MIKROPROPAGACE SORBUS DOMESTICA L. PRO LESNICKOU PRAX I I OPTIMALIZACE KULTURY IN VITRO.

Transkript

1 MIKROPROPAGACE SORBUS DOMESTICA L. PRO LESNICKOU PRAX I I OPTIMALIZACE KULTURY IN VITRO. Hana PRKNOVÁ, Jaroslav KOBLIHA Česká zemědělská univerzita, Fakulta lesnická a dřevařská, Kamýcká 1176, CZ Praha 6 Suchdol, prknova@knc.czu.cz, kobliha@fld.czu.cz PRKNOVÁ, H., KOBLIHA, J.: Micro propagation of Sorbus domestica L. for forestry practice optimisation of in vitro culture. Lesn. Čas. Forestry Journal, 54(4): , 2008, 2 fig., 3 tab., ref. 20. Original paper. ISSN Vigorous and productive in vitro organ cultures of true service tree (Sorbus domestica L.) were obtained when using a liquid half-strength Murashige and Skoog medium together with silica sand. Early signs of senescence were found in plantlets grown on agar medium. The ph adjustment of media has not to be done precisely as the optimal range lies from 5.7 to 7.2. Growing multiple shoot cultures were formed within 6 9 weeks only. Under cool (but not freezing) and dark conditions, the growth was ceased and cultures could be stored for at least 22 weeks. This minimal growth culture was achieved in dark at 3 5 C. Key words: micropropagation, Sorbus, minimal growth culture Orgánové kultury jeřábu oskeruše (Sorbus domestica L.) dobře rostou na tekutém médiu Murahige-Skoog v poloviční koncentraci, při použití pískového nosiče. Na tomtéž médiu zpevněném agarem se projevily dřívější příznaky senescence. Acidita média nemusí být nastavována přesně, neboť kultury rostly stejně dobře jak při ph 5,7, tak při ph 7,2. Kultury musí být pasážovány po 6 9 týdnech. V temnu a chladu 3 5 C však lze zbrzdit jejich růst a přechovávat je až 22 týdnů. 1. Úvod a problematika Jeřáb oskeruše (Sorbus domestica L.) je v aktuální Květeně 3 (HEJNÝ, SLAVÍK 1992) považován za strom z teplých částí Evropy, severní Afriky, Turecka a Iránu. Jižní Slovensko je považováno za místo nejsevernějšího přirozeného výskytu. Jako ovocná dřevina však byl šířen již ve starověku (VĚTVIČKA 1999). V Čechách rozhodně není dřevinou původní. Výskyt starých jedinců je znám prakticky jen z Českého středohoří (KUBÁT 2007) a přilehlého dolního Poohří (u Libochovic, z autopsie). Výskyty na jižní Moravě jsou předmětem dosavadního studia výzkumné stanice Uherské Hradiště VÚLHM (Prudič 1998). Panuje shoda v tom, že jeřáb oskeruše se v ČR velmi málo rozmnožuje generativně. Je schopný tvořit kořenové výmladky, ale na tuto strategii běžně nepřechází. Jestliže při kvartérních klimatických oscilacích pravděpodobně nyní dochází k dlouhodobější teplejší výchylce, stává se jeřáb oskeruše zajímavým pro české a slovenské lesnictví. Připadá v úvahu pro relativně teplé oblasti. Skutečnost, že se alespoň v Čechách spontánně nemnoží, je výhodou z hlediska ochrany přírody, neboť nehrozí žádná případná expanze. Kdyby se podařilo odstranit slabý článek v autekologii jeřábu oskeruše, chabou schopnost spontánního rozmnožování i pomalé množení klasickými způsoby, byl by cennou a prakticky využitelnou dřevinou. Očekávání lze v takových případech mít při použití mikropropagace. V případě S. domestica jsou již k dispozici výsledky některých dřívějších experimentů (ARRILLAGA et al. 1991, 1992). Nejvíce druhů důležitých v lesnictví, ať již v mírné, subtropické nebo tropické klimazóně, se množí orgánovými kulturami, kde explantát dává vzniknout přímo miniaturním stonkům s listy. Pro orgánové kultury je (oproti somatické embryogenezi) charakteristické, že se u nich nově vyrůstající orgány nezakládají z dediferencovaného kalusového pletiva. Vznikající prýty 1

