Richard Prùša. Ústav klinické biochemie a patobiochemie 2. lékaøské fakulty UK

Transkript

1 Richard Prùša Richard Prùša Ústav klinické biochemie a patobiochemie 2. lékaøské fakulty UK

2 .

3 Základy analytických metod v klinické molekulární biologii Richard Prùša Praha 1997

4 Základy analytických metod v klinické molekulární biologii Autor: Doc. MUDr. Richard Průša, CSc. Vydala 2. lékařská fakulta UK a LAMBDA BIO MED spol. s r. o., Praha 1997 Sazba a layout: Radovan Šupej, SupRa Design Tato publikace vznikla za podpory grantu IGA MZ ČR č První vydání. ISBN

5 Obsah Úvod Izolace a purifikace nukleových kyselin RFLP Hybridizační metody Reverzní transkripce Amplifikační metody Elektroforetické metody Metody detekce Sekvenování nukleových kyselin PTT test Nové metody Použitá literatura Doporučená literatura

6 6

7 Úvod Vyšetřování iontů a substrátů v biologickém materiálu bylo následováno velkým rozvojem proteinové a enzymové diagnostiky. V současnosti jsme svědky expanze DNA a RNA diagnostiky a rozsáhlých možností její aplika ce v humánní a veterinární medicíně. Nejen lepší porozumění podstatě one mocnění, ale také převratné diagnostické a terapeutické důsledky jsou výsledkem aplikace technik molekulární biologie v diagnostice infekčních virových, bakteriálních, mykotických a parazitárních onemocnění, v prena tální a postnatální diagnostice dědičných chorob s mendelovskou i nemen delovskou dědičností, v diagnostice nádorových chorob a v identifikaci (DNA typizaci) osob pro účely transplantační nebo forenzní. DNA a RNA diagnostika vyžaduje nový způsob myšlení i práce. Schopnost detekovat několik málo molekul sledované látky patřila vždy ke snům a cílům chemi ků analytiků. Dnes je možné měřit několik kopií některé DNA sekvence lid ského genomu amplifikací například pomocí PCR. I pro ty, kteří pracovali s velmi citlivými metodami a měřili množství v pikomolech a attomolech (10 18 mol, tj molekul), jsou chemické testy pro nukleové kyseliny skokem v analytickém myšlení ve smyslu množství. Jedná se o překlenutí propasti mezi attomoly a dvěma molekulami. Pro tyto účely byly zavedeny dvě nové jednotky pojmenované zeptomol (10 21 mol) a yoctomol (10 24 mol). Samozřejmě, že neexistuje 1 yoctomol, protože sama Avogadrova konstanta je 6,023 x 10 23, takže 1 molekula má hodnotu 1,7 yoctomol. Právě tyto jednotky jsou potřebné pro rozsah měření používa ný při PCR. Byl také vytvořen termín PCR mentalita popisující nutnou změnu ve stylu myšlení při práci v oblasti analytiky nukleových kyselin. PCR je proces, kdy z několika málo kopií jedné molekuly (sekvence nukleotidů) získáme milion i více násobek. Příprava vzorku je kritickým bodem. Je nutno zajistit, aby amplifikovaná molekula byla právě jen ta sle 7

8 dovaná a nikoliv jiná, zavlečená do reakce náhodně. Opakovatelnost a kon trola kvality (positivní a negativní kontroly) jsou základními podmínkami DNA a RNA analýzy. Od roku 1869, kdy Miescher poprvé izoloval nukleovou kyselinu z bí lých krvinek obsažených v hnisu, dosáhla biochemie supramolekulárních lá tek mimořádného pokroku. Nukleové kyseliny představují molekuly, které se stávají důležitým cílem laboratorní analýzy. Z tohoto důvodu klinické (servisní a výzkumné) laboratoře potřebují jednoduché a spolehlivé analy tické metody. Analytické postupy v molekulární biologii obecně používají metody centrifugační, metody extrakce a purifikace DNA (RNA), elektroforetické, hybridizační a amplifikační metody. Tyto metody se v praxi vzájemně překrývají. Nástrojem těchto metod jsou enzymy, jejichž biologické funkce jsou použity pro specifické reakce in vitro (orientačně viz tabulka na násle dující straně). Základní zvláštní přístrojové vybavení klinické molekulárně biologické laboratoře tvoří např. chlazená centrifuga, termocyklery, termo stat, vany pro horizontální agarosovou a vertikální polyakrylamidovou elek troforézu, zdroj napětí, UV transiluminátor, fotografická kamera, hybridi zační pece, sušička gelů, izotopové pracoviště. 8

9 9 Enzymy běžně používané v molekulárně biologické laboratoři

10 Izolace a purifikace nukleových kyselin Principy izolace DNA vycházejí z chemických vlastností deoxyribo nukleové kyseliny: 1. fosfátové estery jsou silné kyseliny a chovají se jako anionty při neutrálním ph, 2. DNA se snadno precipituje alkoholem, 3. base jsou jen slabě basické a bez náboje, 4. vodíkové vazby mezi skupinami NH 2 a OH jsou stabilní od ph 4 do ph 9, 5. nukleové kyseliny mají maximum absorpce UV světla při 260 nm, jednovláknová DNA dává o 20 30% větší absorbanci než dvouvláknová, 6. DNA je mimořádně stabilní molekula a zaujímá obvykle konformace A, B, C nebo Z. K extrakci a purifikaci DNA z leukocytů ( ml plné krve s 5 mmol/l K 2 EDTA), amniových buněk a choriových klků se používá směs chloroform fenol s proteinasou K, guanidinhydrochlorid s proteinasou K, chloroform s chloristanem sodným v silikonové suspenzi a mnoho dalších. Odběr choriových klků se považuje za bezpečný od 10. týdne gravidity dále (časnější odběry nesou riziko amputací končetin plodu). Pro rutinní praxi klinické laboratoře (pro univerzální potřeby analytické a pro archivní potřeby uchovávání vzorků v DNA bance) je vhodnou me todou k izolaci DNA metoda s guanidinhydrochloridem (Sambrook et al., 1989; Shibata et al., 1994). Pro účely polymerázové řetězové reakce je mož no použít následující alternativní zdroje DNA pro její extrakci: a) izolace DNA z krevního odběru na novorozenecký screening fenylketonurie, b) izolace DNA ze vzorku buněk bukální sliznice získaných výplachem úst, c) izolace DNA z buněk vlasových kořínků. Vzorky žilní krve odebrané do zkumavek s K 2 EDTA uzavřeného systému by měly být zmraženy nejpo zději do 3 hodin po odběru a skladovány při teplotě 70 C. Metoda izolace DNA s guanidinhydrochloridem je založena na následu jícím postupu (Průša et al., 1996): hemolýza vodou, centrifugace k získání 10

