PŘENOS KYSLÍKU V BIOTECHNOLOGII. Úvod. Limitace metabolismu kyslíkem

Transkript

1 PŘENOS KYSLÍKU V BIOTECHNOLOGII Při aerobních procesech katalyzovaných buňkami nebo enzymy je nutné zabezpečit dostatečný přívod kyslíku do fermentačního média reaktoru (fermentoru). U některých organismů i krátkodobá limitace metabolismu kyslíkem může způsobit nevratné změny v respiračním systému. Vždy dochází ke snížení rychlosti růstu a tvorby produktů. Limitace kyslíkem má proto negativní nejen biochemické, ale i ekonomické dopady. Požadovaná koncentrace kyslíku v růstovém nebo produkčním médiu se dosahuje vhodným vzdušněním a mícháním. Ukazatel účinnosti systému vzdušnění a míchání je jedním z nejdůležitějších parametrů fermentačního zařízení. Jeho určení a další využití v biochemii je náplní této práce. Úvod Limitace metabolismu kyslíkem Důvody limitace respirace a růstu buněk kyslíkem (analogicky u enzymů) vyplývají z následujících vztahů. Při aplikaci kinetiky Michaelise a Mentenové platí: Q O2 = Q O2, m c/(k m + c) (1) Q O2 specifická rychlost spotřeby kyslíku (Q O2,m je maximální hodnota) K m Michaelisova konstanta pro kyslík (v případě celých buněk jde o zdánlivou hodnotu) c koncentrace kyslíku v kapalném médiu Podle Monodova vztahu pro podmínky růstu mikroorganismů platí: = m c/(k S + c) (2) specifická růstová rychlost ( m je maximální hodnota) K S saturační konstanta pro kyslík Byly pozorovány i odchylky od těchto kinetik. Vliv koncentrace kyslíku na metabolismus růstových kultur mikroorganismů souvisí dále se vztahem rychlosti respirace a růstu mikroorganismů: Q = (1/Y X/O ) (dx/dt) + m O2 X (3) po zanedbání m O2 a úpravě (dx/dt = X): Q O2 = /Y X/O (4) Q celková rychlost spotřeby kyslíku Y X/O výtěžek biomasy na kyslík X koncentrace biomasy t čas

2 2 m O2 specifická rychlost spotřeby kyslíku související s procesy nespojenými s růstem (udržovací koeficient) Ze vztahů (3) a (4) lze experimentálně určit Y X/O, případně m O2. Uvedené vztahy demonstrují úzkou souvislost mezi koncentrací kyslíku a respirační, příp. růstovou, aktivitou mikroorganismů. Koncentrace kyslíku ve fermentačním médiu by měla být udržována nad jeho limitující koncentrací (oblast K m, resp. K S ). Někdy se tato hodnota vyjadřuje jako dolní kritická koncentrace kyslíku. Zbytečně vysoká koncentrace kyslíku naproti tomu vyžaduje zvýšené vdušnění a míchání, což se projeví zvýšenými náklady na energii. Objemový koeficient přestupu kyslíku (k L a) Pro rychlost přestupu kyslíku z plynné do kapalné fáze lze odvodit následující vztah: dc/dt = k L a(c s -c) (5) c okamžitá koncentrace kyslíku v kapalině c s nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku v kapalině k L a objemový koeficient přestupu kyslíku k L a představuje součin koeficientu přestupu kyslíku z fázového rozhraní do kapalné fáze (k L ) a specifického povrchu mezifázového rozhraní (a). Je konstantní pouze pro dané podmínky aerace. Hodnota k L a je ukazatelem účinnosti aeračního systému a důležitým parametrem pro přenos výsledků do většího měřítka. Své uplatnění má i v dlouhodobém sledování respirační aktivity organismů. Je-li v systému kultura respirujících mikrooorganismů (příp. jiných aerobních organismů nebo se studují enzymové systémy a neuvažujeme-li v případě buněk o diskutabilním přestupu kyslíku z plynné fáze přímo do buňky, ale pouze o přestupu v kapalině rozpuštěného kyslíku do buňky), rovnice (5) má tvar: dc/dt = k L a(c s - c) - Q (6) Po úpravě c' = c s - Q/k L a (7) kde c' je koncentrace kyslíku za podmínky dc/dt = 0, výsledek rovnováhy mezi rychlostí spotřeby kyslíku kulturou a rychlostí jeho dodávky z plynné fáze do kultury, rovnice (6) přejde na tvar: dc/dt = k L a(c' - c) (8) po integraci (v hranicích 0 - t, c 0 - c): c = c' - (c' - c 0 )exp(-k L a.t) (9) Vztah (9) vyjadřuje časový průběh koncentrace kyslíku v provzdušňované kultuře (před dosažením rovnovážné koncentrace kyslíku c').

