REGULACE TRANSLACE DEGRADACE BÍLKOVIN. 4. Degradace bílkovin souhrn. 4. Degradace bílkovin souhrn. 4. Degradace bílkovin

Transkript

1 4. Degradace bílkovin Degradace bílkovin probíhá v bu ce neustále = celullar housekeeping REGULACE TRANSLACE DEGRADACE BÍLKOVIN Degradace: 1. odstra uje abnormální, chybné bílkoviny (mutace, chyba v translaci, uspo ádávání bílkoviny) 2. podporuje akumulaci podjednotek u oligomérních bílkovin pro zachování správné stochiometrie 3. udr uje správn kvantitativní pom r mezi enzymem a substrátem 4. hraje klí ovou roli v mnoha biologick ch procesech likviduje spou tecí, signální bílkovinu v kaskád d j 5. zásobuje bu ku aminokyselinami z recyklací 4. Degradace bílkovin Degradace - n kolik proteolytick ch cest, specifick ch pro ur it bun n kompartment 4. Degradace bílkovin Proteolytické systémy jednotliv ch bun n ch kompartment nesou stopy svého fylogenetického v voje Mitochondrie + chloroplasty = prokaryontní bu ka Vakuola (m e tvo it a 90% obsahu bu ky) je obdobou lysosomu Protein body v semenech specializovaná vakuola, reservoár zásobních bílkovin pro první fáze klí ení semen Nejlépe prostudován degrada ní systém v cytosolu

2 4. Degradace bílkovin 4. Degradace bílkovin stabilita bílkovin dána jejich N-terminální sekvencí (Met, Thr, Ser, Gly, Val) nebo postransla ní modifikací typu acetylace P idání argininu zna ka pro degradaci nestabilita bílkovin také ur ována sekvencí aminokyselin ( Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Leu, Glu) 4. Degradace bílkovin 4. Degradace bílkovin = ubiquitinace kovalentn navázan ubiquitin (76 AMI) ozna uje protein pro následnou degradaci komplex enzym : E1 = ubiquitin-aktiva ní E2 = ubiquitin konjuga ní E3 = ubiquitin liga ní 1. protein s degrada ním signálem rozpoznán E3 2. dv ma kroky navázán ubiquitin na protein 3. pro degradaci je nutné o navázat 4 ubiquitiny 4. translokace proteinu na místo degradace 5. ubiquitiny uvoln ny 6. protein degradován

3 4. Degradace bílkovin Ubiquitinace Regulace translace 1. Transla ní aparát 2. Translace 3. Posttransla ní modifikace bílkovin 4. Lokalizace bílkovin v bu ce a jejich degradace 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích REGULACE TRANSLACE TRANSLACE V CHLOROPLASTECH A MITOCHONDRIÍCH

4 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích Endosymbiotické organely Vlastní DNA, mrna, rrna, trna, ale informa ní obsah nesta í pokr t pot eby organel, 80-90% bílkovin kódováno jadern Iniciace translace prokaryontního typu, bez úpravy 5 UTR mrna SD sekvence R st a d lení organel v interfázi, není synchronní s d lením bun k, závisí na inkorporaci bun n ch bílkovin a lipid 5. Translace v chloroplastech a mitochondriích Chloroplasty Chloroplastov genom sekvenován pb, v závislosti na druhu pb = transla ní aparát pb = bílkoviny fotosyntetického aparátu Sou innost jadern ch a chloroplastov ch gen (Rubisco)

5 Chloroplasty úzká spoluprace jaderné a chloroplastové DNA Rubisko: chloroplasty Rubisko tém 50% celkov ch rozpustn ch bílkovin v listech malá podjednotka je kódována jadernou DNA velká podjednotka je kódována chloroplastovou DNA trna: kodována jadern m i chloroplastov m genomem Ribosomy vypl ují obsah chloroplast z víc jak 40% ribosomální bílkoviny: malá podjednotka velká podjednotka chloroplastov genom 12 8 jadern genom chloroplasty chloroplasty Grana = PSII Stroma = PSI, ATPsyntáza Cytochrom b 6 f = v obou typech mambrán