2 o délce většinou 1,5 až 2 cm, nebo jen o málo větší, představují po odříznutí tzv. mikrořízky. Zakořeňování těchto mikrořízků a jejich adaptace na nesterilní podmínky je kritickým momentem, a proto je zpravidla zvláště zkoumána metodika multiplikace (zmnožování prýtů) ve sterilních podmínkách in vitro a metodika zakořeňování do přirozených substrátů. Pro fázi multiplikace sice existují osvědčená kultivační média, ale protože každý druh má jinou ekologickou konstituci, musí se v každém případě živný roztok a vůbec celá metodika kultury in vitro nejprve optimalizovat. Tato studie si klade za cíl optimalizaci kultury tak, aby byla také co nejsnáze proveditelná v lesnické praxi. 2. Materiál a metody Primárními explantáty byla zygotická embrya vyjmutá ze semen matečného stromu v Arboretu ČZU v Kostelci nad Černými lesy. Z malviček sklizených r byla vyjmuta semena, dokonale oprána a po oschnutí skladována v papírovém sáčku v suchu a chladu 0 4 C. Před dalším zpracováním byla povrchově sterilizována v nasyceném roztoku chloraminu po dobu 20 minut. Ve sterilním prostředí v laminárním boxu byla dne vypreparována embrya a umístěna do lahviček s živným médiem Murashige-Skoog (dále jen MS) v poloviční koncentraci minerálních komponent a bez fytohormonů (KYTE, KLEYN 1996). Inkubace probíhala vesměs za teplot C a na světle, při periodě 16 hodin světla a 8 hodin temna, pod zářivkami značky Serra daylight poskytujícími intenzitu osvětlení v místě kultur celkem 150 μmol.m -2.s -1. Stejné inkubační podmínky byly použity i pro další subkultury. Ze semenáčků byl k další kultivaci odebrán pouze epikotyl, jakmile se vyvinul do délky asi 2 cm. Všechny experimenty proběhly s použitím jediného náhodně vybraného klonu, aby se na výsledcích nemohl projevit případný vliv přirozené variability druhu na chování v kulturách in vitro. Na základě zkušeností se stárnutím podobného materiálu byly kultury pasážovány podle potřeby po 6 9 týdnech (PRKNOVÁ 2004). Uvedená kratší doba je optimální, kdežto delší doba byla zvolena zejména pro sledování prvních projevů senescence za různých podmínek. Na výchozí modifikaci média byl použit originální recept 1/2 MS solí, s přídavkem 1 mg.l -1 benzylaminopurinu (BAP), 20 g.l -1 sacharózy, 100 mg.l -1 myoinositolu, 0,4 mg.l -1 thiaminu. Acidita byla nastavena na ph 5,7. Dále byly použity jiné modifikace: Pro zjištění, zda by pro daný materiál mohl být používán výhodný pískový nosič, bylo uvedené médium připraveno v tekutém i gelovém stavu (6 % agaru). Tekutá media byla použita tak, že v lahvičce o objemu 200 cm 3 a průměru 6 cm bylo 25 cm 3 sklářského písku a 20 ml roztoku. Písek nebyl předem zvláště sterilizován. Připravené uzavřené lahvičky s pískem a mediem byly v autoklávu podrobeny teplotě 115 C po dobu 20 minut. Toto stanovení bylo hodnoceno podle ukazatele kvantitativního (počet mikrořízků za čas) a kvalitativního (pozorování symptomů senescence). Pro zjištění vlivu acidity byla připravena tekutá média s ph 4,5, ph 5,7 a ph 7,2. Stanovení bylo kvantitativní, tj. pomocí velkých sérií. Inkubace trvala 6 týdnů. Byl hodnocen počet mikrořízků vzniklých z jednoho výchozího. Statistické testování hypotéz bylo provedeno nástroji pro analýzu dat počítačového programu Microsoft Excel, a sice dvouvýběrového t-testu s rovností rozptylů. Pro rozhodování, zda má být použit t-test s rovností, anebo nerovností rozptylů se často doporučuje předběžný F-test shody rozptylů. Bylo však zjištěno, že v případě větších rozsahů statistických výběrů (stačí rozsahy větší než 8) a přitom stejných (n 1 = n 2 ), může být vždy použit t-test s rovností rozptylů (MELOUN, MILITKÝ 2004). Experimenty byly proto naprogramovány tak, aby byly splněny uvedené matematické podmínky. Byla prověřena možnost skladování kultur v chladu bez pasážování. Kultury na tekutém médiu 1/2 MS solí, s přídavkem 1 mg.l -1 BAP, 20 g.l -1 cukru, 100 mg.l -1 myoinositolu, 2