11 leukocytů, cytolýza pomocí detergentu, centrifugace k získání jader, homo genizace peletu s guanidinhydrochloridem vychlazeným na 4 až 6 C a s octanem amonným na třepačce, lýza jader pomocí dodecylsulfátu sodného a deproteinace proteinasou K, inkubace při 37 C nebo 57 C, precipitace ethanolem, solubilizace v 1 ml TE pufru, reprecipitace, kontrola koncentra ce a čistoty. Iminomočovinové (guanidinové) soli jsou velmi silné chaotrop ní látky a působí jako denaturační činidla mimořádně účinně (Zolfaghari et al., 1993). Chemicky se jedná o aminomethanamidinhydrochlorid, o relativ ní molekulové hmotnosti 95.53, [HN=C=(NH 2 ).HCl]. Izolace RNA se provádí ultracentrifugací v prostředí CsCl po destrukci buněčných membrán guanidin thiokyanátem. RNA vytvoří pelet, DNA a proteiny zůstanou nad vrstvou CsCl. Jinou metodou je extrakce guanidin thiokyanátem s fenolem v prostředí nízkého ph. Existuje řada komerčních kitů, některé jsou založeny na využití polyadeninového řetězce mrna. Etanolový precipitát RNA se uchovává při 20 C, vodný roztok při 70 C. Izolovaná neporušená celková RNA dává při kontrole elektroforetickou separací v agarosovém gelu dva pruhy: 28S rrna a 18S rrna. Měření koncentrace a čistoty získaného vzorku DNA a RNA. V běžné praxi se používají dvě metody. Jestliže je vzorek čistý, tj. neob sahuje významné množství nečistot jako jsou bílkoviny, fenol, agarosa, pak spektrofotometrické měření v UV světle je jednoduché a přesné. Jestliže je množství DNA nebo RNA velmi malé (<25 mg/l) nebo vzorek obsahuje vý znamné množství nečistot, pak koncentrace nukleových kyselin může být zjištěna z intenzity fluorescence emitované ethidiumbromidem srovnáním se vzestupnou řadou standardních vzorků DNA o koncentraci od 0,5 50 mg/l. Touto metodou je možno zjistit tak malé množství jako je 1 5 ng DNA. Při spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou. Měří se při vlnových délkách 260 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané poměry jsou 1.8 pro DNA a 2.0 pro RNA. Poměr 11

12 absorbancí 260/280 menší než 1,75 svědčí pro obsah kontaminujících bílko vin. V případě vyššího obsahu nečistot se provede reprecipitace vzorku. Optická hustota 1 odpovídá přibližně 50 mg/l pro ds DNA, 40 mg/l pro ss DNA a RNA, 20 mg/l pro oligonukleotidy. Dále by měla následovat kon trola celistvosti získané DNA elektroforézou a fotografií gelu na UV trans iluminátoru (0,8% agaróza, 100 V, asi 1 hodinu) po obarvení ethidiumbro midem. Výtěžek DNA z 5 ml krve činí obvykle mg/l. K automatizaci provozu klinické molekulárně genetické laboratoře byly vyvinuty komerční kity pro izolaci DNA (RNA) a jednoduché UV spektro fotometry pro kvantifikaci oligonukleotidů, RNA a DNA s automatickou kalkulací. Od roku 1987 je možno provádět izolaci DNA pomocí automatic kého extraktoru nukleových kyselin. Jsou to například přístroje jedné ame rické firmy, jejichž automaty používají metodu chloroform fenolové extrak ce s proteinasou K. RFLP (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů) Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleasami na fragmenty. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Je známo velké množství bakteriálních restrikčních endonukleas (asi 1500), které se liší od sebe tím, že rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů 4, 6, 8 a že štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bazí a podle rozpoznané sekvence. Za daných podmínek vzniká reprodukovatel ný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí). Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Některé restrikční endonukleasy jsou citlivé na methylaci DNA. V některých případech methylace adeninu a methylace cytosinu inhibují štěpení, v jiných je methylace pro štěpení nezbytná. Odlišení různých DNA se provádí na 12

13 základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst. Obecně restrikční endonukleasy, které rozpoznávají kratší sekvenci, štěpí DNA častěji na menší úseky, zatímco restrikční endonukleasy rozpoznávají cí delší sekvenci štěpí méně často a na delší fragmenty. Při neúplném (par ciálním) štěpení DNA vlivem nevhodných reakčních podmínek vznikají del ší úseky (například velký obsah bílkovin, nevhodná teplota, nedostatečná doba). Hvězdičkové štěpení (tzv. star aktivita enzymu) je způsobeno nespecifickým štěpením mimo rozpoznávací místa. Vzniká tak mnoho krát kých úseků. Tento analyticky nepříznivý stav může být způsoben například nadbytkem glycerolu v reakci. Proto nelze zvyšovat koncentraci restrikční ho enzymu v reakci zvyšováním použitého objemu, ale použitím stejného objemu enzymu ze zásoby o vyšší koncentraci. Příklady restrikčních endonukleas a jejich specifických restrikčních míst: MwoI (Methanobacterium wolfei), inkubační teplota = 60 C: 5...GCNNNNN.NNGC CGNN.NNNNNCG...5 DdeI (Desulfovibrio desulfuricans), inkubační teplota = 37 C: 5...C.TNAG GANT.C...5 HaeIII (Haemophilus aegyptius), inkubační teplota = 37 C: 5...GG.CC CC.GG

14 Znalost restrikčních endonukleas citlivých na methylaci (např. enzymy HpaII a EagI štěpí pouze nemethylovanou DNA) má široké uplatnění napří klad v X inaktivačních studiích pro diagnostiku aktivního a neaktivního chromozomu X u řady onemocnění (např. Wiskottův Aldrichův syndrom, mukopolysacharidosa typu II). Klinický význam má studium náhodné a nenáhodné inaktivace v různých buněčných populacích. Test se provádí ve dvou reakcích. Kromě RFLP se pro DNA diagnostiku a pro studium příbuzenských vztahů (například průkaz otcovství) hojně využívá polymorfismu repetitiv ních úseků DNA VNTR (variabilní počet tandemových opakování). Tak například pro chromozom X se používá sondy M27 beta (EcoRI, MspI, PstI), pro chromozom 15 sondy CMS620 (HinfI), CMW 1 (TaqI), pro chromozom 7 sondy MS31 (HinfI). Zatímco při RFLP jsou jednotlivé alely charakterizovány velikostí získa ných fragmentů v závislosti na přítomnosti variabilního restrikčního místa, při VNTR jsou jednotlivé alely charakterizovány buď velikostí fragmentu v závislosti na počtu repetic nebo intenzitou (množstvím) při štěpení, které oddělí jednotlivé repetice. Princip RFLP (Cílová DNA obou chromosomů 1 a 2 je štěpena restrikční endonukleasou v pravidelném restrikčním místě a a variabilním místě á.) Obraz na gelu po elektroforetické separaci: 14

