Detekce glykomických tumorových markerů a cílený transport cytostatik

Transkript

1 Detekce glykomických tumorových markerů a cílený transport cytostatik Jarmila Králová ÚMG AVČR

2 Co jsou glykany? polysacharidy, oligosacharidy nebo karbohydrátová část glykokonjugátů glykoproteiny karbohydrát je připojen na protein během ko-translačních nebo postranslačních modifikací procesem glykosylace glykolipidy poskytují energii a slouží jako markery buněčného rozpoznávání proteoglycany silně glykosylované glykoproteiny. Proteinové jádro má kovalentně připojený jeden nebo více řetězců glykosaminoglykanů (GAGs). Lineární karbohydrátové polymery jsou negativně nabité díky sulfátům a uronové kyselině. Jsou to hlavní složky extracellularní matrix. GAGs řetězce mohou být: chondroitin sulfát a dermatan sulfát heparin a heparan sulfát keratan sulfát Aggrecan

3 Důležité glykany spojené s nádorovou progresí a) N-vázané glykany kovaletní vazba s Asn b) -vázané glykany kovalentní vazba s Ser /Thr c) Glykosphingolipids ceramid vázaný s 1 cukry d) Glykosylfosfatidyl-inositol (GPI)-vázané proteiny glykan kovaletně vázaný k fosfatidylinositolu Glykosaminoglykany GAGs volné řetězce (hyaluronan) kovalentní komplexy s proteoglykanovými proteinovými jádry (heparan sulfát, chondroitin sulfát and dermatan sulfát)

4 Stádia nádorové progrese: a) Nádorová proliferace b) Invaze nádorové buňky získávají schopnost degradovat a migrovat skrz bazální membránu a extracelulární matrix c) Rozsev nádorové buňky jsou šířeny krevním řečištěm, agregují s hostitelskými krevními destičkami a lymfocyty a nakonec se usídlí v malých cévách vzdálených orgánů d) Angiogeneze je nutná pro jak pro patologický růst primárních nádorů tak jejich metastáz Glykany hrají roli ve všech těchto stádiích nádorového vývoje.

5 Glykany se účastní hlavních patofysiologických dějů během nádorové progrese a) Glykany modulují receptory pro růstové faktory b) Invaze je asociována s expresí sialovaných glykanů, které zvyšují disociaci nádor. buněk c) Selektiny jsou důležité adhezní receptory aktivovaných destiček (P-selektin), leukocytů (L-selektin) a endoteliálních buněk (E-selektin) které se váží na specifické glykanové receptory exprimované na příslušných nádorových ligandech (Lewis X (SLeX) or SLeA) d) Angiogeneze je rašení cévních endoteliálních buněk jako odpověď na proangiogenní factory (VEG, G) uvolňované z nádor. buněk a stromatu Heparan sulfát usnadňuje vazbu G a aktivaci endotheliálních receptorových tyrosin kináz.

6 SUHRN Nádory anomálně exprimují různé glykany, které regulují různé aspekty nádorové progrese včetně proliferace, invaze, angiogeneze a metastáz Proliferace nádorových buněk je potencována schopností glykoproteinů a glykosfingolipidů přímo aktivovat receptory pro růstové faktory s tyrosin kinázovou aktivitou a schopností proteoglykanů fungovat jako ko-receproty pro solubilní nádorové růstové faktory Nadexprese specifických glykosyltransferáz nádorovými buňkami podporuje tvorbu nádorových glykanů usnadnění invaze Karcinomy často nadexprimují -vázané glykany ve formě mucinů (povrchové a sekretované), což jsou ligandy pro ahezní receptory=selektiny, které podporují schopnost nádor. buněk interagovat s krevními destičkami,leukocyty a endoteliálními buňkami usnadnění metastáz Glykosfigolipidy ve formě gangliosidů jsou nadexprimovány řadou nádorů, jejich uvolňování do krevního řečiště může zhoršit imunitu vůči některým nádorům Heparan sulfát-proteoglykany (HSPGs) na povrchu nádor. buněk fungují jako koreceptory stabilizující signální komplex G receptor. Sekretované HSPGs přítomné v extracellularní matrix uchovávají G mobilizovatelné nádorovými heparanázami Některé glykany lze měřit v krvi a využít je jako markery pro zjišťování specifických nádorů a ke sledování odpovědi na terapii

