LightCycler Color Compensation Set Příruční roztoky k vytváření souborů pro barevnou kompenzaci k systému LightCycler 2.0 System.

Transkript

1 Pro všeobecné laboratorní použití POUZE pro použití IN VITRO. Color Compensation Set Příruční roztoky k vytváření souborů pro barevnou kompenzaci k systému 2.0 System. Kat. čís Verze ze října, 2005 Souprava pro 5 kalibrací. Skladujte při teplotách -15 až -25 C. Uchovávejte v temnu! 1. K čemu se používá tento produkt? Počet testů: Souprava je určena pro 5 kalibrací. Součásti: Souprava pro barevnou kompenzaci Compensation Set obsahuje čtyři součásti: Láhev / Uzávěr Označení Součásti / Funkce 1) 1 Bezbarvá Nepopsané 100 μl standardního tlumícího roztoku bez fluoroforů k určení standardní fluoroscence tlumícího roztoku 2 Zelená Kalibrátor Fluorescein 3. Červená Kalibrátor Červeň Fialová Kalibrátor Červeň μl standardního oligonukleotidu, označeného na konci 3 fluoresceinem (0,3 μm) k určení překryvu z fluoresceinu (kanál 1 /530/) do kanálů 2 /640/ a 3 /705/. 100 μl standardního oligonukleotidu, Red 640, označeného na konci 5, (1, μm) k určení překryvu z barviva LC Red (kanál 2 /640/) do kanálů 1 /530/ a 3 /705/. 100 μl standardního oligonukleotidu, Red 705, označeného na konci 5 /1 μl/ k určení překryvu z barviva LC Red 705 /kanál 3 /705/) do kanálů 1 /530/ a 2 /640/. 1) Hodnoty v závorkách jsou odkazy na program Software 4.0.

2 Skladování a stabilita Souprava Color Compensation Set je stabilní při -15 až -25 C až do data spotřeby, vytištěného na označení výrobku. Souprava se přepravuje na suchém ledu. Uchovávejte v temnu! Použití Soupravu Color Compensation Set používejte k vytváření datových souborů pro barevnou kompenzaci ( Software 3.5) nebo objektů ( Software 4.0). Na jejich základě lze provádět duální barevné experimenty s barvivy Red 640 a Red 705, označenými próbami HybProbe v jediné kapiláře. Vytvořený soubor (nebo objekt) pro barevnou kompenzaci lze používat univerzálně ve všech dalších duálních barevných experimentech na daném přístroji, ke kompenzaci syrových fluorescenčních dat, a to buď on-line, během cyklu, nebo pro účely analýzy dat po cyklu. Barevná kompenzace je specifická podle barvy. Z tohoto důvodu je třeba vytvořit soubor pro barevnou kompenzaci pro každý přístroj zvlášť. Nový kalibrační experiment provádějte pravidelně každých 6 měsíců. Nový soubor / objekt pro barevnou kompenzaci je třeba vytvořit vždy po aktualizaci programu nebo po opravě optického systému. Barevnou kompenzaci je třeba provádět jen pokud provádíte experiment se dvěma nebo více barvivy v jedné kapiláře. Barevná kompenzace není nutná, když se při experimentu používá jediné barvivo (např. SYBR Green I nebo Red 640). Přístroj 2.0 má dodatečné detekční kanály, které umožňují provádět vícebarevné testy (např. multiplex HybProbe) se čtyřmi různými barvivy-akceptory: Red 610, Red 640, Red 670, Red 705. Používáte-li vícebarevnou aplikaci, musíte vytvořit objekt pro barevnou kompenzaci se specifickými parametry pro každý experiment. Pokyny pro přizpůsobené vícebarevné kompenzační experimenty najdete v technické poznámce č. 19, Barevná kompenzace. Souprava Color Compensation Set není vhodná pro test barevné kompenzace duálně barevné hydrolýzy próby. Příslušné metody naleznete v technické poznámce č. 21, Testy hydrolýzy próby se systémem. Další požadované vybavení Systém 2.0 ( 2.0 Instrument, 1.5 Instrument nebo nižší verze přístroje) Kapiláry (20_l) Standardní stolní ( benchtop ) mikrocentrifuga s rotorem pro reakční zkumavky s obsahem 2.0 ml Adaptéry, které umožní odstředění kapilár ve standardním centrifugovém rotoru, se poskytují se systémem. Nebo Odstředivka LC Carousel Centrifuge pro použití s 2.0 Carousel (nepovinné).