6 chloroplasty chloroplasty chloroplasty transla ní regulace exprese bilkoviny D1 Chloroplasty D1 bílkovina z komplexu RCII její exprese je transla n regulována D1 je kódována chl-genem Transkript stále v nadbytku p ítomen P epis transkriptu regulován vazebnou bílkovinou Vazebná bílkovina kódována jadern, exprese regulována sv tlem první detailní popis transla ní regulace genové exprese v rostlinné bu ce a regulace je p íkladem sou innosti jadern ch a chloroplastov ch gen

7 chloroplasty transla ní regulace exprese bilkoviny D1 transla ní regulace exprese bilkovi D1 chloroplasty transla ní regulace exprese bilkoviny D1 chloroplasty, LHCII D1 bílkovina polo as rozpadu 30 minut Optimální podmínky: po 30 minutách D1 vyt sn na a lokalizována nová molekula D1 Vysoká ozá enost = pot eba sní ení po tu RCII komplex : 1. Degradace 2. Blokace funkce = po kozená D1 není vyt sn na, ale je fosforylována a v této podob nem e opustit RCII komplex Zm na podmínek = D1 defosforylována, vyt sn na, vstup nové D1 molekuly, = aktivace RCII komplexu LHCII = sv tlosb rn komplex = anténa pro PSII Jeho funkce regulována fosfyrylací Fosforylace: negativní náboj molekuly LHCII odpoutání se molekuly od hydrofobního povrchu granalních membrán pokles sv telné absorbce do PSII Signálem pro transla ní regulaci D1 bílkoviny je ozá enost a ta reguluje: Expresi D1mRNA kódována chloroplastovou DNA Expresi D1mRNA-vazebné bílkoviny (kódována jadern ) Expresi kináz a fosfatáz modujících aktivitu D1 (kódovány jadern )

8 chloroplasty, organizace cytochromového komplexu PetG, cytf, PetL a PetM = jednovláknová roubovice v membrán Cyt b6, Podjednotka IV = n kolik transmembránov ch roubovic mitochondrie Mitochondrie mitochondrie = základní organela respirace u eukaryontních bun k biogeneze mitochondrií stále nejasná mitochondrie vykazují heterogenitu morfologickou i funk ní (aktivita ADH oxidázy) prom nlivé je slo ení lipid a bílkovin heterogenita i ve spektrech bílkovin po et mitochondrií per bu ka velmi variabilní, ale koncentrace mitochonrií per objem bu ky mnohem stabiln j í hodnotou po et mitochondrií v rostlinné bu ce je men í ne v bu ce ivo i né respira ní rychlost rostlinné bu ky je vy í V rostlinn ch mitochondriích: existují plazmidy a to integrované i volné, jedno i dvouvláknové RNA voln se replikující

9 Mitochondrie 1.Transla ní aparát- ribosomy Mitochondriální DNA (mtdna) je maternáln (cytoplasmaticky) d di ná Objem DNA druhov charakteristick : lidské pb kvasinkové pb rostlinné pb U rostlin více typ mtdna P enos mt-gen z mitochondrií do jádra (reverzní transkripce viz psedogeny) Dlouhé nekódující oblasti trna u p enice jadern kódován Mutace mt-gen = heteroplasma problém v bu kách i tkáních s vysok m nárokem na dostupnost ATP: tapetum u rostlin, cytoplasamatická sam í sterilita ada záva n ch chorob, ischemická choroba srde ní Ribosomální podjednotky: Bakterií (70S), Eukaryot (80S), Mitochondrií (55S) Velká podjednotka 50S 60S 39S 23S 28S 16S rrnas 5S 5S 5S 5.8S bílkoviny Malá podjednotka 30S 40S 28S rrnas 16S 18S 12S bílkoviny rostlinné mitochondrie mitochondrie translace velmi variabilní délky transkript, sest ih, editace ojedin l jev: translace i aberantních transkript a díky patné nebo ádné editaci: nefunk ní ribosomální bílkoviny selekce a na úrovni bílkovin otvírání nov ch tecích rámc ( nedostate n sest ih? nedostate ná proteázová aktivita?) fosforylace mitochondriálních bílkovin: u savc b ná, má regula ní charakter u rostlin mt kináza nenalezena, nep ím m d kazem autofosforylace HSP70 Úloha mitochondrií za stresu: exprese shsp aktivace glutation-askorbátového cyklu Úloha mitochondrií v apoptose, mitochondrie = sensor stresu Alternativní oxidáza jedine n komplex u rostlin

