MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:"

Transkript

1 - 1 - MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Praktický kurz základních metod experimentální biologie konaný na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v Ostravě v termínu

2 - 2 - Program praktického kurzu Pondělí Úterý Středa Čtvrtek Pátek Přednáška - mikrobiologie Přednáška transformace bakterií plasmidovou DNA. Přednáška elektrochemie nukleových kyselin Přednáška restrikční štěpení Přednáška + praktické ukázky zásady správného pipetování dopoledne Mikrobiologie: Disimilační aktivita mikrooorganismů. Specifické metody barvení mikroorganismů. Mikrobiologie: vyhodnocení výsledků.. Elektroaktivita a povrchová aktivita NK, vliv struktury NK; denaturace DNA v roztoku a na povrchu elektrody, předdenaturační přechody. Analýza poškození DNA pomocí elektrochemických metod. Restrikční štěpení plasmidové DNA, elektroforéza restrikčních fragmentů. Imunodetekce proteinů na membránách. odpoledne Izolace DNA pomocí kolonek. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty. Transformace buněk plasmidovou DNA. Selekce buněk s rekombinantním plasmidem. Detekce poškození DNA. Polyakrylamidová gelová elektroforéza proteinů Barvení gelu Elektroforetický přenos proteinů z gelu na membránu. Vyhodnocení výsledků, hodnocení kurzu účastníky.

3 - 3 - Téma: Disimilační aktivita mikroorganismů Metabolismus (látková přeměna) představuje soubor vzájemně na sebe navazujících oxidoredukčních reakcí, které probíhají v určitém prostoru buňky a v konkrétním čase. Termín metabolismus byl prvně uveden v roce 1839 německým přírodovědcem Theodorem Schwannem ( ). Metabolismus mikroorganismů se podobně jako u všech ostatních živých jedinců rozděluje na dvě základní větve: anabolismus (zahrnující procesy biosyntézy za spotřeby energie) a katabolismus (rozkládání, degradace složitějších sloučenin v buňce na látky jednodušší za tvorby energie ). Metabolická dráha představuje řetězec enzymaticky katalyzovaných chemických reakcí, ve kterých buď dochází k výstavbě složitějších molekul z jednodušších látek, nebo naopak k jejich rozkládání. Následující experimentální úlohy jsou zaměřeny na praktické osvojení si některých základních biochemických testů, jimiž je zjišťována schopnost mikroorganismů syntetizovat určité enzymy. Úkol č. 1: Fermentace sacharidů Princip: Fermentací sacharidů testovaným mikroorganismem vznikají různé organické látky. Důsledkem metabolické činnosti dochází k hromadění kyselin v kultivačním médiu, což se projeví posunem hodnoty ph do kyselé oblasti a dojde ke změně barvy indikátoru přidaného do média. Rozklad cukrů může probíhat za tvorby plynu nebo bez tvorby plynu. Tvorba plynu se obvykle prokazuje přidáním malých plynovek (Durhamovy zkumavky) do tekutého média, v nichž se během kultivace shromažďují bublinky CO 2. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: tekutá živná média pro fermentaci sacharidů (s glukózou, sacharózou, fruktózou, laktózou a manózou, indikátor bromthymolová modř) C. Laboratorní vybavení: Pipety, očkovací klička, plynovky, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Obr. Fermentace sacharidů (fenolová červeň jako indikátor) (převzato z Harley-Prescott 2002). Pozn. V našem testu bude jako barevný indikátor použita bromthymolova modř a změna zbarvení bude z modré na žlutou

4 - 4 - Postup: 1. Fermentační zkumavky s tekutým médiem a plynovkami zaočkujte pomocí kličky čistou 24 hod. kulturou testovaného mikroorganismu. Jednu zkumavku ponechte nezaočkovanou. 2. Naočkované zkumavky kultivujte 24 hodin při 35 C. 3. Po kultivaci zhodnoťte růst kultur, změnu zbarvení média a tvorbu plynu. Naočkované zkumavky porovnejte s nezaočkovanou fermentační zkumavkou. 4. V případě pozitivního výsledku dojde ke změně modrozeleného zbarvení média na žluté. U negativních výsledků nedochází ke změně zbarvení média. Hodnocení výsledků: 1. Všechny zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte Mikroorganismus Escherichia coli Enterobacter aerogenes Alcaligenes faecalis Proteus vulgaris následující tabulku. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. Zbarvení nezaočkovaného média: Sacharidy Glukóza Laktóza Sacharóza Růst Barva Kys. Plyn Růst Barva Kys. Plyn Růst Barva Kys. Plyn

5 - 5 - Úkol č. 2: Test tvorby sirovodíku (TSI TEST) Princip: Mikroorganismy mohou tvořit sirovodík z různých zdrojů. Mohou to být aminokyseliny (cystein) i anorganické látky obsahující síru (sulfáty, thiosulfáty, sulfity). Reakce na H 2 S z organických látek je většinou málo průkazná, neboť běžné komponenty kultivačních médií jsou na síru chudé a proto vzniká i málo H 2 S. Proto se používají pro diferenciaci mikroorganismů kultivační média obsahující sirné anorganické látky. Bylo prokázáno, že mechanismus tvorby H 2 S z organických látek je zcela odlišný od procesu tvorby H 2 S z anorganických komponent, je proto důležité výsledky testů srovnávat pouze za podmínky použití stejného kultivačního média. Jako kultivační médium se používá médium TSI (tvorba sirovodíku je indikována železnatými solemi, které vytvářejí po reakci se sirovodíkem černé sulfidy železa). Obr. TSI test (převzato z Harley-Prescott 2002) a-nezaočkovaná zkumavka, b-žluté zbarvení povrchu i agaru živného média (tvorba kyselin), tvorba plynu, absence tvorby sirovodíku, c-červené zbarvení povrchu i agaru média (alkalické prostředí), tvorba sirovodíku, absence plynu, d- červené zbarvení povrchu média (alkalické prostředí), žluté zbarvení média (tvorba kyselin), tvorba sirovodíku, absence plynu Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Triple-Sugar-Iron agar (TSI) C. Laboratorní vybavení: Očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Čistá kultura testovaného mikroorganismu se naočkuje na připravený šikmý agar (vpichem podél stěny zkumavky, nátěrem na šikmý agar). Jednu nezaočkovanou zkumavku se šikmým agarem použijte jako kontrolu.

6 Zkumavky se kultivují při teplotě 35 C hodin (případně až 48 hodin pro tvorbu sirovodíku). 3. V případě pozitivního výsledku dojde jednak k tvorbě černého sirovodíku (tvoří se kolem vpichu, případně u dna zkumavky), jednak ke změně barvy živného média na žlutou. Také je sledována tvorba plynu. 4. U negativního výsledku nedojde u kultivačního média po kultivaci k žádným změnám. Hodnocení výsledků: 1. Zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Při pozorování zkumavek si všimněte zbarvení agaru, přítomnosti či absence černého zbarvení kultivačního média, přítomnosti či nepřítomnosti tvorby plynu. Mikroorganismus Escherichia coli Alcaligenes faecalis Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Zbarvení nezaočkovaného média: Fermentace cukrů Tvorba plynu Produkce sirovodíku Zbarvení agaru (+/-) Zbarvení (+/-) Poznámka: Zežloutnutí média pouze kolem vpichu bývá s největší pravděpodobností způsobeno štěpením glukózy. Vzhledem k jejímu malému obsahu v médiu jsou kyseliny, vznikající štěpením glukózy u povrchu média, dále vlivem vzdušného kyslíku odbourávány, takže zde nemůže dojít ke změně hodnoty ph. V případě, že je organismus schopen štěpit i laktózu, které je v médiu 10x více, nestačí se kyseliny u povrchu média odbourávat a proto dojde k poklesu hodnoty ph i u povrchu média. Výsledkem je zežloutnutí média i zde.

7 - 7 - Úkol č. 3: Hydrolýza škrobu Princip: Amylolytické bakterie vytvářejí amylolytické extracelulární enzymy amylázy, kterými ve vnějším prostředí katalyzují hydrolýzu škrobu a substrátů s vyšším obsahem škrobu. Škroby jsou významnými polysacharidy. Skládají se obvykle asi z 20 % amylózy a 80 % amylopektinu. Amylolytické bakterie stanovujeme na tzv. škrobovém agaru. Po naočkování a příslušné inkubaci se miska přelije roztokem Lugolova činidla z jodu a jodidu draselného. Kolem kolonií produkujících amylázy se vytváří bezbarvá průhledná zóna. Amylázy tvoří zejména zástupci rodů Bacillus a Clostridium a rovněž některé plísně. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Škrobový agar Lugolův roztok C: Laboratorní vybavení: Petriho misky, pipety, očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Na Petriho misku se škrobovým agarem si na spodní straně fixem vyznačte tři vodorovné čáry. 2. Každou část misky zaočkujte rovnou čárkou testovanou bakteriální kulturu. 3. Misku inkubujte 24 až 48 hodin při 35 C. 4. Po inkubaci zakapejte povrch živné půdy s narostlou kulturou Lugolovým roztokem. 5. Pozorujte, zda dochází k hydrolýze škrobu, což se projeví vznikem nezbarvených zón kolem rostoucí kultury test je pozitivní. Půda s nerozloženým škrobem se zbarví modře test je negativní. 6. Pozor: Modré zbarvení škrobu po určité době mizí, proto výsledky odečítejte okamžitě. Hodnocení výsledků: 1. Petriho misku vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Mikroorganismus Bacillus subtilis Proteus vulgaris Růst Zbarvení média okolo kolonií po přidání Lugolova roztoku Hydrolýza škrobu (+/-)

8 - 8 - Escherichia coli Téma: Mikroskopování kvasinek Úkol č. 1: Test vitality Princip: Test využívá semipermeability cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají zbarvenu pouze buněčnou stěnu, proto se jeví jako světle modré. Mrtvé buňky jsou zbarveny intenzívně modře, neboť jejich membránový systém je narušen. Pro kontrolu vybarvení mrtvých buněk připravujeme vedle vitálně barveného preparátu také preparát barvený po fixaci plamenem. Materiál: Podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, pipety, filtrační papír, mikroskop. Kultury: Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Z pekařských kvasnic připravíme ve zkumavce se sterilní destilovanou vodou řídkou suspenzi. 2. Pipetou přeneseme kapku methylenové modři na podložní sklíčko. 3. Kápneme malou kapku kultury. 4. Ihned přikryjeme krycím sklem. Pokud se nám zdá preparát málo zbarven, lze k hraně krycího skla přikapávat barvivo, přičemž z druhé strany jej odsáváme proužkem filtračního papíru. 5. V 10 zorných polích spočítáme počet živých a mrtvých buněk. POZOR! Pracujte rychle, celková doba barvení by měla trvat jen 3 minuty. Přesáhne-li 5 minut, barvivo působí toxicky a všechny buňky budou sytě modré. 6. Připravíme ze suspenze kvasinek ještě jeden preparát. Mikroorganismy v nátěru fixujeme v plameni poněkud déle, aby došlo k úhynu buněk (pozitivní kontrola). 7. Barvíme a mikroskopujeme stejně jako v předchozím případě. Hodnocení výsledků: Zakreslete obraz pozorovaný v jednom zorném poli. Vypočítejte % mrtvých kvasinek.