15 Princip VNTR (Cílová DNA je štěpena podle počtu opakování dané sekvence restrikční endonukleasou v místě a za vniku dvou různě dlou hých fragmentů nebo jinou restrikční endonukleasou v místě b za vzni ku odlišné intensity proužku.) Obraz na gelu po elektroforetické separaci: Hybridizaèní metody Významnou metodou je hybridizace získaných fragmentů DNA s jinou molekulou DNA komplementární a značenou sondou. Hybridizace se provádí na pevných nosičích, na kterých je polynukleotid vázán a je součas ně schopen hybridizace, přestože kinetika této reakce je pomalá a relativně málo efektivní. Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří dot, blot a slot hybridizace, Southernův přenos, hybridizace RNA (northern blotting) a hybridizace in situ. Imobilizace vzorků se provádí nejčastěji na membrány z nitrátu celulosy nebo nylonu. Přenosu DNA na pevný nosič předchází depurinace, alkalická denaturace a neutralizace. Přenos se uskuteční buď prostou difuzí na podkladě kapilárních sil nebo za pomoci vakua nebo půso bením elektrického proudu (electroblotting). Malé fragmenty (do 1500 bp) se přenesou na membránu při použití difuze kapilární silou do 2 hodin, větší fragmenty (nad 15 kb) vyžadují i více než 15 hodin. Permanentní fixa 15

16 ce na membránu se docílí např. působením UV světla. Vlastní hybridizace znamená reasociaci příslušných dvojic bazí podle specifického pořadí nuk leotidů se sondou značenou radioaktivním nebo neradioaktivním markerem. Jde buď o úseky DNA (dvou nebo jednovláknové) klonované pomocí bakte riálního vektoru nebo syntetické oligonukleotidy. Méně často se používají tzv. ribosondy (crna). Senzitivita hybridizace závisí na čtyřech hlavních faktorech: délce (počtu bazí) a komplementaritě sondy, koncentraci sondy (a potlačení nespecifických vazeb), specifické aktivitě sondy dané aktivitou (koncentrací) navázaného markeru, koncentraci testované DNA přenesené a fixované na membráně. Potlačení nespecifických vazeb (např. prehybridi zací se sonifikovanou lososí spermatickou DNA nebo prehybridizací sondy se sonifikovanou lidskou DNA) dovoluje vyšší koncentraci sondy při dodr žení hybridizačních podmínek teploty, koncentrace solí aj. Reakční směs a kinetika hybridizační reakce jsou stanoveny obvykle empiricky. Po hybridi zační reakci ve speciálním inkubátoru s termostatem následuje vymývání pufrem SSC o různé koncentraci (1 x SSC: 0.15 mol/l NaCl, mol/l citrát trojsodný). Dot, blot a slot hybridizace. Názvy jsou odvozeny od tvaru jednotlivých vzorků nanesených na membránu: dot velmi pravidelný okrouhlý tvar, slot velmi pravidelný protáhlý tvar, blot ručně nanesený vzorek více méně ná hodného tvaru. Reverzní blotting spočívá v tom, že na membránu je naopak nejprve fixována sonda a potom teprve hybridozována s DNA z vlastního zkoumaného vzorku. Southernův přenos a hybridizace RNA (northern blotting). Tyto me tody jsou zvláštní tím, že přenosu fragmentů DNA nebo RNA na membránu a následné hybridizaci předchází elektroforetické rozdělení. Elektroforetické separaci obvykle ještě předchází štěpení restrikční endonukleasou. Tato metoda dává dvojí informaci: interpretuje po vizualizaci proužků např. auto radiograficky nebo kolorimetricky jednak přítomnost a jednak velikost nukleové kyseliny, která hybridizovala s aplikovanou specifickou sondou. Northern blotting a hybridizace se používají nejčastěji k hodnocení úrovně genové exprese konkrétních mrna, a proto kvantifikace nebo semikvanti 16

17 fikace se provádí k referenční kontrolní hybridizační sondě (např. aktin). In situ hybridizace. Tato metoda je založena na tom, že hybridizace pro bíhá v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromozomech, kte ré jsou fixovány na mikroskopickém sklíčku. Demonstruje se genetická informace v morfologickém kontextu a metoda sdružuje standardní světel nou mikroskopii s detekcí hybridizace. Hybridizaci se značenou sondou mů že předcházet amplifikační reakce (nepřímá in situ PCR). Přímá in situ PCR inkorporuje marker vázaný na oligonukleotidový primer nebo na dntp přímo. Následuje obvykle detekce protilátkou a vizualizace. Celý proces může být automatizován. Příkladem je metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace). Velmi speciální metodou je analogicky přímá a nepřímá in situ RT PCR (reverzní transkripce a amplifikace cdna), která využívá vlastností rekombinantní rtth DNA polymerasy. Reverzní transkripce Detekce a analýza molekul RNA patří k důležitým molekulárně biolo gickým postupům. Molekuly mrna se podílejí pouze 1 2% na celkovém množství izolované RNA (převážnou část tvoří rrna). Adaptace amplifi kačních technik umožňují relativně snadnou analýzu mrna tím, že po re verzní transkripci následuje amplifikace cdna např. pomocí PCR. RT PCR je velmi hodnotná metoda k analýze genové exprese, k detekci infekčních agens, k detekci genetických nemocí (eliminují se introny, poskytuje infor mace o alternativním sestřihu). Mezi používané reversní transkriptasy patří MLV, AMV, Tth. Reversní transkriptasy M MuLV (z Moloneyho myšího leukemického viru) a AMV (z ptačího myeloblastického viru) jsou schopny syntetizovat cdna až do 10 kb, zatímco bakteriální termostabilní Tth DNA polymerasa jen do 2 kb. Reversní transkriptasa Tth na rozdíl od dvou před chozích nemá aktivitu RNasy H a vyžaduje navíc Mn +2 kationty v reakci. 17

18 Optimální reakční teploty se liší: M MuLV = 37 C, AMV = 42 C, Tth = 65 C. Používají se tři typy primerů: specifické oligonukleotidy pro syntézu vybrané určité mrna, směs náhodných hexanukleotidů a oligo(dt) Schopnost uskutečnit reversní transkripci a PCR v jedné re akci a v jedné zkumavce je jedinečnou výhodou enzymu Tth, protože se pod statně snižuje riziko kontaminace a celá procedura se zjednodušuje. Amplifikaèní metody 1) Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii. Jedná se o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Saiki et al., 1988; Schutzbank et al., 1993; White et al., 1992). Dvouvláknová DNA je nejprve denaturována na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA. Nukleotidová sekvence cílové DNA nemusí být známa, ale musí být známé alespoň sekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované DNA. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují na obou stra nách cílové DNA, řídí syntézu nových vláken. Jejich syntézu katalyzuje ter mostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus) od 5 konce ke 3 konci vždy začínající od primerů. Během prvního cyklu syntéza nového vlákna pokračuje dále až za sledovanou sekvenci, ale následné cykly již amplifikují převážně pouze úsek mezi dvěma vybranými sondami (primery). Některé termostabilní DNA polymerasy (případně jejich kombinace v reakci) umožňují amplifikaci fragmentů až 5000 bp, jiné uměle upravené se aktivují až při působení teploty 95 C po dobu 10 minut. 18

