Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka

Transkript

1 Práce s inkluzními tělísky Refoldování Fúzní proteiny Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy a její separace od rekombinantního proteinu Mgr. Michal Křupka Ústav imunologie LF UP Inkluzní tělíska Agregáty proteinů ů s nesprávnou konformací v cytoplazmě ě nebo jádru buněk Původ: Virové infekce akumulace virových kapsidových proteinů Např. Negriho těliska (Vzteklina), Guarnieriho tělíska (Neštovice), Cucumber mosaic virus Jiné patologické stavy Např. Lewyho tělíska uvnitř neuronů (Parkinsonova choroba), inkluze hemoglobinu (thalasémie) Agregace g rekombinantního proteinu v expresních buňkách E. coli Inkluzní tělíska Až 70 % rekombinantních proteinů (hlavně eukaryotického původu) je exprimováno v E.coli ve formě inkluzních tělísek Částice tvořené agregovaným rekombinantním proteinem Protein je obsažen zpravidla v chybné konformaci a není funkční Pro získání funkčního produktu je třeba solubilizace inkluzních tělísek a následná renaturace produktu V některých případech lze tvorbě inkluzí zabránit např. kultivací za nižší teploty, fúzí s tagy, koexprese chaperonů. Photo from Webpages of The Working Group Downstream Processing at the Department of Biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria Cílový protein v supernatantu t Rozpustný protein Purifikace za Denaturačních podmínek Nativní čistý produkt Nativní lyzát Centrifugace Renaturace Cílový protein v peletě Nerozpustný Protein v inkluzních tělíscích Purifikace za Denaturačních podmínek Denaturovaný čistý produkt

2 Kultivace expresního kmene E. coli do O.D. 600 = 0,6 Indukce exprese (1mM IPTG), kultivace indukovaných E. coli 3 4 hod. 37 C Izolace bakteriální biomasy (centrifugace) Lýza buněk Lysozym, sonikace, opakované zamražení Centrifugace, promytí pelety pufrem Inkluzní tělíska Renaturace (refolding) Inkluzní tělíska Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, mercaptoethanol) Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie) Čistý denaturovaný solubilní protein Renaturace Metody renaturace proteinů Rekonstituce nativní (funkční) konformace proteinu po předchozí denaturaci Převedení do nativních podmínek, odstranění chaotropního (denaturačního) činidla a jeho nahrazení pufrem (PBS, Tris, fyziologické ph a osmolalita) Cílem je získat rozpustný protein v aktivní formě, tj. plnící svoji biologickou funkci (antigen, enzym ) Úspěšnost procesu obtížně predikovatelná Průměrná výtěžnost bioaktivního proteinu kolem 25 % Dialýza odstranění nízkomolekulárních látek přes membránu o definované pórovitosti, jednoduchá nebo gradientová Ředění postupné přidávání roztoku proteinu do nadbytku pufru Renaturace na koloně - afinitní nebo gelová chromatografie Aditiva přidávaná do renaturačních pufrů (snižují agregaci proteinů, umožňují tvorbu disulfidických vazeb) Arginin (0,5 1M) Glycerol Oxidovaný a redukovaný glutathion Dithiotreitol Polyethylen glykol Detergenty EDTA

