Protilátkami modifikované částice pro izolaci zinek vázajících proteinů

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Protilátkami modifikované částice pro izolaci zinek vázajících proteinů"

Olga Beránková
před 7 lety
Počet zobrazení:

Protilátkami modifikované částice pro izolaci zinek vázajících proteinů Ing. Soňa Křížková, Ph.D. 24. 2. 2012 Reg.

1 Protilátkami modifikované částice pro izolaci zinek vázajících proteinů Ing. Soňa Křížková, Ph.D Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik

2 Paramagnetické částice Protilátky proti těžkým kovům Imunoglobuliny Způsoby imobilizace protilátek na povrch paramagnetických částic Zinkové proteiny Imunoseparace Zn-proteinů z bakteriálního lyzátu Imunoseparace Zn-proteinů z krevní plasmy

3 ...om

4 ...om Genom Proteom Metallom Peptidom chemoproteom Metabolom Transkriptom mirnom Lipidom Glykom Interaktom Degradom Soubor molekul s podobnými vlastnostmi v organismu Biom..cca 100 omů

5 ...omika Genomika Proteomika Metallomika Peptidomika chemoproteomika Metabolomika Transkriptomika mirnomika Lipidomika Glykomika Interaktomika Degradomika Separační metody Frakcionační metody Detekční metody Bioinformatické metody..cca 100 omik

Zinkové proteiny Bioinformatika 2800 Zn-vazebných proteinů v lidském proteomu (~10 %) Nejstarší Zn-protein: karbonát anhydrasa (EC 4.2.1.1), objeven v roce 1939 Skladovací funkce Albumin.

10 Zinkové proteiny Bioinformatika 2800 Zn-vazebných proteinů v lidském proteomu (~10 %) Nejstarší Zn-protein: karbonát anhydrasa (EC ), objeven v roce 1939 Skladovací funkce Albumin. metalothioneiny Metaloenzymy Matrixové metaloproteinasy, Zn-dependentní proteasy, karboxypeptidasa, akonitasa, všechny enzymové třídy Transkripční faktory Zinkové prsty Strukturní proteiny Regulační proteiny Metalothioneiny Signální proteiny Přenašeče DNA reparace, replikace, translace Karbonát anhydrasa (EC )

11 Způsob vazby Zn(II) v proteinech Nespecifický, převážně přes Cys, His, Asp. Aktivní místo enzymů Specifické domény (zinkové prsty, C 4, C 3 H, CDH 2 ) Na povrchu uvnitř proteinu Stálá přechodná Heavy metal β-domain -SH group from cysteine α-domain

12 Protilátky proti těžkým kovům Hapteny (velikost, orientace) Komplexy s proteiny (BSA nebo KLH) Stanovení těžkých kovů (ELISA, biosensory), imunolokalizace těžkých kovů Slepičí protilátky

13 Paramagnetické částice Magnetizovatelné Polystyren pokrytý polyurethanem Průměr 1.08 µm Modifikovaný povrch Nemodifikovaný povrch Velikost Tvar porozita Stabilita ~ ~ ~ ~ ~

Struktura imunoglobulinů: Vazebné místo pro antigen H 2 N H 2 N HOOC HOOC COOH COOH NH 2 NH 2 Lehký řetězec Variabilní oblast Konstantní oblast Těžký řetězec Rozdíl mezi savčími a ptačími

14 Struktura imunoglobulinů: Vazebné místo pro antigen H 2 N H 2 N HOOC HOOC COOH COOH NH 2 NH 2 Lehký řetězec Variabilní oblast Konstantní oblast Těžký řetězec Rozdíl mezi savčími a ptačími imunoglobuliny: Protein G Paramagnetická částice IgG Species Ig Subclass Protein A Protein G Human Mouse Rat Goat Sheep IgG1, IgG2, IgG4 IgG3 IgD IgD Fab ScF v IgG1 IgG2a, IgG2b, IgG3 IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG Cow / Bovine + IgG2 Horse IgG(ab) + - IgG(c) + - IgG(T) - Rabbit Total Ig Dog Total Ig + Cat Total Ig + Pig Total Ig + Guinea pig Total Ig + Chicken Total Ig - - : strong binding, ++: medium binding, +: weak binding, -: no binding.