19 Přehled termostabilních DNA polymeras a jejich charakteristika podle exonukleasové aktivity: Reakční podmínky: l Reakční objem je obvykle mezi 20 a 100 ul. l Množství templátové DNA potřebné pro PCR je mezi 1.0 a ng. l Oligonukleotidové primery jsou syntetizovány tak, aby hybridizovaly s komplementární sekvencí na obou vláknech dubletu DNA; jsou obvykle nukleotidů dlouhé. Potřebné množství každého pro jednu reakci je pmol. Jejich optimální koncentrace v reakci je mezi 0.1 až 1.0 µmol/l. GC:AT poměr byl měl být 1:1. Primer by neměl obsahovat oblasti bohaté na AT a GC. Primery by neměly být mezi sebou komplementární, ze jména ne na 3 konci, kde překrytí dvou nebo tří basí může způsobit vznik 19

20 dimeru primerů, zejména při nadbytku primeru. Může tak vzniknout nežá doucí produkt PCR, např. z 2x20 bp primerů se amplifikuje 40 bp fragment. Někdy vznikají problémy se sekundární strukturou, zejména u primerů bo hatých na GC. V tom případě jsou vhodné primery delší, např bp. Výpočet 50 pmol oligoprimeru se provádí podle vzorce: Y µl primeru = 50 pmol/z, kde Z (x10 6 mol/l) = 1/X x Abs(260nm) x Dil.f., kde X = Axn + Cxn + Txn + Gxn, kde koeficienty nukleotidů jsou: A=15200, C=7050, T=8400, G=12010, n je počet příslušného nukleotidu v sekvenci primeru, Abs je optická hustota oligonukleotidového primeru v UV světle při 260 nm a Dil.f. je diluční faktor. l dntp, deoxynukleotidtrifosfáty, optimálně 200 µmol/l každý, toleranční rozpětí 20 až 400 µmol/l. l Mg +2, optimálně 4 mmol/l, toleranční rozpětí mmol/l, vyšší kon centrace snižují specificitu, ale u primerů bohatých na GC je vyšší koncentrace lepší. Závisí také na použité metodě izolace DNA. l Taq DNA polymerasa, optimálně 1 2 U pro každou reakci, toleranční rozpětí U, vyšší koncentrace zvyšuje pravděpodobnost amplifikace chybně hybridizovaných primerů (pozadí). Porfyriny, heparin, methanol a detergenty inhibují její aktivitu. l PCR pufr obsahuje µmol/l Tris HCl, maximálně 50 µmol/l KCl, případně acetamid, albumin, želatinu nebo Tween 20. Teplotní fáze reakčního cyklu: a) denaturace optimálně při 95 C, toleranční rozpětí C, pro fragmenty do 1 kb 15 sekund, pro větší fragmenty minutu, b) hybridizace optimálně podle denaturační teploty duplexu templátové DNA s primerem minus 12, obvykle mezi 50 C a 55 C, nízká teplota podstatně snižuje specifitu, vysoká teplota zamezí amplifikaci, c) syntéza obvykle mezi 70 C a 74 C, pro fragmenty do 1 kb

21 minuta, pro úseky 6 10 kb je potřebná doba až 15 minut, pro primery bohaté na obsah GC je někdy vhodná teplota 80 C. Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí Každá reakce s tes tovaným vzorkem musí mít positivní kontrolu, slepou (negativní kontrolu) a interní kontrolu probíhající amplifikace. Významnou inhibici PCR způsobují erytrocyty (například primárně hemolyzovaná krev). Takový vzorek vyžaduje odstranění inhibitorů nebo jejich neutralizaci. Jednoduchá metoda je založena na využití iontoměničo vé pryskyřice (např. kopolymer styren divinylbenzenu) Chelex 100, která váže dvojmocné ionty (Miffin et al., 1994; Shibata et al., 1994). Princip polymerázové řetězové reakce (tři fáze 1. cyklu) 21

22 Zkušenosti s PCR poukázaly na nutnost zavedení technik, které minima lizují kontaminaci amplikonem (produktem PCR). V praxi je běžné použí vat negativní kontrolu a slepou (reakční směs bez cílové DNA). Jedna pre ventivní metoda k zabránění kontaminace je založena na využití dutp mís to dttp v reakční směsi PCR. Bakteriální enzym uracil N glykosylasa de graduje DNA obsahující uracil. Jenom fragmenty DNA pocházející z PCR budou degradovány, protože normální DNA uracil neobsahuje. Uracil N glykosylasa je přidána do reakční směsi před zahájením amplifikační reak ce, aby všechny případné amplikony byly včas degradovány. Samotný en zym je pak inaktivován při prvním denaturačním cyklu, takže nové produk ty PCR se již mohou akumulovat v reakční směsi. Jiná metoda je založena na přidání derivátu psoralenu do směsi na začátku reakce. Psoralen neinter feruje s amplifikací a je stabilní během teplotních cyklů. Zkumavky jsou po ukončení reakce ještě před otevřením vystaveny UV světlu. Interakce mezi formami isopsoralenu a pyrimidiny neovlivňuje hybridizaci, ale zabraňuje následné amplifikaci DNA polymerasou. Další běžnou metodou je používá ní speciálních pipet a pipetovacích špiček s filtrem. Rozsáhlé diagnostické využití repetitivních sekvencí DNA je umožněno aplikacemi PCR metod, např. AFLP (délkový polymorfismus amplifikova ných fragmentů). Repetitivní sekvence jsou označované podle svých speci fik jako VNTR (variable number of tandem repeats), STR (short tandem repeats), (CA) n, mikrosatelity (Epplen, 1992). V lidském genomu je přibliž ně (dc da) n.(dg dt) n. Jedná se o podskupinu STR, běžně označovanou (CA) n. Využívají se např. v diagnostice příbuzenských vztahů, delecí genů nebo ztráty heterozygocie. Nested PCR. Amplifikuje se nejprve úsek, kde templátem je genomická DNA. Následuje další PCR zv. nested reakce, kde templátem je produkt reakce předcházející. Pro první reakci se použije první sada oligonukleotidů, v druhé, nested reakci se použijí oligonukleotidy, které jsou navrženy pro fragment získaný jako produkt první PCR. Tato oblíbená modifikace má řadu aplikací, některé vystačí se sadou pouhých tří primerů. 22