7 Strategie pro odhalení nádorových glykobiomarkerů EBS Journal 277 (2010)

8 Glykomické profilování Analytické nástroje 1) hmotnostní spektroskopie izolovaných glykanů 2) expresní profilování genů funkčně zúčastněných v syntéze, degradaci N-vázaných and -vázaných glykanů, Lewis antigenů, glykosaminoglykanů a glykosfingolipidů

9 Cílené protinádorové strategie založené na glykanech A: změna exprese glykanů na povrchu nádorových buněk peracetylované disacharidy (GlcNAcβ1,3Galβ) kovalentně vázané na hydrofobní nekarbohydrátovou část umožňující vstup do buňky. V nádor. buňce jsou disacharidy deacetylovány a upraveny glykosyltransferázami odlákání a odklon glykosylace pryč od endogenních glykoproteinů snížená exprese specifických glykanů na buněčném povrchu Redukce exprese sialyl Lewis X blokace nádorového rozsevu Některé cukerné analogy obsahující místo -H skupiny přímo inhibují glykosylaci

10 Cílené protinádorové strategie založené na glykanech metabolická inkorporace nepřirozených prekurzorů kyseliny sialové - vede ke vzniku nepřirozených epitopů (manosamin analog je konvertován v nádor. buňkách na derivát kys. sialové produkce nových povrchových glykokonjugátů obsahujících derivát kys. silaové) zvýšení protinádorové imunity

11 Cílené protinádorové strategie založené na glykanech B: specifické chemické sondy s vlastním terapeutickým potenciálem pro rozpoznání glykanů na povrchu nádorových buněk konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami polymethiniové sole jako senzory pro polysulfátové sacharidy C: modifikace chemických sond pro kombinovanou cílenou terapii umožňující cílenou přepravu cytostatik -cyklodextrinové konjugáty porfyrinů a jejich inkluzní komplexy s léčivy

12 Konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami pro rozpoznávaní sacharidových tumorových markerů testované konjugáty testované tumorové markery Sialová kyselina Hyaluronová kyselina Heparan sulfát Vazebné konstanty Titrační křivka konjugátu 1 s heparan sulfátem Analyt Komplex 1 5 Log(Ks) Glukosa 1:1 5,7 2,0 Sialiová kyselina 1:1 5,7 4,3 Hyaluronová kyselina 1:1 5,4 5,7 2:1 7,0 12 2: Heparan sulfát 1: :1 7,0 6,0

13 Konjugáty porfyrinů se žlučovými kyselinami pro rozpoznávaní sacharidových tumorových markerů rozpoznání nádorových buněk fotodynamický účinek porfyrinů cílená zabíjení buněk s nádorovým fenotypem Králová J, Koivukorpi J, Kejík Z, Poučková P, Sievänen E, Kolehmainen E, Král V. rg. Biomol. Chem., 2008, 6,

14 Polymethiniové sole (PMS) jako senzory pro polysulfátové sacharidy heparin Vazebné konstanty Analyt Log(Ks) Komplex Heparin 11 1:2 18 1:3 Polygalakturonová kyselina 4,8 1:1 Pektin 3,9 1:1 kolorimetrická sonda rozpoznávající s velkou selektivitou a učinností sulfonované sacharidy lokalizace uvnitř buňky otvírá možnost pro zobrazování silně sulfonovaných částí buněk (lysosomy nádorových buněk) značná toxicita PMS pro nádorové buňky Titrace s heparinem Bříza T, Kejík Z, Císařová I, Králová J, Martásek P, Král V. Chem Commun (Camb). 2008, 16,

15 Supramolekulární cyklodextrin-porfyrinový systém pro cílený transport a kombinovanou terapii HCH 2 H 2 CH H H H H H HCH H 2 H 2 CH H H H H H N H CH 2 NH HH 2 C H H H N CH N 2 H Bis beta cyklodextrin porfyrinový konjugát HCH 2 H 2 CH H HCH HH H 2 H H H H 2 CH H H H H CH 2 H H CH H 2 H CH 2 H Imatinib A 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, λ/nm A 0,57 0,55 0,53 0,51 0,49 0, C(imatinib)/c(2)