15 Způsoby imobilizace molekul na povrch paramagnetických částic Modifikovaný povrch Kovalentní imobilizace Tosyl Karboxyl Amin Epoxid Nekovalentní imobilizace Avidin/Streptavidin Protein G/protein A His-tag (IMAC) náboj Nemodifikovaný povrch Velikost Tvar porozita Stabilita ~ ~ ~ ~ ~

16 Kovalentní imobilizace Výhody: organická chemie (kovalentní vazba). Buď přes N- nebo C- konec. Za určitých podmínek možnost recyklace. Nevýhody: organická chemie (reagencie). Kovalentní vazba. Orientace, interference se stabilizátory, možná denaturace, delší proces. Epoxyskupina Karboxylová skupina Aminoskupina Tosylová skupina

17 Nekovalentní imobilizace Výhody: biochemie/fyzikální chemie. Rychlejší. Více definované. Specifita. Reagencie. Nevýhody: biochemie/fyzikální chemie. Stabilita. Potřeba určitých struktur/vlastností (doména, biotinylace, histidinová kotva), náboj. Protein A, G Avidin, Streptavidin IMAC (histidinová kotva) náboj

Imunoseparace bakterií a následná imunoextrakce Zn-proteinů Staphylococcus aureus kultivovaný v přítomnosti ZnCl 2 Proteiny obsahující Zn(II) jsou spojeny s patogenitou a rezistencí k

18 Imunoseparace bakterií a následná imunoextrakce Zn-proteinů Staphylococcus aureus kultivovaný v přítomnosti ZnCl 2 Proteiny obsahující Zn(II) jsou spojeny s patogenitou a rezistencí k ATB (MRSA fenotyp) Schema procesu: + A D B Zn others proteins + + and cell parts E + Zn Zn C F MPs S. aureus Protein A (S. aureus) IgG ultrasound IgY (gal) anti-zn-proteins Zn Zn-protein

Imobilizace slepičích protilátek na povrch částic Přes tosyl-skupinu (sulfonyl ester) Interference s azidem sodným proti bakteriální kontaminaci Odstranění NaN 3 (centricon cut off 50 K)

19 Imobilizace slepičích protilátek na povrch částic Přes tosyl-skupinu (sulfonyl ester) Interference s azidem sodným proti bakteriální kontaminaci Odstranění NaN 3 (centricon cut off 50 K) 1000 ug ligandu na 25 mg beads Acidifikace na ph = min Výměna pufru (amicon 50 K) ph = 9.5, (NH4)2SO4, 24 hod 37 C Blokování 0.5 % BSA, Tween hod. Paramagnetická částice IgY

20 Imobilizace lidských IgG na povrch paramagnetických částic: Stejný typ, stejný postup S. aureus má povrchový protein A (antigen), který je schopen vazby (téměř) jakýchkoli imunoglobulinů Existuje i protein G (Streptococcus) Využíváno pro imobilizaci protilátek (Téměř) specifická imunoextrakce (x Streptococcus) Extrakce z média, příp. směsné kultury, nabohacující kultivace IgG Paramagnetická částice Bakterie Povrchový antigen Protein G Specifický imunoglobulin Nespecifický imunoglobulin

21 Proč lidské imunoglobuliny? Bakteriální superantigeny. Zn-proteiny MSCRAMM proteiny (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) Funkce: vazba imunoglobulinů, které dále nejsou rozeznávány složkami imunitního systému. Obrana proti imunitní odpovědi hostitele (opsonizace, fagocytóza) Protein A, 56 kda, Staphylococcus ssp. Protein G, 65 kda, Streptococcus ssp. Protein A/G, 50.5 kda, rekombinantní fúzní protein. Protein L, 76 kda, Peptostreptococcus ssp. Vazebné místo pro antigen H 2 N H 2 N NH 2 NH 2 Opsonizace: Makrofág Bakterie Fagocytóza: Bakterie Makrofág HOOC HOOC COOH COOH Vazebné místo pro protein G nebo makrofág Lehký řetězec Variabilní oblast Konstantní oblast Těžký řetězec Povrchový antigen Protein G Receptor pro imunoglobulin Imunoglobulin

Turbidity (AU) Absorbance * 10 2 [AU] 0,5 0,4 0,3 Control Beads with captured bacteria Medium after immunoextraction 1,4 1,2 1,0 0,8 + 0,2 0,6 0,1 0,4 0,2 Eluate Beads A 0 0 4 8 12 Cultivation time