9 - 9 - Úkol č. 2: Měření velikosti buněk kvasinek Princip: Velikost mikroorganismů, tj. šířka a délka buněk, fruktifikačních orgánů, spór a některých buněčných organel, patří k diagnostickým znakům mikroorganismů. Jestliže za stejných podmínek zjistíme, že velikost buněk téže kultury kolísá, stanovíme maximální a minimální hodnoty a jako výsledek uvedeme variační rozpětí (např. 0,4 1,2 µm x 3,0 6,5 µm). K přesnému zhodnocení velikosti bychom museli proměřit 100 až 200 buněk příslušné kultury. Materiál: Mikroskop, objektivový a okulárový mikrometr, podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, filtrační papír. Kultury: kultura Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Připravíme preparát dle úlohy č Měření provádíme pomocí objektivového a okulárového mikrometru. Postupujeme tak, že před vlastním měřením seřídíme stupnice objektivového a okulárového mikrometru tak, aby obě stupnice ležely v zorném poli rovnoběžně a jejich počátky se ztotožnily. Pak zjistíme, kolik dílků objektivového mikrometru odpovídá dílkům okulárového mikrometru. Odpovídající dílky se musí přesně krýt. Okulárový mikrometr Objektivový mikrometr 3. Vypočteme hodnotu okulárového dílku (H) pro dané zvětšení podle vzorce: H = dílky objektivové x 10 dílky okulárové

10 Při vlastním měření se objektivový mikrometr nepoužívá. Tzn., že ho musíme vyjmout a místo něj umístíme připravený preparát. Pozor! S mikrometrem manipulujte velmi opatrně, ihned jej řádně uložte, aby se nepodřel, neztratil nebo nerozbil! 5. Jednotlivé buňky umístíme do středu zorného pole a natočíme na ně okulárový mikrometr tak, aby bylo možné odečíst délku v dílcích (desetiny dílku odhadujeme). 6. Otáčením okuláru o 90 lze pak stejným způsobem odečíst šířku buňky. 7. Proměříme větší počet buněk a průměrné hodnoty v dílcích se pronásobí zjištěnou hodnotou dílku (H) pro určité zvětšení a výsledky se převedou na µm. Hodnocení výsledků: Proveďte měření velikosti buněk kvasinek. Změřte 10 buněk v daném preparátu. Hodnoty zapisujte do tabulky. Dílky přepočtěte na µm. Buňka Délka buňky (µm) Šířka buňky (µm) Variační rozpětí V závěru se zkuste zamyslet nad příčinami možných rozdílů ve velikosti buněk jedné kultury. Uveďte, čím mohou být způsobeny. Úkol č. 3: Barvení glykogenu a bílkovin Princip: Glykogen je důležitá rezervní látka v buňkách mikroorganismů. Buňky v optimálních podmínkách růstu mohou obsahovat až 20 % glykogenu. Rychlost tvorby glykogenu je závislá na podmínkách prostředí a jeho obsah v buňce je v určitém poměru k bílkovinám. Množství glykogenu je nepřímo úměrné množství bílkovin v buňce. Podle množství glykogenu posuzujeme fyziologický stav kultury. Materiál: Mikroskop, podložní a krycí sklo, Lugolův roztok, pipety, filtrační papír. Kultury: třídenní kultura Saccharomyces cerevisiae

11 Postup: 1. Na čisté a suché podložní sklíčko přeneseme malou kapku suspenze kvasinek. 2. Přikápneme kapku Lugolova roztoku, promícháme a přikryjeme krycím sklíčkem. 3. Mikroskopujeme za použití imerze. Hodnocení výsledků: Obraz preparátu zakreslete: Zhodnoťte množství glykogenu v kultuře: Žlutě zbarvené části plazmy dokazují přítomnost bílkovin, hnědé a hnědočervené zbarvení nasvědčuje přítomnosti glykogenu. Všimněte si pučících buněk, v pupenech se glykogen nevyskytuje - starší buňky obsahují poměrně velké množství glykogenu. Proveďte důkaz rozpustnosti glykogenu: Podložní sklíčko se zbarveným preparátem zahřejte nad plamenem hnědé zbarvení zmizí, po opětovném zchlazení se znovu objeví (je potřeba pracovat co nejrychleji po zahřátí sklíčka ihned pozorovat s imerzí).

12 Téma: Barvení buněčných organel a struktur Úkol č. 1: Barvení pouzder Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, Kongo červeň, roztok Maneval s. Kultury: 24 hod. kultury Enterobacter aerogenes, E. coli, Proteus vulgaris Postup práce: 1. Na konec podložního sklíčka umístíme kapku Kongo červeně. 2. Kličkou přeneseme inokulum a rozmícháme. 3. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme kapku do tenkého filmu po celé ploše podložního skla. 4. Nátěr necháme zaschnout na vzduchu (nefixujeme teplem). 5. Nátěr převrstvíme Maneval s roztokem, necháme působit 1 min. 6. Opláchneme tekoucí vodou a osušíme. 7. Mikroskopujeme za použití imerze. Hodnocení výsledků: Vegetativní buňky jsou zbarveny modře (červeně) Pouzdra vytvářejí bílé prstence kolem buněk. Zakreslete pozorovaná pouzdra. Srovnejte vzájemně všechny kmeny.

13 Úkol č.2: Barvení spor Bakteriální spory se vyznačují velmi špatnou barvitelností. K jejich obarvení je proto nutné použít metod agresivního barvení založeného na barvení koncentrovanými barvivy za horka. Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, malachitová zeleň, mafranin. Kultury: 24 hod. a 1 týdenní kultury Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus. Postup: 1. Připravíme si nátěry z 24 hod. a z 1 týdenní kultury a bez fixace je usušíme. 2. Na nátěr umístíme filtrační papír a nakapeme na něj roztok malachitové zeleně. 3. Sklíčko opatrně zahříváme 10 minut až do odpařování barviva, ale barvivo nesmí vřít, přitom však barvivo průběžně doplňujeme. 4. Po skončení barvení filtrační papír odstraníme a preparát opláchneme tekoucí vodou. 5. Převrstvíme vodným roztokem safraninu a barvíme 30 sekund. 6. Znovu opláchneme a po zaschnutí pozorujeme imerzním objektivem. Hodnocení výsledků: Spory pozorujeme zbarvené zeleně, vegetativní buňky červeně. Zakreslete mikroskopický obraz. Stanovte typ pozorovaných spor. Stanovte % sporulujících buněk v 10 zorných polích.

14 Rozlišení jedno a dvouřetězcové DNA pomocí AC voltametrie, detekce hybridizace oligonukleotidů na uhlíkové elektrodě Princip metody AC voltametrie (ACV) patří mezi voltametrické metody se střídavou složkou potenciálu. U této metody se na elektrodu vkládá lineárně se měnící potenciálová rampa. Na ni je superponováno střídavé napětí sinusového průběhu o malé amplitudě (10 mv) a nízké frekvenci (desítky až stovky Hz). Měří se závislost střídavého proudu procházejícího elektrodou na jejím potenciálu. DNA poskytuje v ACV řadu signálů. Některé z nich jsou citlivé ke změnám struktury DNA. Dvouřetězcová (ds) a jednořetězcová (ss) DNA poskytují pík 1, který je způsoben adsorpcí/desorpcí cukrfosfátové kostry. Ds DNA dále poskytuje pík 2 v důsledku adsorpce/desorpce zdeformovaných ds úseků. Ss DNA poskytuje pík 3, který je způsoben adsorpcí/desorpcí zbytků bází v jednořetězcových úsecích. Rozdílů v ACV záznamech lze využít pro rychlé rozlišení ss a ds DNA. Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie je založena na užití adsorptivního nahromadění analytu z roztoku na povrchu pracovní elektrody. Naadsorbovaný analyt je pak v dalším kroku voltametrickém scanu rozpuštěn zpět do roztoku základního elektrolytu. Tím se o několik řádů zvýší detekční limit. Při adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrii je analyt nahromaděn na povrchu elektrody (analyt se musí adsorbovat ireverzibilně) z malé kapky vzorku (3-5 l), poté je elektroda s naadsorbovanou vrstvou omyta a přenesena do roztoku základního elektrolytu. Zde pak probíhá samotné elektrochemické měření. Díky aplikaci této metody se sníží potřebný objem vzorku o tři řády (jednotky ml jednotky l). Navíc lze tímto způsobem analyzovat vzorky DNA obsahující nízkomolekulární látky, které by mohly rušit elektrochemické měření. Další možností pro posouzení stavu DNA je možnost využít oxidačních signálů bazí. K oxidaci adeninu a guaninu dochází v místech (na atomech), které se účastní párování bazí vodíkovými můstky. V dvouřtězcovém stavu jsou tedy báze od elektrody stéricky izolovány a svůj oxidační signál poskytují jen v jednořetězcovém stavu. Tohoto lze využít například při detekci hybridizace. Pracovní postup A: nativní a denaturovaná DNA - Denaturace DNA. DNA rozpuštěná ve vodě o koncentraci maximálně 150 g/ml se zahřeje na 6 minut na 99 o C a poté se rychle ochladí v nádobě s ledem. - Připravená denaturovaná DNA i původní nativní DNA se naředí 0,2 M NaCl na koncentraci 30 g/ml (připravovaný objem 30 l) - Měření AC voltametrie do měřící nádobky nalijeme 3 5 ml základního elektrolytu (roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 ze zásobních roztoků 3M NaCl a 0,5 M Na 2 HPO 4 ). Provedeme voltametrické měření v potenciálovám rozsahu -0,6 až -1,6 V. Jako pracovní elektrodu používáme visící rtuťovou kapku. Měříme nejdříve základní elektrolyt a potom postupně oba vzorky DNA. Měření DNA probíhá pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie (AdTSV).