3 Pokud budete používat nižší verzi přístroje než je verze 2.0, budete navíc potřebovat košíček LC Carousel Centrifuge 2.0 Bucket 2.1* Pro adaptaci karuselu 2.0 Sample Carousel na původní LC Carousel Centrifuge budete navíc potřebovat rotorovou sadu LC Carousel Centrifuge 2.0 Rotor Set*. Pipety s hroty na jedno použití (typ positive displacement ) Čas potřebný k provedení testu Postup Nastavení kalibračního cyklu Kalibrace Celkový testovací čas Čas 5 min 40 min 45 min 2. Jak tento produkt používat Všeobecné poznámky Uživatelům programu Software 3.5: K provedení kalibračního pokusu k barevné kompenzaci použijte soubor calibration.exp, který naleznete ve složce Demo Protocol pod heslem Demo. Obsahuje veškeré nezbytné informace o vzorku. Uživatelům programu Software 4.0: K vytvoření objektu pro barevnou kompenzaci použijte makro určené k automatickému provedení kalibrace, které je zahrnuto ve složce Roche pod heslem Templates and Macros / Experiment Macros / Demo Macros / Color Compensation Set (Cat No ). Řiďte se pokyny podle Experiment Kit Wizard. Protokol Následující tabulka znázorňuje parametry, které je třeba naprogramovat k nakalibrování systému pro použití se soupravou Color Compensation Set. Před přípravou kalibračních směsí naprogramujte přístroj. Rychlost / sklon změny teploty je 20 C / s., kromě případů, kde se uvádí jinak. Ostatní parametry, které nejsou uvedeny v tabulce níže, nastavte na hodnotu 0. Režim analýzy Počet cyklů Segment Cílová teplota 1) Čas trvání Režim akvizice Zahřívací krok Není 1 95 C 30 s Není Cyklovací krok Není C 0 s Není Software 3.5 křivky tání 2 55 C 10 s Singulární 3 72 C 10 s Není Krok zvyšování teploty 1 95 C 0 s Není 2 40 C 5 s Není

4 Software 4.0 barevná kompenzace C nárůst = 0,2 C / sek. 1) 0 s Kontinuální Krok chlazení Není 1 40 C 30 s Není Fluorescence a parametry pro nastavení cyklu Parametr Nastavení Všechny verze programu Software Požadovaná teplota Režim displeje 30 C Zvolte jakýkoliv fluorescenční kanál; během cyklu můžete zobrazený kanál změnit. Verze programu předcházející verzi Software 3.5 Fluorescenční zisk Fluorimetr Hodnota zisku Kanál 1 (F1) 1 Kanál 2 (F2) 15 Kanál 3 (F3) 30 Fluorescenční zisk Nepožaduje se LigthCycler Software, verze 3.5 Software, verze 4.0 Fluorescenční zisk Max. seek pos (Max. vyhledávaných pozic) Instrument Type (Typ přístroje) Capillary Size (Velikost kapiláry) Údaje o vzorcích Nepožaduje se Vložte počet pozic vzorků, které má přístroj hledat. 6 Ch. : pro přístroj 2.0 Instrument (výchozí nastavení) 3 Ch. : pro přístroj 1.5 Instrument a nižší verze přístroje Zvolte 20 μl jako velikost kapiláry pro experiment Pouze pro typ přístroje 6 Ch. Otevřete seznam vzorků a zvolte Color Compensation jako typ analýzy Zvolte tabulátor Color Comp. Pro každý ze čtyř vzorků nastavte příslušný Dominant Channel (např. Vzorek 1 = voda, vzorek 2 = 530 atd.)