3 0,4 mg.l -1 thiaminu i ph 5,7 s pískovým nosičem byly v plném růstu za pokojových teplot a na světle přeneseny do bezmrazého prostoru chladničky, kde byly po dobu 22 týdnů udržovány v temnu při teplotách 3-5 C. Hodnocení bylo provedeno podle podílu kultur probuzených k růstu po přenesení na čerstvé médium a do původních kultivačních podmínek. Stejně provedené kultury byly ovšem jako kontrolní série inkubovány normálně v teple a na světle, a přitom pasážovány a děleny na jednotlivé mikrořízky s odstupem 6 týdnů, aby mohla být porovnána také morfologie normálně rostoucích exemplářů s jedinci inhibovanými chladem a temnem. Speciálním případem je pasážování kultur, jež právě absolvovaly skladování v chladu a temnu. Bylo odzkoušeno, zda by nebylo možné dosáhnout bujnějšího růstu, kdyby místo ½ MS, jak bylo popsáno, bylo použito MS v plné koncentraci. Toto stanovení bylo provedeno a vyhodnoceno jako kvantitativní. Čtyřpolní tabulka s výslednými frekvencemi vitality a mortality byla statisticky vyhodnocena pomocí χ 2 -testu (KUBÍKOVÁ 1970). 3. Výsledky První otázkou řešenou při optimalizaci média bylo, zda je možné v případě S. domestica používat místo agaru pískový nosič. Výchozí modifikace 1/2 MS média, jak je uvedena v metodice, byla připravena jako agarový gel a jako tekutý roztok použitelný s pískovým nosičem. Každý druh média byl použit pro 100 kultur, naočkovaných vždy jedním mikrořízkem o délce asi 1,5 cm. Pozorování trvalo, dokud se neprojevily kvalitativní rozdíly mezi oběma sériemi. Po 9 týdnech byl pozorován kvalitativní rozdíl spočívající v nápadných příznacích senescence, které se ovšem projevovaly výhradně a u všech kultur na agarovém médiu (obr. 1). Produkce mikrořízků ze všech kultur je shrnuta v tabulce 1. Byla stanovena nulová hypotéza, že jde o výběrové soubory se stejným průměrem. Uvádíme dvouvýběrový t- test této hypotézy, provedený pro údaje z tabulky 1: agar písek Výběrový průměr 4,32 4,95 Rozptyl 5, , Pozorování t stat. -1,77688 t krit. 1, Protože absolutní hodnota vypočteného testovacího kritéria (t stat.) nepřesahuje kritickou hodnotu (t krit.), platí s pravděpodobností 95 % nulová hypotéza. Produktivita kultur vyjádřená počtem získaných mikrořízků se tudíž u agarového a tekutého média s pískovým nosičem významně nelišila. Závěr pro praxi musí jednoznačně podpořit používání tekutého média s pískovým nosičem, neboť je pro kultivaci zcela vhodné, neprojevuje se na něm tak brzy senescence a laboratorní manipulace s ním probíhá za studena a je při výrobě i rušení ukončených kultur snazší a rychlejší. Pískový nosič je navíc oproti agaru chemicky a konzistencí naprosto stálý při každém ph. Substrát u kultur in vitro je ve všech vlastnostech zcela umělý a není ani využíván pomocí kořenů. Při nastavování jeho acidity se proto nelze řídit ekologickou konstitucí kultivovaného druhu v přirozených podmínkách. Další experiment byl proto připraven tak, aby se zjistilo, zda standardně používané ph 5,7 pro MS-médium je nejlepší. Byly porovnány dostatečně velké série kultur na kyselejším médiu (ph 4,5) a na slabě alkalickém, skoro neutrálním médiu (ph 7,2). Výsledné hodnoty jsou v tabulce 2. Nulová hypotéza, že průměrná produkce na kyselejším médiu se významně neliší od produkce na standardním médiu byla otestována t- testem: 3

