mikrodestička vyschla v období mezi ukončením promývacího cyklu a přidáním činidel. 11. Nepoužívejte stejnou nádobku na konjugát a roztoky substrátu. 12. Nedovolte, aby konjugát nebo roztoky obsahující substrát-chromogen přišly do styku s kovy nebo ionty kovů. 13. Během uchovávání nebo inkubace zamezte expozici chromogenového nebo substrát-chromogen reakčního roztoku silnému světlu. Nedovolte, aby se roztoky chromogenu dostaly do styku s oxidačním činidlem. 3

4 14. Zamezte kontaktu zastavovacího roztoku s oxidačním činidlem. Nedovolte, aby se zastavovací roztok dostal do styku s kovy nebo ionty kovů. 15. Používejte čisté, bezprašné materiály (zkumavky, špičky, nádobky, atd.), aby se minimalizovala možnost kontaminace sporami Aspergillus z prostředí. Vzhledem k tomu, že galaktomanan je teplotně stabilní, sterilizace použitého materiálu nezaručuje absenci kontaminujícího antigenu. Apyrogenní materiály jsou optimální, ale při dodržení vhodných bezpečnostních opatření lze použít standardní materiály. 16. Omezte vystavení roztoků (sérum, ředící roztok, konjugát) nebo otevřené nádoby (destičky, zkumavky, pipety) působení vzduchu. 17. Nevyužitý konjugát nevracejte do originální lahvičky. 18. Substrát-chromogen reakční roztok musí být bezbarvý. Objevení modrého zabarvení po zředění znamená, že roztok je kontaminovaný a nesmí se použít. Roztok zlikvidujte a připravte čerstvý. 8 PŘÍPRAVA ČINIDEL A UCHOVÁVÁNÍ Destička mikrotitračních stripů (R1) Po otevření obalu s destičkou jsou mikrotitrační stripy stabilní po dobu 5 týdnů, pokud se uchovávají v pečlivě uzavřeném originálním obalu při teplotě +2-8 C za přítomnosti přibaleného desikantu. Promývací roztok (R2) Připravte potřebný pracovní promývací roztok smícháním jednoho dílu koncentrovaného promývacího roztoku s 9 díly sterilní deionizované nebo destilované vody. Pracovní promývací roztok lze uchovávat po dobu 14 dní při teplotě +2-8 C. Připravte dostatečné množství pracovního promývacího roztoku pro dokončení daného cyklu (80 ml pro jeden strip: 8 ml R ml destilované vody). Po otevření je koncentrovaný promývací roztok stabilní do data exspirace vyznačené na štítku, pokud se uchovává při teplotě C. Negativní kontrolní sérum (R3) Obsah jedné lahvičky s kontrolou rozpusťte v 1000 µl (1 ml) sterilní purifikované vody (pokud možno apyrogenní vody). Sérum musí být rehydratováno těsně před provedením testu. Po 2-3 minutách potřebných pro rehydrataci sérum důkladně zamíchejte. Rozdělte 300 µl do každé ze 3 polypropylenových mikrocentrifugačních zkumavek. Veškeré zbylé polypropylenové centrifugační zkumavky, které se nepoužijí po rehydrataci, okamžitě zmrazte při teplotě -20 C. Poznámka: Kontrolní séra, která byly dříve rehydratována a okamžitě zmražena při teplotě -20 C, se mohou rozmrazit a použít bez další rehydratace. Zmražené rehydratované kontroly lze uchovávat po dobu 5 týdnů při teplotě -20 C. S kontrolními séry zacházejte stejným způsobem jako se vzorky od pacientů (300 µl séra µl ředícího roztoku, atd...). Cut-off kontrolní sérum (R4) a pozitivní kontrolní sérum (R5) Připravte stejným způsobem, jak bylo popsáno výše pro negativní kontrolní sérum. Substrát-chromogen reakční roztok (R8 + R9) Připravte substrát-chromogen reakční roztok přidáním jednoho dílu koncentrovaného roztoku TMB chromogen (R9) do 50 dílů substrátového pufru TMB (R8). Pro každý strip připravte 2 ml reakčního roztoku substrátchromogen: 40 µl R9 + 2 ml R8. Roztok je stabilní po dobu 6 hodin, pokud je uchováván v temnu při pokojové teplotě ( C). Po otevření jsou činidla R8 a R9 stabilní do data exspirace vyznačené na štítku, pokud se uchovávají při teplotě C za nepřítomnosti kontaminace. Konjugát (R6), roztok pro úpravu séra (R7) a zastavovací roztok (R10) Po otevření jsou činidla R6, R7 a R10 stabilní do data expirace vyznačené na štítku, pokud se uchovávají při teplotě C za nepřítomnosti kontaminace. 9 ODBĚR VZORKŮ Odeberte krevní vzorky v souladu se standardními laboratorními postupy. Test se provede na séru. Vzorky séra nesmí být kontaminovány sporami plísní a/nebo bakteriemi. Vzorky převážejte a uchovávejte v utěsněných zkumavkách bez přístupu vzduchu. Neotevřené vzorky lze před testováním uchovávat po dobu 5 dní při teplotě +2-8 C. Po prvním otevření lze vzorky před testováním uchovávat po dobu 48 hodin při teplotě +2-8 C. Pro delší uchovávání, skladujte sérum za teploty -70 C. 4