15 Pracovní postup B: Signály bazí DNA na uhlíkové elektrodě - Hybridizace oligonukleotidů do mikrozkumavky 1 smíchejte k sobě komplementární oligonukleotidy a doplňte 0.2M NaCl tak, aby výsledná koncentrace nukleotidů byla cca 30µg/ml, ve výsledném objemu 20µl. - Zkumavky zahřejte na 99ºC a nechte pomalu chladnout. - Na uhlíkové elektrodě v SWV módu změřte signály bází za podmínek: základní elektrolyt 0.2M acetát sodný, počáteční potenciál -0.1V, koncový 1.5V, frekvence 200Hz, amplituda 50mV - Mezi jednotlivými měřeními je potřeba povrch elektrody obnovit nastavte na 30s potenciál 1.8V (condition potential) a pak obnovte povrch elektrody pomocí lepící pásky Materiál a pomůcky - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand) - tlaková láhev s argonem - základní elektrolyty, 0,2M acetát sodný, 0,3 M NaCl, 50 mm Na 2 HPO 4 - roztok 0,2 M NaCl - DNA

16 Analýza nukleotidových sekvencí pomocí magnetických kuliček a hybridizace se sondou značenou enzymem Princip úlohy: Přítomnost určité sekvence nukleotidů v cílové DNA lze dokázat pomocí vhodně navržené sondy - krátkého úseku DNA, která s hledanou sekvencí hybridizuje, tj. vytvoří duplex DNA. Vznik duplexu detekujeme. V této práci bude cílová DNA s (da) 30 -koncem nejprve navázána na magnetické kuličky modifikované (dt) 25 řetězci. Bude-li v této DNA úsek komplementární k navržené sondě nesoucí biotin, dojde k hybridizaci. Na biotin bude poté navázán konjugát streptavidinu s enzymem, alkalickou fosfatázou, která přemění elektroneaktivní substrát 1-naftylfosfát na 1- naftol, jehož oxidace bude detekována pomocí lineární voltametrie. Postup: 1) napipetujeme 40 μl kuliček DB-(dT) 25 do eppendorfky, pomocí magnetu odebereme skladovací pufr a 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS (tj. resuspendujeme na vortexu a pomocí magnetu odebereme promývací roztok a přidáme čistý) 2) před posledním odebráním promývacího pufru kuličky rozdělíme do 2 eppendorfek po 50 μl 3) do jedné eppendorfky napipetujeme 20 μl cílové DNA I (5 μg/ml) v roztoku 0,3M NaCl, do druhé totéž ale s cílovou DNA II 4) necháme inkubovat v termomixeru 12 min, 20 C, 900 rpm 5) 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 6) do obou eppendorfek napipetujeme 20 μl biotinylované sondy (5 μg/ml) 7) viz 4) 8) viz 5) 9) přidáme 50 μl mléka (2,5 g sušeného mléka + 50 ml PBS) - necháme inkubovat 10 min, 20 C, 900 rpm

17 ) po odebrání mléka přidáme 50 μl konjugátu streptavidinu s alkalickou fosfatázou 100x ředěného v mléce 11) viz 4) 12) promyjeme - 3x 100 μl PBST (fosfátový pufr + 0,2 % TWEEN) a 3x 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 13) přidáme 50 μl 100mM 1-naftylfosfátu v uhličitanovém pufru 14) viz 4) 15) odebereme roztok od kuliček a přeneseme ho do 1 ml uhličitanového pufru Elektrochemická detekce: metoda: LSV - lineární voltametrie pracovní elektroda: PGE - elektroda z pyrolytického grafitu roztok připravený v bodě 15) přeneseme do elektrochemické měřící nádobky, vložíme do ní elektrody, spustíme měření, vyhodnotíme

18 Značení DNA komplexy oxidu osmičelého Komplexy oxidu osmičelého s bidentátními dusíkatými ligandy poskytují s pyrimidinovými zbytky bází v DNA kovalentní adukty. Thymin je asi 10x reaktivnější než cytosin. Pokud je jako ligand použit 2,2 -bipyridin (Os,bipy) je tato reakce specifická pouze pro jednořetězcovou DNA. Tato vlastnost byla použita pro detekci některých sekundárních struktur DNA. Tyto adukty jsou elektroaktivní a na rtuťových a uhlíkových elektrodách poskytují celou řadu elektrochemických signálů. Na rtuťových a uhlíkových elektrodách jsou to faradaické signály způsobené postupnou redukcí nebo oxidací atomu osmia v molekule aduktu. Pouze na rtuťových elektrodách pak lze získat signál katalytického vylučování vodíku v důsledku přítomnosti aduktu na povrchu pracovní elektrody. Tento katalytický signál může sloužit pro velmi citlivé stanovení modifikované DNA. Naproti tomu elektrodu z pyrolytického grafitu lze použít pro přímou analýzu reakční směsi, kdy je nezreagovaný komplex separován z povrchu pracovní elektrody extrakcí organickým rozpouštědlem (chloroform, isopropylalkohol). Pracovní postup: 1) Odpipetujte 20 μl CT-DNA (120 μg/ml) a nechte 10 min inkubovat při 95 stupních, prudce zchlaďte v ledové lázni 2) Připravte si 10 μl komplexu OsO 4 s bipyridinem (20 mm ekvimolární) 3) Napipetujte: a) 2 μl komplexu, 5 μl ssdna, 2 μl Tris-Cl ph 8, 11 μl H 2 0 b) 2 μl komplexu, 5 μl dsdna, 2 μl Tris-Cl ph 8, 11 μl H 2 0 4) Obě zkumavky nechte inkubovat 30 min při 37 C, sledujte čas 5) Připravte si analogickým způsobem dvě zkumavky s nemodifikovanou DNA (ss a ds) o koncentraci 30 μg/ml 6) Připravte si základní elektrolyt 200 mm acetát sodný ph 5 7) Na uhlíkové elektrodě změřte signál ssdna a dsdna 8) Na uhlíkové elektrodě změřte signál DNA modifikované osmiem Elektrochemické měření: Do měřící nádobky napipetujeme 2 ml základního elektrolytu (0,2 M acetátový pufr, ph 5) provedeme záznam SWV s počátečním potenciálem -1, konečným potenciálem +1,5 V, frekvence 200 Hz amplituda 50 mv. Poté obnovíme povrch pracovní elektrody lepící páskou, naneseme vzorek (7 l) a 60 s akumulujeme. Pak elektrodu opláchneme v destilované vodě, ethanolu a isopropylalkoholu (60 s). Po omytí provedeme měření. Po naměření provedeme elektrochemickou úpravu povrchu elektrody (30 s 1,8 V) a opět obnovíme povrch lepící páskou. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (PalmSens) elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát termomixér 0,2 M acetátový pufr, ph 5 roztok OsO 4 roztok 2,2 -bipyridinu isopropylalkohol, ethanol

19 Izolace plasmidové DNA Izolace plasmidové DNA pomocí kolonek od firmy QIAGEN Princip: V současné době je izolace plasmidové DNA velice usnadněna díky dostupnosti komerčních kitů, které umožňují zkrátit dobu nutnou pro izolaci, vyhnout se práci s některými chemikáliemi (fenol, chloroform) a získat plasmidovou DNA v požadované kvalitě. Na našem trhu jsou k dispozici izolační kity od několika firem (Qiagen, Macherey-Nagel, Sigma), které fungují na podobném principu a liší se pouze v detailech. K dostání jsou kolony o různé kapacitě, kolony, kterými nanesený lyzát protéká pouze za pomoci gravitační síly nebo kolony, u nichž je průtok lyzátu urychlen centrifugací. Posledně jmenované kolony zkracují čas potřebný pro izolaci, používají se hlavně při přípravě malých množství DNA, protože jejich kapacita je omezená. Poslední novinkou na trhu jsou kolony vybavené speciálním filtrem, které umožňují oddělit rozpustnou frakci lyzátu od nerozpustné bez použití centrifugace. A B Obr. 5.1: (A) Znázornění kolony od firmy Qiagen a její upevnění ve zkumavce. (B) Aniontové výměnné kolony firmy Qiagen o kapacitě g. Podstatou izolace DNA je alkalická lýze a oddělení nerozpustné buněčné frakce s chromozomální DNA od vodné frakce, ve které je rozpuštěna plasmidová DNA. Vodná

20 frakce je nanesena na kolonu, jejíž náplň je tvořena chemicky upravenou pryskyřicí a při ph 7 obsahuje kladně nabité konce tvořené dietylaminoetanolem (DEAE). Kladné náboje interagují se záporně nabitými nukleovými kyselinami (obr. 5.2A) a zadrží je na koloně. Z kolony jsou nežádoucí biomakromolekuly vymyty pufrem, který obsahuje dostatečnou koncentraci solí pro uvolnění krátkých oligomerů, trna, rrna a ssdna, zatímco plasmidová DNA zůstane navázána. Eluce DNA je provedena pufrem o vyšší iontové síle než je promývací pufr (obr. 5.2B) A Obr. 5.2: (A) Interakce DEAE se záporně nabitými fosfátovými skupinami DNA. (B) Separace jednotlivých druhů nukleových kyselin při neutrálním ph na aniontové výměnné koloně Pro úspěšnou izolaci čisté plasmidové DNA je kritickým krokem lýze buněk. Pokud lýzi buněk provedeme příliš drasticky, ať už prodloužením času nebo příliš intenzivním protřepáním směsi po přidání lyzačního pufru, fragmenty chromozomální DNA se uvolní do rozpustné frakce a v dalších krocích se při izolaci chová jako plasmidová DNA. Přečištění takto znehodnocené DNA je možné pouze za použití centrifugace v gradientu chloridu cesného, nicméně musíme počítat s nižším výtěžkem, protože chromozomální DNA na koloně kompetuje o vazebná místa s plasmidovou DNA. B Pracovní postup: Tab.: Objemy bakteriální kultury a pufrů pro izolaci plasmidové DNA na aniontových výměnných kolonách Qiagen podle kapacity použité kolony. Kapacita kolony ( g) Objem kultury (l) Objem pufru P1 (ml) Objem pufru P2 (ml) Objem pufru P3 (ml) Objem pufru QBT (ml) Objem pufru QC (ml) Objem pufru QF (ml) Objem isopropanolu (ml) Objem etanolu (ml) Mini (20) 0,003 0,3 0,3 0,3 1 2 x 2 0,8 0,56 1 Midi (100) 0,025 (0,1) x ,5 2 Maxi (500) 0,1 (0,5) x ,5 5 Mega (2 500) 0,5 (2,5 ) x ,5 7 Giga (10 000) 2,5 (5 ) x ,5 10 Pozn. : Optimální objem kultury pro jednotlivé izolace je uveden pro plasmidy, které v bakteriálních buňkách vytvářejí velký počet kopií (řádově stovky až tisíce) nebo pro plasmidy nízkým počtem kopií (10-20) jejichž počet byl zvýšen amplifikací v důsledku kultivace v přítomnosti chloramfenikolu. V závorce je uveden objem bakteriální kultury pro plasmidy s nízkým počtem kopií, které nebyly amplifikovány.

