Česká zemědělská univerzita v Praze. Charakterizace genetických zdrojů chmele pomocí molekulárně genetických metod

Transkript

1 Česká zemědělská univerzita v Praze Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra genetiky a šlechtění Charakterizace genetických zdrojů chmele pomocí molekulárně genetických metod Disertační práce Vedoucí práce: Doc. Dr. Ing. Pavel Vejl Školitel specialita: Ing. Vladimír Nesvadba Ph.D. Autor práce: Ing. Jakub Vašek

2 Poděkování: Na výsledné podobě této disertační práce se různou měrou podílela řada lidí, kterým bych rád touto formou poděkoval. Jedná se především o pracovníky Katedry genetiky a šlechtění České zemědělské univerzity v Praze. Jmenovitě bych rád poděkoval panu Doc. Dr. Ing. Pavlu Vejlovi za odborné rady, podmětné návrhy a připomínky během celého doktorského studia. Dále bych rád poděkoval paní Ing. Daniele Čílové a slečně Ing. Šárce Vašíčkové za neocenitelnou pomoc při uskutečňování řady molekulárních analýz a korektorskou činnost. Rovněž bych chtěl poděkovat panu Ing. Petru Sedlákovi Ph.D. a paní Ing. Vladimíře Sedlákové za odborné rady a diskuse ohledně statistických analýz. V neposlední řadě můj dík patří paní Ing. Martině Melounové Ph.D. za vysoce kvalitní a odbornou překladatelskou a korektorskou činnost. Mé poděkování patří rovněž zaměstancům Chmelařského institutu s. r. o. v Žatci. Především panu Ing. Vladimíru Nesvadbovi Ph.D., Ing. Josefu Patzakovi Ph.D. a Ing. Karlu Kroftovi Ph.D. za poskytnuté vzorky planých a kulturních chmelů, údajů z chemických analýz a řadu upřesňujících informací. Dále paní Bc. Aleně Henychové a paní Bc. Zdeňce Polončíkové za poskytnutí morfologických dat, ověření správnosti seznamů chmelů a za pomoc při odběru vzorků.

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Charakterizace genetických zdrojů chmele pomocí molekulárně genetických metod vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiložené bibliografii. V Praze dne : 2

4 . ÚVOD CÍLE PRÁCE PŘEHLED LITERÁRNÍCH POZNATKŮ CHMEL (HUMULUS LUPULUS L.) SYSTEMATIKA CHMELE CHARAKTERISTIKA A MORFOLOGIE POHLAVÍ A CYTOLOGIE ANALÝZY CHMELE POMOCÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH METOD Fylogeneze chmele Identifikace a studium variability chmele Určení pohlaví chmele Tvorba genových map a QTL analýzy MIKROSATELITY TANDEMOVĚ REPETITIVNÍ DNA ELEMENTY KLASIFIKACE Schematické řazení mikrosatelitů Nomenklatura satelitní DNA Struktura mikrosatelitních sekvencí HISTORIE OBJEVU SATELITNÍ DNA VÝSKYT A ROZŠÍŘENÍ V GENOMU FREKVENCE MUTACÍ MIKROSATELITŮ MUTAČNÍ MECHANISMY Replikační sklouznutí...4 3

5 Rekombinace Mikrosatelity a transpozony GENEZE (PROTO-) MIKROSATELITŮ MUTAČNÍ MODELY FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ FREKVENCE MUTACÍ MMR (mismatch repair) systém Počet opakujících se motivů Další faktory MIKROSATELITY JAKO MOLEKULÁRNÍ MARKERY Výhody a nevýhody mikrosatelitních markerů Typy SSR markerů a jejich využití Chyby při genotypování u SSR markerů Nulové alely Velikostní homoplasie Netemplátové přidávání nukleotidů a koktavé produkty MATERIÁL A METODY OBECNÁ KONCEPCE KOMPLEXNÍ ANALÝZY MIKROSATELITŮ PŘIDÁVÁNÍ NETEMPLÁTOVÉHO A A KOKTAVÉ PRODUKTY VELIKOSTNÍ HOMOPLASIE NULOVÁ ALELA ROSTLINNÝ MATERIÁL IZOLACE DNA...6 4

6 4.4 PCR MIKROSATELITNÍ MARKERY Singleplex PCR Multiplex PCR MARKERY K IDENTIFIKACI POHLAVÍ ROSTLIN STS marker dle Polley et al. (997) STS markery dle Danilova et al. (6) SSR marker dle Jakše et al. (7) ELEKTROFORETICKÉ METODY AGAROZOVÁ ELEKTROFORÉZA AKRYLAMIDOVÁ ELEKTROFORÉZA SSR metoda SSCP metoda KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA Příprava vzorků Podmínky separace SEKVENACE DNA PURIFIKACE PŘED SEKVENAČNÍ REAKCÍ SEKVENAČNÍ REAKCE PURIFIKACE PO SEKVENAČNÍ REAKCI SEKVENACE ANALÝZA A STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ DAT

7 5. VÝSLEDKY A DISKUZE OPTIMALIZACE SSR METODY TESTOVÁNÍ A OPTIMALIZACE PCR U SSR MARKERŮ OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY AKRYLAMIDOVÉHO GELU OPTIMALIZACE SSCP METODY OBECNÁ KONCEPCE SSCP ANALÝZY OPTIMALIZACE BARVENÍ ANALÝZA ZDROJŮ CHYB PŘI GENOTYPOVÁNÍ VELIKOSTNÍ HOMOPLASIE Lokus HlGT Lokus HlGT NULOVÁ ALELA Lokus HlGA Lokus HlGT Lokus HLC-2B Výskyt nulové alely VLASTNOSTNI STUDOVANÝCH LOKUSŮ TESTOVÁNÍ V RÁMCI ČELEDI CANNABACEAE VARIABILITA SSR LOKUSŮ VAZBOVÁ A SEGREGAČNÍ ANALÝZA Segregační analýza Vazbová analýza...9 6

8 5.5 CHARAKTERIZACE GENETICKÝCH ZDROJŮ DENTIFIKACE GENOTYPŮ DESKRIPTIVNÍ STATISTIKA STRUKTURNÍ ANALÝZA KOMPARATIVNÍ ANALÝZA Informace o chemických a morfologických datech Předúprava dat MDS a CLU ZÁVĚR SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY PŘÍLOHY SLOŽENÍ ROZTOKŮ BARVENÍ GELU POMOCÍ DICHROMANU DRASELNÉHO SEZNAM ODRŮD A NOVOŠLECHTĚNÍ VAR SKÓRE LOD SKÓRE IDENTIFIKACE PLANÝCH A KULTURNÍCH CHMELŮ EDA