5 Když provádíte cyklus barevné kompenzace na přístroji 1.5 Instrument (nebo na nižší verzi přístroje) v kombinaci s programem Software 3.5 (nebo nižší verzí programu), přístroj nemusí být schopen rozpoznat kapiláry ve všech čtyřech pozicích rotoru. Objeví se komunikační okno, které se bude ptát, zda chcete v cyklu pokračovat, přestože požadovaný počet kapilár nebyl detekován. V takovém případě nepokračujte v cyklu. Zvolte kanál a zavřete tak komunikační okno. Pak v menu Programming Screen Options zrušte volbu Use Seek Threshold. Znovu zahajte cyklus. Příprava kalibračních směsí Nedotýkejte se povrchu kapilár. Při zacházení s kapiláry vždy noste rukavice. 1 Rozmrazte součásti soupravy Color Compensation Set, jemně promíchejte a skladujte na ledu, chráněné před světlem. 2 Umístěte požadovaný počet kapilár Capillaries do předchlazených adaptérů odstředivky nebo do Sample Carousel v předchlazeném košíčku Centrifuge Bucket. 3 Napipetujte 20 μl každé součásti do zvláštní předchlazené kapiláry Capillary. Nesnižujte objem! 4 Každou kapiláru uzavřete stopperem. Adaptéry s kapilárami umístěte do standardní stolní ( desktop ) mikrocentrifugy. Adaptéry odstředivky na odstředivce rozmístěte do rovnovážné pozice. Odstřeďujte při 700 x g po dobu 5 s (3000 rpm ve standardní stolní odstředivce). Eventuálně použijte pro roztočení kapilár odstředivku Carousel. 5 Na vzorkový karusel přístroje umístěte kapiláry v následujícím pořadí: pozice rotoru 1: čirá (nádobka 1, bezbarvé víčko) pozice rotoru 2: kalibrátor fluorescein (nádobka 2, zelené víčko) pozice rotoru 3: kalibrátor LC Red 640 (nádobka 3, červené víčko) pozice rotoru 4: kalibrátor LC Red 705 (nádobka 4, fialové víčko) Neměňte pořadí pozic kalibračních roztoků v rotoru. 6 Vzorky cyklujte dle výše uvedeného popisu. Vytváření souborů / objektů pro barevnou kompenzaci V závislosti na tom, zda jste uživatelem programu Software 3.5 nebo 4.0, následujte příslušné níže uvedené pokyny: Software 3.5 Po kalibračním cyklu program Software automaticky znázorní modul analýzy dat pro. Ke konverzi získaných údajů: Použijte funkci Select a Program k výběru segmentu křivky tání (segment 3) teplotního profilu. (Program na displeji znázorní zelené kurzory okolo gradientu teploty). Poté v rozbalovacím menu Color Compensation zvolte tabulátor Calibration. Uložte údaje o barevné kompenzaci tak, že pojmenujete kalibrační