22 Turbidity (AU) Absorbance * 10 2 [AU] 0,5 0,4 0,3 Control Beads with captured bacteria Medium after immunoextraction 1,4 1,2 1,0 0,8 + 0,2 0,6 0,1 0,4 0,2 Eluate Beads A Cultivation time (h) C 0.0 0,0 Anti-chicken/HRP Anti-mouse/HRP anti-chicken/hrp 1:12000 anti-mouse/hrp 1:4000 kda Mr µg/ml BSA Chicken anti-zn IgY Human IgG B 2 μm Krizkova et al.: Rapid Paramagnetic-Beads-Based Automated Immunoseparation of Zn-Proteins from Staphylococcus aureus with Nanogram Yield, PLOS One, odesláno do redakce D 25

23 Concentration of Zn (µg/ml) Zn(II) content (µg/mg proteins) Turibidity (AU) 2,0 1,5 1, (cells*10 3 ) kda Mr R L kda Mr E IgY HC Fab 37 0, LC A 0, Cultivation time (h) B D 15 kda Mr cells*10 3 2, ,0 1, , ,5 0 L E R E + R y = 0,06e 0,12x R² = 0,92 10 C E 0, S. aureus (cell count*10 3 ) Krizkova et al.: Rapid Paramagnetic-Beads-Based Automated Immunoseparation of Zn-Proteins from Staphylococcus aureus with Nanogram Yield, PLOS One, odesláno do redakce

Krevní plasma Celkem přibližně 300 proteinů, z toho 10 % (možná až 30 %) obsahuje Zn(II) Krevní plasma krevní sérum Hlavní Zn-vazebné proteiny v krevním séru albumin plasma Mr kda α2-makroglobulin

24 Krevní plasma Celkem přibližně 300 proteinů, z toho 10 % (možná až 30 %) obsahuje Zn(II) Krevní plasma krevní sérum Hlavní Zn-vazebné proteiny v krevním séru albumin plasma Mr kda α2-makroglobulin 250 transferin Fibronektin 150 ceruloplasmin 100 IgG, IgA, IgM Transferrin komplement C4 75 haptoglobin Albumin prealbumin IgG těžký řetězec 50 c-reaktivní protein α1-antitrypsin α1-9.5s glykoprotein 37 Nádorová onemocnění Zn status Zánětlivá onemocnění Deprese IgG lehký řetězec 25 Imunitní poruchy 20 15

Imunoextrakce Zn-proteinů z krevní plasmy: -Optimalizace -ph elučního roztoku, množství vzorku a částic, čas a teplota extrakce a eluce, eluční pufr -SDS-PAGE extrahovaných proteinů -Stanovení a

25 Imunoextrakce Zn-proteinů z krevní plasmy: -Optimalizace -ph elučního roztoku, množství vzorku a částic, čas a teplota extrakce a eluce, eluční pufr -SDS-PAGE extrahovaných proteinů -Stanovení a bilance Zn(II) kda Mr plasma retentát Zn-proteiny Covalent immobilization of antibodies to the beads surface Analyte binding Removal of the retentate Elution of the analyte Removal of the eluate Zn(II) determination L S R E paramagnetic bead anti-zn-klh antibody Zn proteins other proteins Proteins analysis magnet

26 kda Mr kda Mr

Zn(II) concentration (µm) Peak height (µa) A kda Mr 1 2 3 4 5 6 250 C 14 12 10 150 8 100 75 50 37 25 20 15 6 4 2 0 y = 0,1164x R² = 0,9978 0 20 40 60 80 100 Zn(II) concentration (nm) B kda Mr 1 2 3 4

27 Zn(II) concentration (µm) Peak height (µa) A kda Mr C y = 0,1164x R² = 0, Zn(II) concentration (nm) B kda Mr D Total Zn(II) Retentate Eluate Retentate + Eluate Blood serum sample Krizkova et al.: Immunoextraction of zinc proteins from human blood serum using chicken yolk antibodies immobilized onto paramagnetic particles and their electrophoretic analysis, Electrophoresis, 2012, v tisku

28 Shrnutí: Rychlý a senzitivní způsob izolace proteinů z biologické matrice Preparativní Použitelné pro následnou proteomickou analýzu Miniaturizace Automatizace

29 Děkuji za pozornost! kda Mr Pův R E Pův R E Pův R E Pův R E Pův R E Pův R E S Tato práce byla financována ze zdrojů: CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ , NANOSEMED GA AV KAN , Liga proti rakovině 2012, NanoBioTECell GACR P102/11/1068.

Podobné dokumenty

Obsah. Sarkosin Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu. Dagmar Uhlířová

Obsah. Sarkosin Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu. Dagmar Uhlířová Investice do rozvoje vzdělávání Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu Dagmar Uhlířová 7.2.2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Název projektu: Partnerská síť centra