23 Analýza heteroduplexů se používá k detekci mutací genetických onemocnění stále častěji. Metoda je jednoduchá a citlivá. Principem metody je skutečnost, že heteroduplexy, které se tvoří po amplifikaci u heterozygo tů, migrují v agarosovém gelu pomaleji než homoduplexy. Když amplifiko vané fragmenty ze dvou odlišných alel (mutace, polymorfismus) spolu hyb ridizují, vytvářejí dva homoduplexy a dva typy heteroduplexů. Za vhodných hybridizačních podmínek vznikají všechny čtyři druhy duplexů v ekvimo lárním poměru. Detekce separovaných fragmentů v gelu se provádí barve ním ethidiumbromidem nebo stříbrem. V některých případech se využívá tzv. generátoru heteroduplexů, tj. molekuly DNA upravené mutagenesou. Asymetrická PCR je modifikace PCR, která umožňuje preferenční syntézu jenom jednoho vlákna z duplexu DNA tím, že jeden z primerů je v nadbytku. Jako produkt PCR tak vzniká jednovláknová DNA vhodná např. pro sekvenování. Jinou modifikací je SSPR (single strand producing reaction), která je ještě specifičtější. Tato metoda se také vhodně kombinuje s nested PCR. Multiplexová reakce je velmi výkonná metoda PCR k testování mnoha delecí a bodových mutací v jedné amplifikační reakci, v jednom elektrofo retickém dělení v agarose a obvykle s detekcí značením ethidiumbromidem. Nejsložitější je fáze přípravná, kdy je nutno vypracovat takové reakční pod mínky (sekvence nukleotidů, koncentrace primerů, optimální teploty jedno tlivých kroků cyklu atd.), aby amplifikační reakce pro každý testovaný úsek genomické DNA neprobíhala pouze v případě, že se jedná o mutaci v tom kterém příslušném místě. Pro každou reakci je zařazena pozitivní a negativ ní kontrola. Například v DNA diagnostice delecí v oblasti genu pro dystro fin multiplexová reakce pro oblast 3 konce testuje 11 různých exonů a pro oblast 5 konce 7 exonů najednou. Prakticky to znamená, že místo dříve pro váděných 18 samostaných amplifikací, se provedou reakce pouze dvě (Abbs et al., 1991). 23

24 Pro přímou detekci známých bodových mutací je vhodná metoda hybri dizace s ASO (s alelově specifickými oligonukleotidy). Produkty polymerá zové řetězové reakce se rozdělí elektroforeticky např. v 1% agarosovém gelu. Pak následuje denaturace a dvojité blotování z gelu, který je umístěn mezi dvě nylonové membrány. Denaturační roztok slouží jako přenosový pufr. Fixace DNA k membránám se provede v UV světle expozicí 1 minutu na transiluminátoru. Následuje hybridizace s alelově specifickými oligo nukleotidy (normální a mutantní), které jsou označeny vhodným detekčním systémem, například na 5 konci α32 P (ATP) pomocí T4 polynukleotidkina sy. Za určitých hybridizačních podmínek se dosáhne situace, kdy jediný chybný pár bazí mezi sondou a analyzovanou DNA zabrání hybridizaci. Bezchybně komplementární úseky spolu naopak hybridizují výborně. Po hybridizaci se provede vymývání a detekce proužků například autoradio graficky. CMC (chemical mismatch cleavage) je metoda štěpení heteroduplexů piperidinem v místě mutace chybně spárovaných bazí, které jsou che micky modifikované hydroxylaminem a OsO 4. Následuje separace fragmen tů, která se obvykle provádí pomocí denaturační PAGE. Jinou příbuznou modifikací je EMC (enzymatic mismatch cleavage). AS PCR (alelově specifická PCR). Pro detekci bodových mutací a ma lých delecí se často používají metody PCR, které využívají tzv. alelově spe cifické oligonukleotidy jako primery. Tyto metody prodělaly v posledních letech vývoj od hybridizačních technik, přes dot blot analýzu, nested PCR až po metody, které vystačí s detekcí fragmentů v agarosovém gelu s ethidium bromidem po elektroforetickém dělení. Alelově specifická dot blot hybridi zace je časově náročná a vyžaduje hybridizaci s radioaktivně značenou son dou. Využití alelově specifické PCR ukázal poprvé Olerup et al. (1991) na detekci subtypů HLA. 24

25 Princip reakce AS PCR a ARMS Princip hodnocení AS PCR a ARMS (s = společný, n = normální, m = mutantní primer) 25

26 Amplifikační refrakční mutační systém (ARMS) je metoda detekce jakékoliv mutace v rozsahu záměny jednoho nukleotidu nebo malé delece. Jedná se o variantu AS PCR (alelově specifické PCR). Metoda je jednodu chá, spolehlivá, neizotopová a jasně rozliší heterozygota ve sledovaném lokusu od homozygotů pro jednu nebo druhou alelu (Ferrie et al., 1992). Systém je založen na pozorování, že DNA/DNA hybridy pospojované mis matched (nedokonalé spárování) na jejich 3 konci nejsou vhodnými substráty pro působení Taq DNA polymerasy. Toto důležité pozorování bylo využito a byl vyvinut systém diferenciální amplifikace. ARMS test se skládá ze dvou samostatných reakcí, z nichž jedna je specifická pro normál ní DNA sekvenci a druhá pro sekvenci s mutací. Do jednoduchého ARMS testu musí být zařazena vnitřní PCR kontrola, aby byla jistota, že amplifi kační reakce probíhá správně. Také je možné kombinovat několik ARMS reakcí do jednoho multiplexového (několikanásobného) ARMS testu. Pozitivní kontroly není třeba, smísí li se 4 nebo více testů a jsou li současně ARMS reakce kombinovány tak, aby musel vždy vzniknout alespoň jeden reakční produkt v obou reakčních mixech. Vlastní polymerázová řetězová reakce probíhá na termocykleru v běžném provedení. ARMS metoda byla úspěšně aplikována například k detekci mutací v oblasti genu pro cystickou fibrosu. Byla vyvinuta multiplexová varianta, která simultánně analyzuje DNA vzorek pro čtyři nejběžnější mutace CFTR genu. Reakce A identifikuje CFTR geny, které nemají mutaci F508 a G21+1G>T nebo které mají mutaci G551D a G542X, zatímco u reakce B je tomu právě naopak: identifikuje mutantní sekvenci F508 G21+1G>T a normální sekvenci v oblastech G551D a G542X. PSM (PCR mediated site directed mutagenesis) je metodou, která umožňuje identifikaci specifických alel umělou změnou sekvence během PCR tak, že dojde k vytvoření nového nebo k zániku původního restrikční ho místa pro restrikční endonukleasu. Metoda je založena na nepřesné hyb ridizaci sondy s genomickou DNA. Sekvence je modifikována tak, že jeden 26