5 Vzorky séra lze podrobit maximálně 4 cyklům zmražení/rozmražení. Dříve zmražené vzorky je nutno po rozmrazení a před testováním důkladně promíchat. Výsledky nejsou ovlivněny vzorky obsahujícími 20 mg/l bilirubinu, lipemickými vzorky obsahujícími ekvivalentní množství 2g/l trioleinu (triglyceridu) nebo hemolyzovanými vzorky obsahujícími 165 mg/l hemoglobinu. Interference vzhledem k nadbytku albuminu nebyly testovány. U sér neprovádějte inaktivaci komplementu. 10 POSTUP Dodávaný materiál Viz kapitola REAGENCIE. Potřebný materiál, který není součástí dodávky 1. Sterilní destilovaná nebo deionizovaná voda pro zředění promývacího roztoku. 2. Sterilní purifikovaná voda pro rekonstituci kontrolního séra. 3. Absorpční papír. 4. Rukavice na jednorázové použití. 5. Ochranné brýle. 6. Chlornan sodný (bělidlo) a hydrogenuhličitan sodný. 7. Pipety nebo multipipety, nastavitelné nebo s pevným nastavením dávkováním k odměřování a pipetování objemů 50 µl, 100 µl, 300 µl a 1000 µl. 8. 1,5ml polypropylenové mikrocentrifugační zkumavky se vzduchotěsnými zátkami, které snesou ohřev až na 120 C (topný blok) nebo 100 C (lázeň s vařící vodou). a. Zkumavky se šroubovým uzávěrem: 1,5 ml kónické zkumavky, Bio-Rad kat. č nebo ekvivalentní. b. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem: Mikrozkumavky EZ, 1,5 ml, Bio-Rad kat. č nebo ekvivalentní. 9. Aretační uzávěry zkumavek (VWR kat. č nebo ekvivalentní). Tyto aretační systémy bezpečně uzavřou zkumavky s nasazovacím uzávěrem a zabrání otevření během teplotních a tlakových změn, a také umožní jejich snadné vytažení z elektrického ohřívače bloku nebo lázně z vařící vodou. 10. Laboratorní centrifuga až na g pro polypropylenové zkumavky 1,5 ml 11. Kulatý, plovoucí stojánek na mikrocentrifugační zkumavky do 1L kádinky. 12. Vortex mixér. 13. Tepelný blok. Doporučeny jsou následující modely tepelných bloků: a. 1 model bloku: Grant kat. č. QBD1 (VWR Kat. č ) b. 2 model bloku: Grant kat. č. QBD2 (VWR Kat. č ) 14. Blok pro tepelný blok: oba tepelné bloky musí být použity s blokem Grant, kat. č. QB-E1 (VWR Kat. č ). 15. Lázeň s vařící vodou 100 C. 16. Inkubátor pro mikrotitrační destičky na teplotu 37 ± 1 C. 17. Poloautomatická nebo automatická promývačka mikrodestiček. 18. Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky vybavený filtry 450 nm a 620 nm. Poznámky k postupu Pro validaci výsledků testu je nutno testovat u každého cyklu negativní, pozitivní a cut-off kontroly. Zpracování séra Všechny kontrolní séra: negativní (R3), cut-off (R4) a pozitivní (R5) se musí zpracovat ve stejné době jako testované vzorky: 1. Napipetujte 300 µl každého testovaného séra a kontroly do jednotlivých 1,5 ml polypropylenových zkumavek. 2. Do každé zkumavky přidejte 100 µl roztoku pro úpravu séra (R7). 3. Zkumavky důkladně promíchejte intenzivním mícháním nebo vortexovým míchadlem. Zkumavku těsně uzavřete, aby se během ohřevu neotevřela. U zkumavek s nasazovacím uzávěrem: použijte aretaci víčka. Zátku nepropichujte. 4. Varianta s topným blokem: Zkumavky zahřívejte v tepelném bloku po dobu 6 minut při teplotě 120 o C. Zkumavky je nutné vložit do bloku pouze po dosažení předepsané teploty (*). NEBO Varianta s vodní lázní: Pokud používáte lázeň s vařící vodou: zkumavky zahřívejte po dobu 3 minut při teplotě 100 C(*). 5