9 Seznam obrázků Obr. 3.: Karyotyp samčí rostliny H. Lupulus...8 Obr. 3.2: Ukázka DAPI barvení a idiogram samčí a samičí rostliny H. Lupulus...8 Obr. 3.3: Haplotypy určené indely ve všech regionech cpdna...22 Obr. 3.4: Elektroforeogram markeru dle Polley et al. (997)...28 Obr. 3.5: Členění repetitivních elementů DNA...3 Obr. 3.6: Konformace DNA na základě různých typů repetitivních sekvencí...38 Obr. 3.7: Schéma replikačního sklouznutí...4 Obr. 3.8: Model DSB repair slippage...42 Obr. 3.9: Nerovnoměrný crossing-over sesterských chromatid...43 Obr. 3.: Faktory ovlivňující dynamiku mikrosatelitních lokusů...5 Obr. 4.: Schéma analýz mikrosatelitních lokusů...59 Obr. 5.: Marker HlGA Obr. 5.2: Výsledek křížového testu...76 Obr. 5.3: Test polymeráz pomocí teplotního gradientu...77 Obr. 5.4: Elektroforeogram SSCP gelu pro lokus HlGT...82 Obr. 5.5: Sekvence lokusu HlGT u genotypů Belg8,Belg84 a Belg Obr. 5.6: Elektroforeogram srovnání vzorků v lokusu HlGT9 na akrylamidovém gelu...85 Obr. 5.7: Elektroforeogram vybraných vzorků pro lokus HlGT9 na kapilární elektroforéze...86 Obr. 5.8: Sekvence genotypů Cau97 a Can8 v lokusu HlGT Obr. 5.9: Nulová alela u kanadských planých chmelů v lokusu HlGA Obr. 5.: Nulová alela u kombinačního křížení Kombinace v lokusu HlGA Obr. 5.: Porovnání sekvencí alely "" a "2" u odrůdy Vital pro lokus HlGA Obr. 5.2: Porovnání kvality původních a nových primerů u Kombinace v lokusu HlGT5...9 Obr. 5.3: Porovnání sekvencí alely 76 u odrůdy Vital a genotypu /5 pro lokus HLC-2B... Obr. 5.4: Porovnání proteinů na základě kompletní CDS genu HCH u mutované a původní alely...95 Obr. 5.5: Sekundární struktura proteinu na základě kompletní CDS genu HCH u mutované a původní alely...96 Obr. 5.6: Konzervativní domény CDS sekvence genu HCH podle conserved domain database...97 Obr. 5.7: Vazbová skupina 8... Obr. 5.8: Krabicové grafy pro HO a PIC spolu s výsledky Kruskal-Wallisovy ANOVy a MannWhitneyho U testu...7 Obr. 5.9: Krabicové grafy pro n spolu s výsledky Kruskal-Wallisovy ANOVy a Mann-Whitneyho U testu...8 Obr. 5.: Cattelův indexový graf vlastních čísel a grafy kompomentních vah pro PC Obr. 5.2: Graf komponentního skóre pro PC-2 s detaily jednotlivých skupin...23 Obr. 5.22: Graf komponentního skóre pro PC-2, PC-3 a CLU analýza...24 Obr. 5.23: Výsledek PCoA u 92 genotypů...27 Obr. 5.24: Shepardův diagram...33 Obr. 5.25: Zobrazení genotypů dle SSR, obsahových látek a morfologických údajů pro D Obr. 5.26: Zobrazení genotypů dle SSR na základě DA matice pro D Obr. 5.27: Zobrazení genotypů dle SSR na základě Euklidovských vzdáleností pro D Obr. 5.28: Zobrazení genotypů dle obsahových látek na základě Euklidovských vzdáleností...38 Obr. 5.29: Zobrazení genotypů dle morfologických deskriptorů na základě Euklidovských vzdáleností...39 Obr. 5.3: Podobnosti genotypů určené pomocí CLU pro SSR, obsahové látky a morfologické údaje...42 Obr. 8.: Hodnoty VAR skóre pro SSR markerů (.část)...75 Obr. 8.2: Hodnoty VAR skóre pro SSR markerů (2.část)

10 Obr. 8.3: Exploratorní analýza dat - PIC...85 Obr. 8.4: Exploratorní analýza dat HO...86 Obr. 8.5: Exploratorní analýza dat - n

11 Seznam tabulek Tab. 4.: Sekvence primerů k detekci nulové alely...62 Tab. 4.2: Teplotní profil singleplex PCR...63 Tab. 4.3: Kombinace pro multiplex PCR...65 Tab. 4.4: Sekvence primerů pro marker STS29 a STS Tab. 5.: Křížový test...76 Tab. 5.2: Hodnoty předpokládaných frekvencí nulové alely v jednotlivých lokusech...98 Tab. 5.3: Velikosti alel u druhu Humulus japonicus Sieb. & Zucc. a Cannabis sativa L. (.část)... Tab. 5.4: Velikosti alel u druhu Humulus japonicus Sieb. & Zucc. a Cannabis sativa L. (2.část)... Tab. 5.5: Výsledky segregační analýzy (.část)...6 Tab. 5.6: Výsledky segregační analýzy (2.část)...6 Tab. 5.7: Hodnoty LOD skóre pro samičí vazbovou mapu...9 Tab. 5.8: Hodnoty LOD skóre pro samčí vazbovou mapu...9 Tab. 5.9: Vazbové skupiny... Tab. 5.: Shodné genotypy v kolekci genobanky - pouze pro plané...3 Tab. 5.: Hodnoty heterozygotnosti pozorované (HO)...4 Tab. 5.2: Hodnoty polymorfního informačního indexu (PIC)...5 Tab. 5.3: Počty alel na lokus (n)...5 Tab. 5.4: Vícenásobné porovnání p-hodnot pro počet alel (n)...9 Tab. 5.5: Hodnoty CC a delta pro jednotlivé shlukovací metody...26 Tab. 5.6: Hodnoty stress, D* a D^ pro zvolený počet dimenzí...3 Tab. 5.7: Hodnoty CC a delta pro jednotlivé shlukovací metody...4 Tab. 8.: Seznam odrůd a novošlechtění...73 Tab. 8.2: Hodnoty LOD skóre pro samičí vazbovou mapu...77 Tab. 8.3: Hodnoty LOD skóre pro samčí vazbovou mapu (.část)...78 Tab. 8.4: Hodnoty LOD skóre pro samčí vazbovou mapu (2.část)...79 Tab. 8.5: Hodnoty LOD skóre pro samčí vazbovou mapu (3.část)...8 Tab. 8.6: Shodné genotypy v kolekci genobanky - plané a kulturní chmely (.část)...82 Tab. 8.7: Shodné genotypy v kolekci genobanky - plané a kulturní chmely (2.část)...83 Seznam grafů Graf 5.: Závislost počtu alel na VAR skóre u hodnocených SSR markerů...3

