10.2. Molekulární mikrobiologická diagnostika v klinické praxi Radek Horváth, Filip Růžička

Transkript

1 10.2. Molekulární mikrobiologická diagnostika v klinické praxi Radek Horváth, Filip Růžička V současné době se v klinické mikrobiologické diagnostice stále více prosazují molekulární biologické metody. Dnes již tradiční mikrobiologické diagnostické metody mají v některých případech z pohledu klinické praxe omezení v nízké senzitivitě, pomalosti a snížené schopnosti detekovat špatně kultivovatelné nebo nekultivovatelné mikroorganizmy apod. Tyto limity jsou do určité míry překonatelné právě pomocí molekulárně-mikrobiologických metod, které jsou kultivačně nezávislé a vynikají rychlostí, specificitou a vysokou citlivostí. Zavedení těchto metod do praxe rozšiřuje možnosti přímé mikrobiologické diagnostiky a s tím souvisejícího zvýšení úrovně péče o pacienty Metody molekulární biologické diagnostiky Molekulární diagnostika je v současné době převážně postavena na technologiích detekujících nukleové kyseliny, které jsou zásadní součástí struktury mikroorganizmů. Proto se v mikrobiologické diagnostice řadí mezi přímé diagnostické metody, na rozdíl od metod nepřímých, zejména tzv. sérologických, které detekují pouze protilátky proti antigenům mikroorganizmů. Z pohledu klinického i laboratorního je tedy třeba pamatovat na to, že metody molekulární diagnostiky jsou metody přímé a detekce může být úspěšná, pouze pokud je mikroorganizmus nebo alespoň jeho nukleová kyselina v klinickém vzorku skutečně přítomna. Přehled metod užívaných v klinické diagnostice Pro účely průkazu infekčních agens je možno použít řadu molekulárně biologických metod. V klinickém použití se ale uplatňují jen některé z nich, a to právě z důvodu jeho specifických požadavků na standardnost provedení, opakovatelnost měření, přesnost měření, rychlost a specificitu stanovení. Mezi další podmínky umožňující jejich uplatnění v rutinní laboratorní praxi patří také robustnost (odolnost), jednoduchost a možnost snadné a co možná jednoznačné interpretace výsledků. Hybridizační metody Hybridizační metody jsou založeny na prosté hybridizaci komplementárních řetězců nukleových kyselin, kdy dochází k vazbě testované molekuly ze vzorku na předem připravenou známou molekulu, tzv. sondu (probu). Vzniklá vazba je pak následně detekována. Přestože patřily mezi jedny z prvních molekulárněbiologických metod používaných v klinické praxi, pro svou jednoduchost a nenáročnost stále nacházejí uplatnění. Je ovšem nutno počítat s jejich nižší citlivostí. Velkou předností těchto metod je možnost rozpoznat velký počet různých podobných molekul NK. Toho lze využít například při rozlišení typů papilomavirů, kterých je dnes známo více než 100, ale pouze některé z nich jsou spjaty s rizikem rozvoje závažných onemocnění, jako je například karcinom cervixu. Metoda klasické hybridizace se značenou DNA sondou se i dnes využívá při detekci streptokoků, gonokoků či chlamydií (známá jako GenProbe ). Patologické laboratoře využívají metody in situ hybridizace, které detekují mikroorganizmy přímo v histologickém řezu nebo vzorku tkáně, a umožňují tak rozpoznání etiologické role mikroorganizmu při určitém patologickém procesu v konkrétním vzorku. Příkladem využití je například diagnostika papilomavirů nebo obecně intracelulárních patogenů. Nevýhodu nízké citlivosti hybridizačních metod se pokouší řešit metoda tzv. bdna (branched DNA; využívaná například firmou BayerDiagnostics, USA), která namísto amplifikace sekvence NK využívá amplifikace signálu generovaného v případě pozitivního výsledku detekce a která se v automatizovaném provedení využívá pro detekci virů HIV, HBV, HCV. Další hojně používanou je metoda hybrid capture assay s RNA sondou detekující hybrid RNA/DNA, kterou mnohé laboratoře využívají pro poměrně spolehlivou a levnou detekci virů HBV, HCMV a detekci a typizaci papilomavirů (výrobce Digene). V současné době se používají i další modifikace hybridizačních metod pracujících se sondami nanesenými na proužcích papíru, kde výhodou je jednoduchost provedení daná 1

2 čtením výsledku jako čárového kódu. Používají se například pro rozlišování typů virů hepatitid nebo opět pro typizaci papilomavirů. Amplifikační metody Podstatou amplifikačních metod je zmnožení prokazované NK, pokud je ve vzorku přítomna, a tedy i zesílení signálu. Z řady amplifikačních metod navržených pro diagnostiku mikroorganizmů doznala největšího rozvoje polymerázová řetězová reakce (PCR polymerase chain reaction). Z dalších amplifikačních metod, se kterými se v mikrobiologické diagnostice můžeme setkat je například dnes již téměř nepoužívaná ligázová řetězová reakce (LCR ligase chain reaction), Qß replikázová reakce; 3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication), častěji užívaná je metoda NASBA (nucleic acid sequence based amplification) Metodika odběru a transportu klinických vzorků do laboratoře Metodami molekulární diagnostiky lze vyšetřit téměř jakékoliv vzorky. Nejčastěji se vyšetřují tělní tekutiny (likvor, BAL, slzy, sputum, sérum, plazma, sperma, moč), dále tkáně, biopsie kůže, katetry, vzorky implantátů apod. Pokud se vyšetřuje vzorek krve, obvykle se odebírá jako krev nesrážlivá, nejčastěji v roztoku EDTA. Lze však vyšetřit i krevní plazmu po odběru srážlivé krve. Pro odběry vzorků pro účely molekulárního mikrobiologického vyšetření platí podobné zásady jako pro odběry pro standardní mikrobiologické metody. Kvůli vysoké citlivosti molekulárněbiologických metod je nezbytné při odběru a manipulaci se vzorky určenými pro tato vyšetření přísně dodržovat zásady asepse až sterility. Je také třeba pamatovat, že nestačí zabránit kontaminaci živými mikroorganizmy, ale je třeba zamezit i kontaminaci jejich zbytky obsahujícími NK. Kontaminace vzorku, ať již samotným mikroorganizmem, či jeho NK, vede k falešné pozitivitě, případně k inhibici reakce, a ztěžuje správnou interpretaci výsledku. Zvýšené riziko kontaminace hrozí zvláště při odběru vzorku. Ke kontaminaci může dojít, zejména pokud není použit dekontaminovaný odběrový materiál. Zdrojem kontaminace může být i samotný pracovník provádějící odběr. Pro úspěch diagnostiky je také velmi důležité správné provedení odběru klinického vzorku. Vzhledem k tomu, že se jedná o přímou diagnostickou metodu, je nezbytné odebrat vzorek, ve kterém lze předpokládat v dané fázi onemocnění přítomnost sledovaného mikroorganizmu. Po správný