4 ph 4,5 ph 5,7 Výběrový průměr 1, , Rozptyl 0, ,84023 Pozorování t stat. -6,15603 t krit. 2, Protože absolutní hodnota vypočteného testovacího kritéria (t stat.) přesahuje kritickou hodnotu (t krit.), zamítáme nulovou hypotézu. Lze konstatovat, že produkce mikrořízků na kyselejším médiu byla významně nižší. Stejným způsobem byla otestována nulová hypotéza, že průměrná produkce na zásaditějším médiu se významně neliší od produkce na standardním médiu: ph 7,2 ph 5,7 Výběrový průměr 4, , Rozptyl 4, ,84023 Pozorování t stat. -0,34017 t krit. 2, Protože absolutní hodnota vypočteného testovacího kritéria (t stat.) nepřesahuje kritickou hodnotu (t krit.), byla přijata nulová hypotéza. Bylo konstatováno, že produkce mikrořízků na zásaditějším médiu se významně (na hladině pravděpodobnosti 95 %) neliší od produkce na standardním médiu. Jako závěr je zde další významné zjednodušení mikropropagace. Není nutno nijak přesně a pracně nastavovat ph, stačí jen orientačně indikátorem překontrolovat, zda se nachází v oblasti slabě kyselé (ph 5,7) nebo vyšší, přibližně neutrální. Tabulka 1 Frekvenční tabulka charakterizující produkci mikrořízků Sorbus domestica na agarovém médiu a na tekutém médiu s pískovým nosičem po 9 týdnů trvající kultivaci. Table 1 Number of microcuttings (1 st column) with corresponding number of flasks given in Počet mikrořízků v lahvičce 1) Agar 3) Písek 4) (počet lahviček) 5) nd column (agar cultures) and 3 rd column (sand cultures), respectively Kultury in vitro je také možné používat jako konzervy, v nichž se po určitou dobu může přechovávat nerostoucí rostlinný materiál určený k množení v pozdější době. V případě S. domestica byly prověřeny jak účinky mrazu -10 C, tak účinek chladu. Působení mrazu je ovšem na 100 % letální. Působení chladu a temna podle oprávněného očekávání zastavuje 4

5 růst, avšak překvapivě nedochází k opadávání listů. Rostlinky po absolvování 22 týdnů v chladničce vypadaly stejně jako exempláře kontrolní, rostoucí bez přerušení (obr. 2). Obr. 2 Dvě kultury skladované v chladu a temnu a druhé dvě stále rostoucí jsou podobného vzhledu Fig 2 Two cultures stored in cool and dark conditions and the other two grown under light exhibit similar appearance Jinou otázkou je však fyziologický důsledek dlouhodobého skladování a kondice rostlinek. Jejich vitalita byla posouzena pomocí statisticky významného souboru kultur, do nichž byly jako inokulum použity po jednom mikrořízky ze skladovaných kultur. Byly srovnány kultury na výchozí modifikaci média (1/2 MS) s kulturami na plné koncentraci (MS-médium), neboť připadala v úvahu podpora růstu díky vyšší koncentraci dusíkatých látek. Podíl rostoucích a nerostoucích kultur na obou druzích médií je v tabulce 3. Nulová hypotéza spočívá v tvrzení, že frekvence a, b, c, d jsou z hlediska statistického u ředěného i koncentrovaného média stejné. Pro výpočet testovacího kritéria byl použit tento vzorec (KUBÍKOVÁ 1970): 2 2 ad bc.n a b c d a c b d Dosazením do vzorce bylo vypočteno χ 2 (stat.) = 24,62. Kritická tabelovaná hodnota pro jeden stupeň volnosti při P = 0,05 je 3,84. (JOSÍFKO 1971). Vypočtené kritérium je vyšší než kritická hodnota, a proto na hladině pravděpodobnosti 95% nulovou hypotézu zamítáme. Závěr je potom dvojí. Pro pokračování zakonzervované kultury je vhodné ředěné médium (1/2 MS), kdežto koncentrované médium mělo negativní efekt. Pokud však mikrořízky přežijí adaptaci na koncentrované médium, rostou i na něm dobře. Počet řízků zjištěný po ukončení experimentu v nejproduktivnější kultuře byl u plné i poloviční koncentrace 9. 5