27 z primerů se v jednom nukleotidu liší a hybridizuje s templátem v blízkosti zkoumané mutace. Amplifikace oblasti s takto uměle vytvořenou mutací vede k inkorporaci záměny nukleotidu do výsledného produktu PCR. Po štěpení příslušným restrikčním enzymem a elektroforetické separaci se iden tifikují jednotlivé alely. Metoda byla úspěšně aplikována např. v detekci mutací CFTR genu, genu pro LDL receptor, genu pro fenylalaninhydroxyla su. Jako příklad je uveden princip detekce mutace R1443X v tumor supre sorovém genu BRCA1. Tato mutace je výsledkem tranzice C T v nukleotidu a způsobuje záměnu argininu ve stop kodon. Zavedení restrikč ního místa AlfIII do produktu PCR mutantní alely vede ke vzniku fragmen tů 180 a 17 bp. Nemutovaná alela se neštěpí a produkt PCR zůstává 197 bp dlouhý. Příklad zavedení nového restrikčního místa pro AlfIII do produktu PCR: RACE je metoda rychlé amplifikace cdna konců pomocí PCR (Innis et al., 1990). Nejprve se syntetizuje cdna reverzní transkripcí z mrna. Je to metoda amplifikace cdna, kdy syntéza probíhá směrem k 5 nebo 3 kon ci. Musí být známa část sekvence některého exonu. Amplifikace 5 konců vyžaduje purifikaci prvotní cdna a ukončení řetězce terminální transfera sou za vzniku druhého poly(a) konce. Kombinací se pak získá celá plno hodnotná cdna. 27

28 2) Ligázová řetězová reakce (LCR, LAR) LCR je metoda amplifikace DNA určená k detekci stopových množství DNA o známé sekvenci. LCR je dvoufázová cyklická reakce (Barany, 1991; Wu et al., 1989). V první fázi se za vysoké teploty (95 C) cílové molekuly dvouvláknové DNA rozvinou na jednovláknové. V druhé fázi (70 C) se dvě sady (2x2) komplementárních oligonukleotidů přiloží (hybridizují) k cílo vým jednovláknovým molekulám a termostabilní ligasou jsou spolu spoje ny. Produkty ligázové reakce z jednoho cyklu slouží jako templát (podklad) pro následující reakci cyklu. Používají se Tth DNA ligasa izolovaná z Thermus thermophilus a Pfu DNA ligasa z Pyrococcus furiosus. LCR je alternativní amplifikační technika, která může mít některé přímé výhody oproti PCR. Při PCR často vznikají nespecifické amplifikační pro dukty, které znesnadňují interpretaci výsledků. Toto pozadí (amplifikační artefakty) vzniká tím způsobem, že se oligonukleotidové sondy přikládají (hybridizují) k oblastem jak úplné, tak částečné sekvenční homologie s původní templátovou DNA. Rozlišení PCR produktů vyžaduje separaci pomocí elektroforézy, někdy izolaci z gelu a následné určení sekvence amplifikovaných úseků. Naopak molekuly amplifikované pomocí LCR jsou pouze ty, kde se zcela přesně a správně přiložily oligonukleotidové sondy k homologním úsekům templátové DNA. V případě, že se jedna oligonuk leotidová sonda pro LCR označí například biotinem kovalentní vazbou a druhá například alkalickou fosfatasou, pak se amplifikace i detekce obje vují současně. Elektroforéza nebo sekvenování nejsou nutné. Z těchto důvo dů je LCR také vhodnější k automatizaci než PCR a má větší specificitu. Některé metody kombinují PCR s LCR, takže polymerasa a ligasa jsou pří tomny v jedné reakci současně. 28

29 3) Qß replikasová reakce (Kramer et al., 1992) RNA bakteriofág Qß využívá RNA polymerasu k replikaci svého geno mu. Qß replikasa nepotřebuje oligonukleotidový primer k iniciaci syntézy RNA, ale rozpoznává vysoce organizovanou oblast RNA genomu jako iniciátoru. Jednovláknová molekula RNA je vhodným templátem pro Qß replikasu. To umožňuje in vitro exponenciální vzestup počtu kopií RNA. Denaturace není potřeba k iniciaci další replikační reakce. Enzym Qß replikasa je velmi rychlý a výkonný: jedna molekula templátu je amplifiko vána na kopií za minut při 37 C. V praxi je nejprve sonda hyb ridizací navázána na Qß templát. Po hybridizaci se provede amplifikace. Aplikace metody jsou limitovány požadavkem na absolutní specificitu hyb ridizace sondy. Jakékoliv hybridizační pozadí vede k snadné amplifikaci ja kéhokoliv produktu. 4) 3SR amplifikační reakce (self sustained sequence replication; Fahy et al., 1991; Gingeras et al., 1990) 3SR reakce využívá kolektivního účinku reverzní transkriptasy (např. z ptačího myeloblastového viru), RNasy H (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerasy. K syntéze cdna se používá hybridní primer, který obsahuje cílovou specifickou oblast a nehybridizující konec s promotorem pro T7 RNA polymerasu. Výsledná kopie cdna má na jednom konci tento promotor. RNasa H degraduje RNA v RNA/DNA hybridu. T7 RNA poly merasa syntetizuje podle DNA mnoho kopiií RNA, které jsou následně opět cílem pro reversní transkriptasu, která syntetizuje další cdna. Všechny reakce probíhají při stejné teplotě. Reakční činidla jsou v koncentracích tak, aby umožnily akumulaci produktu. K dalším amplifikačním reakcím patří reakce cyklující sondy (cycling probe reaction; Duck et al., 1990) nebo modifikace jako např. transkripční 29

30 amplifikační reakce (TAS, isothermal transcription based amplification reaction; Guatelli et al.,1990), NASBA (nucleic acid sequence based amplification). Elektroforetické metody Produkty restrikčních nebo amplifikačních reakcí (fragmenty DNA) se dělí podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti náboje elektrofo rézou DNA fragmentů v gelu (Sambrook et al. 1989). Sacharido fosfátová páteř nukleových kyselin je příčinou rovnoměrného rozložení negativních nábojů v mokelulách DNA a RNA. Pohyb těchto vysoce elekronegativních molekul v elektrickém poli vede k jejich separaci podle molekulové hmot nosti. Větší dělící mohutnosti pro rozdělení velkých fragmentů (až 5000 kb) lze docílit použitím elektroforézy v pulzujícím poli (PFGE). Právě analýza velikosti fragmentů je podstatou interpretace řady molekulárně biologických metod. Nejčastěji se používá jako elektroforetické medium agarosa ( %), jejíž koncentrace se volí podle velikosti fragmentů, které mají být separovány (orientačně viz tabulka). Mnoho aplikací používá horizontální elektroforézu (např. U= V, I = ma) a gel je uložen ve svém lůžku ponořen do pufru (TE, TBE, TAE). Nejběžnější aplikace používají dvě velikosti gelů, např. 12 x 20 cm 30