12 Seznam zkratek 8S rdna = gen pro ribozomální 8S RNA 26S rdna = gen pro ribozomální 26S RNA AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphism (délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) ANOVA = Analysis of Variance (analýza rozptylu) AMOVA = Analysis of Molecular Variance (analýza molekulárního rozptylu) bp = base pair (pár bází) BSA = Bovine Serum Albumin (bovinní sérum albuminu) cdna = complementary DNA (komplementární DNA) CDS = Coding Sequence (kódující sekvence) cm = centimorgan cpdna = chloroplast DNA (chloroplastová DNA) cpssr = chloroplast SSR (chloroplastové SSR) DAPI = 4,6-diamidino-2-phenylindole (4,6-diamidino-2-fenylindol) DArT = Diversity Arrays Technology DMSO = dimethylsulfoxid (dimethylsulfoxid) DNA = deoxyribonucleic acid (deoxyribonukleová kyselina) dntp = deoxynucleotide-5 -triphosphate (generally) (deoxynukleotid-5 -trifosfát (obecně)) DSB = Double Strand Breakage (dvouvláknový zlom) EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid (kyselina ethylendiamintetraoctová) EST = Expressed Sequence Tags (exprimované sekvenční úseky) EST-SSR = Expressed Sequence Tags-Simple Sequence Repeats (mikrosatelitní exprimované úseky) ETS = External Transcribed Spacer (vnější transkribovaný mezerník) FPPS = Farnesyl Pyrophosphate Syntase (farnesyl pyrofosfát syntáza) FISH = Fluorescent in situ Hybridization (fluorescenční in situ hybridizace) GS = Genetic Similarity (genetická podobnost) gssr = genomic SSR (genomický mikrosatelit) GUS = gen pro β-glukuronidázu HE = Heterozygosity expected (heterozygotnost očekávaná) HO = Heterozygosity observed (heterozygotnost pozorovaná) HOMOVA = Homogeneity of Molecular Variance (homogenita molekulárního rozptylu) CHS = Chalcone Synthase (chalkon syntáza)

13 IAM = Infinite Allele Model (model nekonečného počtu alel) IGS = Intergenic Spacer (intergenový mezerník) indel = Insertion/Deletion (inzerce/delece) ISSR = Inter Simple Sequence Repeat ITS = Internal Transcribed Spacer (vnitřní transkribovaný mezerník) KAM = K-alleles model (K-alelový model) kb = kilobase (kilobáze) LG = Linkage Group (vazbová skupina) LOD = Log of the Odds Ratio (logaritmus poměru pravděpodobnosti) MAS = Marker Assisted Selection (markery asistovaná selekce) Mb = megabase (megabáze) MDS = Multidimensional Scaling (vícerozměrné škálování) mini-me = microsatellite initiating mobile elements ML = Maximum Likelihood (maximální věrohodnost) MMR = Mismatch Repair (system) (opravný systém) mrna = messenger RNA (mediátorová RNA) MSI = Microsatellite Instability mtdna = mitochondrial DNA (mitochondriální DNA) NMMDS = Non-Metric Multidimensional scaling (nemetrické varianta MDS) nt = nucleotide (nukleotid) PCA = Principle Component Analysis (analýza hlavních komponent) PCoA = Principle Coordinate Analysis (vícerozměrné škálování), synonymum pro metrické MDS PCR = Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) PIC = Polymorphism Information Content (polymorfní informační index) PVP = Polyvinylpyrrolidone (polyvinylpyrrolidon) QTL = Quantitative Trait Locus (loci) (lokus/lokusy kvantitativních znaků) RAPD = Randomly Amplified Polymorphic DNA (náhodná amplifikace polymorfní DNA) rdna = ribosomal DNA (ribozomální DNA) RFLP = Restriction Fragment Lenght Polymorphism (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) RNA = Ribonucleic acid (ribonukleová kyselina) SH = Size Homoplasy (velikostní homoplasie) SINE = Short Interspersed Element (krátký roztroušený element) SMM = Stepwise Mutation Model (krokový mutační model) SNP = SIngle Nucleotide Polymorphism (jednobodový polymorfismus) 2

14 SSCP = Single Strand Conformation Polymorphism (jednovláknový konformační polymorfismus) SSM = Single Strand Mispairing (chybné spárování jednoho vlákna) SSR = Simple Sequence Repeat (sekvenčně jednoduché repetice), synonymum pro STR stdna = satellite DNA (satelitní DNA) STR = Short Tandem Repeat (krátká tandemová repetice) STS = Sequence Tagged Site (sekvenčně specifické místo) T DNA = transfer DNA (transferová DNA) TBE = tris-borate-edta buffer (tris-borátový pufr) TD-PCR = Touchdown-PCR TE = Transposable Element(s) (transponovatelný (-é) element (-y)) TMA-oxalate = Tetramethylammonium-oxalate (tetramethylammonium-oxalát) TNR = Trinucleotide Repeat (trinukleotidové opakování) TPM = Two-Phase model (dvoufázový model) TRIS = tris(hydroxymethyl)aminomethane (tris(hydroxymethyl)aminomethan) UTR = Untraslated region (3 či 5 nepřekládaná oblast) VNTR = Variable Number Tandem Repeat (variabilní počet tandemových repetic) VPS = Valerophenone Synthase (valerofenon syntáza) 3

15 . ÚVOD Chmel (Humulus lupulus L.) je zcela nepostradatelnou rostlinou pro pivovarnický průmysl, neboť právě on dodává pivu jeho typickou chuť a vůni. Rovněž v posledních letech narůstá zájem o využití chmele k farmaceutickým účelům, který je způsobený znovuobjevením, vezmeme-li v potaz jeho využití v tradiční medicíně, léčivých účinků řady chemických látek obsažených především v chmelových hlávkách. Šlechtění chmele má v Čechách bohatou tradici a řadu let bylo prováděno pouze na základě pozitivního výběru v porostech nejznámější české odrůdy - žateckého poloraného červeňáku. České šlechtitelství dosud zaostává za celosvětovým šlechtitelským trendem, který je zaměřen na tvorbu nových hybridních odrůd chmele, třebaže v posledním desetiletí došlo v této oblasti k značnému pokroku. Pomocí tradičních šlechtitelských nástrojů trvá vytvoření nové odrůdy 8 až let, protože řada biologických vlastností chmele (dvoudomost, vysoký stupeň heterozygotnosti aj.) šlechtitelský proces znesnadňuje. Vzhledem k této skutečnosti není možné flexibilně reagovat na neustále se měnící požadavky trhu a spotřebitelů. Proto došlo k několika změnám vedoucích k zlepšení a urychlení procesu novošlechtění. První zásadní změna se týká získávání velkých kolekcí planých chmelů, které mohou být vzhledem k vysoké variabilitě donory řady cenných vlastnostní. Tímto způsobem může být zvýšena odolnost vůči abiotickým a biotickým stresům nebo změněno spektrum chemických látek u stávajících kultivarů. Druhou změnou je aplikace molekulárně-genetických metod a molekulárních markerů, které usnadňují výběr perspektivních genotypů s požadovanými vlastnostmi. 4