6 5. Horké zkumavky opatrně vyjměte z tepelného bloku nebo vařící vody a umístěte do centrifugy. Odstřeďujte při g po dobu 10 minut. 6. Supernatant se používá k detekci antigenu galaktomananu. 7. Otestujte supernatanty podle následujícího postupu. Po přípravě lze supernatant vyjmout a před testováním uchovávat po dobu 48 hodin při teplotě +2-8 C. Pokud analýza výsledků naznačuje, že je nutné test opakovat, je třeba připravit další alikvoty séra pro testování. (*) Pro úspěšnost testu je třeba striktně dodržet předepsanou teplotu, předepsanou dobu reakce stejně jako doporučené materiály. Nespoléhejte se na teplotu zobrazenou na přístroji, zkontrolujte, zda teplota odpovídá specifikacím použitím zkalibrovaného teploměru, který se vloží do zkumavky obsahující minerální olej: Teplota uvnitř zkumavky v tepelném bloku musí dosáhnout 120 C, resp. 100 C v lázni s vařící vodou. EIA postup Důsledně dodržujte připravený protokol. Dodržujte správnou laboratorní praxi. 1. Před použitím nechte všechna činidla vytemperovat na pokojovou teplotu ( C) na dobu nejméně 15 minut. 2. Připravte promývací roztok, substrát-chromogen reakční roztok, negativní, pozitivní a cut-off kontroly. 3. Připravte identifikační plán pro testované séra a kontroly v mikrotitrační destičce. Jednu jamku použijte pro negativní kontrolní sérum (R3), dvě jamky pro cut-off kontrolní sérum (R4) a jednu jamku pro pozitivní kontrolní sérum (R5). 4. Z obalu na destičky vyjměte rámeček a mikrotitrační stripy (R1). Stripy, které nepoužijete, vraťte do obalu s desikantem a obal uzavřete. 5. Před použitím homogenizujte obsah lahvičky s konjugátem (R6) obrácením. Do každé jamky napipetujte 50 µl konjugátu (R6). Poté do každé jamky napipetujte 50 µl sérového supernatantu upraveného podle postupu popsaného výše. Vzorky séra nepřidávejte do jamek před konjugátem. 6. Destičku přikryjte adhezívní fólií nebo jiným prostředkem, aby se zamezilo odpaření, přičemž zajistěte, aby byl zakrytý celý povrch a byl vodotěsný. 7. Mikrodestičku inkubujte v suchém inkubátoru mikrodestiček po dobu 90 ± 5 minut při teplotě 37 C (± 1 C). 8. Odstraňte přilnavou fólii. Obsah všech jamek odsajte do nádoby na odpad (obsahující chlornan sodný). Destičku 5 x promyjte za použití minimálně 370 µl pracovního promývacího roztoku. Po posledním promytí mikrotitrační destičku obraťte a odstraňte zbylou tekutinu opatrným poklepáním na absorpční papír. 9. Do každé jamky rychle napipetujte 200 µl reakčního roztoku substrát-chromogen (R8 + R9) mimo dosah přímého světla. 10. Mikrotitrační destičku inkubujte v temnu po dobu 30 ± 5 minut při pokojové teplotě ( C). Během tohoto kroku inkubace nepoužívejte adhezívní fólii. 11. Do každé jamky napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku (R10). Dodržujte stejné pořadí, které bylo použito pro přidání substrátového roztoku. Pečlivě promíchejte. 12. Dno každé destičky důkladně otřete. 13. Změřte optickou denzitu každé jamky při 450 nm (referenční filtr 620 nm). Mikrotitrační destičky je nutno odečíst do 30 minut po přidání zastavovacího roztoku. 11 KONTROLA KVALITY (VALIDAČNÍ KRITÉRIA) Cut-off kontrola: OD (optická denzita) každého cut-off kontrolního séra musí být 0,300 a 0,800 Pozitivní kontrola: Index pozitivního kontrolního séra musí být větší než 2,00. OD pozitivní kontrola (R5) I = > 2,00 Průměrná OD cut-off kontroly Negativní kontrola: Index negativního kontrolního séra musí být menší než 0,40. OD negativní kontrola (R3) I = < 0,400 Průměrná OD cut-off kontroly Jestliže kterákoli z kontrol nesplňuje validační kritéria popsaná výše, analýza je neplatná a výsledky vzorků pacientů se nesmí vydat. Laborant se může po vyhodnocení postupu rozhodnout, zda se analýza provede znovu nebo může požádat o pomoc výrobce. Jestliže se provede opakovaná analýza, musí se při této analýze použít nový alikvot stejného vzorku. 6