31 a 5 x 9 cm, což představuje přibližně 4.5, resp. 9 V/cm. Nanášení vzorku ( µg DNA) na start do jamek předchází smíšení s nanášecím pufrem obvykle v poměru 1:4 nebo 1:5, který obsahuje barvu viditelného spektra (na př. bromfenolová modř 0.5 g/l, 400 g/l sacharosa, 20 mmol/l EDTA). Rozdělené frakce je možné buď přenést na speciální membrány (fólie) tzv. blotováním a podrobit hybridizaci nebo pomocí fluorescenčních barviv např. ethidiumbromidem interkalací mezi nukleotidy (50 µg/100 ml ge lu) vizualizovat na transiluminátoru v UV světle s následnou fotodokumenta cí. Krokový žebříček po 50 nebo 100 bp (Step ladder) nebo jiné PCR markery se používají jako kalibrační škály molekulové hmotnosti (velikosti fragmentů). PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza). Druhým nejčastěji používaným elektroforetickým médiem v molekulární biologii je poly akrylamidový gel (denaturační, obvykle s ureou, nebo nedenaturační). Jedná se o vertikální elektroforézu. Směs akrylamidu a bisakrylamidu polymerizu je při pokojové teplotě v pufru (TAE) pomocí volných radikálů poskytova ných persulfátem amonným (APS), který způsobuje homolytické štěpení vazeb O O. K urychlení polymerizace se používá volná zásada TEMED (tetrametylendiamin), který katalyzuje tvorbu volných radikálů persulfátu amonného. Jiným užívaným iniciátorem polymerizace je riboflavin, který je účinný již ve velmi nízkých koncentracích 5 10 ng/l. Polymerizace se neuskuteční při nízkém ph nebo za přístupu O 2. Konečné koncentrace TEMEDu a APS v polymerizačním roztoku by měly být 0,05 %. Použitá koncentrace akrylamidu se liší podle velikosti separovaných fragmentů DNA od 3.5% (fragmenty 1 2 kbp) až po 20% gely pro separaci malých fragmentů bp. Metoda analýzy SSCP (jednovláknového konformačního polymorfismu, zvaná též SSCA) je jednoduchou, velice senzitivní a efektivní technikou k detekci mutací typu záměny jedné baze (Hayashi et al., 1991). Metoda je založena na principu různé migrace jednovláknových molekul DNA, které se liší svou sekundární strukturou (konformací) v nativním (nedenaturač 31

32 ním) polyakrylamidovém gelu (obvykle 6%, typicky 0.4 mm silný, v TBE pufru). Unikátní konformace jednovláknového fragmentu DNA je dána intramolekulárními interakcemi uvnitř DNA sekvence. Tato konformace je závislá na teplotě a iontové síle. Teplota při elektroforéze je klíčovým para metrem, který ovlivňuje kvalitu rozlišení DNA proužků. Již tak malý rozdíl jako je záměna jedné baze způsobí změnu konformace a rozdílnou pohybli vost při elektroforéze za dodržení podmínky nedenaturace. Rozdíl v konfor maci může tedy být způsoben odlišností pouze jediné baze v sekvenci DNA. Tato vysoce citlivá technika zachycuje 100% mutací v DNA fragmentech menších než 200 bazí a 80% mutací v DNA fragmentech menších než 400 bazí. Optimální velikost PCR produktu je 150 bazí pro detekci mutací, větší PCR produkty jsou vhodné ke sledování polymorfismů. Potřebné zařízení: vhodný zdroj napětí, zařízení pro sekvenační gelovou elektoforézu (20 ma, pokojová teplota) a případně chlazení (45 ma, 4 C). Princip SSCP (SSCA) ds DNA (stejná velikost, odlišná sekvence) 32

33 DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza) je metoda, která umožňuje separaci DNA molekul v polyakrylamidovém gelu na základě od lišné sekvence (liší se v jednom nukleotidu). Gel obsahuje lineární gradient formamidu a močoviny. Dvouvláknová DNA putuje rychlostí určenou její molekulovou hmotností až do doby, než vstoupí do té části gelu, kde je ta ková koncentrace denaturačních látek, že způsobí denaturaci dsdna na jed novláknové molekuly. Tím se výrazně změní její pohyblivost. Konečná po zice fragmentu DNA v gelu závisí tedy na denaturačním bodu (melting). Fragmenty identické velikosti mohou být takto separovány na základě odlišné sekvence v gelech s gradientem denaturačního činidla. Gely mají fixní koncentraci akrylamidu (akrylamid : bisakrylamid = 37,5 : 1) v TAE pufru s lineárním gradientem denaturačního činidla (100% = 40% formamid a 7 mol/l urea). Používají se dva typy DGGE: paralelní gely, v kterých se zvyšuje koncentrace denaturačních činidel lineárně od shora dolů ve dvou samostatných paralelních gelech (první 10 50%, druhý 40 80%); perpendikulární gely, v kterých se zvyšuje koncentrace denaturačních čini del lineárně zleva doprava napříč gelem. Paralelní gely jsou vhodné k vyšet ření několika vzorků, perpendikulární gely mají na startu jednu jamku přes celý gel pro jeden vzorek. Nejčastěji používaná strategie je vyšetření klíčo vého vzorku v perpendikulárním gelu a potom ostatní vzorky z rodokmenu v gelu paralelním. Obvykle používaná koncentrace akrylamidu v této apli kaci je 6 8%, separuje se při konstantní teplotě 60 C, při 150 V po dobu 6 10 hodin. Detekce se provádí barvením stříbrem nebo ethidiumbromidem. Denaturačního gradientu lze docílit také gradientem teplotním (metoda TGGE). Kapilární elektroforéza. Jedná se o alternativní metodu separace frag mentů DNA, která má tyto výhody: minimální spotřeba vzorku (1 2 nl o koncentraci 5 50 mg/l), rychlost, snadná vizualizace. Separace probíhá v lineárním hydrofilním polymeru v kapiláře (vnitřní průměr µm, délka několik cm až 1 m) a elektroforetickém pufru podle molekulové hmot nosti. Elektroendosmosa se využívá k zavedení vzorku a dále je eliminová 33