16 2. CÍLE PRÁCE Vypracování této disertační práce je založeno na několika hypotézách, které jsou shrnuty v následujících bodech: Základem šlechtitelského procesu je shromáždění co nejvariabilnějšího genetického materiálu pro zvýšení šance na vytvoření nové odrůdy s požadovanou vlastností či vlastnostmi. Tento materiál je nezbytné klasifikovat pomocí objektivních kritérií, aby bylo možné pro šlechtění vybírat pouze perspektivní genotypy Dříve používané anatomicko-morfologické popisy a deskriptory nejsou dostatečně přesné a schopné zhodnotit důležité charakteristiky. Z tohoto hlediska se jeví vhodnější metody založené na molekulárně-genetických markerech, které mají řadu předností díky kterým jsou užitečným nástrojem k posouzení jednotlivých genotypů Jedním z cenných zdrojů variability jsou i plané chmele shromažďované v genobankách. Mohou se stát donory genů resistence nebo sloužit k zlepšení či změně spektra hospodářsky významných látek obsažených v chmelových hlávkách. Na základě těchto předpokladů byly stanoveny následující cíle práce: Zavést a optimalizovat novou metodu analýzy pomocí mikrosatelitních markerů v rámci Katedry genetiky a šlechtění ČZU v Praze. SSR metoda byla zvolena na základě vysoké spolehlivosti a přesnosti Eliminovat či alespoň snížit množství chyb běžně vznikajících během mikrosatelitních analýz a zvýšit tak vypovídací schopnost studie a přesnost získaných informací Získat podrobné informace o struktuře a vlastnostech studovaných lokusů chmel. Charakterizovat genetické zdroje chmele genobanky Chmelařského institutu s.r.o. v Žatci pomocí DNA markerů a určit jejich genetickou podobnost a variabilitu Jednoznačně identifikovat každý genotyp a nalézt případné duplicity v genové bance. 5

17 3. PŘEHLED LITERÁRNÍCH POZNATKŮ 3. CHMEL (HUMULUS LUPULUS L.) 3.. SYSTEMATIKA CHMELE V současné době je rod chmel (Humulus L.) řazen do čeledi konopovité (Cannabaceae) řádu kopřivotvaré (Urticales Dumortier). Do čeledi konopovitých je kromě rodu Humulus L. také řazen rod konopí (Cannabis L.) se kterým sdílí chmel mnoho společných znaků. Neve (99) uvádí, že při opylení chmele pylem z konopí dochází ke stimulaci tvorby šištic (cones), ale vznikají pouze nevyvinutá embrya. V rámci rodu Humulus L. Neve (99) rozlišuje tři druhy chmele a to Humulus lupulus L. (chmel otáčivý), Humulus japonicus Sieb. et Zucc. (chmel japonský) a Humulus yunnanensis Hu (chmel junnanský). Na základě morfologicko-anatomických vlastností a podle geografických oblastí uvádí Small (978) pět variet u Humulus lupulus L., třebaže proti tomuto rozdělení vznášejí někteří autoři námitky (Rybáček et al., 98; Neve, 99). Jedná se o: ) Humulus lupulus ssp. lupulus planý a kulturní chmel rostoucí v Evropě, který byl postupně rozšířen do celého světa 2) Humulus lupulus ssp. neomexicanus (Nels. et Cockerell) (chmel novomexický) americký chmel vyskytující se v západní části Severní Ameriky 3) Humulus lupulus ssp. pubescens (E. Small) rovněž americký chmel nacházející se především ve střední části Severní Ameriky 4) Humulus lupulus ssp. lupuloides (E. Small) poslední z amerických variet, která se vyskytuje především ve východní části Severní Ameriky společně s výše uvedenými 5) Humulus lupulus ssp. cordifolius (Miquel) (chmel srdčitolistý) tato varieta se vyskytuje ve východní Asii, především na japonských ostrovech. Rybáček et al. (98) navrhl rozdělení druhu Humulus lupulus L. na tři poddruhy a to H. lupulus ssp. neomexicanus (Nels. et Cockerell), H. lupulus ssp. cordifolius (Maxim) a H. lupulus ssp. europeus (Ryb.), které se odlišují především v utváření spojených pohlavních chromozómů. Dále Rybáček et al. (98) u poddruhu europeus rozlišuje tři variety a to chmel zakrslý (var. irenae minima Blatt.), planý (var. spontanea Ryb.) a kulturní (var. culta Ryb.). Toto členění však v současné vědecké literatuře není příliš používáno a obecně je akceptováno výše uvedené rozdělení dle Small (978). 6

18 3..2 CHARAKTERISTIKA A MORFOLOGIE Chmel (Humulus lupulus L.) je dvoudomá, vytrvalá a popínavá bylina. Její bezúponková lodyha se pravotočivě pne po jakékoliv dostupné podpoře, přičemž uchycení jí usnadňují křemičité háčky (hooked hairs). Réva dorůstá až do výšky 9 m a dosahuje tloušťky,7,3 cm. Nadzemní část rostliny, která zahrnuje révu, révové listy, pazochy, květenství a hlávky, každoročně odumírá. Listy rostou vstřícně párovitě z jednotlivých nodů na révě. Listy nabývají různého tvaru v závislosti na vegetační době a příslušné varietě nebo kultivaru. Tvar listů se pohybuje od srdčitého do sedmilaločného, u dospělých rostlin se nejčastěji vyskytují listy troj až pětilaločné. Samčím květenstvím je lata. Samičí květenství po rozvinutí tvoří hustá šišticová květenství složená z až 6 kvítků. Podzemní část rostliny je tvořena tzv. babkou a kořenovým systémem. Babka je víceletý základ chmelové rostliny, jejíž součástí jsou pupeny, z kterých každoročně vyrůstají základy budoucí lodyhy (Rybáček et al., 98; Neve, 99). Hospodářsky se využívají pouze rostliny samičího pohlaví. Zpracovává se jejich květenství tzv. šištice, které obsahují chmelové pryskyřice a silice dávající pivu hořkost a chuť (Neve, 99). Charakteristický profil z chemických komponent v chmelových šišticích závisí na odrůdě chmele. Existuje okolo odrůd chmele rozšířených po celém světě, které jsou pěstované ploše 8 hektarů (Patzak, 2). Chmel se rozmnožuje vegetativně (čehož se využívá komerčně) i generativně. Generativní způsob je využit při šlechtění chmele. 7

19 3..3 POHLAVÍ A CYTOLOGIE Za použití metod fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a barvící techniky DAPI se podařilo identifikovat u chmele druhu H. lupulus všechny somatické i pohlavní chromozomy (Karlov et al., 3). V této studii bylo zjištěno, že H. lupulus má jakožto diploidní rostlina 2n = chromozomů a z toho pár heteromorfních pohlavních chromozomů. Ukázky karyotypu samčí rostliny H. lupulus a idiogramu H. lupulus jsou na obr. 3. a 3.2. Shepard et al. () uvádí odlišný počet chromozomů u blízce příbuzného H. japonicus, kdy samičí rostlina má 6 (2n = 4 + XX) a samčí rostlina 7 (2n = 4 + XYY2) chromozomů. O cytologii H. yunnanensis není nic známo (Neve, 99). Obr. 3.: Karyotyp samčí rostliny H. Lupulus Vysvětlivky: karyotyp samčí rostliny chmele sestavený z mitotických chromozomů s dobře patrným párem heteromorfních pohlavních chromozomů (označených X, Y) (upraveno dle Shepard et al., ) Obr. 3.2: Ukázka DAPI barvení a idiogram samčí a samičí rostliny H. Lupulus Vysvětlivky: (a) ukázka barvení DAPI u metafázových chromozomů samčí rostliny WH, šipky ukazují pohlavní chromozomy a bílý obdélník odpovídá měřítku o velikosti μm, (b) a (c) idiogramy chromozomů samčích a samičích rostlin chmele s vyznačeným DAPI barvením (modrá kolečka) a lokalizací tří rdna míst 8S-45S (zelený fluorescenční signál) a 5S (červený fluorescenční signál) (upraveno dle Karlov et al., 3) 8