21 Dobře rostlou a centrifugovanou bakteriální kulturu suspendujeme v pufru P1 tak, aby bakterie byly kompletně rozsuspendovány a nevytvářely žádné shluky. 2. Přidáme pufr P2, jemně ale důkladně zamícháme několikanásobným (4-6 x) obrácením zkumavky dnem vzhůru a inkubujeme 5 minut při pokojové teplotě. 3. Přidáme vychlazený pufr P3, jemně zamícháme (bod 2) a necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni. 4. Centrifugujeme 30 minut při 4 C a RCF minimálně x g. Supernatant, obsahující plasmidovou DNA, slejeme přes složenou gázu do připravené zkumavky. Odebereme 250 l vyčištěného lyzátového supernatantu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 1). 5. Během centrifugace ekvilibrujeme kolonu QIAGEN-tip ekvilibračním pufrem QBT. Necháme kolonu vyprázdnit působením gravitace. 6. Na ekvilibrovanou kolonu naneseme supernatant (krok 4) a počkáme, než se kolona působením gravitace vyprázdní. Odebereme 250 l vzorku prošlého kolonou a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 2). 7. Promyjeme kolonu promývacím pufrem QC. Tímto krokem se zbavíme všech nečistot, jejichž vazba vůči kationtům v náplni kolony je slabší než vazba dsdna (proteiny, RNA, ssdna) Odebereme po 500 l z promývacích frakcí a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorky 3 a 4). 8. Eluujeme DNA elučním pufrem QF. Odebereme 100 l eluátu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 5). 9. Získanou plasmidovou DNA vysrážíme přidáním isopropanolu (0,7 objemu). Zamícháme a okamžitě centrifugujeme 30 minut při x g a teplotě 4 C. Opatrně slijeme supernatant. 10. Vysráženou DNA promyjeme 70% etanolem a centrifugujeme 10 minut při x g a teplotě 4 C. Opatrně slijeme supernatant, abychom neporušili pelet. 11. Pelet vysušíme při sníženém tlaku po dobu 5-10 minut a DNA rozpustíme v TE pufru, ph Kontrolní vzorky 1-5 přesrážíme přidáním 0.7 objemu isopropanolu, centrifugujeme, promyjeme 80% etanolem a vysušíme. Rozpustíme v 50 l TE pufru, ph 8.0. Na gel nanášíme po 10 l přesrážených kontrolních vzorků. Tento krok provádíme souběžně se srážením izolované DNA. Během srážení si také připravíme 1% agarosový gel (krok 14). 13. Stanovení výtěžku a čistoty DNA provedeme UV spektrofotometrií při 260 a 280 nm a kvantitativní analýzou na agarosovém gelu. 14. Do Erlenmayerovy baňky navážíme 1 g agarosy, přidáme 100 ml 1 x TAE pufru, zamícháme a v mikrovlnné troubě vaříme 3 minuty při 500 W. Protože během varu dochází k odpaření vody, poznačíme si původní úroveň hladiny. Destilovanou vodou doplníme úbytek vody. Pod tekoucí vodou zchladíme agarosu na cca 60 C a naléváme na připravený nosič. Po ztuhnutí agarosy zalijeme gel 1 x TAE pufrem ( ml), ke vzorkům (10 l ) přidáme 2 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a vzorky naneseme na gel. 15. Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 16. Z intenzity zbarvení standardů a izolované DNA stanovíme výtěžek izolace. 17. Změřením absorbance při 260 nm a 280 nm provedeme nezávislé stanovení výtěžku DNA a její čistoty. Dvoušroubovicová DNA o koncentraci 50 g/ml dává v kyvetě o

22 tloušťce 1 cm hodnotu absorbance při 260 nm 1. Poměr absorbancí při 260 a 280 nm by měl činit minimálně Obr. 5.3: Kontroly izolace plasmidů pbsk- (dráhy 1,5,9,13), ppgm1 (2,6,10,14), ppgm2 (3,7,11,15) a ppgm3 (4,8,12,16). V drahách 1-4 jsou kontroly buněčného lyzátu před nanesením na aniontovou výměnnou kolonu (kontroly 1), dráhy 5-8 představují kontroly 2 lyzát prošlý kolonou, dráhy 9-12 představují spojené frakce kontrolních vzorků 3 a 4 promývací frakce, v drahách jsou vzorky eluované z kolony.

23 Izolace plasmidové DNA pomocí centrifugačních kolonek Princip: Pro izolaci plasmidové DNA je možné použít nejen kolonky, u kterých je k přečištění a uvolnění zachycené plasmidové DNA využíváno přirozené gravitační pole. Na trhu jsou k dispozici izolační kity, které využívají odstředivou sílu vznikají při centrifugami. Princip izolace je obdobný jako v případě gravitačních kolonek. Použití vyššího přetížení nám však umožňuje zkrátit čas potřebný pro izolaci na 20-30min. Na druhé straně centrifugační kolonky mají nižší kapacitu, izolací proto získáme menší množství DNA. Pracovní postup: 1. V centrifuze stočíme 1-5 ml bakteriální kultury kultivované v LB médiu. Centrifugami provádíme 30 sekund při x g. Odstraníme supernatant, pokud možno kompletně. 2. Přidáme 250 l pufru A1. Resuspendujeme buněčný pelet na vortexu. Pro účinnou izolaci je nutné, aby v suspenzi nezůstaly viditelné shluky buněk. Přidáme 250 l pufru A2. Promícháme přvrácením zkumavky dnem vzhůru a zpět 6-8x. Nevortexujeme! Inkubujeme při pokojové teplotě 5 min. Přidáme 300 ml pufru A3. Opět jemně zamícháme převrácením zkumavky (6-8x). Nevortexujeme! 3. Centrifugujeme 5 10 min při x g při pokojové teplotě. 4. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu do 2 ml sběrné zkumavky a naneseme supernatant z bodu 3 na kolonu. Centrifugujeme 1 min při x g. Odstraníme proteklý roztok. 5. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu zpět do sběrné zkumavky a přidáme 600 l pufru A4. Centrifugujeme 1 min při x g. Roztok prošlý kolonou odstraníme. 6. Abychom dostatečně vysušili membránu, na které je plasmidová DNA navázána, vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu zpět do prázdné sběrné zkumavky a centrifugujeme další 2 min při x g. Tento krok zabezpečí odstranění zbytků etanolu, který je součástí promývacího pufru A4. Etanol může inhibovat enzymatické reakce, ke kterým může být izolovaná DNA použita. 7. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a přidáme 50 l pufru AE. Inkubujeme 1 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min při x g. Opakováním tohoto kroku můžeme dosáhnout zvýšení výtěžku o 15-20%. Eluce může být prováděna destilovanou vodou nebo TE pufrem.

24 - 24 -

25 Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA Po izolaci DNA (plasmidové, chromozomální) je nutné zjistit její koncentraci a čistotu. Pro další aplikace izolovaných DNA je naprosto nezbytné zajistit, aby do reakcí (sekvenování, PCR apod.) bylo bráno alespoň přibližně stejné množství DNA. Rovněž izolované vzorky nesmějí být kontaminovány jinými molekulami, např. proteiny nebo látkami typu fenolů. Ke stanovení čistoty a druhu nukleové kyseliny ve vzorku se používá výpočet poměru hodnot absorbancí při 260 a 280nm. Nukleové kyseliny mají absorpční maximum při 260 nm, absorpční maximum proteinů a aromatických látek je kolem 280 nm. Pro přesné stanovení čistoty a koncentrace je třeba vzít v úvahu možný vliv pufrů s vysokou absorbancí, zákal vzorku, či použití kyvet se zúženou štěrbinou. Protože ani nukleové kyseliny ani proteiny neabsorbují při 320 nm, používá se tato vlnová délka pro kompenzaci vlivu absorbance pozadí. Index čistoty DNA je dán poměrem absorbancí při 260 a 280 nm, sníženým o rozptyl světla při 320 nm. Čistá DNA má tento poměr minimálně 1,8; čistá RNA 2,0. Hodnoty významně nižší signalizují přítomnost nečistot ve vzorku a nutnost dalšího přečištění. Také zvýšená absorbance při 230 nm může být způsobena nečistotami. Vlnová délka 230 nm je blízká absorpčnímu maximu peptidových vazeb, také Tris, EDTA a jiné pufry absorbují při této vlnové délce. Absorbance 260nm se používá pro kvantifikaci čistých nukleových kyselin: roztok s absorbancí 1,0 v kyvetě s optickou dráhou 10 mm odpovídá koncentraci 50 g/ml u dvouřetězcové DNA, 40 g/ml u ssdna a RNA, a 33 g/ml u oligonukleotidů (může se měnit v zavislosti na složení bází). U vzorků s příměsí proteinů lze přibližnou koncentraci vypočítat dle Warburgovy-Christianovy rovnice: C protein = (1552,0 *A 280 ) (757,3*A 260 ) C nukleová kys. = (62,9 *A 260 ) (36,0*A 280 )