6 Software 4.0 soubor a uložíte jej do správné složky. (Software automaticky k souborům připojuje koncovku ccc.) Po kalibračním cyklu z menu Analysis zvolte Color Compensation a data uložte jako objekt pro barevnou kompenzaci: Klepněte na Save CC Object. Umístěte objekt do složky Special Data / CCC pod vaším uživatelským jménem. Používání souborů / objektů pro barevnou kompenzaci V závislosti na tom, zda jste uživatelem programu Software 3.5 nebo 4.0, následujte příslušné níže uvedené pokyny: Software 3.5 Software 4.0 Uložený soubor pro barevnou kompenzaci ( color compensation file ; *.ccc file) můžete aktivovat v několika bodech protokolu za účelem poskytnutí barevné kompenzace pro syrová data: Barevná kompenzace on-line Soubor *.ccc můžete na přístroj nahrát během cyklu za účelem opravy dat znázorněných on-line. Klepněte na Choose CCC File a zvolte příslušný soubor. Barevná kompenzace pro analýzu dat Soubor *.ccc můžete nahrát a aktivovat za účelem kompenzace překryvu mezi kanálem 2 a 3 během duální barevné analýzy. Před započetím této analýzy zvolte Load Calibration Data z menu Color Compensation a pak zvolte příslušný soubor. Uložený objekt pro barevnou kompenzaci můžete použít k duálním barevným HypProbe experimentům, které využívají totožné barevné kombinace (Red 640 / Red 705), a to následujícím způsobem: Klepněte na Color Compensation v modulu Run nebo Analysis. Pak zvolte příslušný objekt pod Select Color Compensation. Když se otevře komunikační okno a znázorní se všechny kompenzované kanály, odklepněte OK. Nerušte volbu predefinovaných kanálů. Nekompenzované kanály v experimentálním souboru dat se během analýzy neznázorňují. 3. Dodatečné informace o tomto výrobku K čemu se tento produkt používá Souprava Color Compensation Set se používá ke kalibraci přístrojů Instruments ke korekci spektrálního překryvu fluorescenčních kanálů v duálních barevných aplikacích, které využívají próby HypProbe, označené Red 640 a 705. Během kalibrace měří přístroj fluorescenci každého barviva ve všech kanálech a vytváří soubor (nebo objekt) pro barevnou kompenzaci, specifický pro ten který přístroj. Program později automaticky používá tento soubor (nebo objekt) pro barevnou kompenzaci k opětnému přiřazení fluorescence pro každý kanál k příslušnému barvivu. Síťovým výsledkem je detekce jediného barevného signálu pro každý kanál.

7 Princip testu Teplotní profil, použitý v protokolu barevné kompenzace, vždy zahrnuje zahřívací krok, cyklovací krok, krok zvyšování teploty a krok chlazení. Cyklovací krok napodobuje typickou PCR, včetně sběru dat. Avšak data požadovaná pro barevnou kompenzaci jsou převzata z kroku zvyšování teploty. Při tomto kroku dochází po krátké denaturalizaci (95 C) k pomalému nárůstu teploty po přírůstcích zhruba 0,2 /s., a to ze 40 C na 95 C při současném neustálém sběru dat. Po kalibraci uloží Software vygenerovaná data jako experimentální soubor. Aby tato data mohla být použita pro barevnou kompenzaci, je nejprve třeba tato data konvertovat do souboru ccc (nebo do objektu) a znovu je uložit. Informace o principu testu Systém dokáže detekovat dva a více různých sekvencí v jednom vzorku, např. cíl i vnitřní kontrolu. Takové testy vyžadují dvě specifické sady prób HybProbe. Próby HybProbe sestávají ze dvou odlišných krátkých oligonukleotidů, které se váží na vnitřní sekvenci amplifikovaného fragmentu během anelační fáze amplifikačního cyklu. Jedna próba je označena na konci 5, pomocí červeného fluoroforu ( Red 640 nebo 705) a navíc je 3 fosforylovaná, aby nedošlo k extenzi. Druhá próba je označena na konci 3, pomocí fluoresceinu. Teprve po hybridizaci na templátovou DNA se obě próby dostanou do těsné blízkosti, což má za výsledek fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET) mezi dvěma fluorofory. Během FRET se fluorescein, dárcovský fluorofor, excituje pomocí světelného zdroje přístroje a část excitační energie je přenesena na červené barvivo Red - akceptující fluorofor. Emitovanou fluoroscenci červeného barviva Red poté změří přístroj. Přestože jsou optické filtry každého detekčního kanálu optimalizovány pro různá emisní maxima, mají všechna momentálně dostupná fluorescenční barviva emisní spektra s dlouhými ocásky, což vede ke spektrálnímu překryvu. Jak je znázorněno na obrázku níže, emisní spektrum dárcovského barviva (fluorescein) lehce překrývá emisní spektrum barviva Red 640, což zase překrývá emisní spektrum barviva Red 705. Emitovaná fluorescenční intenzita a emitovaná spektra fluorescenčních barviv silně závisí na teplotě. Proto teplota zvolená pro sběr dat významně ovlivňuje překryv. Za účelem umožnění kompenzace překryvu ve vícebarevných experimentech při jakékoliv teplotě mezi 40 C a 95 C, zahrnuje vytváření souborů pro barevnou kompenzaci krok zvyšování teploty s kontinuálním sběrem fluorescenčních dat měřených ve všech třech kanálech.