20 Z výše uvedeného je patrné, že pro evropské plané chmely je typický výskyt heteromorfního páru pohlavních chromozomů, přičemž samičí pohlaví je homomorfní (XX) a samčí heteromorfní (XY). Nicméně Sinoto (929) popisuje u samčí rostliny planého chmele H. lupulus ssp. cordifolius čtyři pohlavní chromozomy. Systém pohlaví u této variety je pak udáván u samic jako X XX2X2 a u samců XYX2Y2. Jak uvádí Neve (99) podrobné cytologické studie prováděl Ono (955), který na základě analýzy velkého počtu samčích rostlin chmele odvodil existenci pěti různých typů pohlavních chromozomů identifikovatelných během samčí meioze. Souhrn těchto typů publikoval Neve (99), třebaže má pochybnosti, na základě vlastních analýz, o správnosti interpretace výskytu kvadrivaletních chromozomů, které popsal Ono a Sinoto. Typy pohlavních chromozomů během meioze jsou: typ Winge - heteromorfních pár s velikostním poměrem :5,2 a devíti bivalenty nový typ Winge - heteromorfní pár s velikostním poměrem :8 a devíti bivalenty typ Sinoto - kvadrivalent s velikostními poměry :2:4,2:7,2 a osmi bivalenty nový typ Sinoto - kvadrivalent s velikostními poměry :2,7:,9:3,4 a osmi bivalenty homotyp - deset bivalentů Zajímavým zjištěním je, že pohlaví pravděpodobně není určeno přítomností/nepřítomností Y chromozomu, ale silně koreluje s poměrem X:Y:A (A pro autozomy) jak uvádí Neve (99) na základě výsledků studia polyploidních rostlin ze své disertační práce (Neve, 96). Rovněž v článku o událostech vedoucích k evoluci pohlavních chromozomů Negrutiu et al. () používá chmel jako jednu z modelových rostlin a řadí ji mezi druhy, které mají tzv. X:A vztah. Z toho plyne, že pohlaví je určeno vztahem mezi X chromozomem a autozomy, a Y chromozom je bez většího vlivu na pohlaví a z tohoto hlediska postradatelný. Naopak Y chromozom hraje esenciálně nezbytnou roli ve vývoji života schopného pylu (Neve, 99). 9

21 3..4 ANALÝZY CHMELE POMOCÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH METOD Chmel je poměrně významnou hospodářskou plodinou, a proto je oblast výzkumu zaměřena především na možnosti jednoznačné identifikace kultivarů, určení genetické podobnosti a diverzity kultivarů a planých chmelů, zlepšení hospodářsky významných znaků, odolnost vůči chorobám a škůdcům a urychlení šlechtitelského procesu pomocí genetických markerů. Také bylo provedeno několik studií zaměřených na fylogenezi chmele a porovnání příbuzných rostlin čeledi Cannabaceae v rámci rodu, druhu či variety Fylogeneze chmele Studium historického vývoje a šíření rostlin rodu chmel (Humulus L.), stejně jako poznání rozdílů na úrovni inter- a intradruhové, má význam z hlediska poznání evoluce chmele a genetických vlastností tohoto druhu. Získané informace mají hodnotu nejen per se, ale i z praktického hlediska při tvorbě nových odrůd. Pillay a Kenny (994) využili RFLP metodu k poznání rozdílů v chloroplastové DNA (cpdna) mezi druhy H. lupulus a H. Japonicus. K analýze použili kombinace 4 různých restričních enzymů a pět z nich použili k vytvoření restrikční mapy. Na základě této analýzy zjistili značnou podobnost v sestavených restrikčních mapách obou druhů, přičemž H. japonicus se od H. lupululus lišil ztrátou jednoho restrikčního místa pro enzym PstI. Rovněž detekovali 3 malé indely, každý o přibližné velikosti,8 kb. Chloroplastový genom chmele má velikost cca 48 kb a strukturou či uspořádáním se neliší od chloroplastů jiných krytosemenných rostlin (Pillay a Kenny, 994). Zjištěné rozdíly v chloroplastovém genomu jsou velmi malé v kontrastu s počtem chromozómů (H. lupulus 2n = ; H. japonicus 2n = 6 u samic a 2n = 7 u samců) a morfologií obou druhů a potvrzují jeho vysokou konzervativnost. Jiný počet chromozómů pravděpodobně souvisí s aneuploidií vedoucí ztrátě/zvýšení počtu chromozómů a k této události muselo dojít až po rozdělení druhů (Pillay a Kenny, 994). Stejný postup využívající RFLP aplikovali tito autoři při studiu struktury a dědičnosti genů pro ribozomální RNA (rdna) u kulturních a planých chmelů. Podařilo se jim získat dva velikostně odlišné fragmenty,3 a 9,3 kb způsobené pravděpodobně rozdílným počtem repetic v IGS (intergenic spacer) regionu (Pillay a Kenny, 996b), což později potvrdil Murakami (). Štěpením těchto fragmentů pomocí enzymu XhoI detekovali tři fenotypy (A, B a C) na základě rdna profilů. Typ A převládal u evropských planých a kulturních chmelů, typ B u severoamerických kultivarů a typ C se vyskytoval pouze u amerických planých chmelů. O deset let později Pillay a Kenny (6) porovnali strukturu rdna pomocí RFLP v rámci celé čeledi Cannabaceae. Zjistili vysoký stupeň podobnosti v kódujících oblastech mezi druhy H. lupulus, H.