7 Příklad výpočtu: Vzorek Absorbance (OD) OD negativní kontroly (R3) 0,117 OD cut-off kontroly (R4) 0,596 0,576 OD pozitivní kontroly (R5) 2,602 Výpočty Průměrná hodnota cut-off kontroly Při výpočtu průměrné hodnoty OD cut-off kontroly (R4) sečtěte hodnoty OD pro každou replikaci cut-off kontroly a výsledek vydělte 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Index negativní kontroly Při výpočtu indexu negativní kontroly vydělte OD negativní kontroly průměrnou hodnotou OD cut-off kontroly: 0,117 I = = 0,20 0,586 Index pozitivní kontroly Při výpočtu indexu pozitivní kontroly vydělte OD pozitivní kontroly průměrnou hodnotou OD cut-off kontroly: 2,602 I = = 4,44 0,586 Platnost Ve výše uvedeném příkladě: Každá OD cut-off kontroly, která je 0,300 a 0,800 znamená, že cut-off kontrola je platná. Index negativní kontroly < 0,40 znamená, že negativní kontrola je platná. Index pozitivní kontroly > 2,00 znamená, že pozitivní kontrola je platná. Testovací cyklus je v tomto příkladě považován za platný, protože výsledky splňují validační kritéria pro každou kontrolu. 12 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Přítomnost nebo nepřítomnost antigenu galaktomananu v testovacím vzorku se určí výpočtem indexu pro každý vzorek pacienta. Index (I) je hodnota OD vzorku vydělená průměrnou optickou denzitou jamek obsahujících cutoff kontrolní sérum. Výpočet průměrné optické denzity cut-off kontroly: Sečtěte hodnoty optických denzit obou jamek obsahujících cut-off kontrolní sérum (R4) a celkovou hodnotu vydělte 2. Výpočet indexu (I) pro každé testovací sérum: Vypočítejte následující poměr pro každé testovací sérum: I = OD vzorku Průměrná OD cut-off kontroly Séra s indexem < 0,50 jsou považována za negativní na přítomnost antigenu galaktomananu. Poznámka: Negativní výsledek může znamenat, že výsledek testu pacienta leží pod detekovatelnou hladinou analýzy. Poznámka: Negativní výsledky nevylučují diagnózu invazivní aspergilózy. Jestliže je výsledek negativní, ale existuje podezření na onemocnění, doporučujeme test opakovat. Séra s indexem 0,50 jsou považována za pozitivní na přítomnost antigenu galaktomananu. U všech pozitivních pacientů je doporučeno, aby test byl zopakován s novým dílem stejného vzorku a také byl pacientovi odebrán nový vzorek pro následné testování. Poznámka: hodnota absorbance nižší než 0,000 může znamenat, že došlo k procesní nebo přístrojové chybě, která by měla být vyhodnocena. Takovýto výsledek je neplatný a testování vzorku musí být zopakováno. Pro zvýšení citlivosti a dosažení časné pozitivity testu je doporučeno provádět pravidelný screening (dvakrát týdně) vysoce rizikových pacientů. Poznámka: imunologický test Platelia Aspergillus EIA je určen jako pomůcka pro diagnostikování invazivní aspergilózy. Pozitivní výsledky získané pomocí imunologického testu Platelia Aspergillus musí být posuzovány v souvislosti s jinými diagnostickými postupy, jako je mikrobiologická kultivace, histologické vyšetření bioptických vzorků a rentgenové snímky. 7

8 Příklad výpočtu: Vzorek Absorbance (OD) OD negativní kontroly (R3) 0,117 OD cut-off kontroly (R4) 0,596 0,576 OD pozitivní kontroly (R5) 2,602 Vzorek pacienta č. 1 0,134 Vzorek pacienta č. 2 0,436 Vzorek pacienta č. 3 1,196 Výpočty Příklad výpočtů pro určení validity kontrol analýzy naleznete v části Kontrola kvality (validační kritéria). Průměrná hodnota cut-off kontroly Při výpočtu průměrné hodnoty OD cut-off kontroly (R4) sečtěte hodnoty OD obou nanesených cut-off kontrol a výsledek vydělte 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Vzorek pacienta č. 1 Při výpočtu indexu vzorku pacienta č. 1 vydělte hodnotu OD vzorku pacienta č. 1 průměrnou hodnotou OD cut-off kontroly: 0,134 I = = 0,23 0,586 V tomto příkladě je vzorek pacienta č. 1 negativní, protože hodnota indexu je 0,23, t.j. < 0,50. Vzorek pacienta č. 2 Při výpočtu indexu vzorku pacienta č. 2 vydělte OD vzorku pacienta č. 2 průměrnou hodnotou OD cut-off kontroly: 0,436 I = = 0,74 0,586 V tomto příkladě je vzorek pacienta č. 2 pozitivní, protože hodnota indexu je 0,74, t.j. 0,50. Vzorek pacienta č. 3 Při výpočtu indexu vzorku pacienta č. 3 vydělte OD vzorku pacienta č. 3 průměrnou hodnotou OD cut-off kontroly: 1,196 I = = 2,04 0,586 V tomto příkladě je vzorek pacienta č. 3 pozitivní, protože hodnota indexu je 2,04, t.j. 0, LIMIT POUŽITELNOSTI 1. Negativní test nemůže vyloučit diagnózu invazivní aspergilózy. Pacienti s rizikem invazivní aspergilózy se musí testovat dvakrát za týden. 