3 3 Určení k L a Z více možností zde uvedeme tři často používané způsoby, které budou předmětem experimentální práce. 1. Vytěsňovací metoda V kapalině bez respirujících organismů se vytěsní kyslík inertním plynem a po té se za definovaných podmínek aerace registruje sycení média kyslíkem. Po integraci rovnice (5) (v hranicích 0 - t, c 0 - c) platí: ln(c s - c) = ln(c s - c 0 ) - k L a.t (10) k L a představuje směrnici experimentální závislosti ln(c s - c) = f(t). Za přítomnosti respirujících organismů lze určit k L a vytěsňovací metodou po inaktivaci organismu (Q = 0), což však neodpovídá přirozeným fyziologickým podmínkám. 2. Dynamická metoda Tato metoda určuje k L a i c s v reálných kultivačních či produkčních podmínkách s respirujícím organismem. Je založena na vyhodnocení změn koncentrací kyslíku v kapalném médiu po přerušení a opětném spuštění přívodu vzduchu. Typický záznam těchto změn je na obr. 1. Z lineárního poklesu c v čase po zastavení přívodu vzduchu se určí Q (Q = -dc/dt). Po spuštění přívodu vzduchu podle rovnice (6) platí: c = (-1/k L a)(dc/dt + Q) + c s (11) Po určení průběhu dc/dt ve vázi vzdušnění se získá k L a i c s z lineární závislosti (11). 3. Rovnovážná metoda k L a se určí za podmínek ustáleného stavu, kdy dc/dt = 0. Z rovnice (6) plyne: k L a = Q /(c s - c') (12) c' je ustálená koncentrace kyslíku, viz obr. 1 a vztah (7). Výpočet je jednodušší než v případě dynamické metody, při nižší intenzitě aerace však navodění ustáleného stavu může trvat delší dobu. Q lze opět změřit v uzavřeném systému, na rozdíl od dynamické metody musí být známa hodnota c s. Při porovnávání aerační účinnosti různých fermentačních zařízení a pro optimalizaci míchání a vzdušnění je výhodné určení k L a vytěsňovací metodou. Pro určení k L a v reálných kultivačních nebo produkčních podmínkách je vhodnější dynamická nebo rovnovážná metoda. Měření respirační aktivity v otevřeném systému

4 4 Při znalosti k L a a c s je možné v otevřeném (vzdušněném) systému dlouhodobě sledovat respirační aktivitu organismů. Ze vztahu (6) plyne: Q = k L a(c s - c) - dc/dt (13) v rovnovážném stavu: Q = k L a(c s - c') (14) Cíl práce Stanovení objemového koeficientu přestupu kyslíku jako indikátoru účinnosti aerace; využití v měření rychlosti respirace. Vybavení Kyslíková elektroda, amperometrický detektor, zapisovač, termostat, magneticky míchaná termostatovaná měřící nádobka v horní části uzavíratelná zábrusem s kapilárou, v dolní části nádobky je připevněna kyslíková elektroda, tlaková nádoba s dusíkem, kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Pracovní postup Kalibrace kyslíkové elektrody Nulová hodnota se nastaví pomocí roztoku siřičitanu sodného, nasycená (rovnovážná) koncentrace kyslíku pomocí destilované vody. V měřící nádobce s kyslíkovou elektrodou se aeruje destilovaná voda, po ustálení záznamu koncentrace kyslíku se nastaví její tabelovaná hodnota pro danou teplotu a atmosferický tlak. Určení k L a vytěsňovací metodou Destilovaná voda v otevřené měřící nádobce se zbaví kyslíku probubláváním dusíkem. Pracovní objem kapaliny je dán maximálním objemem nádobky vymezeným zábrusovou zátkou. Jakmile se koncentrace kyslíku blíží k nule, přeruší se přívod dusíku a za daných podmínek aerace (konstantní objem a otáčky míchadla, teplota 26 o C) se voda sytí vzdušným kyslíkem. Na zapisovači získáme záznam odpovídající rovnici (5). c s se odečte po ustálení nasycené (rovnovážné) koncentrace kyslíku ve vodě. Z rovnice (10) určíme k L a lineární regresí. Určení k L a dynamickou metodou 0,2 g pekařského droždí se rozsuspenduje v 50 ml vytemperované destilované vody a suspenze se přenese do měřící nádobky (teplota 26 o C). Po uzavření nádobky zábrusem (za nepřítomnosti vzduchových bublin) se zapne míchání a registruje lineární pokles koncentrace kyslíku v čase (při konstantní rychlosti spotřeby kyslíku). Q je dáno směrnicí této lineární závislosti. U koncentrace kyslíku rovnající se asi 1/4 c s se otevře měřící nádobka a registruje se závislost odpovídající rovnici (6), resp. (9) (za stejných podmínek aerace jako u vytěsňovací metody). V aerační fázi se určí průběh dc/dt a ze závislosti c = f(dc/dt + Q) se podle rovnice (11) určí k L a a c s lineární regresí.

5 5 Výpočet dc/dt Derivaci lze určit různými způsoby, zde se aplikuje numerická derivace po vyrovnání daného úseku křivky polynomem 2. stupně. Z pěti bodů se vypočte derivace v prostředním bodě, potom se přidává postupně další bod na křivce a výpočet opakuje (za použití počítače), viz obr. 2. Určení k L a rovnovážnou metodou Po experimentu s dynamickou metodou vyčkáme ustáleného stavu a odečteme c'. Pro případnou změnu rychlosti respirace opět změříme Q po uzavření nádobky zábrusem. k L a určíme z rovnice (12). Závěr Z naměřených hodnot se porovnají rozdíly k L a určených v destilované vodě a suspenzi mikroorganismů. Vyhodnotíme respirační aktivitu mikrobiální kultury na základě měření v otevřeném systému (rovnice (13) a (14)). C aerace vypnuta I II III aerace zapnuta t Obr. 1. Časový průběh koncentrace kyslíku ve fermentoru s organismy nebo enzymy spotřebovávajícími kyslík. Fáze I: Q = -dc/dt, fázi II popisují vztahy (6) a (9), ve fázi III c = c' (rovnovážný stav, vztah (7) a (14)).

6 6 C c +2 c +1 c 0 c -1 c -2 t t Obr.2. Schematické znázornění výpočtu numerické derivace v bodě c 0 závislosti koncentrace kyslíku na čase u dynamické metody určení k L a. dc 0 /dt = (-2c -2 - c -1 + c c +2 )/10. t