Fyziologie průmyslových mikroorganismů

Transkript

1 Fyziologie průmyslových mikroorganismů sylabus k předmětu

2 OBSAH OBSAH... 2 Třídění živých objektů... 4 Charakteristika tří domén živých organismů... 5 Archaea... 6 Bacteria... 7 Eukarya... 7 Buněčná architektura... 8 Prokaryota... 8 Eukaryota... 8 Buněčná výživa ve vztahu k buněčným funkcím... 8 Základní charakteristika výživy... 8 Typ fyziologie Zdroj energie Zdroj uhlíku Příklady Typy buněčných reakcí Energetické reakce Biosyntetické reakce Polymerační reakce Reakce vedoucí k samouspořádání Buněčný transport Difuze Aktivní transport Skupinová translokace Fyziologie růstu Růst a množení buněk a buněčné populace Lag fáze Stacionární fáze Fáze odumírání buněk Mikrobní interakce v binárním systému Buněčná diferenciace Buněčný cyklus

3 Vnější faktory a jejich působení na buňku Teplota Osmotický tlak Hydrostatický tlak ph kultivačního prostředí Základní regulační mechanismy Účelové chování buňky Chemotaxe bakterií opatřených bičíkem Fototaxe Magnetotaxe Quorum sensing u bakterií

4 Třídění živých objektů S vynálezem mikroskopu byl poznán svět jednobuněčných organismů (v letech italský vědec Francesco Stelluti poprvé použil mikroskop pro pozorování včel a brouků, nizozemský přírodovědec A. van Leeuwehoek v roce 1676 poprvé uviděl pod mikroskopem bakterie). Od této doby se začaly živé objekty třídit na makroskopické a mikroskopické, jinými slovy na mnohobuněčné a jednobuněčné. Tento pohled plně vystihuje Haeckelovo fylogenetické schéma z r. 1866, v němž jsou rozlišeny tři základní kategorie živých organismů, a to rostliny, živočichové a protista. Další členění živých organismů navrhl v r francouzský biolog Edouard Chatton. Navzdory určitému zkreslení, které tato klasifikace přináší, se pro svoji jednoduchost ujala. Vychází z poznání, k němuž biologie ve 30. letech minulého století dospěla, a to, že buňky jsou zřetelně dvojího konstrukčního typu. Mezi oběma typy nejsou přechodné formy a lze tedy vždy jednoznačně určit, do kterého konstrukčního typu daná buňka náleží. V souvislosti s tímto přístupem je možné živé organismy členit na prokaryota a eukaryota. Objektivně existující taxonomickou jednotkou v případě eukaryot je biologický druh. Podle základní definice je druh souborem jedinců, schopných vzájemného křížení za vzniku dále plodných potomků. Druh je tedy přirozená taxonomická jednotka, na rozdíl od vyšších taxonomických jednotek (čeleď, třída), které jsou umělé. Tato definice druhu je tedy vázána na existenci sexuality, tj. takový způsob reprodukce, kdy nový jedinec vzniká splynutím dvou haploidních buněk (zpravidla od dvou rodičů). Pro eukaryotní organismus rozmnožující se sexuálně je charakteristické střídání haploidní a diploidní fáze. Prokaryota jsou však haploidní a množí se asexuálně. Výše uvedená definice druhu je tedy pro ně nepoužitelná. U prokaryot není tedy druh přirozeně vymezen. Mezi jednotlivými skupinami, které označujeme jako druhy, chybějí ostré hranice. U prokaryot je tedy vymezení druhu umělé, je otázkou dohody. Druh je v případě prokaryot představován skupinou mikroorganismů, které poskytují shodnou odpověď na vybrané testy. Výběr těchto testů je založen na stavu poznání v biologických vědách. Dříve se jednalo o testy povahy biochemické, mikrobiologické a fyziologické, šlo tedy o porovnání charakteristik fenotypu, což ovšem vedlo k řadě nepřesností. V současné době je druh nově definován na základě výsledků studia genotypu. Informace, získaná z genotypu, tj. informace vycházející z molekulárních sekvencí proteinů a nukleových kyselin je jasná, spolehlivá, obsažnější a dobře interpretovatelná. Na rozdíl od trojrozměrné fenotypové úrovně je sekvenování jednorozměrné. Hodnocení vycházející z jednorozměrné úrovně je zároveň mnohem jednodušší a matematicky popsatelné. Definice druhu je v současné době založena na porovnání homologických sekvencí DNA. Informace, získaná z genotypu, je dobře využitelná nejen pro definici druhu, ale i k měření evolučních rozdílů, tedy ke konstrukci fylogenetického schématu. Snaha nalézt příbuzenské vztahy mezi živými organismy spolu s konstrukcí základního stromu života na základě porovnání charakteristik vyplývajících z genotypu se objevila již koncem 60.let minulého století. V té době se ve vědecké literatuře objevily první informace o tom, že určité molekuly mohou dokumentovat evoluční rozdíly a sloužit tak jako časoměry evoluce. Evoluční rozdíly mezi druhy mohou pak být měřeny na základě rozdílů v homologických sekvencích takových molekul, především proteinů a nukleových kyselin. Za molekulární časoměr může být považována molekula, v jejíž struktuře dochází v průběhu času k náhodným změnám. Celkové množství sekvenčních změn závisí na rychlosti, se kterou dochází ke stabilním mutacím DNA a času, po který ke změnám dochází. Stabilní mutace jsou řídící silou evoluce. Výběr molekuly, která se pro srovnání použije, se řídí následujícími kriterii: Vybraná molekula se musí vyskytovat u všech srovnávaných organismů. 4