34 na použitím kapilár se speciální úpravou vnitřního povrchu. K zařízení je připojena přímá detekce měřením absorbance při 260 nm. Typická analýza trvá méně než 20 minut. Pro separaci jednovláknové DNA se používá pufr obsahující ureu (7 mol/l). Systém umožňuje jednoduché změny ve složení pufru. Metody detekce Po označení nukleových kyselin následuje fáze detekce a případně kvan tifikace. Značení DNA se provádí metodami enzymatickými nebo přímou chemickou vazbou. V obou skupinách rozlišujeme značení radioaktivní a značení neizotopové. Enzymatické metody umožňují značení homogenní nebo značení pouze 3 nebo 5 konců. K radioaktivní detekci se používají nukleotidy značené těmito izotopy: Neizotopové enzymatické systémy značení dosahují stejné citlivosti jako radioaktivní a jsou vhodné pro automatizaci. Nejpoužívanější systémy detekce jsou např.: a) biotin protilátka enzym substrát b) biotin streptavidin enzym substrát c) sulfonová skupina protilátka enzym substrát d) digoxigenin protilátka enzym substrát e) fluorescenční detekční systém (např. rhodamin). 34

35 Ve všech těchto systémech se používá některý z chromogenních, chemi luminiscenčních nebo fluorescenčních substrátů a enzym je konjugován s protilátkou nebo s avidinem. Používají se alkalická fosfatasa, peroxidasa, glukosidasa, beta galaktosidasa. Velmi citlivý způsob detekce je bionylace nukleových kyselin a následná specifická reakce s modifikovaným avidinem (konstanta afinity K = mol). Bionylace se provádí arylazidovým derivátem biotinu s ná slednou fotoaktivací. Vzniká vysoce reaktivní skupina, která umožní kova lentní vazbu biotinu s nukleovou kyselinou. Hybridizace in situ vyžaduje někdy navíc inaktivaci endogenního biotinu (např. v hepatocytech). Také některé metody přímého značení založené na fyzikálních a chemic kých principech vazby s nukleovou kyselinou jsou hojně používány. Mezi tyto systémy patří značení ethidiumbromidem, radioaktivním jodem nebo barvení stříbrem. Možná je také kovalentní vazba enzymů na nukleovou kyselinu. Příkladem je zesílený chemiluminiscenční detekční systém. DNA se značí přímo peroxidasou, která působí za přítomnosti H 2 O 2 na luminol, zesílení signálu se provádí pomocí derivátů fenolu (například 4 iodofenol). Emitované světlo se detekuje na fotografickém filmu nebo se měří na lumi nometru. Řada detekčních systémů umožňuje různé sestavy a ve spojení s ampli fikační reakcí jsou tyto metody vhodné pro automatizaci. Porovnání vybraných metod vhodných pro detekci neznámé mutace: 35

36 Sekvenování nukleových kyselin Určení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNA o několika stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo xynukleotidová, ddntp reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenová ní na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze synté zou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynuk leotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Sekvenační 5% polyakrylamidový gel je denaturační (např. 7 mol/l urea), obvykle 0.3 mm silný, separační vzdálenost 50 cm, TBE pufr. Parametry zdroje pro separač ní rychlost asi 100 bazí za hodinu jsou 60 W (1900 V, 45 ma). Moderní se kvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení termináto rů reakce (ddntp), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, opti mální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specia lizovaný software. 36

37 PTT test (protein truncation test) PTT je moderní metoda (popsána poprvé v roce 1993) k detekci mutací, které vedou ke vzniku předčasného stop kodonu a tím k předčasnému ukon čení translace. Od ostaních metod se liší tím, že detekce mutací se provádí na úrovni proteinů. Metoda umožňuje analýzu relativně velkých fragmentů genů (2 3 kb) a detekuje výlučně patologické mutace, které vedou k neúpl ným bílkovinám, přičemž ignoruje např. polymorfismy. Některá onemocně ní jsou způsobena v % mutacemi, které vedou výlučně ke zkrácené mu produktu translace (např. gen pro dystrofin, tumor supresorové geny BRCA1 a HNPCC). Obvyklé provedení tohoto testu spočívá nejprve v amplifikaci příslušné části genomické DNA (případně mrna) pomocí PCR (případně RT PCR), přičemž jeden primer obsahuje startovací ATG kodon, T7 promotor a Kozakovu sekvenci. Následuje transkripce PCR pro duktu do RNA pomocí T7 RNA polymerasy a potom konečně translace např. pomocí lyzátu retikulocytů. Zkrácené proteiny jsou separovány elektroforeticky v SDS polyakrylamidovém gelu podle své molekulové hmotnosti a detekovány např. barvením stříbrem. Jiné snadné a citlivé de tekce se docílí, když se při translaci použijí trna, které nesou lysin znače ný biotinem. Po SDS PAGE produktů translace označených biotinem se pro vede western blotting na membránu např. z nitrátu celulosy. Použitím systé mu strepravidin peroxidasa a luminol iodophenol se chemiluminiscence de tekuje expozicí na film. Kompletní PTT test z produktu PCR trvá přibližně 6 hodin. Místo T7 promotoru se někdy používá promotoru SP6 nebo T3 a příslušné fágové RNA polymerasy. 37

38 Nové metody K nově vyvíjeným metodám patří minisekvenování, DNA (genové) chi py, strand displacement amplification, PCR pouch, NASBA, TaqMan, bran ched DNA, CFLP (cleavase fragment length polymorphism) a jiné. Nejvíce perspektivní se jeví metody, které integrují do jednoho homogenního systé mu amplifikaci a detekci s průběžným měřením (např. fluorescence) a vy hodnocováním již během PCR v termocykleru. Jednou z nových perspektivních technik jsou prostorově adresné oligo nukleotidové matice DNA čipy. Tyto matice jsou připraveny in situ pomo cí fotolitografie a chemické syntézy oligonukleotidů na pevném např. skle něném nosiči. Umožňují na principu alelově specifické oligonukleotidové hybridizace opakované a rychlé testování buď prosté přítomnosti nebo sekvenační analýzy fluoresceinem značených nukleových kyselin. Inku bační (hybridizační) fázi může podle potřeby předcházet amplifikace testo vané cílové DNA pomocí PCR. Hustota oligonukleotidové matice a její in formační kapacita je limitována prostorovým rozlišením v jakém mohou být jednotlivé oligonukleotidové sekvence na čipu imobilizovány, syntetizovány a hlavně nakonec detekovány po hybridizaci. Tak vysoce prostorově citlivé detekce intenzity emitované fluorescence bylo dosaženo speciálním lasero vým scannerem (epifluorescence confocal scanning microscopy). V součas nosti dosahované rozlišení 20 µm umožňuje umístění různých oligonukleotidových sekvencí na plochu cm 2. Toto rozlišení je dosta čující např. k úplnému sekvenování 16 kb mitochondriálního genomu. Metoda využívající bdna je amplifikační metodou zvláštní v tom, že po reakci s cílovou detekovanou DNA (RNA) probíhá amplifikace signálu a nikoliv templátu. Amplifikace se docílí použitím syntetických větvených oligonukleotidů. Tato metoda se používá např. k detekci a kvantifikaci virové 38