8 4. Dodatečné informace 4.1 Ujednání Textová ujednání Za účelem terminologické konzistence s přehlednosti se v příbalovém letáku používají následující textová ujednání: Textová ujednání Číslovaná stádia, označená 1, 2 atd. Číslovaná stádia, označená 1, 2, atd. Hvězdička Použití Stádia v procesu, která se obvykle objevují v uvedeném pořadí. Stádia v postupu, která je třeba provádět v uvedeném pořadí. Označuje výrobek dostupný od Roche Applied Science. Symboly Symbol Popis Informační poznámka: Dodatečná informace o daném tématu nebo postupu. Důležitá poznámka: Rozhodující informace pro úspěšný průběh postupu nebo pro použití výrobku. 4.2 Informace k objednání Roche Applied Science nabízí velký výběr reagencií a systémů pro výzkum v life science. Kompletní přehled našich výrobků a uživatelské příručky najdete na našich stránkách a na našich zvláštních internetových stránkách Special Interest Site, včetně: The 2.0 System pro real-time, on-line PCR: Výrobek Velikost balení Kat.čís. Přístroj LigthCycler přístroj plus doplňky Přístroj LigthCycler přístroj plus doplňky Kapiláry LigthCycler (20 μl) 1 balení (8 krabiček, každá po 96 kapilárách a stoppery) Karuselová odstředivka LigthCycler odstředivka s rotorem a košíčkem (115 V) (230 V) LigthCycler Software balení software Oznámení kupujícím ZŘEKNUTÍ SE LICENCE: Tento produkt je optimalizován pro použití v polymerázové řetězové reakci (PCR) a je krytý výsadními právy, jež vlastní společnost F. Hoffmann-La Roche Ltd. (Roche). Podle těchto výsad se žádná licence prodejem tohoto výrobku nepostupuje, úmyslně ani neúmyslně, kupujícímu. Pro účely jistých typů výzkumu a rozvojových aktivit doprovází koupi

9 jistých reagencií společnosti Roche Applied Biosystems nebo jiných oprávněných dodavatelů licence pro použití procesu PCR, pakliže se používá v souvislosti s autorizovaným termálním cyklerem; tato licence je rovněž dostupná od Applied Biosystems. Pro použití v diagnostice je požadována licence od Roche. Další informace o nákupu licencí lze získat na adrese: Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California, USA. Pro technologii použitou pro systém udělila licenci Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. 4.4 Obchodní známky LIGHTCYCLER a HYBPROBE jsou obchodními známkami Roche. SYBR je obchodní známkou Molecular Probes, Inc., Eugene OR, USA. Kontakt a podpora Jestliže máte dotazy, řešíte problémy, navrhujete vylepšení, nebo chcete nahlásit nové aplikace, navštivte laskavě naši internetovou stránku Online Technical Support na: Pokud nám chcete telefonovat, psát, faxovat nebo ovat, navštivte naši domovskou stránku a zvolte svoji zemi. Znázorní se kontaktní informace specifické pro vaši zemi. Použitím funkce Product Search najdete příbalové letáky a bezpečnostní listy k materiálům.