22 japonicus a C. Sativa a potvrdili správnost taxonomického zařazení rodu Humulus L. a Cannabis L. do jedné čeledi. Přestože tyto tři druhy sdílejí mnoho společných restrikčních míst, bylo možné odlišit je díky variabilitě ribozomální DNA (Pillay a Kenny, 6). Velikost úseku rdna repetic byla 9,2 kb u H. japonicus,, kb u Sativa a,3 kb u H. Lupulus, přičemž nebyla detekována žádná vnitrodruhová variabilita (Pillay a Kenny, 6). Murakami (a) provedl sekvenční srovnání v několika regionech cpdna (fragment rbcl, nekódující oblasti, intron trnl a mezerník mezi trnl 3 exonem a trnf) a v místě ITS2 (internal transcribed spacer) regionu jaderné DNA. Rozdíly hodnotil nejen na úrovni druhů, porovnáním H. lupulus a H. japonicus, ale rovněž na úrovni jednotlivých variet, konkrétně H. lupulus ssp. lupulus, H. lupulus ssp. neomexicanus a H. lupulus ssp. cordifolius. Mezi těmito varietami byla detekována pouze jedna substituce (ze dvou celkových) v rbcl kódující sekvenci, která měla za následek změnu v typu aminokyseliny. Nicméně celková frekvence substitucí a nukleotidová variabilita se v rámci studovaných variet druhu H. lupulus statisticky významně nelišila. Detekované rozdíly mezi H. lupulus a H. japonicus už byly podstatně větší - 3 substitucí v rbcl, 9 v nekódujících oblastech a 24 v ITS2. Použitím frekvence nukleotidových substitucí o hodnotě 2, x -9 na nukleotid na rok v rbcl oblasti Murakami (a) odhadl, že ke speciaci těchto druhů došlo před 3,74 miliónem let. V pozdější studii (Murakami, 6b) však uvádí 6,38 milionů let, což je způsobeno použitím jiné hodnoty (,23 x -9) koeficientu pro frekvenci nukleotidových substitucí. Dalším sekvenováním, tentokrát IGS regionu ležícího mezi 8S a 26S rdna, zjišťoval Murakami () rozdíly mezi stejnými druhy a varietami chmele jako v předchozí studii (Murakami, a). Nalezl jak délkové, tak sekvenční rozdíly mezi jednotlivými skupinami. Velikost IGS u evropských kultivarů a planých chmelů byla 4,2 kb, u planých amerických a japonských 3,4 kb a u H. japonicus 3,2 kb. Uvnitř IGS oblasti nalezl Murakami () tři podtypy repetic (pojmenované A, B a C) s opakujícím se motivem o délce přibližně 44 bp, přičemž ani jeden z podtypů nebyl nalezen u H. japonicus. Podle rozdílného počtu opakujících se jednotek v každém podtypu bylo možné rozlišit evropské, americké a japonské chmely. Poté Murakami () provedl fylogenetickou analýzu na základě částečné ETS (external transcribed spacer) sekvence při které identifikoval dva haplotypy u evropských, tři u amerických a jeden u japonských chmelů společně s H. japonicus. Tvorba fylogenetického stromu na základě ML (maximum likelihood) metody ukázala tři možné topologie fylogenetického stromu mezi třemi analyzovanými varietami H. lupulus. Z tohoto poznatku Murakami () odvozuje, že k divergenci těchto variet došlo přibližně ve stejnou dobu. 2

23 Detailnější fylogenetickou analýzu uskutečnil Murakami et al. (6b) na 49 planých chmelech z celého světa a třech rostlin H. japonicus sloužících jako outgroup skupina. Při určování haplotypů, divergence a šíření chmele, porovnával IGS region na základě délky a sekvence, sekvenci úseku ETS dlouhou 537 bp a sekvence 2-ti nekódujících oblastí cpdna. Pomocí ETS haplotypů a kombinací dat z nekódujících cpdna regionů Murakami et al. (6b) určil, že primárně se plané chmely rozdělily na evropskou skupinu zahrnující i chmel z Kavkazu a Altaje a asijsko-americkou skupinu. K divergenci došlo pravděpodobně v Číně, což odvozuje Murakami et al. (6b) podle zařazení vzorků ze severní Číny k evropské skupině a vzorků z jižní Číny ke skupině asijsko-americké. Tento poznatek podporuje hypotézu o původu chmele právě v oblasti Číny (Small, 978; Neve 99), vycházející ze znalosti výskytu blízce příbuzných druhů H. japonicus a H. yunnanensis pouze ve východní Asii, přičemž H. yunnanensis je endemický druh vyskytující se pouze v čínské oblasti. K primárnímu rozdělení došlo před,5 až,27 milióny let. Později proběhlo další rozdělení na čínské, japonské a severo-americké chmele, které je datováno do doby před,46 až,69 milionem let, kdy muselo dojít k migraci chmele na severoamerický kontinent. Studie navíc ukázala výskyt tří haplotypů dle ETS a čtyř dle cpdna severoamerických chmelů, což podporuje představu o jejich vysoké diverzitě. Oprávněnost existence některých variet (Small, 978) tak byla prokázána i na molekulární úrovní. Na obr. 3.3 je příklad vzájemného propojení všech sedmi detekovaných haplotypů H. lupulus s umístěním H. japonicus. Toto propojení bylo vytvořeno na základě indelů větších než bp v cpdna pomocí metody reduced median network. Obr. 3.3: Haplotypy určené indely ve všech regionech cpdna Vysvětlivky: ine haplotyp zahrnující Evropu, Kavkaz a Altaj; insa, insa, insa2 a insa3 severoamerické haplotypy; injap. japonský haplotyp; injč jihočínský haplotyp; insč severočínský haplotyp; každý svislý pruh značí jeden indel (upraveno dle Murakami et al., 6b) Dalším zajímavým poznatkem bylo nalezení jediného haplotypu evropského chmele. Vysvětlením pro jeho výskyt od Altaje po Portugalsko je podle Murakamiho et al. (6b) rychlá expanze chmele v řádu stovek metrů ročně po poslední době ledové. 22

24 Identifikace a studium variability chmele Jednou z častých aplikací molekulárně genetických metod ve výzkumu chmele je jednoznačná identifikace jednotlivých genotypů chmele a určení stupně jejich genetické variability. Tyto poznatky mají svůj význam z hlediska ověření odrůdové pravosti (DNA profiling či fingerprinting) a novošlechtění. Identifikace odrůd byla dříve prováděna pomocí morfologických deskriptorů, případně chemických analýz. Nicméně tyto metody jsou ovlivněny podmínkami vnějšího prostředí, a proto zde významnou roli hraje vliv ročníku. Naopak metody využívající molekulárních markerů touto nevýhodou netrpí a (zejména) v současné době jsou vysoce spolehlivé a reprodukovatelné. V 9. letech minulého století byla hojně využívána metoda RAPD (Williams et al., 99), protože nevyžaduje primární znalost o sekvenci analyzovaných vzorků. Kupříkladu tímto způsobem Abbott a Fedele (994) otestovali dekamerických primerů a identifikovali -3 primerů, které vykazovaly polymorfismus alespoň mezi dvěma kultivary. Kombinací několika málo primerů (3) se jim podařilo identifikovat všech sedm porovnávaných kultivarů. Pillay a Kenny (996a) použili 6 RAPD primerů k vyhodnocení variability 24 genotypů chmele. Tito autoři konstatovali obecně nízkou variabilitu, protože pouze 8 primerů vykázalo polymorfismus. Navíc u tří z těchto markerů (A, A7 a C9) provedli segregační analýzu u potomků F generace pěti kombinačních křížení. Markery segregovaly podle očekávaných štěpných poměrů a byla potvrzena jejich aplikovatelnost ve šlechtitelských programech a při tvorbě genetických map. Molekulární analýza pomocí RAPD porovnávající 65 kultivarů z celého světa rozdělila chmely do dvou biogeografických zón evropské a americké (Šustar-Vozlič a Javorník, 999). Později Murakami (b) testoval aplikovatelnost RAPD pomocí 2 primerů k predikci množství nejdůležitějších obsahových látek u několika kultivarů. Vícenásobnou regresí a korelací prokázal shodu mezi genetickou vzdáleností a fenotypovým projevem studovaných znaků. Navzdory těmto úspěchům bylo od klasické RAPD postupně upouštěno, protože velkou nevýhodou dané metody je častý problém s reprodukovatelností výsledků i v rámci jedné laboratoře. Proto byla RAPD později používána v kombinaci s jinými technikami a nebo k odvození STS markerů (Tsuchiya et al., 997; Araki et al., 998). 23