odběr je tedy nezbytné znát patogenezi a typický průběh předpokládaného onemocnění. Nelze například počítat s přítomností částic chlamydií v séru, a to ani v případě, že v tomto typu vzorku byly nalezeny protilátky proti chlamydiím. Tyto mikroorganizmy se vyskytují převážně na sliznicích, proto je při podezření na chlamydiovou infekci vhodnější odebírat vzorek stěrem z příslušné sliznice. Pro co možná nejlepší odhad fáze onemocnění, ve kterém se pacient právě nachází, je vhodné využít také poznatky z jiných vyšetření. Například nemusí být přínosné odebírat vzorky v době, kdy pacient již onemocnění prodělal a v séru je přítomen pouze anamnestický titr protilátek třídy IgG. A naopak, protilátky třídy IgM obvykle indikují právě probíhající onemocnění. Pro zpracování molekulárními metodami není třeba zachovat mikroorganizmy životaschopné, a vzorky tedy lze zmrazit nebo jinak vhodně uchovat. Toho se využívá při transportu a také například při shromažďování vzorků pro vyšetření většího počtu vzorků najednou v zájmu snížení nákladů na vyšetření. Kvůli stabilitě NK je však potřeba rozlišovat vzorky pro detekci DNA a vzorky, ve kterých se bude sledovat přítomnost RNA. Molekuly DNA jsou v porovnání s molekulami RNA relativně stabilní a vzorky, ve kterých bude prokazována přítomnost DNA, lze bez újmy dopravit do laboratoře do v průběhu 24 h i při +4 C. Vhodnější, zejména pro delší transport, je ovšem doprava těchto vzorků ve zmraženém stavu. V diagnostice infekcí způsobených viry s genomem tvořeným molekulami RNA je nutné ve většině případů počítat s nižší stabilitou RNA. Proto lze vzorek přechovávat a transportovat při +4 C maximálně po dobu 4 hodin. Pokud je nutný delší transport nebo vyšetření nebude bezprostředně následovat, je nutné vzorky ihned po odběru uchovat zmražené až do doby jejich zpracování. Špatný 2

3 způsob transportu vzorku může mít za následek úplnou nebo částečnou degradaci NK, a tím způsobenou falešnou negativitu stanovení. Molekulární diagnostika v mikrobiologii je zaměřena na cílené vyšetřování konkrétních mikroorganizmů nebo alespoň skupin mikroorganizmů. Je to dáno nutností použití specifických komplementárních sekvencí (sond, primerů). Proto je nezbytné, aby klinik indikující vyšetření sdělil laboratoři, které konkrétní mikroorganizmy je třeba ve vzorku hledat Zpracování vzorku před izolací Klinické vzorky odebrané pro účely molekulární mikrobiologické diagnostiky jsou nejčastěji vzorky nesrážlivé periferní krve, mozkomíšní mok nebo výtěry sliznic. Přesto se můžeme setkat téměř s jakýmkoliv typem vzorku. Správná příprava a úprava vzorku před samotnou izolací NK může výsledky diagnostiky zásadně ovlivnit. Obecně platí, že vzorky je třeba před izolací NK převést do stavu vhodného pro zvolenou izolační metodu, obvykle se materiál a převádí do formy roztoku nebo alespoň suspenze. Vzhledem k omezenému vstupnímu objemu vzorku, který lze vložit do reakce, se materiál koncentruje tak, aby se zvýšila koncentrace složek, které mohou obsahovat hledanou NK. Nestejnorodé vzorky se také homogenizují. Čím lépe se podaří vzorek homogenizovat a zkoncentrovat, tím vyšší výtěžky NK lze při jejich izolaci poté získat, a tím vyšší je pravděpodobnost záchytu hledaného agens. Například vzorek sputa určený pro diagnostiku tuberkulózy je sice tekutý, ale nehomogenní a viskózní. Přidáním chemických činidel (například acetylcysteinu) jej lze ztekutit a poté mechanicky homogenizovat. Vzorky pevných tkání (biopsie jater u hepatitid, biopsie plic u těžkých pneumonií, vzorky kostí, srdečních chlopní u endokarditid aj.) lze před izolací hluboce zmrazit a homogenizovat roztlučením, rozložit chemicky, enzymaticky anebo alespoň rozkrájet na co nejmenší kousky. Při práci se vzorkem je třeba zvažovat a následně minimalizovat rizika pro laboratorní personál. Toho lze dosáhnout zavedením a důsledným dodržováním adekvátních hygienických opatření. Kromě toho je nutno v maximální možné míře využívat možnosti vakcinace, což platí především pro snížení rizika infekce virem HBV nebo M. tuberculosis. Při práci se vzorky, které mohou obsahovat nebezpečná infekční agens, je vhodné vzorek dekontaminovat, tj. snížit riziko infekce usmrcením nebezpečných agens tak, aby nedošlo k dezintegraci hledané NK. Za rizikové mikroorganizmy jsou považovány například původci tuberkulózy (Mycobacterium tuberculosis), tularémie (Francisella tullarensis), leptospiry, Coxiella burnetii, viry chřipky, SARS, Ebola, viry hepatitid, případně i méně infekční, avšak nebezpečné viry HIV, HPV apod. A naopak, je třeba pamatovat také na riziko kontaminace vzorků ze strany personálu laboratoře. Zejména jde o příslušníky normální mikroflóry kůže a sliznic a respiračními patogeny (konkrétně o viry a mykoplazmata). Proto se vzorky otevírají a zpracovávají v laminárním boxu, kde je laboratorní pracovník oddělen od klinického vzorku proudem vzduchu. To chrání nejen samotný vzorek před kontaminací, ale také samotného pracovníka před infekcí. Přehled nejčastěji zpracovávaných vzorků: 1) Tělní tekutiny Periferní krev. Vzorky periferní krve se odebírají zejména pro detekci NK bakterií a kvasinek při podezření na generalizovanou infekci nebo bakteriemii (například sepse, borelióza, kvasinky, toxoplazmóza či malárie apod.), dále při potřebě vyšetření virů, jejichž životní cyklus zahrnuje infekci buněk krve (parvovirus, cytomegalovirus, EBV apod.). Samotnou krev nelze považovat za zcela sterilní, neboť i u zdravého jedince může obsahovat mikroorganizmy (zvláště bakterie a kvasinky) či jejich NK, které se zde v malém množství mohou dostat po překonání kožních či slizničních bariér. Tato přechodná fyziologická bakteriemie není provázena klinickými příznaky a mikroby či jejich NK jsou krevního oběhu rychle odstraněny. Periferní krev se vkládá do izolace NK přímo, bez větších úprav, protože jde o poměrně homogenní materiál, který ale obsahuje variabilní množství buněčné frakce, a ovlivňuje tak výtěžky NK při jejich izolaci. To pak může ovlivnit výsledky kvantitativních diagnostických metod. 3