5 Tato molekula musí mít stejnou funkci u všech studovaných objektů, musí být tedy funkčně homologická. Nelze porovnávat sekvence aminokyselin těch enzymů, které katalyzují odlišné reakce, stejně jako nejde porovnat nukleotidové sekvence nukleových kyselin majících odlišné funkce, protože u funkčně nesouvisejících molekul nelze předpokládat strukturní podobnosti. U srovnávaných molekul musí být možné přesně a jednoznačně identifikovat oblasti sekvenčně homologické a sekvenčně heterogenní. Pro určení fylogenetických vzdáleností nemají všechny sekvenční rozdíly stejnou vypovídací hodnotu. Změny ve struktuře vybrané molekuly musejí probíhat náhodně, nesmí být spojeny se změnou její funkce. Pokud během sledovaného období funkce molekuly není zcela konstantní, v struktuře její molekuly pak dochází nikoliv pouze ke zcela náhodným změnám odpovídajícím evoluci, ale také k selektivním změnám odpovídajícím funkční proměně. V takovém případě by došlo ke stanovení chybných fylogenetických rozdílů. Vybraná molekula musí být jednak dostatečně velká, aby mohla poskytnout odpovídající množství informací a jednak musí vyhovovat svojí strukturní organizací. Na první pohled by se mohlo zdát, že nejvhodnějším molekulárním časoměrem je genetický segment, v jehož struktuře dochází ke změnám, které probíhají náhodně na kterémkoliv místě podél celé délky jeho řetězce. K těmto změnám dochází s téměř hodinovou pravidelností a jsou dobře interpretovatelné. Pro fylogenetické měření mají však tyto změny jen malý význam, protože probíhají s takovou rychlostí, že pokrývají jen velmi omezený fylogenetický úsek. Vzhledem k tomu lze využít změn v sekvencích DNA pro hodnocení pouze velmi krátké evoluční vzdálenosti, tedy jako evoluční stopky. Výběr vhodné molekuly pro srovnávání vycházel ze skutečnosti, že významným dějem, provázejícím živou hmotu od počátku jejího vzniku je proteosyntéza. Ribozóm, který je místem proteosyntézy a jako takový patří k nejstarším biologickým seskupením, nabízí takové molekuly tři. Jsou to rrna se sedimentačními konstantami 5 S, 16 S a 23 S, máme-li na mysli prokaryotní ribozóm. Každá z těchto molekul má své přednosti i nedostatky. 5 S rrna by vzhledem ke své velikosti a tím poměrně snadné analyse by byla vhodnou molekulou, ovšem její malá velikost 120 nukleotidů, omezuje množství informací, které se z ní dají získat. Z tohoto důvodu se jeví jako nejvhodnější 16 S rrna, která je tvořena přibližně 1500 nukleotidy. Molekula 23 S rrna je tvořena přibližně 3000 nukleotidy a její analysa je experimentálně velmi náročná. V případě eukaryotní buňky je nejvhodnější molekulou 18 S rrna, která je funkčně analogická prokaryotní16 S rrna. Sekvenční rozdíly mezi srovnávanými organismy vypovídají o příslušné fylogenetické vzdálenosti. Ze srovnávacích sekvencí se vypočítává tzv. evoluční vzdálenost, jako procento nehomologických sekvencí mezi RNA pro každou dvojici studovaných organismů. Tímto způsobem lze sestavit nejen jednotlivé vývojové linie, ale fylogenetické schéma všech organismů vyskytujících se na Zemi, tedy základní fylogenetický strom. Délka větví fylogenetického stromu, kterou jsou odděleny kterékoliv dva organismy, je pak přímo úměrná evoluční vzdálenosti mezi nimi. Charakteristika tří domén živých organismů Analýza sekvencí rrna malých ribozomových podjednotek vedla k těmto závěrům: buňky prokaryot a eukaryot se vyvinuly z hypotetického univerzálního předka, jemuž logicky musela předcházet ještě jednodušší živá soustava označovaná jako progenot, jejíž vznik se datuje 5

6 do období mezi 3,8 až 4,2 mld. let před současnou dobou. Od univerzálního předka (tzv. LUCA = last universal common ancestor) se odvinuly základní evoluční linie (větve) organismů vyjádřené univerzálním fylogenetickým stromem zkonstruovaným na základě srovnávání sekvencí nukleotidů 16S-rRNA u prokaryot a 18S-rRNA u eukaryot. Začátkem 70. let minulého století navrhl americký mikrobiolog Carl Woese opustit do té doby výhradně uznávané bipartitní dělení živých organismů (prokaryota, eukaryota) ve prospěch dělení tripartitního, a to na doménu Archaebacteria (která byla v r přejmenována na doménu Archaea) a dále na domény Bacteria a Eukarya. Všechny živé organismy lze tedy podle tohoto přístupu zařadit do těchto tří domén, které představují hierarchicky nejvyšší taxon. Dvě z těchto domén jsou prokaryotní (Archaea, Bacteria) a jedna eukaryotní (Eukarya).V systému organismů založeném na evolučních liniích se organismy netřídí na Prokaryota a Eukaryota, ale na tři domény: Archaea Doména Archaea je skupinou prokaryot, která je ve větvení umístěna nejblíže společnému počátku života a během vývoje podlehla menším změnám než ostatní dvě domény. Je tvořena zástupci s velmi dobře definovanými fenotypy, což je odrazem skutečnosti, že mnoho archaeí osídluje lokality s extrémními podmínkami (vysoká teplota, nízká hodnota ph, značná salinita). Tyto extrémní podmínky do jisté míry odpovídají podmínkám, za nichž život vznikl. V tomto směru mohou být některá Archaea považována za evoluční relikt prvních forem života. Členění této domény úzce souvisí s poznáním nových taxonů. V současné době je tato doména rozdělena do pěti říší: 1. Crenarchaeota 2. Euryarchaeota 3. Korarchaeota 4. Nanoarchaeota 5. Thaumarchaeota Obecná charakteristika: Archaea mají s výjimkou rodu Thermoplasma buněčnou stěnu, která neobsahuje murein. Místo mureinu může být tvořena pseudopeptidoglykanem (pseudomureinem), heteropolysacharidy, případně proteiny. Cytoplasmatická membrána vykazuje rovněž značnou konstrukční variabilitu. Vazba mezi glycerolem a mastnými kyselinami je éterová, nikoli esterová, jako v případě bakterií. Diéterové lipidy tvoří dvouvrstevnou membránu, zatímco tetraéterové představují v plasmatické membráně spojení dvou lipidových vrstev v jednu. Mastné kyseliny mohou být u některých archaeí nahrazeny nevětvenými alifatickými alkoholy (z důvodů teplotní resistence), fosfátová skupina vázaná na molekulu glycerolu může být nahrazena jiným aniontem, např. sulfátem a glycerol může být opačným optickým antipodem v porovnání s bakteriemi. Geny přepisované do trna a rrna (nikoli strukturní geny) obsahují na rozdíl od bakterií introny. Mechanismus sestřihu těchto intronů je podobný mechanismu sestřihu realizovaného eukaryoty. Značná část genů je organizována podobně jako u bakterií do transkripčních jednotek typu operonů. 6

7 Replikace, transkripce a translace mají řadu rysů společných s replikací a transkripcí eukaryot. Translace se vyznačuje se jak prvky bakteriální translace, tak prvky translace eukaryot. Rozmnožování je nepohlavní. Metabolismus je chemoautotrofní nebo chemoheterotrofní (obligátně nebo fakultativně). Unikátní katabolickou drahou archaeí je methanogeneze, která nebyla poznána v případě bakterií ani eukaryot. U archeí neprobíhá fosforylace na substrátové úrovni, ale pouze na membráně. Podle typu fyziologie můžeme archaea rozdělit na tyto skupiny: extrémně halofilní archaea archaea produkující metan hypertermofilní archea archea bez buněčné stěny Bacteria Bakterie jsou prokaryota, která se vyznačují značnou rozmanitostí jak z fyziologického, tak z morfologického hlediska. Dokumentují tak skutečnost, že znaky vycházející z fenotypu jsou špatným fylogenetickým kriteriem. Vnitřní klasifikace této domény prošla rozsáhlými změnami, nově vychází z poznatků molekulární biologie. Obecná charakteristika: Bakterie (s výjimkou mykoplasmat) mají buněčnou stěnu tvořenou peptidoglykanem. Lipidy cytoplasmatické membrány jsou charakterizovány esterovou vazbou mezi fosforylovaným glycerolem a mastnými kyselinami. Geny bakterií neobsahují introny. Značná část genů bakterií je organizována do transkripčních jednotek zvaných operónů. Rozmnožování bakterií je nepohlavní. Vzhledem ke způsobu výživy jsou bakterie autotrofní (fotoautotrofní nebo chemoautotrofní) nebo heterotrofní (fotoheterotrofní nebo chemoheterotrofní). Eukarya Pro evoluci této domény platí skutečnost, že neprobíhala rovnoměrně, ale skokově. Výrazné větvení ve fylogenetickém schématu bylo zapříčiněné významnými geofyzikálními a geochemickými změnami, které na Zemi proběhly. Na základě molekulárního sekvenování a výpočtu evolučních vzdáleností bylo zjištěno, že k výraznému štěpení došlo zhruba před 1,5 mld. let, tedy v době vytváření kyslíkové atmosféry. Oxidační prostředí spolu s ozonovou bariérou bylo dobrým předpokladem pro vývoj nových organismů. Hypotéza vysvětlující vytvoření eukaryotních buněk byla založena na symbiotickém komplexu buněk spolupracujících na společném metabolismu. Eukaryotní buňka se tedy vytvořila endosymbiozou a následnou funkční specializací. Obecná charakteristika: Geny eukaryot (strukturní geny a geny přepisované do trna a mrna) jsou dvojího typu, a to geny bez intronů a geny obsahující introny. Rozmnožování je jednak nepohlavní (převážně u jednobuněčných eukaryot) a jednak pohlavní (převážně u mnohobuněčných eukaryot). Metabolismus je obligátně heterotrofní nebo obligátně autotrofní. 7

8 Buněčná architektura Prokaryotní a eukaryotní buňky mají řadu vlastností společných a v řadě vlastností se liší. Společné vlastnosti: lipidová dvojvrstva ( monovrstva ) slouží u obou typů jako permeabilizační bariéra mezi cytoplasmou a vnějším prostředím ribozómy jsou univerzálním místem syntézy proteinů Rozdílné vlastnosti: Struktury univerzálně přítomné v jedné v jedné skupině mohou v druhé skupině chybět - organely opatřené membránami Struktury vykonávající stejnou funkci u obou typů (bičík) se mohou značně lišit jak ve své architektuře, tak v mechanismu svého účinku. Tyto odlišnosti jsou odrazem jednotlivých evolučních vzdáleností. Průměrná prokaryotní buňka je podstatně menší než buňka eukaryotní. Malá velikost prokaryotní buňky s sebou nese řadu fyziologických výhod: Rychlost akumulace nutričních látek a eliminace produktů metabolismu úzce souvisí s počtem a plochou membrán, přes které probíhá transport látek. Obecně platí, že čím je buňka menší, tím rychlejší může tento transport být. V menších buňkách, zvláště za situace, kdy není vnitřní prostor kompartmentován, může probíhat rychleji i vnitrobuněčný transport. Prokaryota využívají výhod jednoduchosti a miniaturizace. Jejich vysoká růstová rychlost a značná adaptabilita umožňuje obývat ekosystémy s proměnlivými a často extrémními vnějšími podmínkami. Naproti tomu složitost eukaryot, podmiňující pomalejší růst, zároveň poskytuje výhodu při soutěži ve stabilních prostředích s omezenými zdroji živin. Prokaryota Prokaryota jsou charakterizována jednoduchou vnitřní organizací bez zjevné vnitrobuněčné kompartmentace. Disponují obalovými vrstvami obklopujícími vnitrobuněčný obsah tvořený cytoplasmou, genetickým materiálem, ribozómy, inkluzemi, případně dalšími strukturami, charakteristickými pro jednotlivé fyziologické typy. Tyto struktury úzce souvisejí s výskytem jednotlivých taxonů ve specifických ekosystémech. Eukaryota Eukaryotní buňka je vybavena intracelulárními organelami a molekulárními seskupeními, z nichž každé obsahuje soubor enzymů, majících specifické metabolické funkce. Tato kompartmentace buněčných funkcí umožňuje metabolickou kontrolu, kterou nelze dosáhnout u prokaryot. Eukaryota disponují mnoha unikátními znaky (struktura genomu, metabolické a biochemické vlastnosti), kterými se liší od ostatních domén. Cytosol eukaryotní buňky je protkán nekovalentně spojenými dlouhými vlákny proteinů vytvářejících cytoskelet. Cytoskelet je soustavou struktur (mikrotubulů, mikrofilamentů a intermediárních filamentů) majících řadu specifických funkcí. Buněčná výživa ve vztahu k buněčným funkcím Základní charakteristika výživy V přírodě se volně vyskytuje velké množství prvků, avšak na tvorbě biomasy se jich podílí jen velmi málo. Buněčná biomasa se skládá přededevším ze čtyř prvků, z uhlíku, vodíku, kyslíku a 8

9 dusíku, které tvoří přibližně 95% její hmotnosti. Další prvky často v biomase zastoupené, jsou kvantitativně méně významné, ale funkčně velmi důležité. Jsou to: fosfor, vápník, draslík, sodík, hořčík, síra, železo, nikl, mangan, měď, molybden, kobalt, zinek, chrom, selen wolfram, vanad a další. Buňky mikroorganismů mohou metabolizovat 50 různých chemických prvků. Živé organismy jsou tedy tvořeny relativně velmi malým počtem chemických prvků, ovšem možností jejich kombinací je velice mnoho, což je podstatou rozmanitosti života na Zemi. V závislosti na požadovaném množství prvků hovoříme o makronutrientech a mikronutrentech. Zdroje uhlíku živiny (nutrienty), které jsou výchozími substráty pro syntézu uhlíkatých skeletů sacharidů, lipidů, aminokyselin, organických bazí a nukleotidů, se označují jako zdroje uhlíku. Využitelnost zdrojů uhlíku buněčným metabolismem závisí na jejich fyzikálním stavu, chemické struktuře a na fyziologických vlastnostech příslušného mikroorganismu. Z fyzikálněchemických vlastností látek přicházejících v úvahu jako potenciální zdroje uhlíku určuje jejich dostupnost pro daný mikroorganismus zejména velikost molekul, rozpustnost ve vodě, prostorová konfigurace a stupeň oxidace atomu uhlíku. Dusík tvoří přibližně 12% suché váhy prokaryot. Úloha zdrojů dusíku spočívá především ve tvorbě aminoskupin a iminoskupin, které se vyskytují v molekulách aminokyselin, nukleotidů, heterocyklických bazí a jiných sloučenin, např. peptidoglykanu. Kyslík a vodík mají zvláštní postavení mezi ostatními prvky. Tyto prvky bezprostředně ovlivňují metabolické děje a podmiňují neutralizační reakce. Jejich hlavním zdrojem je voda, ovšem jsou součástí většiny anorganických i organických látek. Síra je využívána k syntéze některých aminokyselin a proteinů. V těchto látkách se vyskytuje síra ve svém redukovaném stavu ( ve formě skupin -SH, -S-, -S-S-). Přeměna sulfanylových (sulfhydrylových) skupin v disulfidické můstky a obráceně má důležitý význam pro oxidoredukce spojené se změnou redoxpotenciálu. Fosfor je součástí nukleových kyselin, četných koenzymů a fosfolipidů. Některé sloučeniny fosforu patří mezi energeticky bohaté molekuly (ATP, GTP, CTP, UTP, acetylfosfát). Hořčík slouží v buňkách jako kofaktor více než 300 enzymů, pomáhá udržet konformaci nukleových kyselin, stabilizuje ribozómy, udržuje integritu buněčných membrán a prokaryotního ribozómu. Tyto a další buněčné funkce jsou bezesporu podmíněny unikátními vlastnostmi kationtu Mg 2+. Vápník je nezbytný prvek pro růst mnoha mikroorganismů, pomáhá stabilizovat buněčnou stěnu prokaryotní buňky a hraje klíčovou roli v tepelné stabilitě endospor. Ca 2+ patří spolu s Mg 2+ mezi alkalické kovy tvořící v periodické tabulce prvků II.A skupinu. Tyto dva prvky jsou tradičně spojovány vzhledem ke své blízkosti v periodické soustavě. Vykazují však zcela odlišné strukturální, termodynamické a kinetické vlastnosti. Draslík je nejrozšířenějším katiotem v buňkách mikroorganismů. Je přítomen ve všech mikroorganismech. Draslík ve vnitrobuněčném prostředí slouží k udržení osmotické stability cytoplasmatické membrány ve vztahu k vnějšímu prostředí. Značně velká frakce draslíku je vázána na RNA rovněž z důvodů udržení její stability. Dále K + slouží jako párovací kationt při transportu malých aniontů, má tedy funkci nábojového kompenzátoru. Přítomnost K + je nutná pro aktivitu mnoha enzymů, zejména těch, které se podílejí na syntéze proteinů. Za této situace se uplatňuje spolu s ionty Mg 2+. Sodík je vyžadován pouze některými mikroorganismy, jeho potřeba bezprostředně souvisí s výskytem daného taxonu. Mořská voda, bohatá na Na +, umožňuje růst halofilním 9

10 organismům, zatímco jim příbuzné sladkovodní mikroorganismy obvykle kationty sodíku pro svůj růst nevyžadují. Extrémně halofilní mikroorganismy, především z domény Archaea (vyskytující se kupříkladu v Mrtvém moři), vyžadují pro svůj růst takové koncentrace Na +, které téměř odpovídají maximální rozpustnosti NaCl za daných podmínek. Sodík je esenciálním prvkem pro fotosyntetické bakterie, nemůže být nahrazen žádným jiným monovalentním kationtem. Železo - přítomnost iontů železa je vyžadována téměř všemi mikroorganismy, nikoliv pouze obligátními aeroby. Železo je zapotřebí pro katalytickou aktivitu mnoha enzymů, především těch, které katalyzují oxidačněredukční reakce. Železo je součástí cytochrómů v respiračním řetězci, flavoproteinů a ferredoxinů. Enzymy, podílející se na detoxikaci reaktivních forem kyslíku (katalasa, superoxiddismutasa) rovněž vyžadují železo, podobně jako mono- a dioxygenasy, které zahajují rozklad mnoha polutantů. Další prvky např. kobalt, zinek, molybden, měď, mangan, nikl, selen, vanad, wolfram - jsou vyžadovány pouze některými mikroorganismy a to ve stopových množstvích. Některé mikroorganismy vyžadují ve svém růstovém prostředí přítomnost růstových faktorů. Růstové faktory jsou organické látky, které vystupují zpravidla v úloze: stavebních bloků pro polymerační reakce koenzymů součást enzymů nezbytných pro růst a množení buněk Pokud si tyto látky (aminokyseliny, vitaminy, purinové a pyrimidinové base) buňka nedokáže syntetizovat, musí jí být dodány v hotovém stavu. Vzhledem k charakteru zdrojů energie a uhlíku lze rozlišit čtyři základní typy buněčné fyziologie (Tab 1.). Pro prokaryota obecně platí, na rozdíl od eukaryot, že způsoby získávání energie a způsoby získávání uhlíku mohou být na sobě nezávislé. Tab.1. Základní fyziologické typy jednobuněčných organismů Typ fyziologie Zdroj energie Zdroj uhlíku Příklady Fotoautotrofie Světlo CO 2 Cyanobakterie, některé nachové a zelené bakterie Fotoheterotrofie Světlo Organické látky Některé nachové a zelené bakterie Chemoautotrofie nebo Litotrofie (Litoautotrofie) Anorganické látky, např. H 2, NH 3, NO 2, H 2 S CO 2 málo bakterií, mnoho archaeí Chemoheterotrofie nebo Heterotrofie Organické látky Organické látky většina bakterií, některá archaea Typy buněčných reakcí Navzdory rozmanitosti využívaných zdrojů uhlíku a energie, je prostřednictvím energetických reakcí vytvářen omezený soubor malých molekul, charakteristický pro jednotlivé buněčné typy. Energetické reakce mají konvergentní charakter (vycházejí z širokého spektra nutrientů a ústí v omezený počet produktů). Reakce, vycházející z těchto malých molekul, (z produktů reakcí energetických) jsou pak vzájemně podobné a nepříliš závislé na typu buňky. Tyto reakce jsou klasifikovány jako reakce biosyntetické a slouží k syntéze stavebních bloků. Stavební bloky jsou následně zpracovávány reakcemi polymeračními, jejichž výsledkem je biosyntéza polymerů. Polymery jsou zabudovávány do nadmolekulárních seskupení reakcemi, pro které se zavedl 10

11 název samouspořádání. Na základě primárního významu reakcí pro buněčný růst můžeme tedy mluvit o reakcích: energetických biosyntetických polymeračních vedoucích k samouspořádání Energetické reakce V energetických reakcích vykazují mikroorganismy vyjímečnou metabolickou přizpůsobivost. Zejména prokaryota jsou schopna růst téměř ve všech životních prostředích bez ohledu na charakter zdrojů uhlíku, energie, na dostupnosti akceptorů elektronů a fyzikálních podmínkách dané lokality. Jakýkoliv využívaný zdroj energie musí splnit stejné metabolické poslání: produkovat 12 prekursorových metabolitů redukované pyridinové nukleotidy ukládat metabolickou energii (formou protonmotivní síly, ATP nebo jiné energeticky bohaté molekuly.) Všechny produkty jsou vytvářeny v přesných poměrech, jak to vyžaduje biosyntéza a polymerace. Vzhledem k tomu, že rozdílné substráty poskytují různá množství metabolitů, buňka upravuje jejich poměr modulací průtoku substrátů metabolickými dráhami. Prekursorové metabolity jsou syntetizovány souborem reakcí, které jsou nazývány centrální metabolismus. Centrální metabolismus je ve své podstatě velice flexibilní. Metabolické dráhy a samostatné reakce, které ho tvoří, mohou probíhat cyklicky a zcela degradovat glukosu (případně jiný zdroj uhlíku) na CO 2 a H 2 O za tvorby ATP a NADH. Dojde-li však ke změně vnějších podmínek, energetické dráhy mohou probíhat jednosměrně a to tak, aby doplnily prekursorové metabolity využité biosyntézami. Obecně lze konstatovat, že funkce centrálních energetických drah závisí na: charakteru růstových substrátů na vlastnostech přítomných akceptorů elektronů na druhu a počtu požadovaných stavebních bloků To znamená: pokud je přítomen vhodný elektronový akceptor, TCA cyklus oxiduje acetyl-coa, uvádí v činnost respirační řetězec a generuje ATP potřebný pro růst. Pokud není přítomen vhodný elektronový akceptor, TCA cyklus produkuje téměř výhradně prekursorové metabolity. Růst na substrátech, které nejsou intermediáty centrálního metabolismu, je realizován prostřednictvím periferních drah tvořených reakcemi, které konvertují příslušné substráty na intermediáty centrálního metabolismu. Biosyntetické reakce Biosyntézy se vyznačují jednou velmi charakteristickou vlastností. Určitý produkt biosyntetických reakcí se vytváří u všech organismů víceméně stejným způsobem. Drobné rozdíly v biosyntézách sice existují, jsou však nepodstatné. Výjimkami jsou biosyntézy komponent typických pro daný organismus, které zároveň slouží jako indikace specifických biochemických projevů souvisejících s osídlením konkrétní lokality. Biosyntetické reakce produkují stavebních bloků pro polymerační reakce, koenzymy, prostetické skupiny a signalizační molekuly. Výchozími látkami pro biosyntetické reakce je 12 prekursorových metabolitů, redukované nukleotidy, zdroje dusíku a síry a jednouhlíkaté jednotky. Žádný prekursorový metabolit neobsahuje dusík nebo síru, avšak tyto prvky jsou 11

12 obsaženy v mnoha molekulách. Do biosyntetických drah vstupují v anorganické podobě, dusík jako amonný iont a síra v podobě S 2-, nebo SO Biosyntetické dráhy jsou lineární, větvené a cyklické, běžným jevem v těchto drahách je provázanost reakcí. Polymerační reakce Polymerační reakce vytvářejí z aktivovaných molekul stavebních bloků dlouhé přímé nebo větvené řetězce. Všechny makromolekuly jsou vytvářeny ze stavebních bloků. Jejich polymerace na proteiny, RNA, DNA a glykogen probíhá uvnitř buňky, zatímco finální kroky polymerace lipopolysacharidů, kapsulí a peptidoglykanu nastává vně buněčné membrány. Reakce vedoucí k samouspořádání Tyto reakce zahrnují chemickou modifikaci makromolekul, jejich dopravu na požadované místo v buňce a následné spojení do buněčných supramolekulových celků. Společné pro všechny takové funkční celky je skutečnost, že jejich makromolekulové komponenty nejsou k sobě vázány vazbami kovalentními (chemickými), ale slabými nekovalentními vazbami, jako jsou přitažlivost iontů, vodíkové můstky, hydrofobní síly, van der Waalsovy síly a další. Těchto slabých interakcí je v rámci jednoho celku velké množství a proto jsou supramolekulové útvary velmi stálé v širokém rozmezí fyziologických podmínek. Nutnou podmínkou pro vznik takových útvarů je možnost vzájemného přiblížení interagujících komponent. Ta je dána komplementaritou jejich povrchů. Velmi podstatná je skutečnost, že vznik nadmolekulových útvarů nevyžaduje energii, je to proces spontánní. Neméně podstatné je i to, že vznikají bez potřeby vnější informace nebo instrukce. Veškerá potřebná informace je obsažena již v primární struktuře participujících molekul. Ta determinuje velikost molekuly a její tvar a tím i jedno nebo více rekogničních a vazebných míst, kterými jsou partneři navzájem poutáni specifické kvarterní tedy nadmolekulové struktury. Tyto útvary vznikají samouspořádáním. Mnoho biologických dějů probíhá mimořádně rychle a jejich realizace je možná pouze vznikem a zánikem nekovalentních vazeb podjednotkových komponent, tedy energeticky nenáročných a rychlých slabých mezimolekulových interakcí. V této skutečnosti spočívá další výhoda subjednotkové výstavby supramolekulárních funkčních celků. Buněčný transport Povrchové struktury buňky jsou charakterizovány různou propustností. Zatímco buněčnou stěnou mohou volně pronikat ionty a malé molekuly, je cytoplasmatická membrána semipermeabilní. Polopropustnost membrány však není zcela ideální. Díky asymetrické struktuře, podmíněné zvláštním uspořádáním molekul bílkovin a lipidů se vytvářejí v membráně póry, jimiž mohou některé látky pronikat. Transportní mechanismy buňky, můžeme dělit podle dvou základních kriterií: 1. podle architektury transportních zařízení 2. podle nároků mechanismů na dodání energie ad 1. Existují dva základní typy transportních systémů, které se nyzývají kanálky a transportéry (též permeasy, nosiče, přenašeči). Kanálky umožňují penetraci molekul přes membránu, přičemž transportované molekuly (ani příslušná transportní zařízení) nejsou během transportu pozměňovány. Kanálky rozlišují molekuly většinou pouze podle velikosti, v některých případech pak o transportu rozhoduje určitá specifická funkční skupina transportované molekuly. Kanálky zprostředkovávají pasivní difuzi. 12

13 Transportéry umožňují příjem molekul a během transportu podléhají konformačním změnám. Transportéry obsahují vazebné místo specifické pro určitý substrát. Existují ve dvou konformačních stavech s vazebnými povrchy střídavě orientovanými ke dvěma membránovým povrchům. Hodnoty K m a V max těchto transportérů mohou být odlišné v závislosti na orientaci vazebných míst. Transportéry zprostředkovávají dva základní typy transportních procesů: usnadněnou difuzi a aktivní transport. ad 2. Molekuly mohou pronikat membránou buď pasivně, difuzí, nebo aktivně, prostřednictvím zvláštních transportních energetických systémů. Tyto systémy se tradičně dělí na prostou difuzi, usnadněnou difuzi, aktivní transport a skupinovou translokaci. Difuze Difuze směřuje k vyrovnání koncentračních nebo elektrochemických rozdílů uvnitř a vně buňky a nevyžaduje dodání energie. Difundující látka přitom zůstává v původní podobě. Prostá difuze Rychlost difuze je dána koncentračním, případně elektrochemickým gradientem dané látky. O propustnosti membrány pro daný typ látky rozhoduje permeabilizační konstanta, která je úměrná velikosti plochy, přes niž k difuzi dochází. Zprostředkovaná (usnadněná) difuze Probíhá za účasti stereostecifického nosiče proteinové, nebo lipoproteinové povahy, situovaného v membráně. Přítomnost specifického vazebného místa a prostorově měnitelná konfigurace umožňuje vazbu nosiče s příslušným substrátem a jeho přenos přes membránu. Po uvolnění vazby přechází nosič do původního stavu. Rychlost přenosu je podobně jako u pasivní difuze rovněž závislá na koncentračním gradientu, avšak s tím rozdílem, že při nasycení transportního systému substrátem se už dále nezvyšuje. Aktivní transport Převážná většina živin a metabolitů proniká cytoplasmatickou membránou prostřednictvím aktivního transportu. Ten je charakterizován tím, že kromě substrátově specifického přenašeče (permeasy) je vybaven rovněž energetickým systémem, který umožňuje přenos látek bez ohledu na koncentrační gradient. Dosažená koncentrace substrátu ve vnitrobuněčném prostředí může být mnohonásobně větší než v mediu. Aktivní transport se podobá usnadněné difuzi svojí stereospecifitou, ale díky dodané energii umožňuje akumulaci látek i proti příslušnému gradientu. Je možné rozlišit tři typy sekundárního aktivního transportu, a to symport, antiport a uniport. Symport Symport je transport dvou komponent simultánně týmž směrem pomocí jednoduchého nosiče. Pokud je jedna ze dvou komponent transportována do vnitrobuněčného prostředí na základě koncentračního gradientu, pak druhá je transportována spolu s ní. Tento transport probíhá na úkor koncentračního gradientu (až do vyrovnání koncentrací) nebo na úkor membránového elektrického potenciálu. Jestliže je řídící silou iontový gradient, může být v případě symportu přenášen opačně nabitý iont nebo neutrální molekula. Je-li přenášen opačně nabitý iont, je snižován koncentrační gradient, je-li přenášena neutrální molekula, je snižován jak koncentrační gradient, tak membránový potenciál. 13

14 Antiport Antiport je simultánní transport realizovaný přenašečem, při kterém jsou dvě látky transportovány opačným směrem. Řídící silou může být buď ph gradient, nebo membránový elektrický potenciál. Přenášeny mohou být jak ionty, tak neutrální molekuly. Aktivní uniport Pojmem aktivní uniport míníme průtok iontů řízený iontovým gradientem (ph gradientem). Tento transport je založen na přitahování nebo odpuzování iontů založeném na záporném náboji buněčného interiéru. Skupinová translokace Tento název zahrnuje mechanismy, které chemicky pozměňují substráty na deriváty, které jsou transportovány do buňky. Tyto mechanismy nepředstavují aktivní transport v pravém smyslu, protože nejsou poháněny gradientem iontů na membráně, mají však stejnou metabolickou funkci. Koncentrace substrátu uvnitř buňky je vyšší než koncentrace jeho volné formy ve vnějším prostředí. Transport substrátu do buňky pomocí skupinové translokace představuje ve srovnání s aktivním transportem úsporu metabolické energie. Přeměna molekuly substrátu, k níž dochází v průběhu transportu, vyžaduje dodání energie. Příslušná reakce by stejně proběhla i ve vnitrobuněčném prostředí, vzhledem k tomu, že představuje první intracelulární reakci, zapojující substrát do drah centrálního metabolismu. Skupinová translokace je pak pro buňku energeticky výhodnější, než energeticky závislý aktivní transport. Není proto překvapující, že tento úsporný mechanismus je hodně využíván striktními a fakultativními anaeroby. Aerobové mechanismus skupinové translokace využívají velmi zřídka, u eukaryot popsán nebyl. Nejznámější formou skupinové translokace je fosfotransferasový systém, který je využíván mnoha prokaryoty pro transport cukrů (glukosa, manosa, fruktosa), purinů, pyrimidinů a mastných kyselin. Transport jedné a téže látky je u různých mikroorganismů realizován různými transportními mechanismy. Zároveň může nastat situace, kdy jeden a týž substrát je u téhož mikroorganismu transportován do buňky více transportními mechanismy. Tato skutečnost buňku zvýhodňuje, protože buňce umožňuje lépe reagovat na změnu růstových podmínek. Z výše uvedeného textu vyplývá, že buňka je vybavena transportními mechanismy zajišťujícími transport nutričních látek do buňky. Tyto mechanismy mají však ještě další úkoly. Jedním z nich je transport endogenně syntetizovaných metabolitů ven z buněk. Transportní mechanismy jsou součástí buněčného aparátu, kterým buňka reaguje na změny vnějšího prostředí (smyslový aparát), jak je tomu např. v případě chemotaxe. Fyziologie růstu Růst a množení buněk a buněčné populace Nacházejí-li se jednobuněčné organismy v prostředí s vhodným nutričním složením a s vyhovujícími fyzikálními i podmínkami, pak rostou a množí se. Reprodukce buňky je totožná s reprodukcí jedince. U mnohobuněčných organismů dochází zároveň s růstem k vývojovým změnám v důsledku neměnného programu biologické diferenciace. U mnohobuněčného organismu lze využít vývojových charakteristik k hodnocení růstu. U jednobuněčného organismu tuto možnost nemáme, v tomto případě je nejdůležitější charakteristikou stanovení rychlosti, s níž růst probíhá. Studium růstu mikrobní populace tvoří 14

15 podstatu fyziologie mikroorganismů, protože růstové charakteristiky přímo odrážejí fyziologické změny jednotlivých buněk. Jinak řečeno, buněčné události jsou manifestovány změnou růstu buněčné populace. Růst buňky může v zásadě být dvojí. V prvním případě takový, při kterém všechny extenzivní vlastnosti (vlastnosti, pro které platí aditivnost obsah sušiny, počet buněk, obsah buněčných komponent, jejichž hmotnostní zastoupení se mění proporcionálně s růstem buňky) přirůstají v čase stejnou měrou, a pak hovoříme o růstu vyváženém (balancovaném). V druhém případě, kdy extenzivní vlastnosti nepřirůstají úměrně s časem (změny v rychlosti syntézy některých buněčných komponent nejsou přímo úměrné změnám v počtu buněk, např. během adaptivních změn buněčného fenotypu), mluvíme o nevyváženém (nebalancovaném) růstu. O vyváženém (nevyváženém) růstu můžeme hovořit jak v souvislosti s buňkou jako individuem, tak v souvislosti s buněčnou populací. Vyvážený růst může probíhat za dvou zásadně odlišných situací. První možnost představuje stav, kdy jsou všechny živiny v médiu přítomny v tak vysoké koncentraci, že jejich další zvýšení neovlivní rychlost průběhu žádného buněčného děje, tedy ani rychlost růstovou a potom takový růst nazýváme růstem nelimitovaným. Druhým případem vyváženého růstu je růst limitovaný. Limitovaný růst nastává za situace, kdy minimálně jedna z živin je přítomna v tak nízké koncentraci, že ovlivňuje rychlost určitého buněčného děje a tedy i rychlost růstovou. Růst buněčné populace Pro analysu růstu buněčné populace je základní situací růst čisté kultury v uzavřeném kultivačním prostředí, které obsahuje nadbytek živin. V těchto podmínkách lze při kultivaci rozlišit čtyři hlavní stadia růstu, které představují čtyři odlišné typy buněčné fyziologie: Lag fáze Lag fáze je vyjádřením fyziologické vzdálenosti buněk inokula od populace rostoucí exponenciálním růstem. Délka lag fáze je dána především třemi procesy. Přestavbou buňky klidové v buňku exponenciálně rostoucí, adaptací buňky na nové prostředí, a úpravou nového prostředí činností buněk. Všechny tyto faktory se mohou samozřejmě kombinovat. Délka lag fáze není a nemůže být ve vztahu k ostatním fázím růstu, které po ní následují. Faktory, které ovlivňují délku lag fáze neovlivňují ostatní fáze růstu. Exponenciální fáze Parametrem, kvantitativně charakterizujícím exponenciální fázi, je specifická růstová rychlost. Její hodnota je ovlivněna zejména složením kultivačního média a podmínkami kultivace. Stacionární fáze Dvě hlavní příčiny přechodu populace exponenciálně rostoucí do stacionární fáze: 1. Vyčerpání jedné z živin 2. Nahromadění toxických zplodin metabolismu (nebo vysoká koncentrace biomasy). Fyziologie buněk ve stacionární fázi vykazuje specifické rysy. Populace buněk je heterogenní v tom smyslu, že obsahuje na jedné straně buňky hynoucí a autolyzující, na druhé straně ještě buňky rostoucí a množící se a zároveň buňky klidové. Fáze odumírání buněk Příčinou hynutí je destrukční působení fyzikálních a chemických faktorů na chemické skupiny či vazby makromolekul a supramolekulární uspořádání, přesněji řečeno převládnutí těchto procesů nad procesy oprav (reparace). 15

16 Mikrobní interakce v binárním systému Vzájemné působení mikrobních populací je běžně studováno na základě analýzy těchto vztahů v binárním systému. Lze zaznamenat následující typy vzájemných vztahů: Neutralismus nastává, když se populace vzájemně neovlivňují (může být dáno i výrazným ředěním). Amensalismus situace, při níž jedna z populací má nepřímý negativní dopad na populaci druhou, přičemž škodlivě ovlivňovaná populace je neutrální; není zde zahrnut vzájemný buněčný kontakt (produkce bakteriocinu jedním kmenem, který působí inhibičně na druhý kmen). Kompetice soutěž dvou současně přítomných populací o společný substrát, který je pro růst obou populací nezbytně nutný. Komensalismus - situace, kdy jedna z přítomných populací využívá metabolické produkty, případně aktivity jiné, současně přítomné populace. Jedna populace má tedy prospěch z populace druhé, sama zůstává však neutrální (spotřeba kyslíku aerobními nebo fakultativně anaerobními mikroorganismy umožní růst anaerobům). Predace přímá negativní interakce, při níž je jeden organismus konzumován druhým Do této kategorie vztahů můžeme zařadit také parazitismus, který je representován situací, kdy jeden organismus je intracelulárně napadán druhým. Mutualismus přináší prospěch oběma přítomným populacím. Do této kategorie lze zahrnout synergismus vzájemné posílení stávajících aktivit (rychlost degradace celulosy pomocí izolátů in vitro je vždy nižší ve srovnání s degradací in vivo. Dále sem patří symbiosa zahrnuje vzájemný buněčný kontakt, oběma populacím přináší prospěch, je interakcí obligátní. Protokooperace - fakultativní typ interakce, spočívá ve vzájemně výhodné metabolické spolupráci (každá ze dvou přítomných populací produkuje extracelulární metabolit, který využívá druhá současně přítomná populace). Tato interakce není trvalá a není nutná pro přežití obou populací. Buněčná diferenciace Pojmem buněčná diferenciace je nazýván proces, ve kterém beze změny informace uložené v DNA se v čase mění morfologické, fyziologické a biochemické vlastnosti buňky, tedy její fenotyp. Diferenciace postihuje jak buňky nerostoucí, tak buňky rostoucí a dělící se. Nerostoucí buňky mění v důsledku diferenciace své vlastnosti oproti výchozímu stavu, u rostoucích a dělících se buněk se mění vlastnosti jedné nebo obou buněk dceřiných ve srovnání s vlastnostmi původní mateřské buňky. Vlastnosti buňky jsou dány molekulární sestavou buňky, tedy kvalitativním a kvantitativním obsahem velkých a malých molekul. O molekulární skladbě molekul rozhoduje to, které geny daného genomu jsou aktivní a jsou tedy realizovány, a které naopak přepisovány nejsou. Molekulární podstatou diferenciace je selektivní zapínání a vypínání genetické informace a to na základě molekulárních impulsů, které vycházejí z vnějšího a vnitrobuněčného prostředí. Studium diferenciačního procesu u jednobuněčného organismu je vhodným modelem pro organismy mnohobuněčné. U rostoucích a dělících se buněk jednobuněčného organismu je možné rozlišit dva základní typy diferenciace, a to dočasnou a trvalou. Dočasná (biochemická) diferenciace trvá tak dlouho, pokud působí signál, který ji vyvolal. Příkladem je indukovaná syntéza enzymů v rostoucí buněčné populaci, k níž 16

17 dojde na základě přítomnosti vhodného induktoru v médiu. Přítomnost takové látky navodí expresi genů, které do této doby přepisovány nebyly a v důsledku této skutečnosti jsou buňky vybaveny novými enzymy, kterými původní populace nedisponovala. Nové buňky jsou tedy s ohledem na výchozí stav diferencovány (odlišeny). Tento stav přetrvává tak dlouho, dokud je induktor přítomen. Po jeho vyčerpání se příslušné induktivní enzymy přestanou tvořit a nově vzniklé buňky jsou opět shodné s původními buňkami. Dočasná diferenciace je účinné opatření umožňující mikroorganismům pružně reagovat na měnící se vlastnosti vnějšího prostředí. Trvalá diferenciace spočívá ve skutečnosti, že buňka zůstává v novém (diferencovaném) stavu i poté, co vymizel vyvolávací impuls. Tato diferenciace může být buď vratná, nebo nevratná. V případě vratné diferenciace je možný návrat do původního stavu na základě přítomnosti nového signálu, v případě nevratné diferenciace obnova původního stavu není možná. Buněčný cyklus Buněčný cyklus spočívá v posloupnosti vzájemně koordinovaných procesů, které vedou od jednoho buněčného rozdělení k následujícímu buněčnému dělení. Je příkladem cyklického diferenciačního procesu tvořeného jednotlivými nevratnými kroky, nicméně jejich seřazení do příčinného cyklu vede v návratu do výchozí situace. Buněčný cyklus je obdobím individuálního života buňky. V průběhu buněčného cyklu dochází k autoreprodukci buňky. U jednobuněčných organismů je reprodukce buňky zpravidla totožná s reprodukcí jedince. Pro reprodukci buňky se používá termín dělení buňky. Dělení buňky je možno popsat a časově vymezit. Buněčný cyklus je charakteristický tím, že většina dějů, které ho tvoří, neprobíhá současně, ale právě naopak. Tyto děje mohou být v principu seřazeny do sekvence pevné nebo proměnné. Pevná sekvence může být v prvním případě řízena kauzálně. To znamená, že každá událost je důsledkem události předchozí a příčinou události následující. Zastavení jedné události pak vede k zastavení celého cyklu. V druhém případě je sekvence dána řídícím časovým mechanismem. V tomto případě nemusí zastavení jedné události zastavit celý cyklus, vzhledem k tomu, že události nejsou příčinou jedna druhé. V proměnné sekvenci je každá událost jak co do příčinného vztahu, tak co do pořadí v čase navzájem nezávislá. Mezi těmito dvěma možnostmi existuje řada přechodů. Reálný životní cyklus buňky je kombinací pevných a příčinných sekvencí tvořících větve, které jsou vzájemně uspořádány do sekvence proměnné. Buněčný cyklus lze rozčlenit na určité úseky, na fáze buněčného cyklu. Mikroorganismy jsou z hlediska evoluce velmi různorodé a lze očekávat, že různý fylogenetický původ, zvláště pak rozdíly mezi prokaryoty a eukaryoty, jsou hlavní skutečnosti, které určují průběh konkrétního životního cyklu. Cyklická reprodukce buněk se však vždy vyznačuje stejnými základními charakteristikami buněčného cyklu. Smyslem cyklické reprodukce buněk není jen pouhé doplňování ztrát v jejich počtu, biologický smysl této reprodukce má dva hlavní cíle: Střídání generací spojené s rekombinací genů a novými mutacemi je základním mechanismem evoluce druhu. Cyklické střídání generací je nejvýhodnějším mechanismem odstraňujícím šum v genetické informaci, který se nahromadí během života jedince. 17

18 Vnější faktory a jejich působení na buňku Buňky prokaryot, jednobuněčných eukaryot a mnoho buněk tvořících rostlinné nebo živočišné tkáně, se během svého života setkává s působením celého spektra vnějších faktorů, dosahujících běžných (fyziologických) i extrémních hodnot. Nejčastěji jsou to vysoká nebo naopak nízká teplota, zvýšená koncentrace iontů, případně jiných osmoticky aktivních látek, přítomnost toxických látek (těžké kovy, xenobiotika), hladovění na živiny, náhlé změny v aeračním režimu a další. Životní pochody buňky probíhají v těsné závislosti na podmínkách vnějšího prostředí. Tyto podmínky jsou odrazem společného působení různých faktorů. Obecným znakem většiny z nich je zákonitý charakter jejich účinku, který se projevuje charakteristickými body minimálního, optimálního a maximálního působení na fyziologický stav buňky. Pojmem fyziologický stav buňky rozumíme soubor morfologických, biochemických a fyziologických projevů buňky, které jsou ve vzájemném vztahu. Minimální účinek vnějšího činitele bývá vztahován k začátku růstu a množení, optimum působení odpovídá maximální rychlosti růstu a množení, případně nejvyšší rychlosti metabolických dějů. Při maximální intenzitě působení příslušného faktoru se životní projevy buňky zastavují. Na změnu v extracelulárním prostředí vyvolanou jediným faktorem reaguje živý systém jako celek, proto ji můžeme sledovat na řadě růstových a fyziologických charakteristik buněčné populace. Při studiu vlivu určitého faktoru vnějšího prostředí je však nutné nechápat tento faktor odděleně, ale v rámci spolupůsobení faktorů ostatních. V dalším textu budou zmíněny pouze vybrané, nejčastěji diskutované faktory vnějšího prostředí. Teplota Mikroorganismy mohou plnit své životní funkce pouze v určitém rozmezí teploty, charakterizovaném body minima, optima a maxima. Rozmezí mezi minimální a maximální teplotou představuje teplotní pásmo růstu. Jeho rozsah se může u různých mikroorganismů značně lišit. Kupříkladu saprofytní bakterie jsou charakterizovány širokým teplotním pásmem růstu, u patogenních bakterií je naopak velice úzké. Teplota ovlivňuje živé organismy dvěma protichůdnými způsoby. Se zvyšováním teploty chemické a enzymatické reakce v buňce probíhají rychleji a tudíž se celkový růst zrychluje. Na druhé straně zvýšení teploty nad určitou mez denaturuje a ireversibilně poškozuje proteiny, nukleové kyseliny a další teplotně sensitivní buněčné komponenty. Zvyšování růstové teploty až do bodu inaktivace má za následek prudký pokles rychlosti metabolických dějů. Mikroorganismy lze v závislosti na příslušném teplotním pásmu tradičně členit na psychrofily, mesofily, termofily a hypertermofily. Proti tomuto členění jsou vyslovovány námitky, vycházející ze skutečnosti, že stejně jako se v přírodě plynuje, mění teplotní podmínky, tak i mikroorganismus reaguje postupnými změnami své architektury a vnitrobuněčné výbavy na měnící se prostředí. Uvedené členění se však přesto tradičně používá, protože konkretizuje určitý typ buněčné fyziologie. Mikroorganismy osídlují prostředí, která jsou na jedné straně velmi chladná a nehostinná, na druhé straně jsou schopné růstu a množení za extrémně vysokých teplot. Buněčná architektura a adaptační mechanismy těchto mikroorganismů jsou intenzivně studovány, protože významně mění náš pohled na výskyt různých forem života v extrémním prostředí. Rovněž enzymy, které vykazují katalytickou aktivitu a strukturální stabilitu jsou atraktivní pro biotechnologii. Osmotický tlak Vzhledem k potřebě buňky zachovat vnitrobuněčné napětí v žádaném rozmezí, a to navzdory měnící se osmomolaritě vnějšího prostředí není překvapující, že buňka disponuje mechanismy, 18

19 které ji umožňují upravovat svoji vnitřní osmomolaritu podle aktuální situace. Buňka odpovídá na vnější hyperosmotický stres vzrůstem interní koncentrace několika látek. Jsou to především aminokyseliny (glutamát, glutamin, prolin, γ-aminobutyrát, alanin, glycinbetain), N-metylderiváty aminokyselin, cukry (sacharosa, trehalosa, glukosylglycerol) a ionty (K + ). Nejvýznamnější (univerzální) je v tomto směru úloha K + iontů. Jestliže stoupá osmomolarita v růstovém prostředí, vnitrobuněčná koncentrace tohoto iontu rovněž roste. Naopak, klesá-li osmomolarita vnějšího prostředí, je K + pumpován ven z buněk. Je samozřejmé, že vzrůstající vnitřní osmomolarita při zachování konstantní hodnoty membránového napětí má své omezení. Dříve nebo později vysoká vnitřní osmomolarita inhibuje aktivitu některých enzymů a postupně zastavuje buněčný růst. Všechny látky přítomné ve vnitrobuněčném prostředí však nemají pro buňku škodlivé účinky. Některé komponenty, např. výše uvedené osmoprotektanty, jsou schopné zmírňovat poškozující vliv vysoké osmomolarity. V závislosti na citlivosti k roztokům solí lze rozlišit mikroorganismy nehalofilní, mírně, středně a extrémně halofilní. Hydrostatický tlak Velký počet mikroorganismů je ve své životní činnosti ovlivňován změnami hydrostatického tlaku. Vlivem vyššího tlaku dochází ke zpomalení či ztrátě pohybu, ke změnám v metabolismu a zastavení růstu. Mechanismus účinku hydrostatického tlaku spočívá především ve zmenšování objemu a zvyšování viskozity buněčného obsahu, čímž dochází k inaktivaci enzymů a tím ke snižování rychlosti nebo přímo k zastavení biochemických reakcí. Účinek zvýšeného tlaku závisí i na době a teplotě působení. Vysoký hydrostatický tlak indukuje syntézu stresových bílkovin Csp a Hsp, čímž napodobuje odpověď buňky na tepelný a chladový šok. Jak vysoká teplota, tak vysoký tlak destabilizují zejména kvartérní strukturu proteinů a tím zvyšují počet disociovaných nefunkčních jednotek. Mikroorganismy, rostoucí lépe za podmínek zvýšeného hydrostatického tlaku, vyššího než 1 atm, jsou označovány jako barofilní (piezofilní). Obligátně barofilní mikroorganismy hynou při hydrostatickém tlaku nižším než 1 atm. ph kultivačního prostředí Úspěšný růst mikroorganismů je možný jen při určité hodnotě ph daného prostředí. Podobně jako je tomu u teploty, má i ph daného prostředí pro každý mikroorganismus své minimální, optimální a maximální hodnoty, dovolující růst a množení buněk. Tyto hodnoty odpovídají přibližně optimálním hodnotám ph vyžadovaným pro činnost životně důležitých enzymů a mají vztah k teplotě daného prostředí. V souvislosti s požadavky na ph kultivačního prostředí můžeme mikroorganismy dělit na acidofilní, neutrofilní a alkalifilní. Hodnota ph v životním prostředí se z velké části pohybuje v rozmezí ph 4 až 9, pouze omezené spektrum mikroorganismů osídluje lokality s hodnotami ph nižšími než 3 a vyššími než 9. Kritickým faktorem pro život v prostředí s extrémními parametry ph je stabilita buněčné membrány. Základní regulační mechanismy Regulace metabolismu spočívá v regulaci rychlosti enzymových reakcí, tj. v regulaci rychlosti zániku jedněch a vzniku jiných kovalentních vazeb. Vznik a zánik nekovalentních vazeb je podstatně rychlejší než vazeb kovalentních, a proto nelimituje celkovou rychlost dějů. Enzymy se v první fázi své činnosti spojují se svými substráty slabými vazebnými interakcemi. Vzhledem k tomu, že enzymy katalyzují zpravidla oba směry reakce, musí mít afinitu pro oba typy reagujících molekul. Kdyby byly enzymy připojeny k substrátům pevnějšími vazbami, jejich účinek by byl mnohem pomalejší. Energie nejsilnější slabé vazby je jen asi desetkrát větší, než je průměrná energie kinetického pohybu atomů. Slabé vazebné síly se uplatní jen při těsné interakci 19