10 Mitochondrie Mitochondrie, funkce alternativní oxidázy mirochondrie: oxidace organick ch látek = oxidativní fosforylace ATP P esná organizace p enosu elektron v rotlinné mitochondrii komplexy I IV Ubiquinon (UQ), redukovan ubiquinol (UQH 2 ) voln difundují ve vnit ní membrán P enos elektron od dehydrogenázy bu na komplex III nebo na alternatrivní oxidázu ervená = cesta elektron modrá = translokace proton Pohyb proton p es membrány vytvá í protonov elektrochemick gradient ten rozjí dí syntézu ATP z ADP + P pomocí 1TP syntázy U zralého kv tu se v apendixu aktivuje alternativní oxidáza, Volná energie je uvoln na v podob tepla, teplota se zv í z 10 na 25 o C, zv í se uvol ování vonn ch látek Mitochondrie u rostlin rostlinné mitochondrie Regulace genové exprese? nebyla nalezen systém regulující exprese mt gen kódujících základní bílkoviny mt komplex (p esn systém pro COX 1-3 popsána u ivo ich ) díky plastid m nezávislé na zdrojích kyslíku a uhlíkat ch látek Známé induk ní podmínky: alternativní oxidáza = stres citrát syntáza = kv tní meristémy Rf2 (jadern kódovan gen) = ovlivn ní funkce b hem zrání pylu Vztah mezi mitochodriemi a plastidy nevy e en zm na zavád cí sekvence bílkovin pat ící do jedné organely naru í translokaci u obou fotosyntéza je závislá na oxidativní fosforylaci mitochondrií - zastavení ATP syntázy a tím i oxidativní fosforylace v razn sni ovalo uvol ování kyslíku fotosyntézou

11 Metody studia bílkovin Metody studia bílkovin P ehled nej ast ji pou ívan ch technik Na intaktních tkáních, sledování exprese jednotliv ch bílkovin : GFP, imunodetekce Po homogenizaci bun k: Odd lení bílkovin jednotliv ch bun n ch kompartment Vyu ití celé ady metod pro vyd lení ur ité bílkoviny a pro její charakterizaci Homogenizace ( zp sob rozbití bun k, délka homogenizace, volba pufru ) = klí ov bod úsp né a reprodukovatelné anal zy P íprava vzorku- neiontové detergenty Úloha detergentu p i separaci sekre ních protein

12 Subcelulární frakcionace D lení bílkovin -SDS PAGE áste né peptidové mapy Identifikace bílkovin Nativní PAGE a následné d lení vysokomolekulárních komplex

13 D lení bílkovin 2D SDS PAGE Identifikace bílkovin - Western blot Vyu ití radioizotop autoradiografie, fluorografie Identifikace bílkovin indukovan ch stresem puls experiment + 2D SDS PAGE fluorografie

14 Zji t ní lokalizace a stability bílkovin pokus pulse-chase Identifikace bílkovin transkripce-translace, glykosylace a deglykosylace in vitro

15 D kuji za pozornost Doufám e jste si vytvo ili p edstavu o syntéze a v znamu bílkovin a e vám to pom e nahlí et na va e v sledky z dal ího horizontu poznání rostlinné bu ky