26 Příprava kompetentních buněk a transformace plasmidové DNA do bakterií Princip: V laboratoři často nastává situace, kdy je třeba rekombinantní DNA (většinou plasmid s ligovaným úsekem DNA) vpravit do bakteriálních buněk, kde se pomnoží. Bylo vypracováno několik technik, které se liší použitými pufry, způsobem přenosu DNA do buněk a v neposlední řadě i účinností. Nejčastěji používanou technikou je transformace. Ta vyžaduje tzv. kompetentní buňky (schopné přijmout cizorodou DNA), které se připravují inkubací bakteriálních buněk v přítomnosti např. vápenatých iontů při 0 C. Při tomto procesu se podstatně zvýší prostupnost buněčné stěny pro molekuly plasmidu. Po krátkém zahřátí na 42 C plasmidová DNA vstupuje do bakterií. Další metodou je elektroporace, při které je roztok, v němž jsou bakterie spolu s plasmidovou DNA, vystaven krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí. Impuls vytvoří v bakteriální stěně póry, kterými se DNA dostane dovnitř buněk. Materiál: - agarová plotna s narostlými koloniemi bakteriálního kmene, který chceme použít k transformaci - plasmidová DNA - 0,1 M CaCl 2 - MgCl 2 -CaCl 2 (80 mm MgCl 2, 20 mm CaCl 2 ) - LB médium (případně SOB) - SOC médium - agarové plotny s SOB médiem, 20 mm MgSO 4, selekčním antibiotikem - centrifuga - sterilní polypropylenové kyvety 50 ml - sterilní mikrozkumavky - vodní lázeň 42 C - termostat 37 C - pipety - rukavice - sterilní špičky Pracovní postup: a) příprava kompetentních buněk kalciovou metodou 1) Z agarové plotny setřeme oddělenou, dobře narostlou kolonii a přeneseme ji do 100 ml LB média. Inkubujeme kulturu při 37 C do dobu 2-3 hodin za intenzivního třepání. Nádoba, ve které kultivace probíhá, má mít objem minimálně 5 x větší než je objem média. 2) Přelijeme bakteriální kulturu do sterilních vychlazených 50 ml polypropylenových zkumavek. Uložením kultury do ledové lázně na 10 minut ji vychladíme na 0 C. 3) Centrifugací při 4000 rpm při 4 C po dobu 10 minut shromáždíme bakteriální buňky na dně centrifugační kyvety. 4) Opatrně slijeme supernatant. Postavíme kyvety dnem vzhůru na filtrační papír nebo buničinu a necháme je v této poloze 1 minutu, abychom se zbavili posledních zbytků kultivačního média.

27 - 27-5) Bakterie v každé 50 ml kyvetě resuspendujeme jemným třepáním v 30 ml vychlazeného (0 C) roztoku MgCl 2 -CaCl 2. 6) Zkumavky vložíme na 10 minut do ledové lázně. 7) Centrifugujeme při 4000 rpm, 4 C, po dobu 10 minut. 8) Slijeme supernatant z kyvet. Obrátíme zkumavky dnem vzhůru a postavíme je na filtrační papír nebo buničinu. V této poloze je necháme 1 minutu, aby vytekly zbytky supernatantu. 9) Pelet v každé kyvetě resuspendujeme ve 2 ml 0,1 M CaCl 2 vychlazeného v ledové lázni. 10) Bakterie v CaCl 2 rozdělíme po l do sterilních mikrozkumavek. Jednotlivé alikvoty můžeme použít přímo k transformaci nebo je můžeme zamrazit na 70 C. Pokud s buňkami nemůžeme pracovat ihned, můžeme je v tomto stadiu 1-2 dny uchovávat při 4 C. Účinnost transformace u těchto buněk během hodin vzroste 4-6 x, potom se vrací na svou původní hodnotu. b) transformace bakterií plasmidovou DNA 1) K 200 l kompetentních buněk ve vychlazeném 0,1 M CaCl 2 přidáme DNA (maximálně 50 ng v objemu 10 l nebo menším). Jemně zamícháme a inkubujeme 30 minut v ledu. 2) Přeneseme zkumavky do vodní lázně temperované na 42 C. Ponecháme je v lázni přesně 90 sekund. Pozn.: Teplotní šok je kritický krok celého postupu. Pro účinnou transformaci je třeba dodržet co možná přesně teplotu i čas. Při kratších časech je účinnost transformace snížená, při delších časech nastává odumírání bakterií. 3) Rychle přeneseme zkumavky zpět do ledové lázně na 1-2 minuty. 4) Do každé mikrozkumavky přidáme 800 l SOB média. Vzorky inkubujeme 45 minut při 37 C, abychom bakteriím umožnili se vzpamatovat a obnovit svou bakteriální stěnu. 5) Na agarovou plotnu obsahující SOB médium s 20 mm MgCl 2 a antibiotikem, proti němuž transformované bakterie získaly resistenci, vysejeme l buněčné suspenze. Kulturu pomocí sterilní, zahnuté skleněné tyčinky rovnoměrně rozetřeme po celém povrchu plotny. 6) Plotny ponecháme při pokojové teplotě, dokud není veškerá kapalina absorbována. 7) Obrátíme plotny dnem vzhůru a inkubujeme při 37 C. Kolonie transformovaných bakterií se objeví za hodin. Pozn.: Jak příprava kompetentních buněk, tak transformace musí probíhat sterilním způsobem, aby nedošlo ke kontaminaci.

28 Štěpení plasmidové DNA restrikčními endonukleázami, sestavení restrikční mapy Princip: Prudký rozvoj metod molekulární biologie přímo souvisí s objevem restrikčních endonukleáz, které umožňují sekvenčně specifickou fragmentaci DNA. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Pro účely klonování v molekulární biologii se proto zpravidla používají buňky zbavené restrikční aktivity. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. Jsou známy tři typy restrikčních endonukleáz. Typy I. a III. třídy vykazují zároveň modifikační i ATP dependentní restrikční aktivitu. Enzymy skupiny I. se vážou na specifickou rozpoznávací sekvenci, ale štěpí DNA v nedefinované oblasti mimo rozpoznávanou sekvenci. Enzymy této skupiny nemají praktické využití při genových manipulacích. Uplatnění nenašly ani enzymy III. skupiny, neboť ke štěpení DNA dochází opět mimo rozpoznávací oblast. Nejvhodnější pro využití v molekulární biologii jsou enzymy II. skupiny, které nevyžadují ATP, jsou striktně specifické a rozpoznávají tzv. palindromové sekvence, tj. dvouvláknové úseky DNA, které mají v obou vláknech opačně orientovanou sekvenci bází. Délka těchto rozpoznávacích sekvencí se pohybuje nejčastěji mezi 4 6 páry bází, existují ale restrikční endonukleázy rozpoznávající sekvence o 15 párech bází. Tento parametr je rozhodující pro četnost, se kterou enzym bude štěpit molekulu DNA. Volbou restrikční endonukleázy lze tedy ovlivnit délku vznikajících úseků. Enzymy II. skupiny lze dále rozdělit podle způsobu, jakým DNA štěpí, na tři podskupiny: a/ poskytující jednovláknové úseky na 5 koncích EcoRI 5...GAATTC G3 5 AATTC CTTAAG CTTAA5 3 G...5 b/ poskytující jednovláknové úseky na 3 koncích PvuI 5...CGATCG CGAT3 5 CG GCTAGC GC5 3 TAGC...5

29 c/ poskytující tupé konce StuI 5...AGGCCT AGC3 5 CCT TCCGGA TCC5 3 GGA...5 Materiál a chemikálie: - Plasmidová DNA - Restrikční endonukleázy + pufry - 96% a 80% etanol (-20 C) - 3 M octan sodný ph 5,0 - Hlubokomrazící box 80 C - Stolní centrifuga - Pipety, špičky - Rukavice - Mikrozkumavky 1,5 ml - Vortex - Aparatura pro agarosový gel - Agarosa - Termostat na 37 C - Elektroforetický pufr (TAE, TBE) - Zdroj napětí - Ethidiumbromid (1 g/ml) - Dokumentační systém Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle pokynů vedoucího cvičení napipetujeme vzorky jedné z variant uvedených v tabulce. Při přípravě vzorků pipetujeme podle následujícího schématu DNA, pufr, destilovanou vodu a restrikční endonukleázu, v případě dvojnásobných štěpení první enzym. DNA (1 g) 4-5 l pufr (10 x koncentrovaný) 2 l restrikční endonukleáza (2-3 U) 1 l destilovaná voda do 20 l Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37 C. Necháme inkubovat 30 minut Číslo vzorku skupina Použité restrikční endonukleázy A EcoRI ScaI BglI EcoRI + ScaI EcoRI + BglI ScaI + BglI B BamHI XmnI PvuII BamHI + XmnI BamHI + PvuII XmnI + PvuII C EcoRI SmaI AvaII EcoRI + SmaI EcoRI + AvaII SmaI + AvaII

30 D HindIII ScaI RsaI HindIII + ScaI HindIII + RsaI ScaI + RsaI 2) Ke vzorkům přidáme 2 l 3 M octanu sodného, ph 5.0, zamícháme a přidáme 70 l vychlazeného 96% etanolu. Zamícháme a necháme 10 minut při -80 C. 3) Vzorky centrifugujeme při x g po dobu 10 minut. Slijeme supernatant a k peletu DNA přidáme 500 l vychlazeného (-20 C) 80% etanolu. Zamícháme a centrifugujeme 10 minut při x g. Odebereme supernatant a zkumavky s vysráženou a promytou plastidovou DNA vložíme do exsikátoru a sušíme 5-10 za sníženého tlaku. 4) Vysušenou DNA rozpustíme v 17 l destilované vody, přidáme pufr pro druhou restriktázu (2 l), restrikční endonukleázu (2-3 U, tj. 1 l) a necháme inkubovat při 37 C po dobu 30 minut. (U vzorků štěpených pouze jedním enzymem rozpustíme DNA ve 20 l TE pufru, ph 8.0. Vzorky necháme při laboratorní teplotě do doby než je společně s ostatními vzorky naneseme na agarosový gel.) 5) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru (100 ml) a 500 ml 1 x TAE pufru. 6) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 7) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 8) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 9) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pbluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. AvaII 2184, 2406 b. BamHI 719 c. BglI 466, 2160 d. EcoRI 701 e. HindIII 689 f. PvuII 529, 977 g. RsaI 654, 2525 h. ScaI 2526 i. SmaI 713 j. XmnI 2645

