Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mm), 1 ml enzymového preparátu (konc.

Transkript

1 Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mm), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mm Tris, ph 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 C a byl sledován přírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.

2 Sledování průběhu separace Metoda Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] buněčný 258, extrakt (NH 4 ) 2 SO 4 118, HIC 57, GPC 19,

3 Metoda Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] buněčný 258, extrakt (NH 4 ) 2 SO 4 118, HIC 57, GPC 19, Specifická aktivita [U/mg] 0,77 Stupeň přečištění - Výtěžek [%] 100 3,81 4, ,33 13, ,45 85,8 64

4 Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?

5 Afinitní chromatografie

6 Princip afinitní chromatografie 1. afinitní chromatografie afinitní ligand + protein Matrix Spacer arm 2. Imunoafinitní chromatografie ligand protilátka + Proteinový epitop Matrix Spacer arm

7 Příklady afinitních interakcí enzym protilátka lektin nukleová kys. hormon, vitamin analog substrátu, inhibitor, kofaktor antigen,virus, buňka polysacharid, glykoprotein, buněčný povrch, receptor komplementární sekvence, histony, DNA/RNA polymerasy, DNA/RNA vázající proteiny receptor, přenašeče

8 Stacionární fáze nejčastěji agarosa (Sepharosa) ligand kovalentně navázaný přes OH skupinu cukerné jednotky nosiče velké póry umožňující průnik velkých molekul co nejnižší nespecifické adsorbce ligandy: specifické reversibilní vazba schopnost navázat na nosič bez ovlivnění vazby vazba na protein nesmí být ani slabá ani silná

9 ligand M r <1000 raménko Ligand x raménko krátké raménko látka se na ligand špatně váže dlouhé raménko možná nespecifická vazba snížení selektivity velká hustota ligandů - sterická nepřístupnost přebytečných ligandů

10 Vhodné vazebné a eluční podmínky ideální podmínky vazba mezi ligandem a purifikovanou molekulou K D = [L].[P] [LP] vazba K D M eluce K D M

11 K D > 10-4 ~ slabá interakce K D < 10-6 ~ silná interakce obtížná eluce Možnosti eluce Metoda 1 změna ph nebo iontové síly Metoda 2 Extremní ph nebo vysoká koncentrace močoviny nebo guanidin hydrochloridu Metoda 3 a 4 přídavek kompetičního činidla

12 Gradientová x skoková eluce pomalá vazba pomalá desorpce

13 Typy afinitních ligandů Ligandy používané pro mono-specifickou afinitní chromatografii Látky používané pro připojování ligandů aktivátor skupina ligandu N-hydroxysukcinimid (NHS) -NH 2 CNBr -NH 2 Karbodiimid -NH 2, -COOH Epoxid -SH, -NH 2, -OH

14 N-hydroxysukcinimid (NHS-Sepharosa) > 30 mg / 1 ml nosiče připojení přes amino skupinu (často protilátka nebo antigen) první výběr při přípravě imunospecifického média

15 CNBr (CNBr aktivovaná Sepharosa) alternativa k NHS aktivované Sepharose vazba přes primární aminoskupinu nebo přes jinou nukleofilní skupinu vhodná pro větší ligandy proteiny, peptidy, aminokyseliny, nukleové kyseliny

16 N, N'-disubstituovaný karbondiimid EAH Sepharosa + ligand-cooh ECH Sepharosa + ligand-nh 2 malé ligandy

17 Epoxid (Epoxy-aktivovaná Sepharosa 6B) ligandy obsahující OH, -NH 2, -SH malé ligandy cholin, ethanolamin a cukry

18 Aktivovaná thiolová skupina 1 2 tvorba disulfidů (reversbilní-dtt) 3 kovalentní chromatografie 4 reakce s těžkými kovy a jejich deriváty např. p-chloromercuribenzoate mraptidy 5- reakce s alkylovými nebo arylovými halogenidy thioleterové deriváty 6- reakce s látkami obsahujícími C=O, C=C a N=N

19

20 Ligandy používané pro skupinově-specifickou afinitní chromatografii skupinově specifický ligand Protein A Protein G Lektiny Cibacron Blue specifita Fc region IgG Fc region IgG Procion Red NADP + Lysin Arginin Benzamidin Kalmodulin Heparin Streptavidin Oligo (dt, da,...) Kovové ionty glukopyranosylové a mannopyranosylové skupiny široká skupina enzymů, NAD + dependentní enzymy, sérový albumin plasminogen, rrna serinové proteasy serinové proteasy proteiny regulované kalmodulinem kolagulační faktory, lipoproteiny, lipasy, hormony, steroidní receptory, nukleové kyseliny vázající enzymy Biotin a biotinylované látky mrna, nukleasy proteiny a peptidy obsahující dostupný His

21 protein A Staphylococcus aureus protein G Streptococcus purifikace: monoklonální protilátky IgG polyklonální protilátky IgG imunokomplexy Protein A a Protein G