2. Při testování vzorků na přítomnost antigenu galaktomananu je třeba dodržet postup pro Platelia Aspergillus a pro interpretaci výsledků. Doporučuje se, aby si uživatel tohoto kitu před vlastním provedením testu pečlivě přečetl příbalový leták. Obzvláště musí být dodržen postup pro pipetování vzorku a činidla, promývání destiček a časové rozvržení inkubačních kroků. 3. Pokud se vzorek nebo činidlo nenadávkuje podle předpisu, výsledkem může být falešně negativní výsledek. O opakovaném testování dalších vzorků je třeba uvažovat, pokud existuje klinické podezření na invazivní aspergilózu nebo procedurální chybu. 4. Ke kontaminaci jamek s negativním vzorkem pacienta jamkami pozitivní kontroly/vzorkem pacienta může dojít tehdy, jestliže se obsah jedné jamky přelije do druhé jamky při nešetrném zacházení s mikrotitrační destičkou nebo kvůli špatné technice pipetování při přidávání činidel. 5. Účinnost testu Platelia Aspergillus EIA nebyla vyhodnocována u vzorků sér novorozenců a dětských pacientů. 6. Detekce galaktomananu testem Platelia Aspergillus EIA může být snížena u pacientů s chronickým granulomatózním onemocněním (CGD) a Jobovým syndromem 36, Současné použití antifungální terapie může u některých pacientů s invazivní aspergilózou vést ke snížené citlivosti u testu Platelia Aspergillus EIA Kit Platelia Aspergillus EIA nebyl evaluován pro testování vzorku plasmy nebo jiných typů vzorků, jako je moč, BAL nebo CSF. 9. Účinnost Platelia Aspergillus EIA nebyla stanovena pro manuální odečítání a/nebo vizuální stanovení výsledků. 10. Ostatní rody plísní, jako jsou Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum a Histoplasma, reagovaly u krysy s monoklonálními protilátkami EBA-2, použitými při pokusu o zjištění Aspergillus galactomannan. Histoplasmosis by měla být uvažována v endemických oblastech, včetně částí Spojených států amerických 23, 32, 38. 8

9 11. Pozitivní reakce bez klinických známek: Vzhledem k časné detekci antigenu galaktomananu v séru i před projevy klinických a /nebo radiologických příznaků jsou často pozorovány pozitivní reakce bez klinických příznaků: odpovídají "hodnověrně pozitivním" testům u pacientů, u kterých byla později prokázaná nebo pravděpodobně prokázaná invazivní aspergilóza. V některých zvláštních případech při interpretaci testu však musí být vzaty v úvahu některé faktory: a. Byly popsány pozitivní reakce bez klinických příznaků, zejména u malých dětí 26. Ačkoliv některé z těchto případů mohou být vztaženy ke skutečné cirkulaci aspergilových antigenů 5, většina případů může být považována za falešné pozitivity. b. Galaktofuranosy byly prokázány v různých potravinách, zejména v obilninách, obilních produktech a krémových dezertech 1,17. Na rozdíl od lidského mléka, mléko pro lidskou výživu často obsahuje vysoké koncentrace galaktomananu 10. Při interpretaci průběhu antigenaemie u malých dětí a ještě častěji u pacientů s alterovanou intestinální bariérou musí být tudíž brán v úvahu dietní faktor 4, 10. Jakýkoliv případ pozitivní antigenaemie, který není provázen klinickými příznaky, by měl být v této populaci pacientů interpretován ještě více opatrně 17. c. Byly popsány pozitivní výsledky na galaktomanan u pacientů, kteří užívali piperacilin / tazobactam. Raovněž byly publikovány některé várky nebo šarže piperacilinu / tazobactamu, které byly shledány pozitivními na antigen galaktomananu. Pozitivní výsledky u pacientů, užívajících piperacilin / tazobactam, se proto musí interpretovat opatrně a musí být potvrzeny jinými diagnostickými metodami. Byla též publikována detekce galaktomananu v některých šaržích amoxicilinu v kombinaci s kyselinou klavulanovou