3 Metody ověření nativní konformace renaturovaných proteinů Enzymová aktivita Imunogenita Reakce s protilátkami proti konformačním epitopům Vazba na receptor nebo ligand Spektroskopické metody Výsledek renaturace výrazně variabilní mezi jednotlivými proteiny nutná optimalizace metodiky pro každý jednotlivý protein Protein refolding kits - komerční sady pufrů s gradientem koncentrací jednotlivých složek - usnadnění nalezení optimálních renturačních podmínek Databáze renaturačních postupů pro jednotlivé proteiny: Zabránění tvorby inkluzních tělísek v E.coli - Exprese při nižší teplotě laboratorní teplota přes noc x 37 C 4 hodiny - Koexprese chaperonů - Výběr vhodného fúzního peptidu - Použití speciálních kmenů bakterií pro expresi eukaryotických proteinů -Exprese p v eukaryotických vektorech Pichia, Saccharomyces, savčí a hmyzí systémy Chow MK, Amin AA, Fulton KF, Whisstock JC, Buckle AM, Bottomley SP. (2005) REFOLD: An analytical l database of protein refolding methods. Protein Expr Purif. Kmeny E. coli vhodné pro expresi eukaryontních proteinů Origami kmen odvozený z E. coli K-12 mutantní v genu pro thioredoxin reduktázu (trxb) a glutathion reduktázu (gor), zvyšuje tvorbu cysteinových můstků v cytoplasmě Rosetta obsahuje sekvence pro trna pro kodony AUA, AGG, AGA, CUA, CCC a GGA vzácné u E. coli Rosseta gami kombinuje vlastnosti obou předchozích kmeny, tj, tvorbu disulfidových můstků s rozeznáváním eukaryotických kodonů

4 Sekvence plasmidu (Novagen) Fúzní proteiny Proteiny vzniklé na základě spojení dvou nebo více genových Proteiny vzniklé na základě spojení dvou nebo více genových sekvencí původně kódujících odlišné produkty Tagy (značky, kotvy) fúzované s rekombinantními proteiny Význam: - Identifikace, vizualizace a kvantifikace exprimovaných proteinů pomocí protilátkových nebo ligandových konjugátů - Umožnění afinitní purifikace Požadavky: -Možnost jednokrokové afinitní purifikace -Minimální efekt na terciální strukturu proteinu a jeho aktivitu -Možnost snadného a specifického odstranění z molekuly proteinu -Možnost snadné a přesné detekce proteinu v průběhu purifikace -Použitelnost v prokaryotických i eukaryotických expresních systémech Krátké oligopeptidové značky Peptidový řetězec thrombin enterokinase N- term C- term GST His S His His-tag His-His-His-His-His-His (0,84 kda) T7-tag Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly (1 kda) V5-tag Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr y y Xpress epitope Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys S-tag Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser (1,75 kda) pancreatic ribonuclease C-myc Glu-Gln-Lys-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (1,2 kda) SBP-tag Met-Asp-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Trp-Arg-Gly-Gly-His-Val-Val-Glu-Gly-Leu- Ala-Gly-Glu-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Arg-Leu-Glu- L A A L His-His-Pro-Gln-Gly-Gln-Arg- Glu-Pro (4,03 kda) Poly-arginine-tag Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (0,8 kda) Strep-Tag Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (1kDa) FLAG-Tag N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C (1 kda) Calmodulin binding peptide Lys-Arg-Arg-Trp-Lys-Lys-Asn-Phe-Ile-Ala-Val-Ser- Asn Ala Ala-Ala-Asn-Arg-Phe-Lys-Lys-Ile-Ser-Ser-Ser-Gly-Ala-Leu (2,96 kda)

5 Doménové a proteinové značky Celulose binding domains (3 20 kda) Glutathione S-transferase tag (GST) N-term protein (26 kda) Maltose-binding protein (MBP) protein (40 kda) Thioredoxin (TrxA) protein Transcription termination anti-termination factor (NusA) protein Protein disulfide isomerase I (DsbA) protein Krátká sekvence (6 aa) Většinou výrazněji neovlivňuje vlastnosti proteinu enzymová aktivita, struktura, imunogenita Afinita k atomům přechodných kovů - Ni 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+ - purifikace pomocí metaloafinitní chromatografie, metodiky pro nativní i denaturační postup, kovy kotveny nejčastějí pomocí NTA (nitrilotriacetic acid). Ni a Cu silnější vazba, Zn a Co slabší nižší výtěžek, ale vyšší čistota Anti-His protilátky, Ni-NTA NTA konjugáty umožňují detekci na Western blotu i kvantifikaci rekombinantního proteinu (ELISA, Dot blot) His tag Obrázky převzaty z webů Qiagen a KPL Purifikace s použitím metaloafinitní it chromatografieh t Různé formáty, nejčastěji vázáný kov Ni nebo Co, opakované použití