31 Současné štěpení DNA dvěma nebo více restriktázami Princip: Při štěpení DNA restrikčními endonukleázami lze v některých případech použít více restriktáz současně. Tento postup šetří čas a také odpadá riziko ztráty DNA při nedokonalém přesrážení vzorku. Při zvažování, zda můžeme štěpit zároveň více restriktázami, je nezbytné porovnat prostředí, v nichž jsou dané restriktázy aktivní. Jako každé enzymy, i restrikční endonukleázy vyžadují pro svou aktivitu optimální ph, přítomnost iontů (obvykle Mg2+) a iontovou sílu. Většina restrikčních endonukleáz má optimální teplotu štěpení 37 C, ale najdou se i takové, u nichž je optimální teplota nižší (30 C) nebo naopak vyšší (50-65 C) Všechny tyto parametry musíme důkladně prozkoumat než se rozhodneme pro současné štěpení. BglI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 0,1 mg/ml BSA; 37 C. EcoRI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 0,02% Triton X- 100, 0,1 mg/ml BSA; 37 C. ScaI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 1 mm DTT; 37 C. Porovnáním reakčních pufrů dospějeme k závěru, že u uvedených enzymmů lze provést současné štěpení. Pro jednotlivé kombinace jsme vybrali: EcoRI + ScaI: pufr pro ScaI ScaI + BglI: pufr pro ScaI BglI + EcoRI: pufr pro BglI Při rozhodování, který z pufrů vybrat hraje roli stabilita enzymu, jeho cena. Užitečným vodítkem při volbě pufru jsou tabulky v katalozích firem dodávajících enzymy. Z tabulek lze vyčíst, které kombinace restriktáz jsou možné a jaký pufr je pro danou kombinaci vhodný.

32 - 32 -

33 - 33 -

34 Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle níže uvedené tabulky napipetujeme DNA, vhodný pufr a uvedenou kombinaci restrikčních endonukleáz. Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37 C. Necháme inkubovat 60 minut Číslo vzorku (RE) 1-2 EcoRI 3 ScaI 4 BglI 5 EcoRI + ScaI 6 ScaI + BglI 7 EcoRI + BglI DNA Pufr E Pufr S Pufr B EcoRI ScaI BglI H 2 O ) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru a 500 ml 1 x TAE pufru 3) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 4) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 5) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 6) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pbluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. BglI 466, 2160 b. EcoRI 701 c. ScaI 2526

35 Obr.: Mapa plasmidu pbluscript II SK(-), který byl použit pro přípravu plasmidů řady ppgm vložením vazebné sekvence pro protein p53 do HindIII místa Obr.: Výsledek štěpení plasmidu pb II SK (-) restrikčními endonukleázami. 1. scdna; 2961 pb 2. pbs/ecori; lin pbs/scai; lin pbs/bgli; lin a 1694 pb ( = 1694; = 1267) 5. pbs/(ecori + ScaI); lin a 1825 pb ( = 1825; = 1136) 6. pbs/(bgli + ScaI); lin. 366, 901 a 1694 pb ( = 366; = 1694; = 901) 7. pbs/(bgli + EcoRI); lin. 235, 1267 a 1459 pb ( = 235; = 1459; = 1267) 8. Standardy: (odspodu nahoru) 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, pb.

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

VÝŽIVA LIDSTVA Mléko a zdraví

VÝŽIVA LIDSTVA Mléko a zdraví GYMNÁZIUM JANA OPLETALA LITOVEL Odborná práce přírodovědného kroužku VÝŽIVA LIDSTVA Mléko a zdraví Vypracovali: Martina Hubáčková, Petra Vašíčková, Pavla Kubíčková, Michaela Pavlovská, Jitka Tichá, Petra

Více

Gramovo barvení bakterií

Gramovo barvení bakterií Předmět: Biologie ŠVP: Prokaryotní organismy Doporučený věk žáků: 16-18 let Doba trvání: 45 minut Specifické cíle: poznat jednu z nejdůležitějších a nejpoužívanějších mikrobiologických technik Seznam pomůcek:

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction

Více

ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9

ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9 Téma: Bílkoviny, enzymy ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9 Úkol 1: Dokažte, že mléko obsahuje bílkovinu kasein. Kasein je hlavní bílkovinou obsaženou v savčím mléce. Výroba řady mléčných výrobků je

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Animovaná chemie Top-Hit Analytická chemie Analýza anorganických látek Důkaz aniontů Důkaz kationtů Důkaz kyslíku Důkaz vody Gravimetrická analýza Hmotnostní spektroskopie Chemická analýza Nukleární magnetická

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 23. 4. 27. 4. 2012 / II. TURNUS: 14. 5. 18. 5. 2012 ZÁKLADNÍ

Více

LP č. 6 - BÍLKOVINY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013. Ročník: devátý

LP č. 6 - BÍLKOVINY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013. Ročník: devátý LP č. 6 - BÍLKOVINY Autor: Mgr. Stanislava Bubíková Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013 Ročník: devátý Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Organické sloučeniny 1 Anotace: Žáci prakticky ověří

Více

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í LABORATORNÍ PRÁCE Č. 34 MIKROSKOPIE

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í LABORATORNÍ PRÁCE Č. 34 MIKROSKOPIE LABORATORNÍ PRÁCE Č. 34 MIKROSKOPIE PRINCIP V chemické laboratoři se používá k některým stanovením tzv. mikrokrystaloskopie. Jedná se o použití optického mikroskopu při kvalitativních důkazech látek na

Více

STANOVENÍ REZIDUÍ INHIBIČNÍCH LÁTEK V MLÉCE

STANOVENÍ REZIDUÍ INHIBIČNÍCH LÁTEK V MLÉCE STANOVENÍ REZIDUÍ INHIBIČNÍCH LÁTEK V MLÉCE DAVID ŠILHA IVETA BROŽKOVÁ Univerzita Pardubice Fakulta chemicko technologická Katedra biologických a biochemických věd Centralizovaný rozvojový projekt MŠMT

Více

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Výuková prezentace z: Lékařské mikrobiologie Jan Smíšek ÚLM 3. LF UK 2009 Princip identifikace Soubor znaků s rozdílnou diskriminační hodnotou Základní problémy

Více

Sešit pro laboratorní práci z chemie

Sešit pro laboratorní práci z chemie Sešit pro laboratorní práci z chemie téma: Příprava oxidu měďnatého autor: ing. Alena Dvořáková vytvořeno při realizaci projektu: Inovace školního vzdělávacího programu biologie a chemie registrační číslo

Více

Význam ovoce jako zdroje cenných látek ve stravě

Význam ovoce jako zdroje cenných látek ve stravě Metodické listy OPVK Význam ovoce jako zdroje cenných látek ve stravě Druhý stupeň ZŠ 9. VÝZNAM OVOCE JAKO ZDROJE CENNÝCH LÁTEK VE STRAVĚ Praktické cvičení pokus kategorie a vyžadující běžné vybavení Co

Více

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí LABORATORNÍ CVIČENÍ 1. Téma: Ovlivňování průběhu reakce změnou koncentrace látek. podmínek průběhu reakce. Jednou z nich je změna koncentrace výchozích

Více

Praktické cvičení č. 1.

Praktické cvičení č. 1. Praktické cvičení č. 1. Cvičení 1. 1. Všeobecné pokyny ke cvičení, zápočtu a zkoušce Bezpečnost práce 2. Mikroskopie - mikroskop a mikroskopická technika - převzetí pracovních pomůcek - pozorování trvalého

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION AFLP ANALÝZA *** Technika AFLP (Amplification Fragment Lenght Polymorphism - polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) je modifikací RFLP,

Více

analýza dat a interpretace výsledků

analýza dat a interpretace výsledků Genetická transformace bakterií III analýza dat a interpretace výsledků Předmět: Biologie ŠVP: Prokaryotní organismy, genetika Doporučený věk žáků: 16-18 let Doba trvání: 45 minut Specifické cíle: analyzovat

Více

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Autor: Doc. Ing. Josef Formánek, Ph.D. Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti

Více

Základy laboratorní techniky

Základy laboratorní techniky Předmět: Biologie ŠVP: prokaryotní organismy, genetika Doporučený věk žáků: 16 18 let Doba trvání: 2 x 45 min. Specifické cíle: naučit studenty pracovat s laboratorními pomůckami a přístroji Seznam pomůcek:

Více

COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS)

COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS) COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS) OBSAH 1. Princip metody 2. Přístroje a zařízení 3. Příprava vzorků 3.1 Kultivace a sklízení buněk A549 3.2 Výpočet koncentrace buněk 3.3 Hodnocení viability

Více

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)

Více

Bílkoviny (laboratorní práce)

Bílkoviny (laboratorní práce) Zvyšování kvality výuky v přírodních a technických oblastech CZ.1.07/1.128/02.0055 Bílkoviny (laboratorní práce) Označení: EU-Inovace-Ch-9-08 Předmět: chemie Cílová skupina: 9. třída Autor: Mgr. Simona

Více

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í LABORATORNÍ PRÁCE Č. 6 PRÁCE S PLYNY

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í LABORATORNÍ PRÁCE Č. 6 PRÁCE S PLYNY LABORATORNÍ PRÁCE Č. 6 PRÁCE S PLYNY Mezi nejrozšířenější práce s plyny v laboratoři patří příprava a důkazy oxidu uhličitého CO 2, kyslíku O 2, vodíku H 2, oxidu siřičitého SO 2 a amoniaku NH 3. Reakcí

Více

Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera

Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera Princip Jde o klasickou metodu kvantitativní chemické analýzy. Uhličitan vedle hydroxidu se stanoví ve dvou alikvotních podílech zásobního

Více

Název: Acidobazické indikátory

Název: Acidobazické indikátory Název: Acidobazické indikátory Autor: Mgr. Jiří Vozka, Ph.D. Název školy: Gymnázium Jana Nerudy, škola hl. města Prahy Předmět, mezipředmětové vztahy: chemie, biologie, fyzika Ročník: 3. (1. ročník vyššího