pro parenterální aplikaci Při interpretaci výsledků je tudíž nutno vzít do úvahy léčbu semisyntetickými β-laktaminy 1,21 Jelikož Platelia Aspergillus EIA může dobře detekovat antigen galaktomananu i před projevy klinických nebo radiologických příznaků, přítomnost invasivní aspergillózy nemůže být vyloučena. Z tohoto důvodu je třeba pacienty, kteří užívají piperacilin / tazobactam a mají pozitivní výsledky, pečlivě sledovat. d. U pacientů, kterým jsou parenterálně nebo orálně podávány přípravky obsahující galaktomannan, se mohou vyskytovat pozitivní reakce bez klinických příznaků (v přítomnosti změny intestinální bariéry). Přítomnost galaktomannanu v těchto přípravcích je možné vysvětlit použitím fermentačního procesu založeného na použití mykotických mikroorganismů. Pozitivní výsledky se ale u pacienta nevyskytnou, pokud sérová koncentrace exogenního galaktomannanu nedosáhne nebo nepřekročí hodnotu mezní citlivosti testu. Pokud je tedy zjištěn podezřelý pozitivní výsledek při současné absenci jiných příznaků, doporučujeme prozkoumat přípravky, které pacient bere a především jejich výrobní postupy a původ použitých surovin 11, 24, OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY Předpokládaná prevalence invazivní aspergilózy se mění podle populace pacientů, byla publikována míra prevalence 5-20% 7, 13. Ve dvou evropských testovacích centrech byla provedena klinická studie ke zjištění funkčních charakteristik testu Platelia Aspergillus EIA na celkovém počtu 4873 vzorků séra od 239 epizod (203 pacientů) s hematologickou malignitou nebo transplantací hematopoetických kmenových buněk diagnostifikovaných s a bez invazivní aspergilózy. Jelikož pacient mohl být zahrnut do studie ve více než jednou, analýza se provedla na základě jednotlivých epizod léčby. Za epizodu je považováno časové období kolem klinické události (např. transplantace, GVHD atd.). V důsledku toho mohla být u jednoho pacienta pozorována více než jedna epizoda. Průměrná míra prevalence u této studie byla 16% (38/239). Distribuce hodnot indexu u těchto populací je vyjádřena následujícími grafy. 9

10 Pacienti bez diagnózy invazivní aspergilózy (kontrolní populace) Ve dvou evropských testovacích centrech bylo pomocí testu Platelia Aspergillus EIA otestováno celkem 3691 vzorků séra získaných od 201 epizod (168 pacientů) Distribuce hodnot indexu je zobrazena v následujícím grafu. Distribuce hodnot sérového indexu u kontrolní populace pacientů N=3691 Počet sér Index >1.5 Tento bodový graf zobrazuje výsledky analýzy galaktomananu u 3691 vzorků séra od 201 epizod (168 kontrolních pacientů) v této studii (pacienti podstupující imunosupresivní terapii pro HSCT nebo pro léčbu hematologické malignity). KONTROLNÍ POPULACE: DISTRIBUCE INDEXŮ/EPIZOD (N=201 epizod u 168 pacientů) 2 1,5 Index 1 0, Počet epizod 10

11 Pacienti s diagnózou invazivní aspergilózy Tento bodový graf zobrazuje výsledky analýzy galaktomananu u 1182 vzorků séra od 38 epizod (35 pacientů) v této studii s diagnózou prokázané nebo pravděpodobné invazivní aspergilózy tak, jak je definováno definicemi EORTC/NIAID. Neočekává se, že je pozitivní každý vzorek séra od každého pacienta. Očekávaná prevalence invazivní aspergilózy se mění podle populace pacientů; byla publikována míra prevalence 5-20% 7, 13. Míra prevalence pro tuto studii byla 16%. Následující grafy představují příklady pacienta bez klinických příznaků nebo symptomů invazivní aspergilózy (negativní pro Aspergillus), a pacienta s prokázanou invazivní aspergilózou (pozitivní na Aspergillus). PROKÁZANÁ/PRAVDĚPODOBNÁ INVAZIVNÍ ASPERGILÓZA: DISTRIBUCE INDEXŮ/EPIZOD (N=38 epizod od 35 pacientů) Index 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0, Počet epizod Cut-off 0.5 Negativní pacient: KONTROLNÍ PACIENT index 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, dny 11