4 Pro specifické účely, například detekce cytomegaloviru z frakce leukocytů, se izolaci NK předřazuje chemická nebo fyzikální (zmražení a rozmražení vzorku) lýza erytrocytů, která uvolní obsah erytrocytů. Poté je vzorek prostým promytím a centrifugací zbaven většiny uvolněného RNA z erytrocytů, které mohou také inhibovat polymerázu či jinak interferovat s používanými molekulárněbiologickými metodami. V takto zpracovaném vzorku zůstávají z větší části již jen promyté leukocyty. To může být přínosné zejména u intracelulárních parazitů, u kterých se předpokládá jejich přítomnost v leukocytech, příkladem je výše uvedený průkaz cytomegaloviru. Na druhé straně musíme akceptovat ztrátu krevní plazmy, která často obsahuje i hledané NK ve volné podobě nebo obsahuje viry či bakterie, které nelze takto centrifugovat pro jejich nízkou molekulovou hmotnost nebo které mohou být procesem poškozeny (například viry hepatitid jsou příliš malé, bakterie borelie jsou snadno poškoditelné). Plazma či sérum. Obvykle se vkládá do izolace NK přímo bez úprav. Plazma je nejdůležitějším vzorkem pro detekci virů, které se uvolňují do krve, především virů hepatitid C a B. Mohou zde však být přítomny NK i dalších mikroorganizmů. V plazmě standardně separované sedimentací nesrážlivé plné krve mohou být významné koncentrace leukocytů, ze kterých se při izolaci uvolní NK a případně také intracelulární paraziti. Plazmu není vhodné zejména zahřívat, neboť zahříváním se sráží (denaturují se) bílkoviny, což negativně ovlivní další průběh izolace a sníží výtěžky NK. Výhodou plazmy je její homogenita, umožňující standardní kvantifikaci koncentrace NK ve vzorku vztažením zjištěného množství NK na vstupní objem vzorku (například na 50 µl plazmy). V některých případech, například při detekci HIV, lze vzorky centrifugovat při vysokém přetížení, a tak dosáhnout zkoncentrování virových částic sedimentací. Moč. Je homogenním materiálem, který se do izolace NK vkládá bez úprav. V moči lze hledat původce mnoha onemocnění, zejména chlamydie, méně často gonokoky, legionely, borelie, viry (například cytomegalovirus) apod. Význam vyšetření moči metodami molekulární diagnostiky je předmětem aktuálních výzkumů a například na názor detekci legionel či borelií v moči není dosud jednotný. V mnoha případech se jedná o doplňkové vyšetření, snad s výjimkou detekce chlamydií (C. trachomatis). Moč obsahuje variabilní koncentrace buněčné nebo pevné frakce, což může činit obtíže při kvantitativním stanovení. Před izolací NK lze buněčnou složku koncentrovat centrifugací, a tím zvýšit šanci záchytu, toho se využívá například při průkazu chlamydií. Běžně odebraná moč, pomocí tzv. metody středního proudu, bývá kontaminována mikroflórou zevního ústí uretry, často poměrně značným množstvím bakterií. Riziko této kontaminace lze snížit odběrem moči pomocí katetru. Sputum. Je nehomogenní viskózní materiál, který je vhodné před izolací NK chemicky ztekutit a poté jej promícháním homogenizovat. Obsahuje variabilní podíl buněčné frakce. Sputum se odebírá pro vyšetření respiračních patogenů mykobakterie, legionely, chlamydie a mykoplazmata, bordetely, vzácněji virů (cytomegalovirus, ) apod. Punkáty. Pro účely molekulární diagnostiky se odebírají zejména punktáty synoviální tekutiny z kloubů, kde lze vzácně detekovat například borelie ve fázi postižení kloubů nebo původce infekčních artritid. Vzorek vstupuje do izolace NK přímo, bez předchozích úprav. Sperma. Je nehomogenní materiál, který se odebírá zejména při podezření na pohlavně přenosné choroby nebo pro vyloučení chlamydiové infekce u vzorku určeného pro in vitro fertilizaci. Vzorek vstupuje do izolace NK přímo, bez úprav. Mozkomíšní mok (likvor). Je primárně sterilní materiál, který se odebírá zejména pro diagnostiku boreliózy ve stadiu napadení CNS, neurotropních virů (včetně HSV a VZV), méně často pak pro průkaz bakteriálních původců meningitid apod. Jde o čirý, homogenní materiál, který lze centrifugací zkoncentrovat. Zpravidla ale není k dispozici velké množství likvoru, proto se odebraný vzorek vkládá přímo do izolace NK bez předchozí úpravy. 2) Ostatní materiály 4

5 Výtěry a stěry. Provádějí se pomocí sterilního tamponu nebo kartáčku. Stěry ze sliznic respiračního traktu se používají pro vyšetření respiračních patogenů. Častějšími vzorky tohoto typu jsou však výtěry z pochvy, stěr z cervixu, výtěr s uretry, tedy vzorky určené pro detekci původců pohlavně přenosných chorob (chlamydie, gonokoky, mykoplazmata, ureaplazmata, papilomaviry aj.). V mnoha laboratořích představují výtěry pro detekci chlamydií nejčastější typ vzorku pro vyšetření metodami molekulární diagnostiky. Většinou se tampony s výtěrem vloží do fyziologického roztoku a třepáním se do něj uvolní zachycený klinický materiál. Do procesu izolace NK se pak vkládá až tento vzorek, který je možné centrifugací ještě zkoncentrovat, a tak zvýšit pravděpodobnost záchytu patogenu. Biopsie, vzorky pevných tkání. Odebírají se méně často a zpravidla jen pro specifická vyšetření. Setkat se lze prakticky s jakýmkoliv typem materiálu (biopsie jater pro detekci virů hepatitid, kožní biopsie pro detekci borelií nebo dermatomykóz, vzorky chlopní pacientů s infekční endokarditidou, plicní biopsie pro detekci mykobakterií nebo plísní apod.). Před izolací NK může být potřebné vzorky homogenizovat. Vzorky z katetrů, implantátů apod. Metody molekulární diagnostiky umožňují detekovat i mikroorganizmy uchycené v podobě biofilmu na površích implantátů. Takové vzorky se zatím zpracovávají experimentálně. Nejprve je potřeba mikroby z povrchu uvolnit do roztoku, například seškrabováním či sonifikací do fyziologického roztoku. Získaná suspenze se pak vkládá přímo do izolace NK. Z povrchů cévních katetrů lze detekovat původce septických stavů, mimo jiné i původce systémových mykóz u pacientů s febrilní neutropenií. Z dalších implantátů, jejichž povrchy bývají kolonizovány bakteriálními i fungálními patogeny, lze uvést například kloubní náhrady, umělé chlopně, cévní protézy, shunty apod Izolace nukleových kyselin pro účely molekulární mikrobiologické diagnostiky Při rutinní molekulárněbiologické detekci mikrobiálních patogenů v klinických vzorcích je potřeba vkládat do reakce charakterizovanou a čistou NK. Příměsi, které klinický vzorek obsahuje, totiž působí například jako inhibitory polymerázy (viz metoda PCR) či interferují s výsledkem detekce. Kromě toho bývá hledaná NK ve vzorku obsažena v příliš nízkých koncentracích, a vzorek je tedy nutno zakoncentrovat. Pro tyto účely existuje velké množství použitelných metod. V minulosti se používaly standardní biochemické separační metody s využitím postupné extrakce organických složek fenolem, chloroformem, etanolem apod. Pro účely rutinní diagnostiky však tyto metody nejsou kvůli značné náročnosti na práci a čas vhodné. Proto se současné době k izolaci nukleových kyselin používá komerčních souprav pro izolaci DNA a/nebo RNA. Tyto soupravy (tzv. kity) jsou navrženy a testovány přímo pro účely rutinní analýzy NK v humánní medicíně a jsou náležitě certifikovány podle požadavků evropské legislativy, která vyžaduje mj. certifikát o shodě pro zdravotnické prostředky pro in vitro použití (označující se jako CE IVD ). Výhodou těchto komerčních metod je standardnost, rychlost a menší náročnost na provedení. Moderní metody izolace NK jsou založeny na dvou metodikách. První využívá schopnosti vazby NK na amorfní SiO 2. Vzorek je lyzován a NK se zachytává na kolonkách na vrstvě SiO 2, je proplachována a čistá NK je pak uvolněna elucí do roztoku o nízké iontové síle. Druhý postup využívá vazby NK na magnetické kuličky pokryté specifickými anti-nk protilátkami nebo jinými materiály vázajícími NK. Kuličky jsou propláchnuty v proplachovacích roztocích s využitím magnetu a NK je eluována specifickými roztoky. Z pohledu praktického mikrobiologického vyšetření si laboratoře metody izolace NK vybírají především podle plánovaného počtu a typu vyšetřených vzorků. K dispozici je řada komerčních produktů založených na obou popsaných metodikách a určených pro univerzální izolace z různých klinických materiálů. Ty lze využívat pro izolaci NK z prakticky všech typů klinického materiálu, ovšem s nutností případné adekvátní předizolační úpravy vzorku. Pro účely rutinní mikrobiologické diagnostiky je však lépe volit manuální nebo automatické aplikace, které umožňují specificky izolovat DNA virů z plazmy, RNA virů z plazmy, DNA bakterií z výtěrů, DNA či RNA z tkání apod. Izolační 5

6 kity bývají přímo validovány na společné použití konkrétními PCR detekčními soupravami nebo samotný proces izolace může být součástí komplexního automatizovaného detekčního procesu. V současné době se v regionu střední Evropy nejčastěji používají komerční izolační kity a izolátory firem Abbot, biomerieux, Qiagen, Roche Cobas, Roche MagNA Pure, Siemens. Laboratoře s velkým množstvím zpracovávaných vzorků jednoho typu (například vyšetření C. trachomatis z výtěrů; vyšetření HCV z plazmy) často volí právě velkokapacitní automaty s maximální mírou automatizace, s minimálním vstupem manuální práce a vysokou mírou standardizace. Na druhou stranu, s rostoucí mírou automatizace rostou zpravidla také přímé materiálové náklady na izolaci NK. Citlivost molekulárněbiologických metod je významně ovlivněna již ve fázi izolace NK. Velkou roli zde hraje objem zpracovávaného vzorku. V případě komerčních izolačních souprav určených pro rutinní diagnostiku vstupuje obvykle do izolačního procesu objem µl vzorku a výsledný eluční objem pak bývá µl. Čím větší je vstupní objem vzorku a čím vyšší je poměr mezi vstupním objemem a elučním objemem, tím více NK v izolátu může být koncentrováno a tím větší je pravděpodobnost záchytu NK hledaného agens. Závislost však není lineární z důvodu současně se snižující efektivnosti izolace. Optimální protokol pro izolaci NK musí být vždy stanoven specificky pro typ klinického vzorku, pro specifický mikroorganizmus, a musí být optimalizovaný podle work-flow konkrétní laboratoře Amplifikační metody detekce NK. Polymerázová řetězová reakce (PCR) V mikrobiologické diagnostice dnes zcela převažují metody založené na technologii PCR, a to zejména kvůli možnosti detekovat relativně nízké koncentrace NK sledovaných mikrobiálních patogenů na pozadí vysokých koncentrací humánních NK Metoda PCR v mikrobiologické diagnostice Polymerázová řetězová reakce (PCR polymerase chain reaction) je založena na enzymatické amplifikaci NK řízené tepelnými změnami. Specifický úsek (sekvence) DNA (v případě použití reverzní transkriptázy i RNA) hledaného mikroorganizmu je vybrán díky specifickým oligonukleotidovým sondám, tzv. primerům, a následně za účasti termostabilní polymerázy namnožen do snadno detekovatelného množství. Standardní PCR detekuje sekvence DNA a je vhodná pro průkaz většiny mikroorganizmů, včetně bakterií, kvasinek, plísní, prvoků a DNA-virů. Pro průkaz RNA-virů se používá reverznětranskripční PCR (rtpcr), kdy je RNA hledaného mikroorganizmu (zejména RNA-viry) nejprve konvertována na DNA pomocí reverzní transkriptázy. Citlivost detekce je možné zvýšit metodou nested PCR, při které se úsek hledané NK amplifikuje dvoufázově, nebo její moderní variantou single-tube nested PCR. Technika multiplex PCR, při které může proběhnout současně více amplifikačních reakcí v jedné zkumavce díky použití více párů primerů, je vhodná pro současnou detekci více mikroorganizmů nebo více cílových sekvencí jednoho mikroorganizmu. Pro kvantitativní popis infekce je používána technika kvantitativní PCR (qpcr). Metoda standardní PCR s elektroforetickou analýzou amplifikačního produktu (tzv. end-point PCR) byla zavedena do rutinní praxe ve většině mikrobiologických laboratoří. Je vhodná pro nízkokapacitní vyšetřování nebo detekci méně častých patogenů. Modernější a dnes již převažující techniky real-time PCR (s detekcí amplifikačního produktu v reálném čase) výrazně zvyšují atraktivitu molekulární mikrobiologické diagnostiky pro klinické pracovníky i laboratoře díky vyšší rychlosti, přesnější kvantifikaci, menšímu riziku kontaminace, nižší pracnosti a stále se zvyšující reproducibilitě. Uspořádání laboratoří a jejich vybavení pro detekci NK pomocí PCR. Mikrobiologické laboratoře jsou již zpravidla pro provádění detekce NK patogenních mikroorganizmů dobře vybaveny. Z prostorového hlediska je třeba oddělit tento typ provozu od ostatních zejména z důvodu rizika kontaminace. Zde totiž běžná mikrobiologické sterilita nedostačuje, protože reakce může být kontaminována a znehodnocena i mrtvými mikroorganizmy či zbytky jejich NK. Z důvodu rizika kontaminace reakce je nezbytné zajistit, aby nedošlo ke křížení provozů, tj. práce s čistými 6

7 chemikáliemi, práce s klinickými vzorky a izolace NK, provedení samotné PCR a detekce produktu. To platí zejména při použití standardní PCR s elektroforetickou detekcí amplifikačního produktu, kdy je nezbytné spolehlivě oddělit laboratoř určenou pro tento typ analýzy amplifikačního produktu od ostatních prostor. Laboratoře využívající pouze real-time PCR si vystačí s menšími a jednoduššími prostory. Samotná příprava amplifikační reakce se provádí v laminárním nebo v tzv. PCR boxu; kvůli zabránění kontaminace. Dále je třeba disponovat samostatnou sadou pipet samozřejmě s filtrovanými špičkami, suchým termostatickým blokem (tzv. dry block), centrifugou (nebo tzv. pikofugou) a přístrojem pro provádění PCR, tzv. termocyklerem. Takové vybavení stačí pro práci s real-time PCR. Při použití PCR s elektroforetickou detekcí amplifikačního produktu je ještě třeba disponovat vybavením pro gelovou elektroforézu NK a samostatnou sadou pipet. Pro mikrobiologické rutinní aplikace je stále více vyžadována certifikace termocykleru pro použití pro in vitro diagnostiku (označení přístroje CE IVD) nebo lze použít takto necertifikovaný termocykler v kombinaci s certifikovaným komerčním kitem pro stanovení specifického patogenu. Vzhledem k řadě nesporných výhod, jako je menší pracnost a náročnost na prostorové vybavení, se v rutinní mikrobiologické diagnostice dominuje využití real-time PCR. V současné době se na trhu ve střední Evropě používají tzv. real-time termocyklery firem Roche (LightCycler; s rotorem a průběhem reakcí v kapiláře, nebo nověji i velkokapacitní přístroje s reakcí v polypropylénové PP zkumavce; certifikovány CE IVD), velkokapacitní přístroje firmy ABI, přístroje firmy Qiagen (dříve známé jako RotorGene), přístroje BioRad, Jena Diagnostics, nízkokapacitní a velmi rychlé přístroje SmartCycler, řada nových přístrojů s nižší cenou (Slan, Bioair apod.). Pro laboratoře zpracovávající velké množství vzorků jsou již nyní k dispozici automatické přístroje s minimálním vstupem lidské práce (Abbot, Roche aj.), které jsou připraveny pro detekci specifických patogenů ze specifických materiálů (ze séra viry hepatitid, HIV, z výtěrů či moči chlamydie apod.). Tyto automaty jsou využívány také pro detekci závažných kontaminant v krvi a krevních produktech na transfuzních stanicích, kde se takto detekují zejména viry hepatitidy C a B, HIV, někdy parvovirus B19 a HTLV ve vzorcích krevní plazmy. Tyto typy vzorků je možno vyšetřovat v tzv. poolech, kdy se ve stejném poměru smíchá několik vzorků a vyšetří se jako jeden vzorek. Značně se tak šetří náklady, ale dochází ke ztrátě citlivosti. Dostatečným počtem opakování celého procesu detekce lze ovšem i při vyšetření poolu vzorků dosáhnout cenově výhodného poměru cena/kvalita při zachování vysoké citlivosti detekce Falešná pozitivita a falešná negativita Riziko falešné pozitivity V mikrobiologické diagnostikce je potřebná co nejvyšší citlivost metody, která u PCR běžně dosahuje jednotek molekul templátu v reakci. Na druhou stranu, vysoká citlivost detekce zvyšuje i riziko vzniku kontaminace, kdy i velmi nízké úrovně kontaminace specifickým úsekem NK mohou vyústit ve falešnou pozitivitu. Ke kontaminaci může snadno dojít již při manipulaci silně pozitivních vzorků v blízkosti vzorků negativních, tzv. cros-contamination. Toto hrozí například u malých částic virů, jako je parvovirus, anebo obecně v případě manipulace s jakýmkoliv vzorkem s obsahem vysoce koncentrovaného mikroorganizmu. Mnohem častější a pro metody založené na principu PCR je charakteristické riziko kontaminace amplikony, tj. amplifikačními produkty PCR. Tyto amplikony mají zpravidla nízkou molekulovou hmotnost a po laboratorním prostoru se formou aerosolu či prachu velmi snadno rozšíří. Jako specifický templát pak snadno kontaminují další reakce PCR, které tento typ templátu amplifikují. Vzhledem k jejich snadnému šíření a vysoké odolnosti vůči dekontaminaci tak mohou snadno vést k výpadkům provozu laboratoře a případně až k nutnosti zcela změnit metodiku PCR detekce konkrétního mikroorganizmu. Takovou kontaminaci je možné snadno zjistit používáním systému reakčních kontrol (viz dále). Kontaminaci amplikony lze zabránit zejména dodržením standardních pravidel správné 7

8 laboratorní praxe. Při nižších hladinách kontaminace laboratorního prostředí amplikony lze s výhodou využít kombinace použití dutp v PCR reakci (začlení se namísto části dttp) a přidání enzymu uracil- DNA-gylosylázy, která před samotným započetím PCR reakce rozštěpí kontaminující amplikony (jež obsahují dutp), a poté se při prvním cyklu PCR enzym denaturuje a inaktivuje. Takto lze omezit následky nízkých úrovní kontaminace, ovšem za cenu jistého zvýšení nákladů na detekci. K falešné pozitivitě může dojít také v důsledku polymorfizmů v cílové sekvenci templátu. Ačkoliv je možné velmi dobře nastavit specificitu vazby oligonukleotidů na cílovou sekvenci, může se stát, že se oligonukleotid naváže i na sekvenci ne zcela komplementární. Dojde k tomu v případě snížení specificity vazby například z důvodu nevhodné teploty hybridizace (chyba návrhu teplotního profilu reakce; příliš vysoká koncentrace podobného templátu; neoptimální chemické složení reakce, například vysoká koncentrace Mg2+ iontů). V takovém případě se pak oligonukleotidy mohou vázat méně specificky. K tomuto problému může dojít zejména u hybridizačních reakcí s jednou sondou. V případě metody real-time PCR (například ve formátu TaqMan) by ale pro vznik falešně pozitivního signálu bylo nutno kombinovat chybnou vazbu dvou primerů a jedné sondy, což je značně nepravděpodobné. Přesto k tomuto jevu dojít může, například při detekci borelií ze silně infikovaného klíštěte byly zaznamenány případy falešné pozitivity kvůli vazbě oligonukleotidů na fylogeneticky příbuzné spirochety. Nespecifické vazby primerů a sond jsou značným rizikem zejména při typizaci sekvenčně značně příbuzných typů mikroorganizmů (některé typy pailomavirů, herpesvirů aj.). Riziko falešné negativity K falešné negativitě může dojít již v důsledku selhání izolace NK. Častějším důvodem však bývá inhibice enzymů amplifikační reakce, obvykle látkami pocházejícími z klinického materiálu. Reakci PCR mohou inhibovat zbytky hemu ze vzorků krve, ale také například příliš vysoká koncentrace NK ve vzorku. Současné metody izolace NK si již s běžnými ihnibitory umí dobře poradit. Přesto k úplným nebo částečným inhibicím běžně dochází. V mikrobiologii se s nimi často potkáme při vyšetření vzorků spermatu, sražené krve, špatně uchované krve, moči, vzorků pevných tkání, stolice. Samotnou inhibici lze poměrně snadno kontrolovat začleněním správných reakčních kontrol, konkrétně jde o tzv. interní standard indikující skutečnost, že reakce proběhla správně. Při kvantitativních stanoveních je třeba počítat s možností projevu ihnibice v podobě podhodnocení stanovené koncentrace NK ve vzorku. Další příčinou falešné negativity jsou nevhodně navržené oligonukleotidové primery či sondy, případně výskyt polymorfizmu cílových nukleotidových sekvencí u sledovaných mikroorganizmů. V přírodě je většinou přítomno mnohem více variant sekvencí NK, než jsme schopni sekvenací odhalit. Vysoký podíl nedetekovaných typů nebo variant virů lze nalézt zejména u rychle mutujících RNA virů. V rutinní diagniostice samozřejmě není možné pokrýt všechny známé a neznámé sekvenční varianty. Při návrhu oligonukleotidů jsou zpravidla preferovány sekvence, které se vyskytují častěji; sekvence vzácné se pak pomíjejí. Přesto je pro eliminaci tohoto rizika třeba neustále inovovat design detekčních metod a i méně obvyklé či nově zjištěné polymorfizmy v maximální možné míře zahrnout do spektra příslušné metody. Do jisté míry je možné sekvenční polymorfizmy překlenout metodikou tzv. degenerovaných oligonukleotidů nebo metodikou směsí specifických oligonukleotidů. Důsledkem polymorfizmů může být nejen falešná negativita, ale při menších rozdílech také podhodnocení kvantifikace z důvodu nižší efektivity vazby oligonukleotidů na nezcela komplementární templát. Týká se to zejména HIV a jiných rychle mutujících virů. Dalším častým důvodem falešné negativity může být ztráta cílové sekvence, typicky pokud je tato lokalizována na plazmidu. Ke ztrátám plazmidů u mikroorganizmů v jisté míře dochází a toto riziko se v rutinní praxi již několikrát projevilo. Například při detekci C. trachomatis je mnoho rutinních metod cíleno do sekvence kryptického plazmidu, který je v buňce chlamydie obsažen v mnoha kopiích. To je sice výhodné kvůli zvýšení citlivosti detekce, na druhou stranu existuje významné procento kmenů chlamydií, které tento plazmid ztratily. Aby bylo možno detekovat také kmeny, bylo potřeba metodu obohatit o současnou amplifikaci úseku genomové chromozomální DNA. Ta je v buňce přítomna vždy, 8

9 ale jen v jedné kopii. Takto je možno detekovat s vysokou citlivostí kmeny s plazmidem a současně též kmeny bez plazmidu, i když někdy méně citlivě. V poslední době se ukazuje, že systematická diagnostika zaměřená na určité konkrétní sekvence NK ve spojení s účinnou léčbou, eradikací nebo prevencí může představovat reálný selekční tlak. Díky němu pak může dojít k selekci populací mikroorganismů, které diagnostice unikají. Takové mikroorganismy pak mohou dlouhodobě unikat pozornosti. Řešením tohoto nebezpečí je zejména neustálé sledování epidemiologických údajů a nejnovějších poznatků klinické mikrobiologie a neustálé zlepšování diagnostických metod Systém reakčních kontrol pro mikrobiologickou diagnostiku Pozitivní kontrola. Riziko falešné negativity v důsledku selhání samotné polymerázové reakce se kontroluje pomocí tzv. pozitivní kontroly, která se provádí zpravidla jedna na celou vyšetřovanou sadu vzorků a musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě. Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek. Pozitivní izolační kontrola. Metodicky správnější je však použití tzv. pozitivní izolační kontroly, při které se pozitivní kontrola přidává již do vzorku před izolací NK. Pozitivní kontrola tak projde celým procesem izolace, amplifikace i detekce a kontroluje efektivitu izolace NK i samotnou amplifikační reakci. Jako pozitivní kontrola se v mikrobiologických aplikacích (například kvalitativní stanovení M. tuberculosis, C. trachomatis aj.) nejčastěji používá plazmid, který obsahuje cílovou sekvenci templátu pro PCR. Takový plazmid se získává inzercí specifického amplikonu do samotného plazmidu s následným namnožením, například v buňkách E. coli. Poté se plazmid z kultury izoluje a na závěr se kontroluje jeho koncentrace a čistota. Kvantitativní standard. Plazmid sloužíci jako pozitivní kontrola může být také ředěn do ředící kalibrační řady a použit jako kvantitativní standard, tzv. kalibrátor. Ten se používá pro tvorbu kalibrační křivky při kvantitativním stanovení mikrobiální infekce pomocí kvantitativní PCR. V rutinní diagnostice se takový kalibrátor používá například při diagnostice cytomegalovirových infekcí nebo při kvantitativním průkazu virů hepatitid, kdy je třeba koncentraci patogenu měřit a sledovat. Při detekci RNA virů (například virů hepatitidy C, HIV, enterovirů apod.) se jako pozitivní kontroly i kalibrátoru používá uměle vytvořená molekula RNA, která se připravuje jako obdoba přirozeného templátu pro reverzně transkripční PCR (rtpcr) metodou in vitro transkripce. Takto připravené transkripty se purifikují a měří se jejich koncentrace. Problémem je jejich uchovávání, protože stabilita molekul RNA je v porovnání s DNA nižší. Interní standard. Rizika falešné negativity v důsledku inhibice reakce se kontrolují tzv. interním standardem (někdy též zvaným interní kontrola), který je zpravidla uměle připraven a je přidáván buď do samotné amplifikační reakce, nebo do vzorku před izolací NK. Přidání interního standardu do vzorku před izolací je metodicky správnější, protože tak lze kontrolovat jak případnou chybu při izolaci NK, tak inhibici v celém procesu detekce. Procesně jednodušší je přidání interního standardu do samotné amplifikační reakce. Takto je však kontrolována pouze inhibice PCR, nikoliv celý postup, včetně účinnosti izolace NK. Interní standardy se připravují nejčastěji jako úseky NK ohraničené sekvencemi primerů používaných pro amplifikaci specifické sekvence NK hledaného patogenu. Při detekci mikroorganizmů s genomem tvořeným DNA se používají interní standardy připravené tzv. MIMICS metodu, kdy je uměle připravený úsek NK ohraničený sekvencemi specifických primerů začleněn do plazmidu a ten je pak používán jako interní standard. V případě detekce RNA virů, zejména hepatitidy C a HIV, je výhodné používat namísto takto uměle připraveného klonovaného interního standardu koamplifikaci tzv. house-keeping genů či transkriptů (gen v eukaryotické buňce, který je exprimován ve všech typech buněk a ve všech vývojových stadiích; produkty kódované provozními geny jsou nezbytné pro základní funkce buňky). Použití house-keeping sekvencí například pro kontrolu detekce viru HCV metodou rtpcr vyžaduje 9

10 výběr sekvencí exprimujících se ve stabilní a poměrně nízké úrovni a vyskytující se v takových klinických materiálech, jaké se používají pro detekci tohoto viru (tedy převážně krevní plazma). Negativní kontrola. Rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace při přípravě mastermixů (reakčních směsí pro provádění PCR) či při přidávání vzorků se kontrolují použitím tzv. negativní kontroly, která se provádí zpravidla jedna na celou vyšetřovanou sadu vzorků. Jde o přidání sterilní vody (zaručeně bez přítomnosti NK) do amplifikační reakce namísto vzorku. Pokud tato kontrola generuje v amplifikační reakci signál, je reakce pravděpodobně kontaminována. V takovém případě by měly být všechny výsledky současně provedených testů označeny jako nevalidní a je třeba je opakovat. Izolační negativní kontrola. Rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace procesu izolace NK lze kontrolovat pomocí izolační negativní kontroly, kdy do procesu izolace NK je namísto vzorku vložena sterilní voda, zaručeně bez obsahu NK. Také tato kontrola se provádí zpravidla jen jedna na celou vyšetřovanou sadu vzorků a nesmí při amplifikační reakci generovat žádný signál. Na rozdíl od negativní kontroly indikuje nejen přítomnost kontaminace v samotné amplifikační reakci, ale také případnou kontaminaci při izolaci NK Mezilaboratorní kontrola kvality a systém externích kontrol v mikrobiologické diagnostice Rostoucí nároky klinických pracovníků a institucí, jako jsou zdravotní pojišťovny, na strandardizaci a spolehlivost mikrobiologických vyšetření, včetně molekulárněbiologických metod, vedou k nutnosti kontroly práce v laboratořích. Laboratoře by měly kvalitu své práce prokazovat a kliničtí pracovníci by se o kvalitu laboratoře měli zajímat. Pro účely standardizace i snazší orientaci zákazníků (zejména klinických pracovníků) slouží akreditace laboratoří podle norem ES ISO 15189, případně ES ISO Tyto normy popisují správný způsob práce mimo jiné i pro mikrobiologické laboratoře a vyžadují zavedený systém kontroly kvality. Klíčovou roli v systému kontroly kvality práce hraje externí kontrola kvality. Za přípravu externích kontrol je zodpovědná specializovaná externí instituce, v ČR nejčastěji státní zdravotní ústavy či mezinárodní instituce (Instadt, Německo; QCMD Skotsko aj.), která umělé kontrolní vzorky připraví a rozešle sledovaným laboratořím k vyšetření. Ty provedou příslušná kvalitativní či kvantitativní stanovení a výsledky pošlou zpět. Instituice pak srovnáním výsledků zjistí rozptyl v naměřených hodnotách, stanoví přijatelnou míru odchylky a posoudí, které laboratoře se do této odchylky vešly. Těm pak vystaví certifikát, kterým laboratoř prokazuje kvalitu své práce In house metody a komerční metody mikrobiologické amplifikační detekce NK. CE IVD Na rozdíl od mnoha specializovaných molekulárněbiologických laboratoří se rutinní mikrobiologické laboratoře tolik nesoustředí na technologickou stránku diagnostiky, nesnaží se připravovat své vlastní metodiky a v daleko větší míře využívají komerčních diagnostických přípravků. Usnadňují si tím značně práci, neboť se mohou spoléhat na kvalitní přípravu metod ve specializovaných firmách. Ty vyvinou, připraví a především zkontrolují diagnostické přípravky, které se pro detekci mikroorganizmů používají. Laboratoře pak ušetří na práci vývoje, výroby, kontroly vstupního materiálu a na kontrole kvality. Takové laboratoře tedy nemusí testovat každou šarži, nemusí samy nic vyvíjet, dokonce ani nemusí disponovat odborníky v oboru molekulární biologie či biochemie. Je však třeba, aby v rámci zavádění konkrétního diagnostika provedly jednoduchou validaci, která prokáže schopnost laboratoře s diagnostiky správně pracovat, a interně ověří shodu výsledků s očekáváními a s kvalitativními kritérii laboratoře. To ve výsledku významně snižuje náklady a zpřístupňuje metody molekulární diagnostiky i personálně či technologicky méně vybaveným pracovištím. Na druhé straně laboratoře nakupující komerční diagnostika by se neměly soustředit pouze na cenu, ale také na kvalitu nakupovaných reagencií a kitů. V současné době se v regionu EU nesmí na trh uvádět zdravotnické přípravky pro in vitro diagnostiku (tzv. in vitro devices, zkr. IVD) bez prohlášení o shodě. Toto prohlášení se rutinně označuje jako CE IVD a je vystavováno či vydáváno oprávněnými institucemi v souladu se směrnicí Rady 98/79/ES ve znění pozdějších předpisů, jejichž požadavky jsou 10

11 převzaty nařízením vlády ČR č. 453/2004 Sb. Certifikát se vydává pro každý typ diagnostika zvlášť a garantuje, že daný přípravek je vyráběn za podmínek splňujících požadavky citované směrnice. V současné době působí na evropském trhu řada výrobců in vitro diagnostických zdravotnických přípravků v oboru molekulární diagnostiky. Přípravky pro automatizované provozy velkých laboratoří dodávají zejména společnosti Roche, Abbott Laboratories, Siemens. Pro laboratoře zpracovávající menší objemy vzorků jsou určeny například výrobky od firem Digene, Nanogene, GeneProof, Quiagen aj. Výrobci přípravků pro humánní molekulární diagnostiku jsou podle nařízení vlády č. 453/2004 Sb. a 246/2009 Sb. povinni se registrovat a registrovat musí také své jednotlivé produkty. V případě, že si laboratoř komerční diagnostika nekupuje, ale připravuje si je sama, hovoříme o tzv. in house nebo home-made diagnostice. Laboratoř, která se pro tento způsob práce rozhodla, musí provádět rozsáhlé validační studie a musí kontrolovat každou šarži připravených mastermixů i všech kontrol. V případě, že tak nečiní, hrozí poměrně vysoké nebezpečí zkreslení výsledků vyšetření či vzniku chyb. To přímo ohrožuje pacienty a nese s sebou riziko eventuálních právních důsledků pro příslušné zdravotnické zařízení či laboratoř. Zkušenosti laboratoří pracujících s vlastními metodami však nejsou jednoznačně špatné a jejich výsledky mohou být i lepší než u laboratoří nakupujících diagnostika. Také náklady na samotnou reakci bývají nižší, než u komerčních diagnostik, ovšem za cenu vysokých nepřímých nákladů Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky Výhody aplikace PCR metod v klinické mikrobiologii Kultivačně nezávislá detekce. Molekulárněbiologické metody umožňují detekovat, identifikovat a kvantifikovat mikroorganizmy, které nelze standardními mikrobiologickými metodami kultivovat, nebo se kultivují obtížně. Na druhou stranu však v porovnání s kultivačními metodami neumožňují tyto metody izolaci kultury životaschopného mikroorganizmu pro další testování včetně fenotypově vyjádřené citlivosti k antibiotikům. Klasickým příkladem je diagnostika infekcí vyvolaných mykobakteriemi, nejčastěji M. tuberculosis. Tyto mikroby lze sice v rutinních podmínkách kultivovat, ale na mikrobiologických půdách rostou velmi pomalu, a diagnostika se tak protahuje na několik týdnů (až 9 týdnů). Výhody molekulární diagnostiky se uplatní také při detekci borelií, jejichž kultivace je možná, ale pro rutinní diagnostiku není prakticky použitelná. Z dalších obtížně kultivovatelných infekčních agens to jsou například chlamydie, coxielly a původci infekčních endokarditid za skupiny HACEK (Hemophillus sp., Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae). Tyto metody lze také využít v mykologii pro průkaz původců dermatomykóz a dalších mykotických infekcí, které vyžadují delší čas kultivace. Kultivace virů je z hlediska rutinní diagnostiky omezeně využitelná. Metody molekulární diagnostiky se proto v jejich detekci hojně využívají. Mezi nejčastější detekované viry patří zejména herpesviry, viry hepatitid, HIV, parvoviry či papilomaviry. Metody molekulární diagnostiky umožňují také zachytit bakterie rostoucí v biofilmech, kde bývá problém je zachytit kultivačně. Doplňují diagnostiku běžných bakteriálních patogenů vystavených účinkům antibiotické léčby, které se nemusí podařit v důsledku poškození antibiotiky prokázat kultivačně. Tyto metody otevřely rovněž cestu k přímé a vysoce citlivé diagnostice některých prvoků, které je možno v rutinní diagnostice detekovat prakticky pouze mikroskopií. Vysoká senzitivita stanovení. Metody molekulární diagnostiky umožňují dosáhnout vysoké citlivosti detekce. Umí zachytit i jednotlivé kopie cílových sekvencí NK ve vzorku vloženém do reakce. Citlivost metody tedy závisí zejména na metodě přípravy vzorku a izolace NK. Metody s vysokou citlivostí se s výhodou využívají při detekci obligátních patogenů, které se v zevním prostředí běžně nevyskytují (M. tuberculosis, borelie, viry hepatitid aj.), při testování krevních produktů (HCV, HBV, HIV) apod. Naopak vysoká citlivost může představovat komplikaci při interpretaci výsledků při průkazu mikroorganizmů způsobujících latentní či inaparentní infekce bez klinického významu (EBV, cytomegalovirus, HHV6 aj.) nebo při detekci fakultativních patogenů a mikrobů vyskytujících se běžně 11

12 v prostředí či jako součást mikroflóry (například stafylokoky, streptokoky, mykoplazmata, kvasinky a vláknité mikromycety), kde přílišná citlivost při nesprávné interpreataci může být zavádějící. Kvantitativní detekce. Velkým přínosem molekulárněbiologických metod je možnost exaktně kvantifikovat infekční agens, a sledovat tak charakter infekce. Lze tak rozlišit latentní a aktivní infekce, popsat a sledovat průběh infekce či hodnotit reakci na léčbu. Kvantifikace je zásadním přínosem zejména pro diagnostiku infekcí HCV a HBV, HIV, dále pak herpesvirů, CMV a EBV u imunodeficientních pacientů. Možnost zjistit množství viru v krvi, tzv. virovou dávku, umožní sledovat účinnost terapie v reálném čase, což jiné virologické metody prakticky neumožňují. Rychlost detekce. U mnoha infekčních onemocnění má rychlost detekce zásadní význam pro volbu efektivní terapie, to platí zejména u akutních infekcí centrálního nervového sysytému nebo u sepsí. Rychlá detekce je potřeba například u invazivních infekcí způsobených meningokoky, hemofily či streptokoky. Je však potřeba vzít v úvahu, že pokud je z důvodu rychlosti vzorek vyšetřen urgentně, je toto vyšetření zpravidla nákladnější, což by mělo být vyváženo adekvátním informačním přínosem výsledku vyšetření. U méně závažných infekcí je zpravidla ekonomicky výhodnější vyšetřovat vzorky ve větších objemech najednou, a čeká se tedy na dostatek vzorků. Podobná situace v praxi nastává u patogenů, jejichž detekce jinými metodami je výrazně časově náročnější v porovnání s molekulárněbiologickými postupy, a to i přes zdržení při sběru většího počtu vzorků. Jde například o M. tuberculosis, jehož kultivační průkaz trvá až 9 týdnů. Snazší manipulace se vzorky. Ačkoliv v rutinní diagnostice se vyšetřuje jen omezené spektrum vzorků, průkaz metodou PCR je možné provést v jakýchkoliv klinických materiálech včetně archivovaných vzorků tkání a lze vyšetřit například i vzorky tkání v parafínu. Omezením nejsou ani transportní podmínky, protože není třeba zachovat mikroorganizmus životaschopný. Například vzorky pro průkaz gonokoků není potřeba odebírat do transportního média a není ani nutné vzorky okamžitě zpracovat Limity PCR metod v klinické mikrobiologii Problém standardizace metod. U mnoha metod molekulární diagnostiky bylo již dosaženo dostatečné úrovně standardizace (například detekce M. tuberculosis, chlamydií, HCV, HBV, HIV). Výhodou je zejména možnost velmi kvalitní standardizace samotné technologie detekce, která je založena na dobře definovatelných biochemických reakcích, je tedy málo závislá na biologických vlastnostech a odlišnostech mikroorganizmů. U řady aplikací je však třeba stále sbírat a vyhodnocovat data tak, aby bylo možno výsledky těchto metod spolehlivě interpretovat. Především jde o data popisující klinický význam tohoto typu detekce. Je například velmi obtížné interpretovat výsledky kvantifikace virového agens v klinickém vzorku, pokud ještě není popsán význam konkrétní virové dávky u konkrétní klinické jednotky (například jaká virová dávka CMV je u pacienta po transplantaci jater již důvodem k zahájení léčby). Není také jasný způsob nakládání s výsledky detekce původců infekcí krevního řečiště, protože dosud nebylo dosaženo dobré shody se zlatým standardem kultivací. Nedostatečná mezilaboratorní standardizace a málo zkušeností s metodou. Přestože mezilaboratorní (externí) kontrola kvality má nezastupitelnou roli v systému kontroly kvality, viz výše, mnohé laboratoře se do této kontroly kvality ještě nezapojily. To pak snižuje hodnotu jejich výsledků. Samy laboratoře často nemají dostatečnou zkušenost s metodami, s jejich interpretací technologickou či klinickou. Také mnozí kliničtí pracovníci neumí metody molekulární diagnostiky používat; mají přehnaná očekávání a někdy zavrhují staré metody namísto toho, aby je s těmi novými vhodným způsobem kombinovali a doplňovali. Klinickou interpretaci výsledků komplikuje také skutečnost, že mnoho metod a klinických aplikací je stále ve stadiu získávání poznatků. Jejich výsledky pak přinášejí řadu překvapení vysoká citlivost mění pohled na životní cykly mikroorganizmů a patogenezi některých onemocnění. Jak vysvětlit přítomnost dlouhodobě přetrvávající nízké hladiny NK patogenů, které by neměly být přítomny, avšak v těle pacienta přesto dlouhodobě přetrvávají? Jsou to zachovalé části bakterií, nebo jde 12