22

23 Heparin A hexuronová kyselina - D-glukuronová kyselina nebo L-iduronová kyselina (C-5 epimer) B D-glukosamin R1 = -H nebo -SO 3 R2 = -SO 3 nebo -COCH 3. DNA vázající proteiny iniciační a elongační faktory, restrikční endonukleasy, DNA ligasa, DNA and RNA polymerasa inhibitory serinových proteas - antithrombin III Enzymy lipoprotein lipasy, koagulační enzymy, superoxid dismutasa růstové faktory extracelulární matrixové proteiny hormonální receptory - androgenní receptory Lipoproteiny

24 Streptavidin streptavidin - molekula isolovaná z Streptomyces avidinii biotinylované protilátky purifikace antigenů ATP-dependentní kinasy 5 -AMP-Sepharosa 2'5 -ADP-Sepharosa NADP + -dependentní dehydrogenasy silně interagují s 2'5 -ADP

25 Cibacron Blue F3G-A (Blue Sepharosa) Cibacron Blue F3G-A ~ analog NAD + enzymy vyžadující kofaktory obsahující adenyl - kinasy, dehydrogenasy vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

26 Procion Red (Red Sepharosa) enzymy vyžadující kofaktor NADP+ vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

27 lektin z Canavalia ensiformis (jack bean) tetramerní metalloprotein Konkavalin A větvené mannosidy, cukry s terminální mannosou nebo glukosou (αman > αglc > GlcNAc) purifikace glykoproteinů, polysacharidů a glykolipidů detekce změn ve složení látek obsahujících cukry isolace povrchových buněčných glykoproteinů Lentil lektin lektin z Lens culinaris (čočka) větvené mannosidy obsahující fukosu α 1,6 vázanou na N-acetylglukosamin membranové glykoproteiny, povrchové buněčné antigeny, virální glykoproteiny

28 Pšeničný lektin ze semen Triticum vulgare (pšenice) homodimerní neglykosylovaný protein vazba - N-acetylglukosaminových zbytků, chitobiosového jádra N-oligosacharidů, N-acetylneuraminové kyseliny

29 Kalmodulin vysoce konservovaný regulační protein eukaryotních buněk účastní se mnoha buněčných procesů metabolismus glykogenu, přenos nervových impulsů, regulace, kontrola poměru NAD + /NADP + purifikace kalmodulin vázajících proteinů - ATPasy, adenylát cyklasy, protein kinasy, fosfodiesterasy, neurotransmitery

30 Thiol-obsahující látky ~ kovalentní chromatografie Aktivovaný thiol

31 Produkce rekombinantních proteinů proteiny vyrobené genovými modifikacemi, při nichž do genomu producenta (obvykle bakterie nebo kvasinky) byl uměle začleněn gen kódující požadovanou bílkovinu z jiného organismu kultivační podmínky bakteriální kmen expresní systém M B cyt IB produkce rozpustného proteinu nebo nerozpustný protein

32 Rekombinantní fůzní proteiny fůzní kotva imobilizovaný ligand podmínky vazby podmínky eluce Glutathion S- transferasa GST redukovaný glutathion Neutrální ph, nedenaturující prostředí, glutathion musí být redukovaný a GST musí být aktivní volný redukovaný glutathion Histidinová kotva His-tag Chelatovaný nikl nebo kobalt Neutrální ph bez redukčních a oxidačních látek >200 mm Imidazol, nízké ph, silné chelatační činidlo Maltose Binding Protein MBP Amylosa Neutrální ph, nedenaturující prostředí; přídavek NaCl k snížení nespecifické sorbce maltosa Protein A IgG Neutrální ph, nedenaturující prostředí Green Fluorescent Protein GFP Anti-GFP antibody Neutrální ph, nedenaturující prostředí změna ph, iontové síly nízké ph, iontová síla

33 GST fůzní protein glutathion S-transferasa glutathion SDS elektroforesa

34 Pharmacia

35 Histidinová kotva R HN O HC C NH O HC C NH H 2 H 2 N N N N O Ni 2+ O O H 2 C N CH 2 O O CH O H N OH O NiNTA Agarosa stacionární fáze: NiNTA Agarosa His Bind HiTrap Chelating

36 In-fusion ligace

37 MBP (maltosu vázající protein)

38 GFP (zelený fluorescenční protein) HO Tyr 66 Ser 65 HO O NH N H CH 2 N H O Gly 67 O O 2 HO N HO N H N O O

39

40

41

42 Jak vysvětlit tvorbu inkluzních tělísek v bakteriích? overexprese proteinu chaperon příčiny: poměr protein : chaperon velké množství částečně sbaleného proteinu misfolded špatně sbalený agregát nativní protein

43 Inkluzní tělíska u eukaryot Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), , 2000

44 Dva modely tvorby inkluzních tělísek Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), , 2000

45 Výhody a nevýhody inkluzních tělísek (IB) výhody Vysoká produkce IB mohou být isolovány ve vysoké čistotě (40-90 %) Proteiny v IB jsou chráněny před proteasami Možnost produkce toxických proteinů nevýhody Obtížná renaturace, optimální postup nelze předpovědět Produkce nemůže být sledována testováním aktivity Hlavní kontaminací jsou oligomery a špatně sbalené nebo štěpené formy proteinu, které je problém odstranit