Více

REAKCE V ANORGANICKÉ CHEMII

REAKCE V ANORGANICKÉ CHEMII REAKCE V ANORGANICKÉ CHEMII PaedDr. Ivana Töpferová Střední průmyslová škola, Mladá Boleslav, Havlíčkova 456 CZ.1.07/1.5.00/34.0861 MODERNIZACE VÝUKY Anotace: laboratorní práce z anorganické chemie, realizace

Více

PŘÍBALOVÁ INFORMACE. www.geneproof.com. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250. In vitro diagnostický zdravotnický prostředek

PŘÍBALOVÁ INFORMACE. www.geneproof.com. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250. In vitro diagnostický zdravotnický prostředek PŘÍBALOVÁ INFORMACE GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250 In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Souprava je vyrobena v souladu s evropskou Směrnicí Rady 98/79/ES jako in vitro

Více

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Teorie: Derivační spektrofotometrie, využívající derivace absorpční křivky, je obecně používanou metodou pro zvýraznění detailů průběhu záznamu,

Více

POČÍTÁNÍ BUNĚK. Část mřížky Bürkerovy komůrky. Výška prostoru, v němž jsou buňky nad mřížkou počítány, je 0,1 µm

POČÍTÁNÍ BUNĚK. Část mřížky Bürkerovy komůrky. Výška prostoru, v němž jsou buňky nad mřížkou počítány, je 0,1 µm POČÍTÁNÍ BUNĚK Potřeba spočítat množství buněk vzniká při řešení mnoha biologických otázek. Mnohé z nich mívají rovněž klinický význam (zejména v hematologii je zjišťování počtů krvinek každodenním rutinním

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti

Více

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Název proteiny

Více

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1 Teoretický úvod Uveďte vzorec pro: výpočet směrodatné odchylky výpočet relativní chyby měření [%] Použitý materiál, pomůcky a přístroje Úkol 1. Ředění

Více

Solární dům. Vybrané experimenty

Solární dům. Vybrané experimenty Solární dům Vybrané experimenty 1. Závislost U a I na úhlu osvitu stolní lampa, multimetr a) Zapojíme články sériově. b) Na výstup připojíme multimetr. c) Lampou budeme články nasvěcovat pod proměnlivým

Více

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Praktický kurz Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno,

Více

PRÁCE S MIKROSKOPEM Praktická příprava mikroskopického preparátu

PRÁCE S MIKROSKOPEM Praktická příprava mikroskopického preparátu PRÁCE S MIKROSKOPEM 1. Praktická příprava mikroskopického preparátu 2. a) Z objektu, jehož část, chceme pozorovat pomocí mikroskopu, musíme nejprve vytvořit mikroskopický preparát. Obr. č. 1 b) Pozorovaný

Více

Řasový test ekotoxicity na mikrotitračních destičkách

Řasový test ekotoxicity na mikrotitračních destičkách Řasový test ekotoxicity na mikrotitračních destičkách 1 Účel Řasové testy toxicity slouží k testování možných toxických účinků látek a vzorků na vodní producenty. Zelené řasy patří do skupiny necévnatých

Více

Eva Benešová. Dýchací řetězec

Eva Benešová. Dýchací řetězec Eva Benešová Dýchací řetězec Dýchací řetězec Během oxidace látek vstupujících do různých metabolických cyklů (glykolýza, CC, beta-oxidace MK) vznikají NADH a FADH 2, které následně vstupují do DŘ. V DŘ

Více

Vitamin C důkaz, vlastnosti

Vitamin C důkaz, vlastnosti Předmět: Doporučený ročník: 4. - 5. ročník Zařazení do ŠVP: biochemie, přírodní látky, vitaminy Doba trvání pokusu: 45 minut Seznam pomůcek: zkumavky, kádinky, pipety (automatické), míchací tyčinky, odměrné

Více

1.08 Tvrdost vody. Projekt Trojlístek

1.08 Tvrdost vody. Projekt Trojlístek 1. Chemie a společnost 1.08. Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie 2. Cílová skupina Metodika je určena pro žáky 2. stupně ZŠ

Více

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Co je to vlastně ta fluorescence? Některé látky (fluorofory)

Více

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských

Více

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je

Více

Měření ph nápojů a roztoků

Měření ph nápojů a roztoků Měření ph nápojů a roztoků vzorová úloha (ZŠ) Jméno Třída.. Datum.. 1 Teoretický úvod Kyselý nebo zásaditý roztok? Proč je ocet považován za kyselý roztok? Ocet obsahuje nadbytek (oxoniových kationtů).

Více

Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda

Více

LP č. 5 - SACHARIDY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013. Ročník: devátý

LP č. 5 - SACHARIDY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013. Ročník: devátý LP č. 5 - SACHARIDY Autor: Mgr. Stanislava Bubíková Datum (období) tvorby: 28. 2. 2013 Ročník: devátý Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Organické sloučeniny 1 Anotace: Žáci si prakticky vyzkouší

Více

CHSK. Pro hodnocení kvality vod obvykle postačí základní sumární ukazatele. Pro organické látky se jedná zejména o ukazatele:

CHSK. Pro hodnocení kvality vod obvykle postačí základní sumární ukazatele. Pro organické látky se jedná zejména o ukazatele: CHSK Ve vodách mohou být obsažené různé organické látky v širokém rozmezí koncentrací od stopových množství až po majoritní složky podle druhu vod. Vzhledem k této různorodosti se organické látky ve vodách

Více

STANOVENÍ, CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE BIOREMEDIAČNÍCH MIKROORGANISMŮ

STANOVENÍ, CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE BIOREMEDIAČNÍCH MIKROORGANISMŮ Abstrakt STANOVENÍ, CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE BIOREMEDIAČNÍCH MIKROORGANISMŮ Jana Chumchalová, Eva Podholová, Jiří Mikeš, Vlastimil Píštěk EPS, s.r.o., V Pastouškách 205, 686 04 Kunovice, e-mail: eps@epssro.cz

Více

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP na gymnáziu Pierra de Coubertina v Táboře Pavla Trčková, kabinet Biologie, GPdC Tábor Co je fluorescence Fluorescence je jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph. Mgr. Lenka Horutová. Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.

CHEMIE. Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph. Mgr. Lenka Horutová. Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03. www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Pro snadnější výpočet

Více

2.09 Oxidačně-redukční vlastnosti glukózy. Projekt Trojlístek

2.09 Oxidačně-redukční vlastnosti glukózy. Projekt Trojlístek 2. Vlastnosti látek a chemické reakce 2.09 Oxidačně-redukční vlastnosti glukózy. Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie 2. Cílová

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í CZ.1.07/2.2.00/15.0324 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem

Více

Stanovení kvality vody pomocí kompaktní laboratoře Aquamerck

Stanovení kvality vody pomocí kompaktní laboratoře Aquamerck NÁVOD K PROVEDENÍ PRAKTICKÉHO CVIČENÍ Stanovení základních parametrů ve vodách Stanovení kvality vody pomocí kompaktní laboratoře Aquamerck Princip Kompaktní laboratoř Aquamerck je vhodná zejména na rychlé

Více

1. Chemický turnaj. kategorie mladší žáci 30.11. 2012. Zadání úloh

1. Chemický turnaj. kategorie mladší žáci 30.11. 2012. Zadání úloh 1. Chemický turnaj kategorie mladší žáci 30.11. 2012 Zadání úloh Vytvořeno v rámci projektu OPVK CZ.1.07/1.1.26/01.0034,,Zkvalitňování výuky chemie a biologie na GJO spolufinancovaného Evropským sociálním

Více

POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA NÁVODY KE CVIČENÍM

POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA NÁVODY KE CVIČENÍM POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 22. 10. 26. 10. 2012 / II. TURNUS: 29.

Více

DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY

DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY.1Úvod Autor: Ing. František Svoboda Csc. Zvážení rizik tvorby vedlejších produktů desinfekce (DBP) pro úpravu konkrétní vody je podmíněno návrhem

Více

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta Tabulace učebního plánu Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : CHEMIE Ročník: 1.ročník a kvinta Obecná Bezpečnost práce Názvosloví anorganických sloučenin Zná pravidla bezpečnosti práce a dodržuje je.

Více

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují s finanční podporou v Operačním programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost Královéhradeckého kraje Modul 02 Přírodovědné předměty Hana Gajdušková 1 Viry

Více

Sešit pro laboratorní práci z chemie

Sešit pro laboratorní práci z chemie Sešit pro laboratorní práci z chemie téma: Chelatometrie. Chromatografie. autor: ing. Alena Dvořáková vytvořeno při realizaci projektu: Inovace školního vzdělávacího programu biologie a chemie registrační

Více

LIDSKÁ CYTOGENETIKA Laboratorní diagnostika

LIDSKÁ CYTOGENETIKA Laboratorní diagnostika Pod Cihelnou 6 161 00 Praha 6 tel: 233 313 578, fax: 233 313 582 email: asco@ascomed.cz www.ascomed.cz 1. Kultivace lymfocytů LIDSKÁ CYTOGENETIKA Laboratorní diagnostika 1.1 Úvod Karyotypizace lidských

Více

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie STŘEDNÍ ŠKOLA INFORMATIKY A SLUŽEB ELIŠKY KRÁSNOHORSKÉ 2069 DVŮR KRÁLOVÉ N. L. Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie Školní rok:

Více

Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy Ústřední komise Chemické olympiády. 46. ročník 2009/2010. KRAJSKÉ KOLO kategorie D

Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy Ústřední komise Chemické olympiády. 46. ročník 2009/2010. KRAJSKÉ KOLO kategorie D Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy Ústřední komise Chemické olympiády 46. ročník 2009/2010 KRAJSKÉ KOLO kategorie D ŘEŠENÍ SOUTĚŽNÍCH ÚLOH TEORETICKÁ ČÁST (60 bodů) Úloha 1 Vlastnosti prvků 26

Více

KONCENTRACE KYSLÍKU VE VODĚ

KONCENTRACE KYSLÍKU VE VODĚ KONCENTRACE KYSLÍKU VE VODĚ Eva Hojerová, PřF JU v Českých Budějovicích Stanovení koncentrace rozpuštěného O 2 ve vodě Koncentrace O 2 ve vodě je významným parametrem běžně zjišťovaným při výzkumu vlastností