6 Tabuľka 2 Frekvenční tabulka udávající produkci mikrořízků po 6 týdnů trvající kultivaci na médiích s rozdílnou aciditou Table 2 Number of micro cuttings produced in a flask during 6 weeks (1 st column) and corresponding numbers of flasks with media adjusted for different ph values Počet mikrořízků v lahvičce ph 4,5 ph 5,7 ph 7,2 (počet lahviček) 5) Tabuľka 3 Čtyřpolní tabulka s písmenným označením totožným s výpočetním vzorcem pro test dobré shody. Vyčísleny jsou počty kultur rostoucích a nerostoucích po 6 týdnech od naočkování Table 3 Cultures on 1/2 MS and MS media (given in 1 st column) which were vital (2 nd column) and necrotic (3 rd column) 6 weeks after thein establishment. Types are in accordance with the statistical formula Médium 1) Roste 2) Neroste 3) Celkom 4) 1/2 MS a: 71 b: MS c: 36 d: Σ n 200 Po dlouhodobé konzervaci, trvající 22 týdnů, byl rostlinný materiál ještě vitální na 71 % (dle kultury na 1/2 MS médiu). Využitelnost tohoto fenoménu pro praktické laborování k výrobním účelům je zjevné: Snižuje se pracnost s pravidelným pasážováním, neboť kultury S. domestica lze dle popsané jednoduché metody skladovat a aktivovat podle potřeby. Byly popsány všechny fáze mikropropagace pomocí orgánové kultury S. domestica, tj. získání primárního explantátu (viz předešlá kapitola), ideální médium a laboratorní příprava inkubačních nádob, interval pasážování a možnost zakonzervování a aktivace kultur. Produktem jsou olistěné mikrořízky bylinné povahy, jež nemají kořeny. Jejich další zpracování až po produkci školkovaných sazenic je předmětem druhé části této studie. 4. Diskuse Primárním explantátem bylo embryo vyjmuté ze semene (resp. osemení), což je u zkoumaného druhu osvědčená metoda k překonání dormance a okamžitému klíčení (ARRILLAGA et al. 1992). Stejná metoda byla použita též u S. sudetica (PRKNOVÁ 2004). Jeřáb oskeruše (Sorbus domestica) je po jeřábu krkonošském (S. sudetica) již druhým druhem tohoto rodu, u něhož se osvědčila kultura na tekutém médiu s pískovým nosičem (PRKNOVÁ 2007). Jeřáb krkonošský je ovšem v podmínkách daných in vitro acidofytem, kdežto jeřáb oskeruše je neutrofytem. Díky tomu je jeřáb oskeruši možné kultivovat také na 6

7 agarovém médiu, které nelze kvůli hydrolýze používat jen u výrazně kyselých médií. Potvrdilo se, že zpevněné agarové médium má některé nevýhody. Je to nejspíše hromadění nějakých škodlivých metabolických nebo odpadních produktů v těsné blízkosti rostlinek a jistě také horší možnost kontaktu rostlinek s médiem (PRKNOVÁ 2007). Jen tak lze vysvětlit dokumentovaný fakt (obr. 1), že senescence nastupuje při použití agarového média mnohem dříve. Obr. 1 Kvalitativní rozdíl mezi kulturami na písku a na agaru, které jeví známky dřívější senescence Fig. 1 Different quality of cultures on sand and agar, the latter exhibiting earlier signs of senescence Médium MS se pro mnoho druhů rostlin, zejména bylinných, používá v plné koncentraci (KYTE et Kleyn 1996). Pro dřeviny se však často lépe osvědčuje jen poloviční koncentrace minerálních složek média, při zachování normálního obsahu organických složek. U jeřábu oskeruše bylo takto zředěné médium také vyzkoušeno (MIKO et al. 2004). Při našich experimentech naočkování mikrořízků S. domestica, jejichž kondice byla ovlivněna dlouhodobou inhibicí chladem, na koncentrované médium způsobilo vysokou mortalitu. Vhodnější je ředěné 1/2 MS médium, i když pokud rostlinky přežijí adaptaci na plnou koncentraci, rostou také dobře. Jeřáb