6 Proteinové tagy (GST, MBP,TrxA, NusA, DsbA) Zvyšují rozpustnost t exprimovaných proteinů ů v E. coli, mohou zabránit tvorbě inkluzních tělísek GST a MBP mohou sloužit k afinitní purifikaci, k TrxA, NusA a DsbA musí být ý připojena peptidová značka Velice často ovlivňují aktivitu a imunogenitu rekombinantního proteinu nutno odstranit po purifikaci Odstranění fúzních značek Štěpné místo thrombin Web of New England Biolabs enterokinase Schéma purifikace proteinu fúzovaného s Maltose binding protein na imobilizované amylóze Vložení nukleotidové sekvence pro peptid rozeznávaný specifickou proteázou Používané proteázy: Enterokináza Thrombin Faktor Xa Tobacco etch virus (TEV) proteáza thrombin GST GST His S His + + enterokináza GST His S S + + enzym enzym

7 Oddělení produktů štěpné reakce Tag off rek Cleavage/Capture Kit Nutné další purifikační č kroky k - odstranění značek afinitní nebo gelová chromatografie -odstranění ě enzymu vhodné h d é použít značený č enzym afinitní it metody - metody iontoměničové nebo gelové chromatografie Pro některé aplikace stačí inaktivace proteázy - inhibitory však jsou často toxické (PMSF T+) Někdy je možno provést štěpení již na afinitní koloně eluční krok Kit založený na purifikované katalytické jednotce lidské enterokinázy Obsahuje ředící a reakční pufry, kontrolní protein a EKapture agarózu Umožňuje rychlé a snadné odstranění enzymu Protein p24 HIV/pET200 před a po odstranění afinitního tagu, reakce 16 hod při pokojové teplotě Komplikace proteázového odštěpení značek - Oddělení proteázy, odštěpeného peptidu a nerozštěpených proteinů od správně štěpeného proteinu vyžaduje další purifikační kroky - Proteázy mohou štěpit protein nespecificky, případně může protein přirozeně obsahovat rozeznávanou sekvenci - Štěpné místo může být nepřístupné díky konformaci proteinu - Štěpení vyžaduje dlouhou dobu, často při pokojové teplotě problém u málo stabilních proteinů - Metoda je relativně nákladná Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy Samoštěpící moduly, aktivace nízkomolekulární látkou po odmytí kontaminujících proteinů Inteiny proteinové introny, popsány roku 1987 Samoštěpící í aktivita it Fúze s rekombinantními proteiny spojka mezi cilovým proteinem a značkou, např. Chitin binding protein Štěpení po přídání thiolu DTT, mercaptoethanol Web of New England Biolabs

8 Systém založený na autokatalytickém jádře sortázy A y ý y j y Staphylococcus aureus (SrtAc) Ostatní možnosti tvorby y fúzních proteinů Self processing module (SPM) Základem doména proteinu FrpC Neisserie meningitidis Štěpení indukováno vápenatými ionty Trimer tag kolagenová doména - Ovlivnění struktury vzniklého proteinu - Sekrece proteinu v savčích buňkách sekvence odvozené z imunoglobulinů - Humanizace Humanizace produktu monoklonální protilátky - Ovlivnění imunogenity proteinu molekulární adjuvans - a mnoho dalších C- terminální repetitivní sekvence kolagenu

9 Tvorba chimerických a humanizovaných monoklonálních protilátek Imunomodulační fúzní proteiny Fúze antigenu s imunomodulačním proteinem cytokiny, chemokiny, heat shock proteins, kostimulační molekuly. hsp70mm p24 ATG His V5 STOP p24 hsp70mm ATG His V5 STOP hsp70mm ATG His V5 STOP p24 ATG His V5 STOP DNA constructs used in the experiment Děkuji za pozornost