25 Od druhé poloviny 9. let začaly být ve větší míře aplikovány nové metody jako je AFLP (Vos et al., 995), SSR a ISSR (Zietjiewicz et al., 994). Nové techniky umožnily zpřesnit dřívější poznatky a provést vzájemná srovnání variability dle různých metod. Hartl a Seefelder (998) se pokusili AFLP metodou s 8 fluorescenčně značenými primery, které vybrali z 6-ti testovaných, odlišit 8 kultivarů. Získali průměrně 8 polymorfních fragmentů na jednu kombinaci primerů, ale navzdory této variabilitě se jim nepodařilo odlišit tři variety, a to Saazer, Spalter a Tettnanger. V následujících letech Seefelder et al. (a) provedli podobnou analýzu pomocí AFLP, ale znatelně rozšířili počet analyzovaných vzorků na 9 kultivarů a novošlechtění. Výsledná shluková analýza rozdělila chmely do dvou velkých skupin dle původu, a to na evropské aromatické chmely (Hallertauer, Fuggle, Golding, Saazer) a evropské chmely nakřížené s americkými (Brewers Gold, Cascade, Wye Target), které jsou typické vyšší hořkostí. Autoři uvádějí významnou shodu v rozdělení kultivarů na základě AFLP markerů a rodokmenové analýzy. Vhodnost AFLP k identifikaci kultivarů a ověření čistoty vzorků na šesti kultivarech potvrzuje i Townsend et al. (). Pomocí AFLP byla hodnocena i případná somaklonální variabilita kultivaru Tettnanger na 269 vzorcích získaných z 28 různých chmelnic (Fleischer et al., 4). Autorům se podařilo identifikovat pouze tři rozdílné rostliny, u nichž proběhly detekovatelné mutace, a proto svou studii uzavírají konstatováním, že rostliny kultivaru Tettnanger jsou tvořeny jediným klonem. Před 4 lety byla publikována analýza, která poprvé porovnala variabilitu kulturních chmelů pomocí RAPD a 4 STS polymorfních markerů* (Brady et al., 996). Jednalo se o první aplikovatelné mikrosatelitní markery, které byly v následujících letech hojně využívány. Brady et al. (996) detekoval 3 až alel na mikrosatelitní lokus u 34 kultivarů. Dále prokázal relativně nízkou specifitu RAPD, protože po osekvenování dvou RAPD amplikonů specifických pro kultivar T6, jejich konverzi na STS markery a následným testováním na dalších kultivarech, ztratily svou specifičnost. Podobné problémy ztráty specifity po konverzi RAPD na STS markery uvádí i Patzak (2). * V některých článcích o chmelu (Brady et al., 996; Patzak et al., 7) jsou mikrosatelitní markery označovány jako STS markery, což samozřejmě jsou, ale běžnější bývá označení SSR, pravděpodobně vzhledem k vystižení podstaty takového markeru. SSR marker proto můžeme považovat za jakousi podskupinu STS markerů, jelikož ne každý STS marker je mikrosatelitní marker. O rozličných zkratkách, často označujících jednu a tutéž věc, a typech mikrosatelitních markerů podrobně informuje Gupta a Varshney (). 24

26 Jakše et al. () porovnal markerovací schopnost SSR a AFLP metod na 69 kultivarech s různým stupněm ploidie. Pomocí čtyř SSR markerů jednoznačně identifikoval 4 z 55 diploidních kultivarů a na základě PIC >,5 se 3 lokusy ukázaly být informativními markery a 2 vhodné pro mapování. AFLP metoda vykázala mnohem nižší stupeň polymorfismu na počet fragmentů než mikrosatelity (42 % vs. %), ale poskytla mnohem větší počet hodnotitelných fragmentů než mikrosatelitní lokusy. Při porovnání SSR a AFLP bylo rozmezí genetických podobností (genetic similarity - GS) srovnatelné, přičemž podle SSR byla průměrná GS mezi kultivary mnohem nižší (,37) než na základě AFLP (,5) (Jakše et al., ). Rozsáhlou komparativní analýzu porovnávající RAPD, ISSR, STS a AFLP markery na kultivarech uskutečnil Patzak et al. (). Největší stupeň polymorfismu vykázaly STS markery (7 % polymorfních produktů) a nejmenší ISSR (32,6%). Z tohoto hlediska je zajímavá vysoká podobnost všech dendrogamů vytvořených na základě každé z uvedených metod. Patzak et al. () nicméně uvádí, že pouze pomocí AFLP metody bylo možné odlišit všechny Osvaldovy klony, pocházející z výběru žateckého červeňáku (Saazer). Patzak (2) ve své další studii, zaměřené především na jednoznačnou identifikaci kultivaru Agnus, provedl shlukovou analýzu všech markerů (RAPD, STS, ISSR a AFLP) dohromady u 6 kultivarů. Na základě této analýzy byla molekulárně potvrzena příslušnost odrůdy Agnus k vysokoobsažným chmelům, ukázána možnost odlišit všechny české kultivary kombinací pěti STS primerů a schopnost molekulárních metod detekovat příměsi od % ve vzorku (Patzak, 2). Kromě Patzaka pouze Danilova et al. (3) uvádí využití ISSR k identifikaci odrůd. Testováním celkem 23 primerů na 26 odrůdách chmele určila Danilova et al. (3) genetickou rozdílnost kultivarů, která kolísala v rozmezí,7 až,37 a odrážela odlišný původ testovaných kultivarů. Rozdělení těchto kultivarů však žádným způsobem nekorelovalo s řadou dlouhodobě sledovaných kvantitativních znaků jako je výnos, obsah α hořkých kyselin nebo průměrná vegetační doba (Danilova et al., 3). Z výše uvedených údajů je zřejmá vysoká informační hodnota mikrosatelitních markerů, která byla a je u chmele limitována jejich malým počtem. Pravděpodobně z těchto důvodů se někteří autoři pokusili počet mikrosatelitních markerů zvýšit. V roce Jakše a Javorník () nejprve publikovali metodický postup k získání SSR u chmele, aby o rok později uveřejnili jedenáct nových SSR (Jakše et al., 2). Na tyto pokusy navázal Hadonou et al. (4) dalšími deseti a Štajner et al. (5) dokonce 6 mikrosatelity, z nichž 25 bylo vhodných pro markerování. V nedávné době Jakše et al. (8) publikoval dalších 35 mikrosatelitů, přičemž 24 bylo detailněji testováno z hlediska markerovací schopnosti. Navíc někteří autoři (Bassil et al., 5; Patzak et al., 7) využili narůstajícího množství známých sekvenčních dat u chmele, provedli data mining sekvencí s repetivními úseky a podle získaných informací navrhli SSR markery. 25