Více

MICRONUKLEUS TEST MODIFIKACE S CYTOCHALASINEM B

MICRONUKLEUS TEST MODIFIKACE S CYTOCHALASINEM B MICRONUKLEUS TEST MODIFIKACE S CYTOCHALASINEM B O B S A H: 1. Princip Micronucleus testu 2. Chemikálie a spotřební materiál 3. Přístroje a pomocná zařízení 4. Pracovní postup 4.1 Kultivace buněk 4.2 Zpracování

Více

Havarijní plán pro práci s geneticky modifikovanými mikroorganismy Mikrobiologický ústav AV ČR

Havarijní plán pro práci s geneticky modifikovanými mikroorganismy Mikrobiologický ústav AV ČR Mikrobiologický ústav AV ČR Příloha 6 Havarijní plán 1/5 Havarijní plán pro práci s geneticky modifikovanými mikroorganismy Mikrobiologický ústav AV ČR a) Adresa pracoviště Mikrobiologický ústav AV ČR

Více

Návod k laboratornímu cvičení. Efektní pokusy

Návod k laboratornímu cvičení. Efektní pokusy Návod k laboratornímu cvičení Efektní pokusy Úkol č. 1: Chemikova zahrádka Pomůcky: skleněná vana, lžička na chemikálie. Chemikálie: vodní sklo, síran zinečnatý ZnSO 4 (X i ), síran železnatý FeSO 4, chlorid

Více

NMR spektroskopie. Úvod

NMR spektroskopie. Úvod NMR spektroskopie Úvod Zkratka NMR znamená Nukleární Magnetická Rezonance. Jde o analytickou metodu, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje

Více

METABOLISMUS SACHARIDŮ

METABOLISMUS SACHARIDŮ METABOLISMUS SAHARIDŮ A. Odbourávání sacharidů - nejdůležitější zdroj energie pro heterotrofy - oxidací sacharidů až na. získávají aerobní organismy energii ve formě. - úplná oxidace glukosy: složitý proces

Více

IZOLACE DNA POMOCÍ MAGNETIZOVATELNÝCH ČÁSTIC A JEJICH VYUŽITÍ V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

IZOLACE DNA POMOCÍ MAGNETIZOVATELNÝCH ČÁSTIC A JEJICH VYUŽITÍ V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ IZOLACE DNA POMOCÍ MAGNETIZOVATELNÝCH ČÁSTIC A JEJICH VYUŽITÍ V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ Marcela Vlčnovská 1, Kristýna Šmerková 1, Simona Dostálová 2, Jiří Sochor 1, René Kizek 1* 1 Ústav chemie

Více

Sešit pro laboratorní práci z chemie

Sešit pro laboratorní práci z chemie Sešit pro laboratorní práci z chemie téma: Reakce aminokyselin a bílkovin autor: MVDr. Alexandra Gajová vytvořeno při realizaci projektu: Inovace školního vzdělávacího programu biologie a chemie registrační

Více

Sešit pro laboratorní práci z chemie

Sešit pro laboratorní práci z chemie Sešit pro laboratorní práci z chemie téma: Příprava některých činidel autor: MVDr. Alexandra Gajová vytvořeno při realizaci projektu: Inovace školního vzdělávacího programu biologie a chemie registrační

Více

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Teoretická část: vysvětlení principu ionexové (iontové) chromatografie, příprava vzorku pro analýzu aminokyselin (kyselá a alkalická hydrolýza), derivatizace

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 6 - žákovská verze Téma: Kvašení. Mgr. Kateřina Dlouhá

CHEMIE. Pracovní list č. 6 - žákovská verze Téma: Kvašení. Mgr. Kateřina Dlouhá www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 6 - žákovská verze Téma: Kvašení Lektor: Mgr. Kateřina Dlouhá Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Kvašení je anaerobní

Více

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD 1* P. Mikula, 1 B. Maršálek 1 Botanický ústav Akademie věd ČR, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie,

Více

pracovní list studenta

pracovní list studenta Výstup RVP: Klíčová slova: pracovní list studenta ph Jakub Jermář žák se orientuje v přípravě různých látek, v jejich využívání v praxi a v jejich vlivech na životní prostředí a zdraví člověka; žák využívá

Více

Enzymy v molekulární biologii, RFLP. Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek

Enzymy v molekulární biologii, RFLP. Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek Enzymy v molekulární biologii, RFLP Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek Enzymy v molekulární biologii umožňují nám provádět celou řadu přesně cílených manipulací Výhody enzymů:

Více

Úvodní list. II. stupeň ZŠ (9. třída) a odpovídající niţší ročníky víceletých gymnázií 45 minut (s možností dalšího rozšíření o 45 minut)

Úvodní list. II. stupeň ZŠ (9. třída) a odpovídající niţší ročníky víceletých gymnázií 45 minut (s možností dalšího rozšíření o 45 minut) Úvodní list Předmět: Chemie, biologie Cílová skupina: Délka trvání: II. stupeň ZŠ (9. třída) a odpovídající niţší ročníky víceletých gymnázií 45 minut (s možností dalšího rozšíření o 45 minut) Název hodiny:

Více

Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM

Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM Historie 1931 E. Ruska a M. Knoll sestrojili první elektronový prozařovací mikroskop 1939 první vyrobený elektronový mikroskop firma Siemens rozlišení 10 nm 1965 první

Více

Složky potravy a vitamíny

Složky potravy a vitamíny Složky potravy a vitamíny Potrava musí být pestrá a vyvážená. Měla by obsahovat: základní živiny cukry (60%), tuky (25%) a bílkoviny (15%) vodu, minerální látky, vitaminy. Metabolismus: souhrn chemických

Více

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován

Více

Chemický kroužek pro žáky ZŠ. Téma č.1:

Chemický kroužek pro žáky ZŠ. Téma č.1: Téma č.1: ZAČÍNÁME Teoretický úvod: 1. Základy bezpečnosti a ochrany zdraví při práci v laboratoři Chemická laboratoř je místo, kde se pracuje s mnoha látkami, které nám mohou být za určitých okolností

Více

Biochemie. ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: Platnost: od 1. 9. 2009 do 31. 8.

Biochemie. ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: Platnost: od 1. 9. 2009 do 31. 8. Studijní obor: Aplikovaná chemie Učební osnova předmětu Biochemie Zaměření: ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: denní Celkový počet vyučovacích hodin za

Více

Stanovení konduktivity (měrné vodivosti)

Stanovení konduktivity (měrné vodivosti) T7TVO7 STANOVENÍ KONDUKTIVITY, ph A OXIDAČNĚ- REDOXNÍHO POTENCIÁLU Stanovení konduktivity (měrné vodivosti) Stanovení konduktivity je běžnou součástí chemického rozboru vod. Umožňuje odhad koncentrace

Více

5.01 DNA ve zkumavce (izolace DNA ze zeleniny a ovoce). Projekt Trojlístek

5.01 DNA ve zkumavce (izolace DNA ze zeleniny a ovoce). Projekt Trojlístek 5. Forenzní chemie (chemie v kriminalistice) 5.01 DNA ve zkumavce (izolace DNA ze zeleniny a ovoce). Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu

Více

4.02 Důkaz bílkovin biuretovou reakcí. Projekt Trojlístek

4.02 Důkaz bílkovin biuretovou reakcí. Projekt Trojlístek 4. Přírodní látky: zdroje, vlastnosti a důkazy 4.02 Důkaz bílkovin biuretovou reakcí. Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie

Více

2.12 Vyvíjení CO 2 bublinky kolem nás. Projekt Trojlístek

2.12 Vyvíjení CO 2 bublinky kolem nás. Projekt Trojlístek 2. Vlastnosti látek a chemické reakce 2.12 Vyvíjení CO 2 bublinky kolem nás. Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie 2. Cílová

Více

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů 7. června/june 2013 9:30 h 17:30 h Laboratoř metalomiky a nanotechnologií, Mendelova univerzita v Brně a Středoevropský technologický institut Budova D, Zemědělská

Více

Název: Titrace Savo. Autor: RNDr. Markéta Bludská. Název školy: Gymnázium Jana Nerudy, škola hl. města Prahy

Název: Titrace Savo. Autor: RNDr. Markéta Bludská. Název školy: Gymnázium Jana Nerudy, škola hl. města Prahy Název: Titrace Savo Autor: RNDr. Markéta Bludská Název školy: Gymnázium Jana Nerudy, škola hl. města Prahy Předmět, mezipředmětové vztahy: chemie a její aplikace, matematika Ročník: 3., ChS (1. ročník

Více

TEST + ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010

TEST + ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010 30 otázek maximum: 60 bodů TEST + ŘEŠEÍ PÍSEMÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKUŠKY Z CEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010 1. apište názvy anorganických sloučenin: (4 body) 4 BaCr 4 kyselina peroxodusičná

Více

SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU GENOTOXICKÝCH LÁTEK V POVODÍ ŘEKY SVRATKY V SOUVISLOSTI S URANOVÝM PRŮMYSLEM

SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU GENOTOXICKÝCH LÁTEK V POVODÍ ŘEKY SVRATKY V SOUVISLOSTI S URANOVÝM PRŮMYSLEM SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU GENOTOXICKÝCH LÁTEK V POVODÍ ŘEKY SVRATKY V SOUVISLOSTI S URANOVÝM PRŮMYSLEM Jana Badurová, Hana Hudcová, Radoslava Funková, Helena Mojžíšková, Jana Svobodová Toxikologická rizika spojená

Více

Použití v laboratorních podmínkách

Použití v laboratorních podmínkách Použití v laboratorních podmínkách Obsah Velcorin použití v laboratorních podmínkách Strana 3 5 Úvod Strana 3 Bezpečnostní opatření Strana 3 Pracovní postup (senzoricky) Strana 4 Pracovní postup (mikrobiologicky)

Více

Přírodní látky pracovní list

Přírodní látky pracovní list Přírodní látky pracovní list VY_52_INOVACE_199 Vzdělávací oblast: Člověk a příroda Vzdělávací obor: Chemie Ročník: 9 Přírodní látky pracovní list 1)Doplňte křížovku Tajenkou je název skupiny přírodních

Více

Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku.

Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku. Koncentrace roztoků Hmotnostní zlomek w Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku. w= m A m s m s...hmotnost celého roztoku, m A... hmotnost rozpuštěné látky Hmotnost roztoku

Více

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Základní parametry procesů likvidace odpadních vod s obsahem těžkých kovů Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Technologie likvidace OV z obsahem těžkých kovů lze rozdělit na 3 skupiny:

Více