12 Pozitivní pacient index 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 PACIENT S PROKÁZANOU INVAZIVNÍ ASPERGILÓZOU dny 15 SPECIFICKÉ CHARAKTERISTIKY ÚČINNOSTI A Studie reprodukovatelnosti Variabilita opakovatelnosti a reprodukovatelnosti pro Platelia Aspergillus EIA byla stanovena ve studii využívající panel 6 shromážděných vzorků sér pacientů (jeden negativní, jeden slabě pozitivní, dva pozitivní a dva vysoce pozitivní) získaných na třech klinických pracovištích v Severní Americe. Každý z 6 vzorků panelu byl testován třikrát (x3) ve třech různých dnech s jednou šarží na dvou pracovištích (celkový počet replikátů na každém pracovišti = 9). Každý z 6 vzorků panelu byl testován dvakrát (x2) ve třech různých dnech s jednou šarží na třetím pracovišti (celkový počet replikátů na třetím pracovišti = 6). Jeden (1) laborant provedl veškerá přesná testování na každém pracovišti. Údaje byly analyzovány podle National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Průměrná optická denzita (OD) a průměrná hodnota indexu, směrodatná odchylka (SD), procentní variační koeficient (%CV), opakovatelnost a reprodukovatelnost pro každý vzorek z panelu jsou uvedeny v následujících tabulkách. N/A není aplikováno / 1 NCCLS EP5-A, Sv. 19, č. 2, str. 24, rovnice (C2) ²NCCLS EP5-A, Sv. 19, č. 2, str. 24, rovnice (C3) a rovnice (C4 12

13 B Zkřížená reaktivita Byla provedena studie pro posouzení efektů potenciálních interferujících klinických podmínek nesouvisejících s invazivní aspergilózou s jednou šarží sady Platelia Aspergillus EIA. Pomocí testu Platelia Aspergillus EIA byly otestovány následující vzorky séra na zkříženou reaktivitu. Bylo otestováno celkem 151 vzorků séra. Patologie Počet testovaných vzorků Počet pozitivních vzorků Revmatoidní faktor 10 0 ANA pozitivní 10 0 IgG hypergammaglobulinemie 10 0 IgM hypergammaglobulinemie 10 0 Rakovina * 11 0 Nevirová cirhóza (primární biliární; vyvolaná alkoholem; vyvolaná léky) 10 0 Vícenásobné transfuze 10 0 Ženy vícerodičky 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Rubeola 10 0 CMV 10 0 Syfilis (RPR+) 10 0 Toxoplazmóza 10 0 Mykoplazma 10 0 * Rakovina žlučníku, prsu (2), tračníku, endometriu, plíci, prostaty, ledviny a epitelu (3). C Klinické testování Klinické testování k vyhodnocení senzitivity, specificity a prediktivní hodnoty Platelia Aspergillus bylo provedeno na dvou pracovištích v Belgii a Nizozemí. Studie byla provedena retrospektivně použitím celkem 4873 vzorků sér odebraných od následující populace 203 pacientů *: pacienti bez známek invazivní aspergilózy (kontrolní pacienti) pacienti s pravděpodobnou invazivní aspergilózou pacienti s prokázanou invazivní aspergilózou * Kooperační skupina pro invazivní plísňové infekce (Invasive Fungal Infection Cooperative Group - IFICG) Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny (European Organization for Research and Treatment of Cancer - EORTC) a Skupina pro studie mykóz (Mycosis Study Group MSG) národního institutu alergických a infekčních nemocí (National Institute of Allergy and Infectious Diseases - NIAID) definovala kritéria pro diagnózu invazivní aspergilózy (IA) u pacientů s hematologickou malignitou nebo transplantací hematopoetických kmenových buněk 2. Prokázaná invazivní aspergilóza je definována pozitivní mikrobiologickou kultivací získanou sterilním odběrem z postiženého místa a histopatologickým nálezem příslušných morfologických forem u hostitele se symptomy odpovídajícími plísňové infekci. Pravděpodobná invazivní aspergilóza je definována jako nejméně jedno mikrobiologické kritérium a jedno hlavní nebo dvě vedlejší klinická kritéria z místa spojeného s infekcí u hostitele se symptomy odpovídajícími plísňové infekci. Možná invazivní aspergilóza je definována jako nejméně jedno mikrobiologické kritérium nebo jedno hlavní nebo dvě vedlejší klinická kritéria z místa spojeného s infekcí u hostitele se symptomy odpovídajícími plísňové infekci. Vzhledem k relativně vzácnému výskytu pravděpodobné a prokázané invazivní aspergilózy, nabízíme následující definici klinické senzitivity a specificity pro účely této studie. SENZITIVITA Výsledky této studie byly analyzovány z hlediska senzitivity pacienta. Testování sensitivity bylo prováděno pomocí kitu Platelia Aspergillus na dvou pracovištích u kombinovaných 38 epizod od 35 pacientů s transplantací kostní dřeně (BMT) a leukémií s diagnózou prokázané nebo pravděpodobné invazivní aspergilózy. 