46 Izolace inklusních tělísek resuspendace buněčné pelety v pufru s inhibitorem proteas, DTT (5mM) a lysozymem přidat detergent (Triton X-100, DOC) + sonikace přidat DNasu I centrifugace x g 30 min 4 C opláchnout peletu pufrem s detergentem rozpustit peletu (inkluzní tělíska) v pufru s 6M guanidin-hcl a 25 mm DTT centrifugace x g 10 min důležitý krok změřit koncentraci proteinů v supernatant

47 Solubilizace inkluzních tělísek pufr + denaturační činidlo M guanidin/hcl nebo 8M močovina (! při 4 C krystalizuje) Alternativa: alkalické ph, detergenty např. N-laurylsarkosin, SDS (0,3-5%) buňky peleta supen. IB

48

49 Purifikace denaturovaných proteinů renaturace purifikace za nativních podmínek purifikace za denaturujících podmínek renaturace kompatibilita denaturujících podmínek s chromatografiemi

50 Renaturace hlavní parametry renaturace proteinů renaturační pufr: podmínky: renaturační techniky: typ pufru redoxní systém u proteinů s disulfidovými můstky ph aditiva teplota koncentrace proteinu koncentrace aditiva koncentrace redoxního činidla ředění dialysa/ultrafiltrace gelová chromatografie na koloně neexistuje univerzální postup!!! Refolding database

51 Redoxní systém pro proteiny s disulfidovými můstky je potřeba optimální koncentrace oxidačního i redukčního činidla, pro umožnění vytvoření správných disulfidových vazeb glutathion (GSH/GSSH) mol/l, molární poměr red : ox ~ od 1:1 do 10:1 cystein / cystin cysteamin / cystamin ph reakce > 9 (pka Cys v denaturovaném proteinu je 8,7)

52 Typ a koncentrace aditiva

53 Renaturační kity

54 Renaturační techniky Renaturační technika Dialýza Ředění Gelová chromatografie Renaturace na koloně Výhody / nevýhody Časová náročnost Velké objemy pufru Jednoduchá technika Záleží na rychlosti ředění Až stonásobně zředěný protein Sepadace agregátů od renaturovaného proteinu Lze použít vysoké koncentrace proteinu Agregáty může být obtížné vymýt z kolony Pouze malý objem nanášeného vzorku Jednoduché a rychlé Libovolný objem vzorku

55 Renaturace na koloně GSH/GSSG GSH/GSSG

56 Koncentrace proteinu výtěžek renaturace klesá s vyšší počáteční koncentrací proteinu µg/ml

57 Analýza renaturovaného proteinu SDS-PAGE analýza rozpustné a nerozpustné složky testování aktivity ELISA ne WB cirkulární dichroismus nebo infračervená spektroskopie DLS

58 Jak zlepšit rozpustnost rekombinantního proteinu??? snížit rychlost exprese snížení teploty kultivace použití slabšího promotoru změna kultivačního média přídavek prostetické skupiny nebo kofaktoru přídavek pufru kontrola ph použití low-copy plasmidu snížení koncentrace induktoru přídavek 1 % glukosy represe indukce lac promotoru laktosou z media (LB, ) přídavek polyolů (sorbitol) nebo sacharosy zvýšení osmotického tlaku akumulace osmoprotektantů v buňce exprese s chaperony a/nebo enzymy pomáhajícími správně sbalit protein GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, ClpB peptidyl prolyl cis/trans isomerasa (PPI's), disulfidoxidoreduktasa (DsbA), disulfidisomerasa (DsbC) cílení do periplasmatického prostoru přídavek leader sekvence (pelb, ompt) disulfidoxidoreduktasa (DsbA), disulfidisomerasa (DsbC) použití speciálních kmenů E.coli AD494 - mutace thioredoxinreduktasy (trxb) Origami - mutace thioredoxinreduktasy (trxb) + glutathionreduktasy (gor) fúzní proteiny

59 použití afinitní chromatografie Mono-specifická AC Skupinově-specifická AC Fůzní proteiny AC jednokroková purifikace enzymů, receptorů, protilátek ~ s využitím specifických ligandů jednokroková purifikace proteinů obsahujících obecnější vazebné místo jako jsou některé skupiny protilátek, glykoproteiny, NADP-dependentní proteiny,... jednokroková purifikace afinitní část je k proteinu připojena pomocí genového inženýrství

60 . stacionární fáze Mono-specifická AC vysoce poresní, dobře přístupné jak pro ligand, tak i pro protein Experiment Skupinově-specifická AC média jsou komerčně dostupná Fůzní proteiny AC média jsou komerčně dostupná kolona krátké silné krátké silné krátké silné ligandy průtok objem vzorku některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky vazba a desorbce závisí na průtoku nesmí být překročena kapacita kolony pokud je velké K D neměl by být vzorek moc naředěn některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky vazba a desorbce závisí na průtoku nesmí být překročena kapacita kolony některé jsou senzitivní k degradaci, je nutno dodržovat regenerační a skladovací podmínky opakované použití pouze pro stejný protein, riziko kontaminace vazba a desorbce závisí na průtoku nesmí být překročena kapacita kolony