16 Princip kombinovaného terapeutického účinku rozpoznání a akumulace v nádoru umožňuje kombinaci fotodynamická terapie a chemoterapie synergistický účinek Drug R R NH N N HN HCH 2 HCH 2 H H H CH 2 H H H HCH 2 HH H CH 2 H H H H H H HCH 2 CH 2 H Široká škála možných účinků Snadná optimalizace podle potřeb terapie inhibice mikrotubulů (paclitaxel, docetaxel) inhibice kináz (imatinib, lapatinib, sunitinib) cílení na DNA (fluoruracil, doxorubicin, lomustine) inhibice folátového metabolismu (aminopterin) Králová J., Kejík Z., Bříza T., Poučková P., Král A., Martásek P., Král V. J. Med. Chem. (2010), 53, R hν R NH N N HN HCH 2 HCH 2 H H H CH 2 H H H Drug HCH 2 HH H CH 2 H H H H H H HCH 2 CH 2 H R R

17 Vazebné konstanty porfyrinových konjugátů s léčivem při kyselém ph uvolnění léčiva Porphyrin-CD drug complex Log (Ks) ph 7.34 ph 5.50 Complex stoichiomentry carrier/drug Log (Ks) Complex stoichiometry carrier/drug 2 paclitaxel 5.3 1:1 n.d. n.d. 2 docetaxel 6.3 1: : : :1 2 imatinib : : : :1 2 lapatinib 4.8 1:1 n.d. n.d. 2 lomustine 6.0 1: :1 2 fluorouracil 4.5 1: : : :1 2 aminopterin 4.8 1:1 n.d. n.d :2 n.d. n.d. 2 methotrexate :2 n.d. n.d. 3 doxorubicin : :1 3 sunitinib 9.0 1:2 n.d. n.d. 4 paclitaxel : :2 4 imatinib : :2 J Med Chem 2010, 53(1), l V.

18 Uvolnění doxorubicinu z komplexu s porfyrinovým konjugátem

19 Vliv kombinované terapie (chemoterapie a fotodynamické terapie) - komplexy cystatika (paclitaxel, doxorubicin) s CD konjugáty porfyrinu na myším nádorovém modelu Amelanotický melanom C32 bez léčby Nekróza vyvolaná po aplikaci komplexu cytostatika/cdporfyrinu a ozáření (PDT) oceno 7. den po léčbě 30 dnů po terapii vymizení nádoru

20 Publikace l V. Porphyrin-cyclodextrin conjugates as a nanosystem for versatile drug delivery and multimodal cancer therapy. J Med Chem 2010, 53(1), Bříza T., Kejík Z., Králová J., Martásek P., Král V. Synthesis of unsymmetric cyanine dye via merocyanine and their interaction with DNA. Collect Czech Chem Commun 2009, 74(7-8), Králová J, Bříza T, Moserová I, Dolenský B, Vašek P, Poučková P, Kejík Z, Kaplánek R, Martásek P, Dvořák M and Král V. Glycol-porphyrin derivatives as potent photodynamic inducers of apoptosis in tumor cells. J Med Chem 2008, 51, Bříza T, Kejík Z, Císařová I, Králová J, Martásek P, Král V. ptical sensing of sulfate by polymethinium salt receptors: colorimetric sensor for heparin. Chem Commun (Camb). 2008, 16, Králová J, Koivukorpi J, Kejík Z, Poučková P, Sievänen E, Kolehmainen E, Král V. Porphyrin bile acid conjugates: from saccharide recognition in the solution to the selective cancer cell fluorescence detection. rg. Biomol. Chem., 2008, 6, Kralova J, Dvorak M, Koc M, Kral V. p38 MAPK plays an essential role in apoptosis induced by photoactivation of a novel ethylene glycol porphyrin derivative. ncogene, 2008, 27: Bříza T., Kejík Z., Vašek P., Králová J., Martásek P., Císařová I., and Král V. Chromophoric binaphthyl derivatives. rg. Lett. 2005, 7(17):

21 Spolupracovníci: ÚMG AVČR, v.v.i. Irena Moserová RNDr. Michal Dvořák VŠCHT, Praha Prof. Vladimír Král Tomáš Bříza Zdeněk Kejík 1.L UK, Praha Doc. Pavla Poučková RNDr. Marie Zadinová