1. Prokázaná aspergilóza (jak jí definuje IFICG / EORTC; viz výše) Kombinovaná místa N = 19 epizod od 16 pacientů Senzitivita: 100% (19/19). Poznámka: 95% interval spolehlivosti nemohl být vypočítán vzhledem k nedostatečnému množství vzorků. 13

14 2. Pravděpodobná aspergilóza (jak jí definuje IFICG / EORTC; viz výše) Kombinovaná místa N = 19 epizod od 19 pacientů Senzitivita: 94,7% (18/19). Poznámka: 95% interval spolehlivosti nemohl být vypočítán vzhledem k nedostatečnému množství vzorků. 3. Kombinovaná prokázaná a pravděpodobná aspergilóza (jak jí definuje IFICG / EORTC; viz výše) Kombinovaná místa N = 38 epizod od 35 pacientů Senzitivita: 97,4% (37/38). 95% interval spolehlivosti je 86,2 99,9 %. SPECIFICITA Testování specifity bylo prováděno pomocí kitu Platelia Aspergillus na dvou pracovištích u kombinovaných 3691 vzorků získaných z 201 epizod (168 pacientů) bez známek invazivní aspergilózy (kontrolní pacienti). Místo 1: N = 3060 vzorků ze 103 epizod (70 pacientů) Specificita: 92,2% (95/103). 95% interval spolehlivosti je 85,3 96,6 %. Místo 2: N = 631 vzorků z 98 epizod (98 pacientů) Specificita: 88,8% (87/98). 95% interval spolehlivosti je 80,8 94,3 %. Kombinovaná místa N = 3691 vzorků od 201 epizod (168 pacientů) Specificita: 90,5% (182/201). 95% interval spolehlivosti je 85,6 94,2 %. PREDIKTIVNÍ HODNOTA Pozitivní a negativní prediktivní hodnoty (PPV, NPV) byly analyzovány u populace pacientů v této studii na základě skutečné průměrné míry prevalence 16% zjištěné v této studii. PPV: 66,1 % (37/56) NPV: 99,4 % (182/183) Byla rovněž provedena analýza beroucí do úvahy pozitivní výsledky, když 2 po sobě jdoucí vzorky měly index vyšší nebo rovný 0,5. Účinnost je shrnuta v následující tabulce: Senzitivita* Specificita PPV NPV Kombinovaná místa posuzující 1 vzorek 0,5 97,4% (37/38) 90,5% (182/201) 66,1% (37/56) 99,4% (182/183) Kombinovaná místa posuzující 2 po sobě jdoucí vzorky 0,5 92,1% (35/38) 97,5% (196/201) 87,5% (35/40) *: Sensitivita byla vypočítaná u prokázané a pravděpodobné invazivní aspergilózy 98,5% (196/199) 16 KONTROLA JAKOSTI VÝROBCE Všechna vyráběná činidla jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje příjmem surovin, konče komerčním využitím produktu. Každá šarže je podrobená kontrole jakosti a je uvolněná pro trh pouze tehdy, když splňuje předem definovaná akceptační kritéria. Bio-Rad uchovává záznamy spojené s výrobou a kontrolou každé jednotlivé šarže. 17 LITERATURA 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p

15 4. Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis Invasive aspergillosis. Medical Mycology 38: p Erjavec, Z. and P. E. Verweij Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus : antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p Nareddy, S., P. H. Chandrasekar False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer Intravenous PLASMA-LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p

16 25. Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude False positive results in premature infants with the Platelia Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41 : p Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p Surmont,I., W. Stockman Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of falsepositive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p Verweij, P. E. and J. F. Meis Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl.Infect.Dis. 2: p Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p Yeo, S. F. and B. Wong Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /