CHEMIE POTRAVIN A CHEMICKÉ LABORATORNÍ METODY OBECNÉ KAPITOLY

Transkript

1 VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie mléka CHEMIE POTRAVIN A CHEMICKÉ LABORATORNÍ METODY OBECNÉ KAPITOLY Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D. MVDr. Michaela Králová, Ph.D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Mgr. Romana Kostrhounová, Ph.D. Brno 2014

2

3 Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost: Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ ) 1

4 OBSAH 1 ODMĚRNÁ ANALÝZA VOLUMETRIE Acidobazické (neutralizační) titrace Komplexometrické titrace Srážecí titrace Oxido-redukční (redoxní) titrace POTENCIOMETRIE Základy analytické potenciometrie Technika a postupy potenciometrické analýzy Analytické využití potenciometrie Přímá potenciometrie Potenciometrická titrace Přídavkové metody OPTICKÉ METODY Polarimetrie Polarimetr Využití polarimetrie Refraktometrie a interferometrie Refraktometrie Využití refraktometrie Interferometrie Využití interferometrie Turbidimetrie a nefelometrie Využití turbidimetrie a nefelometrie Spektrometrie Atomová absorpční spektrometrie (AAS) Plamenová AAS Elektrotermická AAS (ET-AAS) Atomizace po konverzi prvku na těkavé hydridy (Hg-AAS) Molekulová absorpční spektrometrie UV-VIS spektrometrie Infračervená spektrometrie CHROMATOGRAFICKÉ METODY Klasifikace chromatografických metod Plynová chromatografie (GC) Instrumentace v plynové chromatografii Kapalinová chromatografie (LC) Instrumentace v kapalinové chromatografii Superkritická fluidní chromatografie SFC Mobilní fáze Stacionární fáze, sorbenty Základní pojmy chromatografické separace Vyhodnocování výsledků Kvalitativní hodnocení Kvantitativní hodnocení EXTRAKČNÍ METODY Rozdělení extrakčních soustav Extrakce kapalina/kapalina (LLE)

5 5.1.2 Soxhletova extrakce Extrakce za zvýšené teploty a tlaku (PSE, PLE, ASE) Alkalická hydrolýza zmýdelnění Extrakce na pevnou fázi (SPE) Aplikace SPE Provedení SPE Používané stacionární fáze pro SPE QuEChERS Základní pracovní schéma DEFINICE ZÁKLADNÍCH POJMŮ (VHODNOST ANALYTICKÝCH METOD) SEZNAM ZKRATEK LITERATURA

6 PŘEDMLUVA Chemie potravin a chemické laboratorní metody je průřezovou disciplínou pro potravinářské vědy, svou náplní je "praeklinickou" disciplínou pro navazující předměty technologickohygienické bakalářského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin FVHE VFU Brno. Náplň praktické výuky je zaměřena na zvládnutí analytické práce v hygienicko-potravinářské laboratoři, zaměřené na osvojení si metodik fyzikálně-chemického rozboru jednotlivých komodit a dynamických dějů v nich probíhajících; správného vyhodnocení výsledků (výpočetní technika) a jejich interpretaci vzhledech k platným hygienickým limitům. Předkládaný materiál je souhrnem teoretických informací o nejpoužívanějších metodách v analýze potravin. Cílem materiálu je předložit studentovi stručný princip metod, na základě kterých se provádí stanovení fyzikálně-chemických parametrů potravin. 4

7 1 ODMĚRNÁ ANALÝZA VOLUMETRIE Odměrná (volumetrická, titrační) analýza je způsob kvantitativního stanovení látek, při němž k roztoku látky, jež se má stanovit, přidáváme z byrety roztok odměrného činidla se známou koncentrací látky tak dlouho, až děj, který je postatou stanovení, právě kvantitativně proběhne; v tom okamžiku je dosaženo bodu ekvivalence, který se snažíme určit co nejpřesněji buď: a) subjektivně: vizuálně (autoindikace u manganometrie) vizuálně pomocí indikátorů (v převážné většině případů je barevná změna použitého indikátoru založena na stejné chemické reakci, jako ta, která probíhá mezi odměrným činidlem a stanovovanou látkou, např. acidobazická titrace vyžaduje acidobazický indikátor). b) objektivně: instrumentálními metodami měřením fyzikálně-chemické veličiny (např. potenciálu). K využití ve volumetrii se hodí takové reakce, které probíhají dostatečně rychle a jejichž průběh lze vyjádřit rovnicí v definovaných stechiometrických vztazích, přičemž poměry reagujících látkových množství jsou dány poměry stechiometrických koeficientů. TYPY TITRACÍ se dělí dle podstaty chemické reakce, která probíhá mezi odměrným činidlem a stanovovanou látkou: 1) acidobazické 2) oxido-redukční (redoxní) 3) srážecí 4) komlexometrické BOD EKVIVALENCE = inflexní bod titrační křivky = okamžik, při němž: látkové množství přidávaného titračního činidla je chemicky ekvivalentní látkovému množství stanovované látky 5

8 Spotřeba při titraci = objem odměrného roztoku, který je přidaný od začátku titrace do bodu ekvivalence. Konec titrace je stav, kdy dojde k barevné změně stanovovaného roztoku (je-li použita indikace pomocí barevných indikátorů) nebo výrazné změně potenciálu (je-li použita indikace pomocí měření fyzikálně-chemické veličiny (např. potenciálu). Titrační křivka = funkční závislost vlastnosti titrovaného roztoku nebo koncentrace určité reagující komponenty na přídavku titračního činidla. Výpočet výsledku z odměrné analýzy je založen na stechiometrických koeficientech příslušné chemické reakce (dané chemickou rovnicí), na změřeném objemu odměrného roztoku a jeho známé koncentraci. aa + bb pc + qd+.. Látky A (stanovovaná látka) a B (odměrné činidlo) spolu reagují v poměru látkových množství, který je dán poměrem jejich absolutních stechiometrických koeficientů: n(a)/n(b) = a/b Bod ekvivalence) je dosažen tehdy, když se k n(a) molům stanovovaná látky A přidá (a/b).n(b) molů odměrného činidla: n(a) = (a/b) n(b) Látkové množství odměrného činidla B se vypočítá z jeho koncentrace c(b) a spotřebovaného objemu V(B): n(b) = c(b) V(B) Pro běžné titrace lze vyjít ze vztahu rovnosti látkových množství: c(a) V(A) = c(b) V(B) tedy pro výpočet koncentrace stanovované látky platí: c(a) = c(b) V(B)/V(A) 6

9 1.1 Acidobazické (neutralizační) titrace Acidobazické (neutralizační) reakce jsou takové, na nichž se podílejí proteolyty, tj. elektrolyty, které jsou schopny vázat proton (báze) nebo jej odštěpovat (kyseliny). Dvě sloučeniny, jejichž vzorce se liší pouze o jeden proton, tvoří konjugovaný pár: kyselina báze + H + Acidobazické reakce je nutno chápat jako výměnu protonu mezi dvěma konjugovanými páry, resp. stanovovanou látkou a odměrným činidlem. K určení bodu ekvivalence se používají acidobazické (neutralizační) indikátory např. fenolftalein, methyloranž, methyčerveň, bromethylová modř, tj. látky, jejichž zbarvení závisí na hodnotě ph roztoku. Zvolení vhodného indikátoru je dáno očekávaným ph v bodě ekvivalence, které musí být ve funkční oblasti ph, které odpovídá barevné změně indikátoru. Tabulka 1: Příklady acidobazických indikátorů Indikátor Funkční oblast ph kyselé formy Zbarvení zásadité formy thymolová modř 1,2 až 2,8 červené žluté methyloranž 3,1 až 4,5 červené žluté methylčerveň 4,4 až 6,3 červené žluté bromthymolová modř 6,0 až 7,6 žluté modré fenolftalein 8,2 až 10,0 bezbarvé červenofialové thymolftalein 9,3 až 10,5 bezbarvé modré Zdroj: Blatská a kol. (2014) Acidobazické titrace dělíme podle povahy činidla na: a) alkalimetrii (titrujeme roztokem báze, nejčastěji hydroxidem) b) acidimetrii (titrujeme roztokem kyseliny). Při neutralizační odměrné analýze rozlišujeme tyto typy reakcí kyselin a zásad: - reakce silné kyseliny se silnou zásadou - reakce silné kyseliny se slabou zásadou 7

10 - reakce slabé kyseliny se silnou zásadou - reakce slabé kyseliny se slabou zásadou 1.2 Komplexometrické titrace Při komplexometrických titracích reaguje stanovovaná látka s odměrným činidlem za vzniku komplexní málo disociované sloučeniny. Nejpoužívanější komplexometrickou metodou je chelatometrie. Mezi komplexometrické titrace patří tyto metody: a) chelatometrie b) merkurimetrie a) chelatometrie Stanovení pomocí chelatometrie je založeno na vlastnostech některých aminopolykarbonových kyselin tvořit s 2-4 mocnými ionty kovů rozpustné, málo disociované komplexy. Nejvíce se používá kyselina ethylendiaminotetraoctová (Komplexon II) a její dvojsodná sůl (Komplexon III) neboli chelaton 2 a chelaton 3. Stanovovaný kation kovu reaguje s chelatonem 3 (H 2 Y) za vzniku rozpustného komplexu, vždy v molárním poměru 1:1 např. při stanovení vápníku: Ca 2+ + H 2 Y [CaY] H + Při reakci se uvolňují protony, takže průběh reakce je ovlivněn hodnotou ph. Chelatometrické reakce se proto provádějí v přítomnosti pufru takové hodnoty ph, která spadá do oblasti optimální stability daného komplexu. Komplexy dvojmocných kationtů jsou stále v alkalickém a slabě kyselém prostředí, komplexy výšemocných iontů jsou stabilní i v kyselých roztocích. Vizuální indikace se provádí pomocí metalochromních (komplexometrických) indikátorů, které tvoří s kationtem kovu slabý barevný komplex. Nejčastěji používaným indikátorem je murexid při chelatometrickém stanovení vápníku. Princip barevné změny indikátoru je 8

11 založen na skutečnosti, že po přídavku indikátoru k titrovanému roztoku část vápníkových iontů vytvoří komplex s vápenatými ionty. Přidávané titrační činidlo reaguje nejdříve s volnými vápenatými ionty v roztoku. Ke konci titrace (v okamžiku, kdy je už veškerý volný kovový kation vázán do komplexu s chelatonem) se začíná barevný indikátor uvolňovat u komplexu s vápníkem, ze kterého je vytěsňován. Konec titrace je vlastně dán barvou samotného indikátoru. b) merkurimetrie Další komplexometrickou metodou, používanou pro stanovení halogenidů, kyanidů a thiokyanidů, je merkurimetrie. Při titraci odměrným roztokem obsahujícím rtuťnaté ionty vznikají komplexy [HgX 4 ] 2-, [HgX 3 ] -, [HgX 2 ] a [HgX] +. Protože rozdíl konstant stability posledních dvou komplexů je dostatečně velký, je možné dobře indikovat stav, při kterém se v roztoku nacházejí pouze málodisociovaný rozpustný komplex typu [HgX 2 ]. Pro vizuální indikaci se používá buď zákalový indikátor (nitroprusid sodný) a nebo barevný indikátor (difenylkarbazid). 1.3 Srážecí titrace Při srážecích titracích se ke stanovení koncentrace látek využívá chemické reakce, při které nastává tvorba málo rozpustné sloučeniny. Nejčastěji používanou metodou srážecích titrací je argentometrie. a) argentometrie Pomocí argentometrie je možno stanovit halogenidy. Jako odměrné činidlo se používá dusičnan stříbrný (případně chlorid sodný a thiokyanatan amonný nebo draselný). Indikace bodu ekvivalence je nejčastěji vizuální. Mezi argentometrické metody patří: Mohrova metoda Volhardova metoda Gay-Lussacova metoda Fajansenova metoda 9

12 První dvě z uvedených metod jsou nejpoužívanějšími, a to zejména ke stanovení soli v potravinách. Mohrova metoda Je přímou titrací chloridů a bromidů roztokem AgNO 3. Indikátorem je chroman draselný (srážecí indikátor), který těsně po dosažení ekvivalence zbarví původně bílou sraženinu hnědočerveně vznikajícím chromanem stříbrným. Ke stanovení bodu ekvivalence je možno použít i potenciometrii. Při stanovení chloridů je možno průběh stanovení vyjádřit následujícími rovnicemi: Ag + + Cl - AgCl Ag + + CrO 4 2- Ag 2 CrO 4 Volhardova metoda Je nepřímou (zpětnou) titrací nadbytečných stříbrných iontů v kyselém prostředí roztokem thiokyanatanu amonného za přidání železitých iontů jako indikátoru. Při prvním nadbytku thiokyanatanových iontů vzniká komplex thiokyanatanu s železitými ionty za vzniku červenohnědého zabarvení. Při stanovení chloridů je možno průběh stanovení vyjádřit následujícími rovnicemi: Ag + + Cl - AgCl Ag + + SCN - AgSCN SCN - + Fe 3+ [Fe (SCN 2 ) Fe] 4+ Gay-Lussacova metoda Při této metodě se provádí titrace stříbrných iontů chloridem sodným (nebo naopak chloridu, bromidu nebo jodidu stříbrnými ionty) zjišťujeme okamžik, kdy po vysrážení veškerého halogenidu stříbra již nevzniká nad sraženinou žádný zákal. Fajansova metoda Při Fajansově metodě se provádí titrace chloridu, bromidu, jodidu nebo thiokyanatanu dusičnanem stříbrným za využití adsorpčních indikátorů, např. fluoresceinu nebo eosinu (organická barviva). 10

13 1.4 Oxido-redukční (redoxní) titrace Při redoxní titraci dochází k výměně elektronů mezi redoxním párem stanovované látky a odměrného činidla. Do těchto titrací patří následující metody: a) manganometrie b) jodometrie c) bichromátometrie d) bromátometrie Nejčastěji používanou metodou v rámci redoxních titrací je manganometrie. a) manganometrie (titrace manganistanem draselným) Manganistan je silným oxidačním činidlem. Nejčastěji se titrace manganistanem provádí v kyselém prostředí, kdy dochází k redukci fialových manganistanových iontů na bezbarvé ionty manganaté. Díky výrazné změně zbarvení po redukci není potřeba používat indikátor, protože v bodě ekvivalence dochází k odbarvení roztoku (autoindikace): MnO H e Mn H 2 O Některé látky se však snáze oxidují v neutrálním nebo v zásaditém prostředí: MnO H 2 O + 3 e MnO OH - MnO e MnO 4 2- b) jodometrie Jodometrická titrace je založena na vratném redoxním systému jod jodid. I e 2 I - 11

14 Látky s redoxním potenciálem nižším než systém jod jodid se jodem oxidují. Látky s redoxním potenciálem vyšším než systém jod jodid oxidují I - ionty na jod. V případě stanovení látek oxidujících jodid se ke vzorku přidává nadbytek jodidu a množství uvolněného jodu se stanoví titrací roztokem thiosíranu sodného (nebo arsenitanu): I S 2 O I - + S 4 O 6 2- Přítomnost jodu je detekována modrým zbarvením škrobového roztoku, který je zde v roli indikátoru. c) bichromatometrie (titrace dichromanem draselným) Dichroman oxiduje v kyselém prostředí řadu látek a sám se redukuje na Cr 3+ sůl. Cr 2 O H e 2 Cr H 2 O d) bromatometrie (titrace bromičnanem draselným) Bromičnan draselný je v kyselých roztocích silným oxidačním činidlem. Často bývá redukován až na bromid: BrO H e Br H 2 O V ekvivalenci reaguje nadbytečný bromičnan s přítomným bromidem za vzniku bromu: BrO H Br - 3 Br H 2 O 12

15 2 POTENCIOMETRIE Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření rovnovážného napětí galvanického článku. Článek je sestaven z měrné (indikační) a srovnávací (referentní) elektrody. Potenciál měrné elektrody závisí na koncentraci sledované látky, zatímco potenciál srovnávací elektrody je konstantní. Rovnovážné napětí, které je rozdílem těchto dvou potenciálů, je mírou koncentrace sledované látky. Je-li aktivita stanovované složky určována přímo z hodnoty elektromotorického napětí článku, jedná se o přímou potenciometrii. Změny napětí článku v závislosti na přídavku titračního činidla využívá potenciometrická titrace. Přechod mezi uvedenými metodami tvoří různé přídavkové metody. Potenciometricky lze sledovat jen takové reakce, které vyhovují těmto požadavkům: chemická reakce probíhá dostatečně rychle reakce musí probíhat stechiometricky, jednoznačně bez vedlejších reakcí reakce musí probíhat kvantitativně 2.1 Základy analytické potenciometrie Elektrodový děj probíhající v chemickém galvanickém článku (2 různé elektrody) je oxidačně-redukční reakcí, která umožňuje přenos náboje mezi fázemi elektrody. Na anodě dochází k oxidaci a na katodě k redukci. Výsledkem reakce je elektrodový potenciál vznikající na fázovém rozhraní elektroda-elektrolyt. Probíhá li na elektrodě elektrochemická reakce dle obecné rovnice lze rovnovážný elektrodový potenciál v závislosti na aktivitách reagujících látek vyjádřit Nernstovou rovnicí: Elektrodový děj ox + n e - red Nernstova rovnice E = E RT nf ln a red a ox 13

16 R molární plynová konstanta 8,314 [J.K -1.mol -1 ] T termodynamická teplota F Faradayova konstanta [C.mol -1 ] a aktivita oxidované a redukované formy E standardní elektrodový potenciál (je roven potenciálu, který by elektroda měla při jednotkovém poměru aktivit komponent účastnících se elektrodového děje) Elektrodový potenciál jednotlivých elektrod nelze přímo měřit. Měřitelný je pouze potenciálový rozdíl, kterému říkáme Galvaniho napětí: E = E K E A E E K E A potenciálový rozdíl Galvaniho napětí potenciál fáze kovu potenciál fáze elektrolytu V galvanickém článku probíhá redoxní reakce spontánně za napětí ΔE > 0. Galvanický článek nachází využití v rovnovážné potenciometrii, kdy článkem neprochází elektrický proud, ale dochází pouze k výměnným reakcím, které probíhají v elektrické dvojvrstvě. 2.2 Technika a postupy potenciometrické analýzy Potenciometrická analýza vyžaduje poměrně málo nákladné zařízení. Základ tvoří elektrody a voltmetr s vysokou vstupní impedancí (ph metr, ionometr, elektrometr). Elektroda je heterogenní elektrochemický systém tvořený alespoň dvěma fázemi. Jedna fáze je vodičem první třídy, který vede elektrický proud prostřednictvím elektronů, druhá je vodičem druhé třídy, který vede elektrický proud prostřednictvím iontů. Elektrody se podle konstrukce, nebo základních elektrochemických principů dělí: a) elektrody prvního druhu (indikační) b) elektrody druhého druhu (referentní) c) elektrody redoxní 14

17 d) speciální elektrody a) elektrody prvního druhu (indikační) Elektrody prvního druhu tvoří prvek a jeho ion obsažený v roztoku. Rozlišujeme kationtové a aniontové elektrody (např. měděná elektroda ponořená do roztoku iontů Cu 2+ ). Na membráně elektrody dochází k dvěma protichůdným jevům. Za prvé se kationy v roztoku nabíjejí volnými elektrony z krystalické mřížky elektrody a vylučují se jako elementární kov na povrchu elektrody. Úbytkem elektronů se elektroda nabíjí kladně. Současně však dochází k opačnému procesu a elektroda se nabíjí záporně. Který z těchto procesů je silnější, o tom rozhoduje koncentraci iontů v roztoku a prostředí. Při ustálení (dosažení rovnováhy) se na povrchu elektrody vlivem přitažlivých sil mezi elektrodou a ionty utvoří elektrická dvojvrstva, která má vlastnosti kondenzátoru. Mezi elektrody prvního druhu patří: kovové elektrody Kovové elektrody (zinková, stříbrná apod.) tvoří kovový plíšek v roztoku obsahujícím kation kovu. Na kovové elektrodě probíhá následující elektrodový děj: kovový kation + n e - Ag + + e - kov Ag Ag drátek roztok Ag + iontů Obrázek 1: Stříbrná elektroda (Šucman a Bednář, 1995) Př. stříbrná elektroda (potenciál stříbrné elektrody je funkcí aktivity stříbrných iontů) 15

18 vodíková elektroda (kation plynová elektroda) je tvořena platinovým plíškem pokrytým platinovou černí sycenou plynným vodíkem. Roztok obsahuje ionty H 3 O +. 2 H + 2 e - H 2 chlorová elektroda (anion plynová elektroda) platinovou čerň sytíme plynným chlorem a roztokem chloridové anionty b) elektrody druhého druhu (referentní) Elektrody druhého druhu tvoří kov pokrytý vrstvičkou své málo rozpustné soli a ponořený v roztoku anionů této soli. Mezi elektrody druhého druhu patří: argentchloridová elektroda (obr. 2) potenciál elektrody závisí na koncentraci chloridových iontů. Zjistíme-li tuto koncentraci konstantním oddělením roztoku KCl od dalšího roztoku porézní přepážkou, má argentchloridová elektroda konstantní potenciál a dobře slouží jako srovnávací elektroda v potenciometrii. AgCl + e - Ag + Cl - kalomelová elektroda (obr. 2) nejčastěji používaná srovnávací elektroda. Je-li roztok nasycený, jde o sycenou kalomelovou elektrodu. Hg 2 Cl e - 2 Cl - merkurosulfátová elektroda (srovnávací elektroda při stanovení dusičnanů) je vhodnou elektrodou v případě, kdy se do roztoku nesmějí dostat ani stopová množství chloridových iontů. antimonová elektroda tyčinka z antimonu pokrytá vrstvičkou oxidu antimonitého. Sb 2 O H 3 O e - 2 Sb + 9 H 2 O 16

19 Obrázek 2: Argentchloridová a kalomelová elektroda (Klouda, 2003) (pozn.: kalomel = Hg 2 Cl 2 ) c) elektrody redoxní Jsou to elektrody, jejichž potenciál je ovlivněn oxidoredukčními poměry v roztoku. Redoxní elektroda je tvořena ušlechtilým kovem (platinový nebo zlatý plíšek) ponořeným do roztoku obsahujícího oxidovanou a redukovanou formu redoxního systému. Mezi redoxní elektrody patří: platinová redoxní elektroda - ponořená do roztoku obsahujícího ionty Fe 2+ a Fe 3+. Sama elektroda se oxidoredukční reakce neúčastní, na jejím povrchu probíhá výměna elektronů. Tím je ovlivněn její potenciál. Fe 3+ + e - Fe 2+ d) speciální elektrody Potenciál těchto elektrod se ovlivňuje různě. Další charakteristickou vlastností je, že většinou měří pouze jeden jediný ion. Z tohoto důvodu se velmi často označují jako iontově selektivní elektrody (ISE). 17

20 ISE využívají vzniku potenciálu na membráně selektivně propustné pro určité ionty. Ionty, které mohou vstupovat do membrány, způsobují vznik potenciálového rozdílu mezi povrchem membrány a okolním roztokem. Hovoříme o Donnanově potenciálu. Jeho velikost závisí na aktivitě těchto iontů v roztoku. Mezi speciální elektrody patří: O O O skleněná elektroda - banička z elektrodového skla s vnitřním roztokem o stálém ph a koncentraci chloridových iontů, ve kterém je ponořena argentchloridová elektroda. Donnanův potenciál na povrchu elektrody se ustavuje iontověvýměnnou reakcí mezi sklem a roztokem. Si Obrázek 3: Klouda (2003) O - Na + + H 3 O + (aq) Membrána skleněné elektrody na měření ph je tvořena ze speciálního skla. Do křemičité struktury tohoto skla jsou vneseny tzv. poruchy, které tvoří atomy sodíku. Tyto atomy se v roztoku potom vyměňují za H 3 O + ionty, což je umožněno i mimo jiné schopností tohoto skla se hydratovat. Výměnou sodíku na H 3 O + dochází ke změně potenciálu. Ve vnitřním prostředí elektrody je tlumivý roztok o stabilním ph, který udržuje potenciál na vnitřní straně baničky konstantní. Měří se rozdíl potenciálu vnější a vnitřní stěny baničky vzhledem k vhodné srovnávací elektrodě. Výpočet potenciálu se většinou nepoužívá a je nahrazen metodou kalibrace, kdy je měřící soustava nastavena na roztoky o přesně známém ph. O O O Si OH + Na + (aq) + H 2 O Obrázek 4: Schéma kombinované skleněné elektrody (Klouda, 2003) 18

21 kombinovaná skleněná elektroda (ph elektroda) - má zabudovanou indikační i referentní elektrodu (obr. 4). elektrody s kapalnými membránami obsahují organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou, ve kterém jsou rozpuštěny látky schopné vyměňovat nebo zachycovat ionty z vnějšího roztoku. Od něj jsou odděleny hydrofobní porézní přepážkou (např. z PVC). Dělíme je na ISE iontového typu a ISE s neutrálními nosiči. elektrody s tuhými membránami zhotoveny buď z monokrystalů a lisovaných těžko rozpustných solí homogenní ISE s tuhými membránami, nebo zabudování aktivního materiálu do neaktivní porézní polymerní matrice (polyetylenu, silikonového kaučuku apod.) heterogenní ISE s tuhými membránami. Patří sem fluoridová elektroda. plynové elektrody slouží ke stanovení plynů rozpustných v kapalinách (amoniaková elektroda) enzymové elektrody podobná konstrukce jako plynové senzory, ale na povrchu je zakotvena gelová vrstva s enzymem katalyzujícím určitou reakci. 2.3 Analytické využití potenciometrie Přímá potenciometrie V přímé potenciometrii se vybere měrná elektroda, jejíž potenciál závisí na koncentraci iontů, které chceme stanovit, a doplní se srovnávací elektroda a ze změřeného napětí článku se přímo určí obsah stanovované složky. Příkladem použití přímé potenciometrie je: stanovení ph stanovení amoniaku pomocí ISE 19

22 2.3.2 Potenciometrická titrace V potenciometrických titracích se sleduje závislost napětí vhodně sestaveného článku (elektrod) na objemu přidávaného titračního činidla a z titrační křivky (typický esovitý průběh) se vyhodnotí bod ekvivalence. Příkladem použití potenciometrické titrace je: stanovení obsahu NaCl Volby měrné elektrody u potenciometrické titrace: a) neutralizační titrace skleněná elektroda b) srážecí titraci stříbrná elektroda v argentometrii, ISE citlivá na jeden ze srážecích iontů c) komplexotvorné titrace ISE citlivé na stanovovaný kation d) redoxní titrace platinová redoxní elektroda E [mv] bod ekvivalence V [ml] Obrázek 5: Potenciometrická titrační křivka (esovitý průběh) Zjištění bodu ekvivalence z titrační křivky je možné graficky nebo matematicky (např. 1. derivace V E ). 2.4 Přídavkové metody Koncentrace stanovené látky se určí z rozdílu potenciálů indikační elektrody, naměřených před a po změně koncentrace roztoků ve vzorku. Získání spolehlivých výsledků přídavkovými metodami je podmíněné: 20

23 měřením v lineární elektrodové odezvě konstantou difúzního potenciálu a aktivních koeficientů konstantou podílu stanovované látky, na kterou elektroda vykazuje odezvu, což lze dosáhnout úpravou ph, přidáním nadbytku komplexotvorného činidla nebo uvolněním stanovované látky z vyskytujícího se komplexu. Při splnění uvedených podmínek je možné vyjádřit potenciál indikační elektrody rovnicí přímky a použít některou z přídavkových metod. Nejjednodušší je metoda jednoho standardního přídavku, při které se změří potenciál před přídavkem a po přídavku standardního roztoku. Přesnější výsledky lze očekávat u postupů, při kterých se k roztoku vzorku opakovaně přidává více přídavků standardního roztoku. 21

24 3 OPTICKÉ METODY Optické metody jsou založeny na interakci vzorku s elektromagnetickým zářením. Rozdělujeme je na metody, při kterých: nedochází k výměně energie mezi látkou a zářením a při interakci záření s látkou se sleduje jiná změna vlastností záření, např. rychlost záření, stáčení roviny polarizovaného světla nebo rozptyl záření. Patří sem polarimetrie, refraktometrie, interferometrie, nefelometrie, turbidimetrie (tab. 2). Tabulka 2: Přehled optických metod, při kterých nedochází k výměně energie (Jančářová a Jančář, 2003) Metoda Základní princip Děj polarimetrie interakce polarizovaného záření s opticky aktivními látkami - stáčení roviny lineárně polarizovaného záření - závislost optické otáčivosti na koncentraci vzorku pro jednu vlnovou délku refraktometrie změna postupné rychlosti záření lom záření interferometrie interference záření turbimetrie rozptyl světla na koloidním změna intenzity záření vzorkem prošlého nefelometrie roztoku změna intenzity záření rozptýleného do směru kolmého ke směru vstupujícího paprsku dochází k výměně energie mezi látkou a zářením. Mezi tyto metody patří: a) metody emisní jsou založeny na měření záření emitovaného vzorkem. Emisi je nutno vyvolat dodáním energie vzorku v podobě tepla (plamen), elektrické energie (el. jiskra), proudu elementárních částic nebo jiného elektromagnetického záření. Přijetím této energie se atomy nebo molekuly dostávají do méně stabilních energeticky bohatých stavů a přebytečné energie se zbavují v podobě elektromagnetického záření. Patří sem atomová emisní spektrometrie, luminiscenční analýza, rentgenová fluorescenční spektrometrie. 22

25 b) metody absorpční jsou založeny na měření záření absorbovaného vzorkem. Při těchto metodách se využívají vlnové délky různých oblastí spektra elektromagnetického záření. Podle použitého záření a charakteru vzorku se tyto metody dělí na: atomová absorpční spektrometrie, ultrafialová a viditelná spektrometrie, infračervená spektrometrie, Ramanova spektrometrie, nukleární magnetická a elektronová paramagnetická rezonance. Tabulka 3: Přehled optických metod, při kterých nedochází k výměně energie (Jančářová a Jančář, 2003) Metoda Základní princip Děj atomová emisní spektrometrie (AES) interakce záření s atomy - emise záření po excitaci - tepelná excitace atomová absorpční spektrometrie (AAS) (čarová spektra) - absorpce záření - tepelná atomizace a následná absorpce fluorimetrie interakce záření - emise záření po excitaci fosforimetrie spektrofotometrie ve viditelné a UV oblasti (molekulová AS) s molekulami (pásová spektra) - absorpce záření - excitace elektronů z nižších molekulárních orbitalů do vyšších infračervená spektrometrie (IR) - absorpce záření - změna vibračního a rotačního stavu molekuly elektronová spinová rezonance (ESR) - absorpce záření - změna spinu elektronů nukleární magnetická rezonance (NMR) - absorpce záření - změna spinu nukleonů v jádře 3.1 Polarimetrie Principem polarimetrie je využití schopnosti opticky aktivních látek stáčet rovinu polarizovaného světla doprava nebo doleva. Opticky aktivní jsou látky, jejichž molekuly nemají rovinu ani střed souměrnosti, a proto je nelze ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem. Takové molekuly se nazývají chirální a 23

26 příslušná geometrická vlastnost symetrie chiralita (řecky chiros = dlaň vztah pravé a levé ruky, které nelze vzájemně překrýt, je chirální). Jedná se většinou o organické látky, které obsahují v molekule asymetrický uhlík (nebo jiný atom: N, P, S, As apod.), na který jsou navázané čtyři odlišné substituenty. Mezi opticky aktivní látky patří také některé anorganické látky s asymetrickou molekulou (tetraedrické a oktaedrické koordinační sloučeniny). Opticky aktivní látky s jedním centrem chirality mohou existovat ve dvou opticky izomerních formách = optické enantiomery (antipody), které se shodují ve všech vlastnostech (hustota, index lomu, teplota tání apod.) kromě jedné. Jeden izomer otáčí rovinu polarizovaného záření doprava, tj. ve směru hodinových ručiček (pravotočivý + ), druhý izomer o stejný úhel doleva (levotočivý - ). Opticky neaktivní racemickou směs získáme, pokud jsou oba enantiomery dané sloučeniny v poměru 1:1 (ekvimolární směs). Paprsek světla má elektrickou a magnetickou složku (obr. 6). Elektrický vektor E kmitá v polarizační rovině, magnetický vektor M kmitá v rovině kolmé na polarizační rovinu. Tyto dvě roviny se protínají v přímce (z), která určuje směr toku záření. y E 0 z x M Obrázek 6: Elektrická a magnetická složka paprsku světla (Čakrt a kol., 1989, upraveno) Nepolarizované záření kmitá v nejrůznějších směrech kolmých na směr toku (obr. 7). Po průchodu záření polarizačním zařízením vzniká lineárně polarizované záření, kmitající pouze v jedné rovině. Úhel otočení roviny polarizovaného světla a fázový rozdíl je tím větší, čím více molekul opticky aktivní látky stojí v cestě paprsku. Pro úhel otočení roviny polarizovaného světla ( ) platí vztah: α = [α] D 20 l c 24

27 úhel otočení roviny polarizovaného světla l [α] D 20 měrná otáčivost (20 C, vlnová délka dubletu sodíkové výbojky 589,3 nm) tloušťka vrstvy opticky aktivní látky [dm] c koncentrace látky [g.cm -3 ] Pozn: Měrná otáčivost [α] 20 D charakterizuje opticky aktivní látku. Rovná se úhlu otočení polarizovaného světla pro tloušťku vrstvy 1 dm a koncentraci roztoku 1 g.cm -3. Je závislá na teplotě a vlnové délce Polarimetr Optická otáčivost se měří na polarimetru (obr. 8). Polarimetry jsou konstruovány tak, že jsou v nich umístěny Nicolovy hranoly (dva hranoly z islandského vápence, slepené kanadským balzámem). Jako zdroj záření se používá sodíková nebo rtuťová výbojka. Ze zdroje světla se filtrem vymezí určitý interval vlnových délek. Lineárně polarizované světlo vzniká z nepolarizovaného v zařízení zvaném polarizátor. V polarizátoru (1. Nicolův hranol) dochází k rozdělení nepolarizovaného světla na dva rovinně polarizované paprsky, které kmitají v rovinách na sebe kolmých (obr. 7): řádný paprsek odráží se řezem polarizátoru mimo dráhu a je pohlcen v černém nátěru objímky hranolu mimořádný paprsek postupuje polarimetrem dále přes kyvetu se vzorkem a dopadá na analyzátor (2. Nicolův hranol), jehož optické chování je stejné jako polarizátoru. Analyzátor je otočný kolem své osy a je spojen s kruhovou stupnicí (obr. 9). Obrázek 7: Vznik lineárně polarizovaného záření průchodem paprsků Nicolovým hranolem (1 vstupující nepolarizovaný paprsek, 2 řádný paprsek, 3 mimořádný paprsek, 4 směr optické osy krystalu islandského vápence (kalcitu) (Cídlová, 2014) 25

28 Na nebo Hg výbojka polarizátor polostínové zařízení kyveta se vzorkem analyzátor detektor filtr nepolarizované světlo polarizované světlo světlo Obrázek 8: Schéma polarimetru (polostínové zařízení je součást subjektivních polarimetrů) (Urbánek, 2008; Paveleková, 2012a, upraveno) po průchodu vzorkem Pokud v kyvetě není opticky aktivní látka a oba hranoly jsou ve stejné poloze, prochází mimořádný paprsek v plné intenzitě a zorné pole je osvětleno rovnoměrně. Pokud je analyzátor pootočen vůči polarimetru o úhel 90, je intenzita propuštěného světla nulová (zorné pole ztmavne). Po vložení kyvety s opticky aktivní látkou se rovina polarizovaného světla pootočí a v zorném poli přístroje dochází k vyjasnění. Úhel, o který je nutné pootočit analyzátorem, aby se zorné pole znovu zatemnilo, se rovná úhlu, o který opticky aktivní látka pootočila rovinu polarizovaného světla. Jednodušší subjektivní přístroje (obr. 9) pracují jako polostínové, kdy v zorném poli dalekohledu se ručním otáčením analyzátoru nastavuje stejné zastínění (obr. 10). V moderních přístrojích probíhá natáčení analyzátoru automaticky, dokud není nalezeno minimum intenzity. Signál z detektoru (např. fotonásobič) je vyhodnocován. 26

29 optická otáčivost 9,30 Obrázek 9: Subjektivní polarimetr (Urbánek, 2008) a stupnice polarimetru (Exacta a Optech) Obrázek 10: Detail třídílného zorného pole polarimetru během měření (a,c špatně; b správně) a) b) c) Využití polarimetrie Polarimetrie se využívá ke studiu vlastností anizotropních látek a ke kontrole čistoty směsí chirálních látek. Jako opticky čistý vzorek určité látky je označován ten, který obsahuje pouze jeden enantiomer. Všeobecně můžeme polarimetricky stanovit opticky aktivní látky. Nevýhodou polarimetrie je aditivnost (sčítání) optické aktivity látek. Z tohoto důvodu se používá pro stanovení jedné opticky aktivní látky ve směsi opticky neaktivních látek nebo pro stanovení sumy více optických látek ve směsi. Pokud bychom chtěli stanovit dvě a více opticky aktivních látek vedle sebe, je třeba kombinovat fyzikální měření s některou z chemických reakcí. Příkladem je stanovení sacharosy a glukosy v jednom roztoku. Nejdříve se stanoví součet optické aktivity obou sacharidů. Následuje hydrolýza sacharosy na glukosu a fruktosu a změření optické otáčivosti roztoku. Z rozdílu otáčivosti při prvním a druhém měření se získá koncentrace cukrů, protože sacharosa a glukosa jsou pravotočivé a fruktosa je levotočivá. 27

30 Příklady využití: v potravinářském průmyslu: např. stanovení laktosy v mléce, v cukrovarnictví stanovení sacharosy (sacharimetr) v klinické praxi: např. stanovení cukrů a bílkovin v moči ve farmacii a biochemii: např. stanovení steroidů, vitaminů a alkaloidů 3.2 Refraktometrie a interferometrie Mezi optické metody, které se zabývají měřením indexu lomu nebo jeho malých rozdílů patří refraktometrie a interferometrie Podstatou je měření indexu lomu při refrakci paprsku dopadajícího na fázové rozhraní. Mohou nastat dva jevy: reflexe (odraz) úhel dopadu paprsku se rovná úhlu odrazu refrakce (lom) při průchodu paprsku do jiné fáze se tento paprsek láme v důsledku rozdílné rychlosti světla v obou fázích. Úhel lomu je menší než úhel dopadu pokud paprsek přechází do fáze, ve které je proti původní fázi rychlost světla nižší (lom ke kolmici). V opačném případě nastává lom od kolmice. Když se zvětšuje úhel dopadu, zvětšuje se úhel lomu. Úhly dopadu i lomu se měří mezi paprskem a kolmicí spuštěnou na fázové rozhraní (obr.11 a 12). dopadající paprsek fáze 1 fázové rozhraní fáze 2 kolmice odražený paprsek - úhel dopadu - úhel odrazu - úhel lomu - mezní úhel lomu lomený paprsek Obrázek 11: Odraz a lom paprsku světla (Klouda, 2003; Paveleková, 2012, upraveno) 28

31 kolmice kolmice n n n n Obrázek 12: Lom paprsku světla od kolmice a ke kolmice (Nevřivá, 2011) Index lomu je významnou fyzikální veličinou, která charakterizuje optické prostředí, tj. prostředí, ve kterém se šíří světlo. Závisí na vlnové délce a je bezrozměrnou veličinou. Udává poměr rychlostí světla v obou fázích. Aby bylo možné porovnávat látky podle jejich indexu lomu, volí se shodné prostředí, ze kterého paprsek dopadá. Z teoretického hlediska je ideálním prostředím vakuum, z praktického hlediska je účelnější vzduch. Index lomu rozlišujeme absolutní a relativní: Absolutní index lomu: N = c v c v rychlost světla ve vakuu rychlost světla v daném prostředí Relativní index lomu se nejčastěji uvádí pro přechod světla ze vzduchu do dané látky: n 1 2 = v 1 v 2 v 1 rychlost světla ve fázi 1 v 2 rychlost světla ve fázi 2 Index lomu můžeme rovněž vyjádřit pomocí změny směru průchodu paprsku prostředím dle Snellova zákona: 29

32 n = sin α sin β Snellův zákon nám dovolí určit relativní index lomu libovolné dvojice látek 1 a 2, známe-li relativní indexy lomu pro přechod paprsku ze vzduchu do těchto látek: n 1 2 = v 1 v 2 = sin α sin β = n vzd 2 n vzd 1 Index lomu závisí na vlnové délce záření i na teplotě. V tabulkách se uvádí index lomu pro danou teplotu (např. 25 C) a vlnovou délku (obvykle pro dublet D sodíkové výbojky). Zápis indexu lomu můžeme o tyto údaje doplnit: 25 n D Refraktometrie Přístroje, pomocí kterých se měří index lomu, se nazývají refraktometry. Dělí se podle několika hledisek (konstrukce, účel, použité záření monochromatické a polychromatické). Podle konstrukce se dělí na refraktometry, u kterých: jsou lámavý hranol a dalekohled vůči sobě pohyblivé (Abbeho a Pulfrichův) zaujímá lámavý hranol a dalekohled vzájemně neměnnou polohu (ruční a ponorný). Podstatou měření je zjištění mezního úhlu lomu. Je to maximální možný úhel lomu, když úhel dopadu je 90. Rozhraní mezi osvětlenou a neosvětlenou částí sledujeme v refraktometru. Abbeho refraktometr (obr. 13) je pro svou použitelnost označován jako refraktometr univerzální. Měří v širokém rozsahu indexu lomu (1,3000 1,7000). Má kompenzátor optické disperze, a proto lze pracovat s polychromatickým světelným zdrojem. Při měření stačí kapka vzorku, která se nanese mezi dva hranoly, kde vytvoří tenkou vrstvičku. Spodní hranol je matový, takže do vzorku vstupuje rozptýlené záření. Do druhého hranolu, a tím i do dalekohledu, přechází přes vzorek jen paprsky s úhlem menším než je mezní úhel. V okuláru dalekohledu je možno sledovat rozhraní mezi tmavým a světlým polem. Otáčením obou hranolů, které jsou připojené na otáčivém ramenu, se hranoly nastaví tak, že rozhraní protíná nitkový kříž a na stupnici se odečte hodnota indexu lomu (obr. 14). 30

33 Pulfrichův refraktometr patří mezi refraktometr, u nichž jsou lámavý hranol a dalekohled vůči sobě pohyblivé. Jeho základní vlastností je, že nemá kompenzační zařízení disperze, a proto se musí jako zdroje použít monochromatického světla. Lze jím tedy měřit nejen index lomu, ale i optickou disperzi látek. Ponorný refraktometr patří do druhé skupiny refraktometrů, u kterých lámavý hranol a dalekohled vzájemně zaujímají neměnnou polohu. Rozlišují se dva typy ponorných refraktometrů, a to s nevyhřívaným a vyhřívaným měrným hranolem. První typ je charakterizován volně nasazovatelným měrným hranolem, který se vkládá přímo do analyzovaného roztoku, jež je temperován ve vodním termostatu. Druhý typ je konstruován přímo na měření malého množství kapalin (analyzovaných vzorků). Obrázek 13: Schéma Abbeho refraktometru (Kalous a kol., 1987) 31

34 Obrázek 14. Zorné pole refraktometru (Urbánek, 2008) Využití refraktometrie ke kontrole čistoty chemických látek v tuhé a kapalné fázi a to měřením indexu lomu, který je z dané teploty, popř. za daného tlaku a vlnové délky charakteristickou konstantou čistých látek určování složení binárních směsí látek (metoda kalibrační přímky), a to především směsí organických rozpouštědel pro stanovení obsahu jedné látky ve směsi - např.: stanovení obsahu vody v medu, bromidu draselného ve vodných roztocích, ethanolu ve vodných roztocích kvantitativní analýza dvousložkové popř. třísložkové soustavy, hodnota indexu lomu roztoků je pak přímo úměrná jejich koncentraci (využití kalibrační přímky) Interferometrie Závislost indexu lomu na koncentraci nebo kvalitě látky se využívá také při interferometrických analytických stanoveních. Na rozdíl od refraktometrie se neměří přímo index lomu, ale rozdíl indexů lomu mezi dvěma prostředími prostředím známým s definovaným indexem lomu a prostředím neznámým, měřeným. Metoda využívá difrakci (ohyb) a interferenci (skládání) světelných paprsků. Jedná se o metodu kvantitativní analýzy, kdy při vyhodnocení pracujeme s metodou kalibrační přímky. V zorném poli dalekohledu interferometru sledujeme pod sebou dvě soustavy interferenčních pruhů. Interferují paprsky, které jsou propuštěny ze světelného zdroje svislými štěrbinami (difrakce ohyb). Ze spodní části dvojce štěrbin vystupují dva svazky paprsků, které procházejí stejným prostředím, a proto jsou naprosto rovnocenné. Jejich interferencí vzniká spodní interferenční obrazec. Nejintenzivnější interferenční maximum je uprostřed. Doleva a doprava následují minima (černé proužky) a maxima (světlé proužky) klesající intenzity. 32

35 Horní části dvojice štěrbin propouštějí paprsky, které vedou ke vzniku horního interferenčního obrazce. Horní obrazec se vytváří skládáním paprsku, který prochází kyvetou se vzorkem, a paprsku, který prochází kyvetou se srovnávacím prostředím (např. čistým rozpouštědlem). Obě prostředí se liší indexem lomu. V prostředí s vyšším indexem lomu má světlo nižší rychlost a dochází k posunu interferenčního obrazce do strany. Posun horního obrazce je tím větší, čím větší je rozdíl indexů lomu prostředí v kyvetách. Rozdíl mezi indexem lomu vzorku n 2 a indexem lomu srovnávacího roztoku n 1 se vypočítá podle vztahu: (n 2 n 1 ) = λ N l λ l N vlnová délka světla tloušťka kyvety počet proužků, o který se musel posunout systém pohyblivých proužků oproti kompenzačnímu systému kyveta se srovnávacím prostředím kyveta se vzorkem horní a dolní interferenční obrazec štěrbiny zdroj záření Obrázek 15: Princip interferometrie (Klouda, 2003) Využití interferometrie analýza velmi zředěných roztoků (např. stanovení obsahu solí v mořské vodě, kontrola čistoty pitné vody) 33

36 analýza plynů (např. stanovení methanu v důlních plynech, CO 2 v produktech dýchání organismů, určování stopových množství pár organických rozpouštědel apod.) 3.3 Turbidimetrie a nefelometrie Tyto metody využívají rozptylu světla částicemi v suspenzích a koloidních roztocích. Výsledky měření ovlivňují podmínky stanovení (velikost a tvar částic, absorpce záření vzorkem, doba a intenzita míchání připravované suspenze). Na zvýšení stálosti mikrosuspenzí připravovaných srážením se někdy přidávají ochranné koloidy, resp. Látky, které se adsorbují na povrchu částeček, a tak zabraňují jejich koagulaci (např. želatina, arabská guma, polyvinylalkohol, glycerín apod.) Vyhodnocení se provádí metodou kalibrační přímky. Tabulka 4: Sumarizace rozdílů mezi turbidimetrií a nefelometrií (Klouda, 2003, upraveno) Metoda Umístění detektoru Měří Použití turbidimetrie v ose paprsku světelné záření prošlé vzorkem, které je ochuzené koncentrovanější roztoky o rozptýlenou složku záření nefelometrie kolmo na osu paprsku světelné záření rozptýlené nižší koncentrace rozptýlených částic zdroj záření kyveta se vzorkem mřížka nebo filtr k vymezení vlnové délky detektor u nefelometrie detektor u turbidimetrie Obrázek 16: Schéma turbidimetru a nefelometru (Klouda, 2003) Využití turbidimetrie a nefelometrie Metody jsou vhodné pro měření: 34

37 znečištění vzduchu a jiných plynů i kapalin rozptýlenými částicemi (kouř, aerosoly, stanovení proteinů v séru apod.) koloidů ve farmaceutikách, potravinách a nápojích pro stanovení malých množství málo rozpustných látek (BaSO 4, BaCO 3, AgCl, AgCN) Stanovení časově stabilních suspenzí anorganických i organických látek (Cl -, Br -, I -, SO 2-4, Au, ni, proteiny, lipidy apod.) 3.4 Spektrometrie Spektroskopie je fyzikální obor zabývající se vznikem a vlastnostmi spekter. Spektrometrie patří mezi optické metody, při kterých dochází k výměně energie mezi stanovovanou látkou a zářením a je možno pomocí ní stanovit koncentraci dané látky. Podstatou spektrometrie je absorpce, případně emise elektromagnetického záření atomy nebo molekulami. Mezi nejpoužívanější spektrometrické metody patří metody absorpční. Absorpční spektrometrické metody dělíme na: 1) atomovou absorpční spektrometrii 2) molekulovou absorpční spektrometrii Atomová absorpční spektrometrie (AAS) AAS je metoda, která se používá na stanovení kovů ve vzorku. Metodou lze analyzovat přes 60 prvků periodické tabulky s citlivostí od setin do stovek ppm (mg.kg -1 ). AAS využívá zákonitost (Kirchhoffův zákon), na základě které jsou volné atomy prvku schopny absorbovat záření takových vlnových délek, které samy vyzařují. Konkrétně volné atomy prvku v plynném stavu absorbují záření vlnových délek, které zodpovídají jejich rezonančním čarám, souvisejícím s nejpravděpodobnějším přechodem atomů mezi základním a vybuzeným stavem. Absorpce záření je úměrná koncentraci atomů prvku v plynné fázi a propuštěné (neabsorbované) záření se detekuje citlivým detektorem. Po interakci atomu s fotonem dané energie setrvá atom ve vzbuzeném stavu cca 10-8 s. Absorpce fotonu atomem je málo závislá na teplotě, např. v nízkoteplotních plamenech je většina atomů v základním stavu. 35

38 Předpokladem absorpce při AAS je převedení atomů do plynné fázi. AAS se dle používaného způsobu atomizace dělí na: plamenová AAS elektrotermická AAS (ET-AAS) atomizace po konverzi prvku na těkavé hydridy (Hg-AAS) Roztok stanovovaného vzorku je zmlžen a vzniklý aerosol je zaveden do plamene (nebo grafitového atomizátoru), kde se roztok okamžitě odpaří a rozruší se chemické vazby v molekulách přítomných sloučenin. Fotony paprsku světla ze speciální výbojky jsou při interakci s atomy stanovovaného prvku v roztoku vzorku absorbovány a atom prvku přechází do vybuzeného stavu. Tento stav je provázen úbytkem intenzity procházejícího světla, který je měřen. Úbytek intenzity záření je dán Lambert-Beerovým zákonem: A = log(l 0 /l) = α n l A l 0 l n l absorbance intenzita monochromatického záření před vstupem do vzorku intenzita monochromatického záření po průchodu absorbujícím prostředím atomový absorpční koeficient pro danou absorpční čáru počet atomů analyzovaného prvku v jednotce objemu délka absorpční vrstvy Základními částmi atomového absorpčního spektrometru jsou: zdroj elektromagnetického záření měřící cela (plamen nebo grafitová kyveta) detektor vyhodnocovací zařízení Plamenová AAS Při plamenové AAS je analyzovaný roztok zmlžován v mlžné komoře a vznikající aerosol je unášen plynem (oxidovadlem) do směsného plamene (většinou acetylen-vzduch (2360 K) nebo acetylen-oxid dusný (2990 K). Účinnost zmlžení není velká a činí zpravidla 5 20 %. Potřebná absorpční dráha je realizována dlouhým štěrbinovým laminárním hořákem, který 36

39 poskytuje laminární plamen. Zdrojem elektromagnetického záření je lampa s dutou katodou, která je zhotovena ze spektrálně čistého kovu nebo jeho slitiny (jedná se o stejný kov, jako ten, který stanovujeme) a emituje specifické čárové spektrum. Závislost absorbance na koncentraci je teoreticky lineární, pokud je zachován konstantní stupeň atomizace a nemění se teplotní podmínky v plameni, a to alespoň pro limitovaný rozsah koncentrace prvku. Neznámou koncentraci prvku lze určit metodou kalibrační křivky nebo metodou standardních přídavků. Plamenovou AAS lze výhodně stanovit kovové prvky v prostředí zředěné HCl nebo HNO 3, např.: Mg, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, In, Tl, Cd, Au, Pb, Bi v plameni směsi acetylen-vzduch nebo Be, Ca, Sr, V, Si, Ge, Al, Mo, W v plameni směsi acetylen-oxid dusný. Metodika je obecně používána při analýze potravin, i objektů životního prostředí, ale i kovů a slitin, hornin Elektrotermická AAS (ET-AAS) Elektrotermická (bezplamenná) AAS se od plamenové liší atomizačním zařízením, kterým je speciální grafitová kyveta ( = 4-8 mm). Při stanovení jsou dávkováné mikrolitrové objemy roztoku vzorku zahřívány a odpařovány v indukční nebo odporové peci (atomizéry) v atmosféře argonu v rychlém sledu až na K. Pec je programována do tří oddělených oblastí teplot, odpovídajících sušení vzorku ( 570 K), rozkladu vzorku ( K) a atomizaci ( K). Konečný atomizační puls má charakter absorpčního maxima, jehož plocha se vyhodnocuje v závislosti na koncentraci analytu. ET-AAS se používá ve stopové analýze a mikroanalýze minerálních i biologických vzorků, včetně potravin a objektů životního prostředí. Stanovitelnost koncentrace prvků se pohybují v pg.ml -1, k čemuž přispívá i delší životnost atomů v kyvetě než v plamenech Atomizace po konverzi prvku na těkavé hydridy (Hg-AAS) Pro stanovení As, Sb, Se, Te, Ge, Hg, Bi, Sn, Pb je vhodná předchozí redukce vzorku na těkavé hydridy NaBH 4 v kyselém prostředí. Hydrid je pak trasportován proudem argonu 37

40 (helia nebo dusíku) do studeného vodíkového plamene (dle toho někdy nese označení metoda studených par) nebo horké grafitové kyvety nebo vyhřívané křemenné trubice, kde se rozloží za vzniku atomů stanovovaného prvku. Možné je předchozí zkoncentrování hydridu vymražením kapalným dusíkem a uvolněním při zvýšené teplotě Molekulová absorpční spektrometrie Podstatou molekulové absorpční spektrometrie je absorpce elektromagnetického záření molekulami nebo ionty v roztoku. Využívá se ke kvalitativnímu, ale častěji kvantitativnímu stanovení látek, přičemž podstatou metody je určení změny intenzity světla při průchodu vzorkem při charakteristické vlnové délce. Dle vlnové délky elektromagnetického záření se dělí na: a) UV-VIS spektrometrie (v oblasti vlnových délek nm) b) IČ spektrometrie (IR, NIR spektrometrie, v oblasti vlnových délek 780 nm 0,5 mm) Ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra (UV-VIS spektrometrie) souvisí absorpce záření s přechodem valenčních elektronu mezi dvěma i více energetickými hladinami v molekule (hovoříme o elektronových spektrech). Excitovaná molekula přechází do základního stavu tak, že, zářivá energie se mění v energii tepelnou, zvyšuje se kinetická energie molekul. Absorpční spektrum ve viditelné a ultrafialové oblasti (je závislost absorbance na vlnové délce A = f( )) a je charakteristické pro stanovovanou látku, proto zjištěné absorpční maximum je používáno pro vlastní stanovení analyzované látky. Energie infračerveného záření stačí jen na změny vibrační (blízká IČ spektrometrie) energie molekul, případně rotační energie molekul (vzdálená IČ spektrometrie). Molekulová spektrometrie se řídí Lambert-Beerovým zákonem, pro změnu intenzity záření po průchodu vzorkem. Měřenou veličinou je absorbance (A): A = log(l 0 /l) = α n l A l 0 absorbance intenzita monochromatického záření před vstupem do vzorku 38

41 l n l intenzita monochromatického záření po průchodu absorbujícím prostředím atomový absorpční koeficient pro danou absorpční čáru počet atomů analyzovaného prvku v jednotce objemu délka absorpční vrstvy UV-VIS spektrometrie UV-VIS spektrometrie je univerzálně použitelná pro stanovení prvků, kationtů, vázaných v komplexech, chelátech s organickými činidly, iontových asociátech ve vodných i nevodných roztocích, aniontů nekovů, organických sloučenin s heterocyklickými atomy, aromatických sloučenin, sloučenin s konjugovanými násobnými vazbami, při analýze potravin, ale i tělních tekutin, farmak, drog, a objektů životního prostředí. Podstatou ultrafialové a viditelné spektrometrie je absorpce ultrafialového a viditelného záření (200 až 780 nm) zředěnými roztoky molekul. Při absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů. Absorpční spektrum je závislost transmitance nebo absorbance na vlnové délce nebo vlnočtu záření. Absorpční spektrum je pásové, každý pás odpovídá jednomu typu přechodu elektronů v molekule do excitovaného stavu. Nejstarší optickou metodou je kolorimetrie, která spočívá ve vizuálním porovnávání intenzity zbarvení vzorku a standardu. Objektivní metodou je pak fotometrie, která spočívá v měření prošlého zářivého toku spektrofotometrem. UV-VIS spektrometrie se také uplatňuje jako detekční a kvantifikační princip v kapalinové a iontové chromatografii a při elektromigračních metodách. Neznámou koncentrace stanovované látky lze určit těmito metodami: metodou kalibrační křivky. Tato metoda ověřuje platnost Lambert-Beerova zákona zjištěním linearity kalibrační závislosti A = f(c), respektive A A blank = f(c); (blank = slepý vzorek = porovnávací roztok má mít stejné vlastnosti jako roztok vzorku bez stanovované látky) metodou přídavků standardního roztoku 39

42 výpočtem z Lambert-Beerova zákona porovnáním absorbance vzorku a standardu. Zařízení pro stanovení pomocí UV-VIS spektrometrie (spektrofotometrie) se sestává z těchto hlavních částí: zdroj záření (zdrojem záření pro viditelnou oblast je wolframová nebo halogenová žárovka, pro ultrafialovou oblast je ideálním zdrojem deuteriová lampa) monochromátor (hranol nebo mřížka) kyvety na vzorky (pro viditelnou oblast stačí skleněné, pro UV oblast musí být křemenné. Pro všechny oblasti mohou být i ze speciálního plastu). Šířka kyvety udává délku absorpční vrstvy (l). detektor (fotodiody nebo fotoelektrický násobič) Infračervená spektrometrie Infračervená spektrometrie je nedestruktivní, rychlá metoda pro rutinní analýzu v řadě oblastí. Principem infračervené (IR) spektrometrie je absorpce infračerveného záření molekulami látek. Infračervené záření má větší vlnovou délku než viditelné záření. Protože tato oblast spektra je velice široká (0,8 až 1000 m) rozděluje se do tří částí, blízká NIR (0,8 až 2,5 m), střední (2,5 až 40 m) a vzdálená (40 až 1000 m) IR oblast. V praxi je nejvíce využívána spektrometrie ve střední oblasti. Při infračervené spektrometrii již energie záření nestačí na změny elektronových stavů, ale způsobuje změny vibračních a rotačních stavů molekul. IR spektrometrie se používá v kvantitativní i kvalitativní analýze. Nejdůležitější použití IR spektrometrie ve střední oblasti je ve strukturní analýze a identifikaci sloučenin. V kvantitativní analýze lze využít Lambert-Beerova zákona. Infračervená spektrometrie má největší použití ve kvantitativní analýze, avšak spektra jsou natolik složitá, že je třeba použít chemometrické (speciální software) metody pro jejich vyhodnocení. Z pohledu kvalitativní analýzy je infračervené spektrum charakteristické pro jednotlivé látky natolik, že prakticky neexistují dvě sloučeniny, které by měly zcela shodné spektrum, a proto můžeme identifikovat danou látku při využití knihoven spekter. Další vlastností infračervených spekter je, že dvě jednotlivé funkční skupiny se ve spektru projevují podobně, a proto lze rozborem infračerveného spektra zjistit přítomnost určitých funkčních skupin v molekule a též vyloučit výskyt jiných funkčních skupin. 40

43 Z pohledu kvalitativní analýzy látek má infračervená spektrometrie řadu předností (rychlost, nedestruktivnost, finanční nenáročnost), je však nutno počítat s tím, že nejdříve pro každou matrici (resp. potravinu), je třeba stanovované parametry v širokém rozmezí stanovit metodami referenčními. 41

44 4 CHROMATOGRAFICKÉ METODY Chromatografické metody využívá v každodenní praxi většina analytických laboratoří. Používají se při kontrole technologických procesů, kde jsou alternativní a/nebo doplňující k spektrofotometrickým nebo fluorimetrickým metodám, při kontrole kvality potravin vykazují dostatečnou selektivitu a citlivost, nutnou pro detekci minoritních komponent, vyhovují přísným pravidlům pro stanovení MLR, která byla nastavena pro většinu potravinových produktů. Slouží také pro odhalení a potvrzení falšování potravin Chromatografické metody patří do skupiny separačních metod, které jsou založeny na rozdílné distribuci dělených látek mezi dvě různé navzájem nemísitelné fáze: mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou). Pohybem mobilní fáze je vzorek unášen chromatografickým systémem. Složky vzorku (analyty), které vykazují silnější interakci se stacionární fází, než s fází mobilní se na koloně zdržují déle než složky, vykazující slabší interakce. Dochází tak k separaci (rozdělení) jednotlivých složek směsi. 4.1 Klasifikace chromatografických metod a) Podle povahy mobilní fáze: kapalinová chromatografie (LC), mobilní fází je kapalina, stacionární fází pak pevná látka nebo kapalina ukotvená na pevném nosiči. plynová chromatografie (GC), mobilní fází je inertní plyn, stacionární fází zpravidla tenká vrstva viskózní kapaliny, nanesená na vnitřní povrch kapilární kolony. b) Podle způsobu separace, resp. povahy děje, který převládá při separaci: adsorpční chromatografie, o separaci rozhoduje různá schopnost složek adsorbovat se na povrch stacionární fáze rozdělovací, o separaci rozhoduje různá rozpustnost složek ve stacionární fázi (kapalina ukotvená na nosiči) a mobilní fázi (kapalina, inertní plyn) iontově-výměnná, je založena na silných elektrostatických interakcích mezi ionizovanými funkčními skupinami stacionární fáze (iontoměniči) a opačně nabitými ionty v analyzovaném roztoku 42

45 afinitní, stacionární fáze je schopna vázat ze vzorku právě ty složky, ke kterým má úzce selektivní vztah - afinitu gelová, (GPC) - gel permeation chromatography, též SEC = size exclusion chromatography), separace probíhá na stacionární fázi gelu o definované velikosti pórů, analyty jsou rozděleny podle velikosti molekul c) Podle účelu: analytická (kvalitativní, kvantitativní), preparativní d) Podle prostorového uspořádání: plošná, patří sem všechny druhy tenkovrstvé kapalinové chromatografie, např. papírová, kde stacionární fáze je součástí chromatografického papíru nebo tenká vrstva sorbentu je nanesena na skleněné desce, hliníkové folii nebo plochém podkladu z jiného materiálu sloupcová kolonová chromatografie, stacionární fáze je ve formě sorbentu uložena v chromatografické koloně Plynová chromatografie (GC) Vzorek se dávkuje do proudu inertního plynu, který jej dále unáší kolonou. Aby vzorek mohl být systémem transportován a dále analyzován, musí se nacházet v plynném stavu, látky musí být termostabilní Instrumentace v plynové chromatografii zdroj inertního nosného plynu (tlaková láhev s vodíkem dusíkem nebo heliem) čistící zařízení nosného plynu (patrona se sorbentem, který zachycuje vlhkost a nečistoty z nosného plynu systém pro regulaci průtoku nosného plynu dávkovací zařízení s autosamplerem termostat kolony, dávkovače a detektoru chromatografická kolona (křemenná kapilára se stacionární fází) 43

46 detektor: plamenově ionizační (FID), detektor elektronového záchytu (ECD), hmotnostní (MS) vyhodnocovací zařízení Kapalinová chromatografie (LC) O separaci analytů ve vzorku rozhodují kromě jejich interakce se stacionární fází také interakce s fází mobilní, tedy složení mobilní fáze Instrumentace v kapalinové chromatografii zásobník mobilní fáze vysokotlaké čerpadlo autosampler chromatografická kolona kolonový termostat detektory: UV/PDA, fluorescenční, indexu lomu, vodivostní, elektrochemické, aerosolové, hmotnostní vyhodnocovací zařízení Superkritická fluidní chromatografie SFC SFC je odnož kapalinové chromatografie, kde mobilní fází je kapalný oxid uhličitý. Tento modus se používá především pro separaci nepolárních látek 4.2 Mobilní fáze V plynové chromatografii je mobilní fází inertní plyn, dusík, vodík, helium. V kapalinové chromatografii se používají pro různé mody tyto mobilní fáze: na normální fázi (NP LC) hexan a další nepolární rozpouštědla na reverzní fázi (RP LC): acetonitril, methanol, voda, pufry v superkritické fluidní chromatografii (SFC): kapalný oxid uhličitý s modifikátory v chromatografii hydrofilních interakcí (HILIC): vysoké procento organické složky (acetonitril methanol) 44

47 Jestliže se složení mobilní fáze během analýzy nemění, pracujeme v tzv. izokratickém modu, mění-li se během analýzy vzájemný poměr složek mobilní fáze, používáme tzv. gradientovou eluci. V plynové chromatografii používáme teplotního gradientu, v izokratickém modu je teplota během analýzy konstantní. 4.3 Stacionární fáze, sorbenty V chromatografii na normální fázi je jako sorbent nejčastěji používán silikagel, na reverzní fázi a v SFC silikagel s vázanou fází, nejčastěji C8, C18, amidovou a kyanofází. V chromatografii hydrofilních interakcí se používají sorbenty na bázi silikagelu. 4.4 Základní pojmy chromatografické separace Základním cílem chromatografické separace je dosažení co nejlepšího rozdělení látek, v co nejkratší době, tj. je požadována co největší účinnost chromatografické kolony. Ta je charakterizována počtem teoretických pater, resp. výškovým ekvivalentem teoretického patra. Čím je jeho hodnota nižší, tím je kolona účinnější. Jeho velikost je závislá především na velikosti částic sorbentu, roste s klesající velikostí částic. V současnosti jsou používány částice o velikosti 5 m, 3 m a 1,7 m. Kolony s částicemi menšími než 2 m jsou používány v ultra účinné kapalinové chromatografii UHPLC (Ultra High Performance Chromatography). Obdobné účinnosti jako v UPLC můžeme dosáhnout použitím částic s pevným jádrem a porézní povrchovou vrstvou. Výstupem chromatografické analýzy je grafický záznam odezvy detektoru, tzv. chromatogram. Z něj můžeme odečíst základní chromatografické charakteristiky: retenční čas, tj. doba od nástřiku k vrcholu eluovaného píku, je kvalitativní charakteristikou látky. Retenční čas nesorbované sloučeniny se nazývá mrtvý čas. plocha (výška) píku je přímo úměrná koncentraci analytu a je kvantitativním údajem 45

48 Obrázek 17: Schéma chromatogramu jednosložkové směsi (Klouda, 2003) h výška píku, W šířka píku v nulové linii, W 0,5 šířka píku v polovině jeho výšky, tr retenční čas, t M mrtvý čas, tj. retenční čas nesorbované složky 4.5 Vyhodnocování výsledků Kvalitativní hodnocení K identifikaci látek používáme retenčních časů nebo retenčních objemů. Dále pak specifických detektorů, např. hmotnostního (MS), pomocí nichž získaná spektra poskytují detailní údaje o struktuře molekuly a její molekulové hmotnosti Kvantitativní hodnocení Úkolem kvantitativního hodnocení je nalezení vztahu mezi plochou (výškou, minimálně a jen u symetrických a úzkých píků) píku a množstvím eluované látky. Metoda je komparativní, vyhodnocujeme porovnání se standardem, Nejjednodušší je metoda vnějšího standardu (ESTD), tj. metoda kalibrační křivky, Dále lze použít metodu vnitřního standardu (ISTD) a metodu přídavku standardu. 46

49 5 EXTRAKČNÍ METODY Extrakce je separační metoda, jejímž principem je přechod složky mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi. Analyt se rozděluje mezi tyto fáze na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů (různé rozpustnosti). Čím větší je rozdíl mezi rozdělovacími koeficienty jednotlivých složek ve směsi, tím dokonalejší je jejich separace. Cílem extrakce je selektivní až specifické oddělení analytu od ostatních složek vzorku nebo naopak oddělení rušících složek. Extrakční proces by měl být kvantitativní, rychlý a jednoduchý. 5.1 Rozdělení extrakčních soustav a) podle zúčastněných frakcí plyn kapalina headspace metoda, extrakce těkavých látek plynem z kapaliny kapalina kapalina LLE extrakce analytu z jedné kapalné fáze do druhé, kapaliny jsou vzájemně nemísitelné tuhá fáze kapalina požadovaná složka se rozpouští z tuhého materiálu ve vhodném rozpouštědle, selektivní rozpouštění, loužení kapalina tuhá fáze SPE extrakce pevnou fází, které selektivně zachycuje požadované analyty z roztoku. b) Podle způsobu provedení jednostupňová - dochází k ustanovení jedné rovnováhy mezi fázemi, např. třepání v dělící nálevce mnohostupňová- opakovaná jednostupňová extrakce v několika oddělených krocích kontinuální založena na ustanovení mnoha rovnováh, fáze jsou při protiproudém pohybu v neustálém kontaktu, např. Soxhletova extrakce 47

50 5.1.1 Extrakce kapalina/kapalina (LLE) Je to metoda, která umožňuje oddělit velké množství rušivých látek nebo izolovat stopové množství složky. Extrakce z kapaliny do kapaliny je založena na přechodu rozpuštěné látky z jedné kapalné fáze do druhé. V praxi bývá jedním rozpouštědlem voda (nebo vodný roztok), zatímco druhé rozpouštědlo je organické, s vodou nemísitelné. Látky mohou být ve vodné fázi rozpuštěny, emulgovány či suspendovány a lze je získat extrakcí jiným rozpouštědlem, které se nemísí s původním roztokem (fází), takže se vytvářejí dvě zřetelně ohraničené vrstvy. Takové vrstvy vznikají např. při smíšení vody s četnými organickými rozpouštědly (hexanem, etherem, chloroformem, benzenem, cyklohexanem). Látka rozpuštěná v jedné fázi (např. vodné) přechází při protřepávání obou kapalin do fáze druhé. Po ustavení rovnováhy je poměr koncentrací rozpuštěné látky v obou fázích konstantní. Nernstův distribuční zákon jakákoli sloučenina se rozdělí mezi dvě nemísitelná rozpouštědla takovým způsobem, aby poměr koncentrací v obou fázích zůstal konstantní. Distribuční (rozdělovací) konstanta - charakterizuje danou látku v systému voda organické rozpouštědlo při určité teplotě a tlaku. Čím je hodnota vyšší, tím je větší podíl složky v organickém rozpouštědle a naopak. K D = c org c vod K D c org c vod distribuční konstanta koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi Soxhletova extrakce Je to metoda kontinuální extrakce, která slouží k izolaci analytů z pevné matrice. Fáze jsou při protiproudém pohybu v neustálém kontaktu. 48

51 Soxhletův extraktor je složen z varné baňky, vlastního těla extraktoru a chladiče. Matrice určená k extrakci je vložena do patrony (skleněné, papírové) a umístěna do těla extraktoru. Varná baňka se naplní vhodným rozpouštědlem, ve kterém se dobře rozpouští analyt, který chceme separovat. Baňka se zahřívá do bodu varu rozpouštědla a jeho páry stoupají postranním tubusem do chladiče, kde kondenzují. Rozpouštedlo kape na extrahovaný materiál v patroně. Střední část extraktoru se postupně plní zkondenzovaným rozpouštědlem, jehož hladina stoupá i v tenké přepadové trubičce. Stoupne-li hladina rozpouštědla ve střední části extraktoru k nejvyšší části přepadové trubičky, přeteče roztok do destilační baňky, z níž se těkavé rozpouštědlo znovu destiluje. Nakonec se získá roztok jedné nebo více složek v destilační baňce, z níž po ukončené extrakci rozpouštědlo vydestilujeme. V baňce tak zůstane jen izolovaná složka, popř. složky. E G A extraktor B - trubice na vedení páry C přepadová trubice D extrakční patrona (filtrační papír nebo frita) E chladič G varná baňka Obrázek 18: Soxhletův extraktor (Cídlová a kol., 2014) Extrakce za zvýšené teploty a tlaku (PSE, PLE, ASE) PSE Pressurized Solvent Extraction PLE Pressurized Liquid Extraction ASE Accelerated Solvent Extraction 49