oskeruše je pravděpodobně dosti adaptibilní, neboť roste i na médiu jiného složení, na modifikovaném SH-médiu (ARRILLAGA et al. 1991). Za významnou odlišnost SH-média oproti MS-médiu je nutno považovat téměř osmkrát nižší molární koncentraci amonných iontů, přičemž v nitrátové formě dusíku se tato média nijak podstatně nerůzní (obě přibližně 0,02 M KNO 3 ). Na příjem dusíku přednostně jako kationt, nebo aniont má přitom vliv permeabilita buněčných membrán, ovlivňovaná aciditou prostředí. MS-médium zůstává i v poloviční iontové koncentraci bohatším na amonné ionty nežli SHmédium. Další rozdíl, spočívající v navážce inositolu, pravděpodobně nehraje roli. Ať již je 7

8 předepsáno 1000 mg.l -1 (u SH), nebo 100 mg.l -1 (u MS), jde o množství postačující a nadbytek této organické substance zřejmě nevadí. Acidita ph 5,7 je sice předepsána v původní receptuře MS-média (MURASHIGE, SKOOG 1962, LINSMAIER, SKOOG 1965), obecně však bývá pro různý materiál pozměňována (KYTE, KLEYN 1996). Její nastavení je však pracné, a protože se děje přikapáváním ředěné kyseliny nebo louhu, zvyšuje se také iontová koncentrace média. Zjištění vyplývající z našich stanovení, že v případě S. domestica stačí aciditu nastavit jen přibližně do oblasti ph 5,7 7,2, má proto praktický význam. V rámci rodu Sorbus je jen málo prací věnovaných jiným druhům než S. aucuparia L., jimiž se na ČZU Praha zabýval CHALUPA (1983, 1987) a MAULEOVÁ (2000), která zkoumala ještě S. torminalis (L.) Cr. Právě v práci Mauleové je zajímavé, že S. aucuparia a S. torminalis prý vyžadují vysoké koncentrace minerálních solí a nejlépe rostou na plně koncentrovaném MS-médiu. Zajímavé je i poněkud jiné použití fytohormonů než je uvedeno v mnou požívaném médiu pro S. domestica. Koncentrace BAP 0,2 0,6 mg.l -1 je nižší, což ale nemusí mít fyziologický efekt, avšak přitom je ještě dodán auxin IBA 0,1 0,2 mg.l -1. Pro S. domestica stačí na primární explantát působit pouze cytokininem BAP o koncentraci 1 mg.l -1, kdežto hladinu endogenního auxinu již není potřeba zvyšovat. Působení chladu na kultury bylo uplatněno nikoli kvůli napodobení přirozené bioperiodicity, ale aby byla nalezena možnost inhibice a bezpracného přechovávání kultur. Prýty v kulturách S. domestica in vitro jsou pod vlivem exogenního cytokininu BAP a nereagují na chlad opadáním listů. Reverzibilní inhibice růstu však jím lze dosáhnout, jak bylo prokázáno. Aktivně rostoucí kultury in vitro jsou často i přes normální frekvenci pasážování dosti brzy postihovány stárnutím, projevujícím se poklesem vitality, takže nemohou být považovány za dlouhodobě konzervovaný materiál. Kultury in vitro ovšem lze spatřovat jako paralelní a doplňující postup vedle kryoprezervace (PARK 2002). Bylo by však škoda zúžit problematiku zástavy růstu na kryoprezervaci, tedy na konzervaci za exktrémně nízkých teplot, a uchovávání rostlin in vitro naproti tomu provádět jen jako neustálé pasážování nepřetržitě přirůstajícího primárního explantátu. Možnost chladové konzervace kultur lesních dřevin in vitro v bezmrazých podmínkách (0 10 C) připomněli již VICIENT, MARTÍNEZ (1998). Reakci orgánové kultury Populus tremula na působení chladu 10 C zjistil HAUSMAN (2000), když ji porovnával s kontrolními kulturami rostoucími při 23 C. Zakonzervování chladem bylo tak dokonalé, že mikrořízky získané z kultur vystavených chladu byly ještě po roce vitální. Náš poznatek doložený pro S. domestica je podobný, i když jsem orgánové kultury zkusila uvést do dalšího růstu v teple a na světle dříve, již po několika měsících. Poděkování Příspěvek vznikl v rámci řešení projektu NAZV: QH81160 Ekonomická efektivnost šlechtění lesních dřevin. Literatura 1. ARRILLAGA I., MARZO T. and SEGURA J., 1991: Micropropagation of juvenile and adult Sorbus domestica L. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 27: ARRILLAGA I., MARZO T. and SEGURA J., 1992: Embryo culture of Fraxinus ornus and Sorbus domestica removes seed dormacy. Hort Sci., 27: CORREDOIRA E., SAN-JOSÉ M. C., BALLESTER A. and VIEITEZ A.M., 2004: Cryopreservation of zygotic embryo axes and somatic embryos of European chestnut. CryoLett., 25: HAUSMAN J. F., 2000: Poplar acclimation to cold during in vitro conservation at low non-freezing temperature: Metabolic and proteic 8

9 changes. J. Plant Physiol., 157: HEJNÝ S., SLAVÍK B. [eds.] et al., 1992: Květena České republiky. 3. Academia, Praha, 542 pp. 6. CHALUPA V., 1983: In vitro propagation of willows (Salix spp.), European mountain ash (Sorbus aucuparia L.) and black locust (Robinia pseudoacacia L.). Biol. Plant., 25: CHALUPA V., 1987: Effect of benzylaminopurine and thidiazuron on in vitro shoot proliferation of Tilia cordata Mill., Sorbus aucuparia L. and Robinia pseudoacacia L. Biol. Plant., 29: JOSÍFKO M., 1971: Pravděpodobnost a matematická statistika pro biology. SPN, Praha, 139 pp. 8. KUBÁT K.: Jeřáb oskeruše (Sorbus domestica L.) v sz. Čechách. Electron. J. Biotechnol. [online]. Katedra biologie PF UJEP v Ústí n. L., [citováno 27. září 2007]. Dostupné na internete: 9. KUBÍKOVÁ J., 1970: Geobotanické praktikum. SPN, Praha, 106 pp. 10. KYTE L., KLEYN J., 1996: Plants from test tubes. 3rd ed., repr. 1999, Timber Press, Inc., Portland, 240 pp. 11. LINSMAIER E. M., SKOOG F., 1965: Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 18: MAULEOVÁ M., 2000: Reprodukce vybraných lesních dřevin rodu Sorbus metodami in vitro. Diplomová práce, ČZU v Praze, Fakulta lesnická, 66 pp. 13. MELOUN M., MILITKÝ J., 2004: Statistická analýza experimentálních dat. Ed. 2. Academia, Praha, 953 pp. 14. MIKO M., GAŽO J., BIROŠČÍKOVÁ M., 2004: In vitro klonové množenie genetických zdrojov jarabiny oskorušovej (Sorbus domestica L.) z územia Slovenska. Acta Fytotech. Zootech., 7: MURASHIGE T., SKOOG F., 1962: A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: PARK Y., 2002: Implementation of conifer somatic embryogenesis in clonal forestry: technical requirements and deployment considerations. Ann. For. Sci., 59: PRKNOVÁ H., 2007: The use of silica sand in micropropagation of woods. J. For. Sci., 53: PRUDIČ Z., 1998: Růst a rozšíření Sorbus domestica L. a Sorbus torminalis (L.) Crantz v Moravských Karpatech. Lesnictví, 44: SAN-JOSÉ M. C., JORQUERA L., VIDAL N., CORREDOIRA E. and SÁNCHEZ C., 2005: Cryopreservation of European chestnut germplasm. Acta Hortic, 693: VĚTVIČKA V., 1999: Stromy. Aventinum, Praha, 216 pp. 20. VICIENT C. M., MARTÍNEZ F. X., 1998: The potential uses of somatic embryogenesis in agroforestry are not limited to synthetic seed technology. Rev. Brasil. Fisiol. Veg., 10: Summary The same productivity of in vitro organ cultures of true service tree (Sorbus domestica L.) was ascertained using a liquid 1/2 MS medium with sand and the same medium solidified by agar respectively. The agar medium was worse, because earlier signs of shoot senescence were visible. Optimal growth of the cultures was ascertained as well by ph 5.7 as by ph 7.2. Therefore, we need not fix acidity accurately. The cultures may be reversibly inhibited for as long as 22 weeks if they are kept in darkness at 3 5 C. Traslated by author Revised by Z. AL-ATTASOVÁ 9