27 Souběžně s vývojem nových mikrosatelitních markerů se také začaly objevovat další práce navazující na pilotní studie Pillaye a Kennyho (996a, 996b), kteří charakterizovali genetickou diverzitu kolekcí planých a kulturních chmelů pomocí RFLP a RAPD. Plané chmely jsou potenciálním a velmi cenným zdrojem nových vlastností z hlediska novošlechtění. Například americké plané chmely již byly úspěšně použity jako donory genů resistence proti Verticillium alboatrum nebo pro změnu obsahu α hořkých kyselin (Neve 99). Analýzou 24 rostlin planých a kulturních chmelů Jakše et al. (4) potvrdil existenci dvou genofondů (germplasms) severoamerického a evropského. Pro rostliny z daného genofondu byly ve třech lokusech detekovány velikostně specifické alely typické pouze pro určitý genofond. Dále se ukázalo, že se od sebe kulturní a plané chmely významně liší, třebaže největší genetická variabilita byla uvnitř každé skupiny. Navíc byly molekulární rozptyly obou skupin shodné a z toho výsledku plyne podobná úroveň variability planých a kulturních chmelů (Jakše et al., 4). Vzhledem k uskutečněným sekvenacím je v této studii poprvé informováno o velikostní homoplasii a mutacích v lemujících oblastech u chmele. Použitím mikrosatelitních markerů u 23 planých chmelů rovněž Murakami et al. (6a) potvrdil existenci dvou biogeografických oblastí, ale ani s použitím většího počtu SSR markerů nebylo možné rozdělit evropské chmele dle míst původu. Daný poznatek podporuje domněnku o relativně rychlé expanzi chmele po celé Evropě (Murakami et al., 6b). Některé mikrosatelitní markery se ukázaly být nevhodné vzhledem k vysokému výskytu nulové alely, protože u řady chmelů původem především z Japonska a Číny nebyl amplifikován žádný produkt, což ukazuje na vyšší evoluční diverzitu těchto rostlin (Murakami et al., 6a). Rozsáhlou analýzou pomocí 29 SSR markerů určil Štajner et al. (8) nejen existenci minimálně sedmi biogeografických skupin planých a kulturních chmelů, ale také zastoupení znaků typických pro danou skupinu mezi jednotlivými genotypy. Z toho bylo možné odvozovat, jakým způsobem docházelo ke křížení chmelů, odhalit jejich původ a šíření. U kulturních chmelů byly identifikovány tři skupiny, dvě evropské a jedna americká. Evropské skupiny označené C (pěstitelská centra v Německu a České republice) a D (pěstitelská centra v Anglii a Slovinsku) představují jemně aromatické chmely pocházejících z místních odrůd a jejich výběrů. Poslední skupina kultivarů ( E ) je charakteristická, z hlediska původu, velkým zastoupením alel severoamerických planých chmelů. Tato skupina s vysokým obsahem α hořkých kyselin vznikla pravděpodobně křížením s evropskými chmely a následnou selekcí vzniklých hybridů. Plané chmely byly rozděleny na severo-americké ( F ), chmely pocházející ze zemí bývalé Jugoslávie ( A ), chmely z oblasti Altaje ( B ) a Gruzie ( G ). 26

28 Bassil et al. (8) a Patzak et al. (7) informují o variabilitě mikrosatelitních markerů v kódujích oblastech genů, které souvisejí s enzymy ovlivňujícími přeměny sekundárních metabolitů jako jsou hořké kyseliny a prenylované flavonoidy. Bassil et al. (8) provedl toto srovnání u 22 planých a 24 kulturních chmelů, při kterém se ukázala daleko vyšší variabilita amerických chmelů oproti evropským nejen v nekódujích, ale i v kódujících oblastech. Zajímavý je vysoký počet ESTSSR alel v práci Bassila et al. (8) v porovnání s Patzkovou prací (7). Tento počet se v mnoha případech vyrovná nebo dokonce předčí množství alel u řady genomických SSR chmele. Toto zjištění je v rozporu s obecně uznávanou představou nižší variability genových mikrosatelitů (Varshney, 5) a do budoucna by mohlo být zajímavé sledovat případnou souvislost s výskytem dané alely a žádoucím fenotypovým projevem (Bassil et al., 8). Patzak et al. (7) navíc provedl přímé srovnání 8 genomických SSR a svých STS markerů (z nichž část lze považovat za genové SSR). Mezi vytvořenými dendrogramy byla pouze nižší korelace (,44). Malá shoda rozdílných molekulárních markerů u chmele byla pozorována i dříve (Jakše et al., ), a proto se zdá být nejlepším řešením markery kombinovat, jelikož se pak informačně doplňují (Patzak et al., ; Patzak et al., 7) Určení pohlaví chmele Chmel patří mezi dvoudomé rostliny, ale na produkčních chmelnicích jsou využívány pouze rostliny samičí. Naproti tomu ke šlechtění nových hybridních odrůd je zapotřebí jak samičích, tak samčích rostlin. Pohlaví potomstva příslušného kombinačního křížení teoreticky štěpí v poměru :, třebaže skutečné poměry se od teoretických mnohdy liší (Seefelder et al., b, Čerenak et al., 6). Nicméně pouze u samičích rostlin lze hodnotit významné hospodářské vlastnosti, a proto je polovina potomků z tohoto pohledu nevyužitelná. Pohlaví u chmele lze s jistotou určit nejdříve po jednom či dvou letech růstu v době kvetení, což je z hlediska šlechtění velmi neefektivní a zdlouhavé. Proto proběhlo několik pokusů o tvorbu spolehlivého markeru, který by umožnil jednoznačnou identifikaci pohlaví rostlin již v ranném stádiu vývoje a umožnil včasnou separaci rostlin podle pohlaví. Polley et al. (997) publikovali první marker schopný identifikovat samčí rostliny. Příslušný marker vznikl konverzí z RAPD na STS marker, přičemž bylo testováno RAPD primerů z nichž pouze jediný (OPJ9) byl specifický pro samčí pohlaví. Příslušný marker funguje jako dominantní marker identifikující samčí rostlinu výskytem jediného fragmentu o velikosti,5 kb, kdežto u samičích rostlin neamplifikuje žádný produkt. Názorná ukázka je na obr

29 Obr. 3.4: Elektroforeogram markeru dle Polley et al. (997) Vysvětlivky: na základě přítomnosti/nepřítomnosti,5 kb fragmentu je symbolicky znázorněno předpokládané pohlaví jednotlivých rostlin chmele Čerenak a Javorník (999) analyzovali samčích rostlin tímto molekulárním markerem, který se amplifikoval u všech samčích rostlin s jedinou výjimkou, kterou byla japonská samčí rostlina. Planý chmel z Japonska (Humulus lupulus ssp. cordifolius) a dovezený materiál měl násobný systém pohlavních chromozómů (Parker a Clark 99; Dellaporta a Claderon-Urrea 9). Tento systém pohlaví vznikl translokací mezi pohlavními chromozomy a autozomy. Je možné, že následkem těchto změn může být některý lokus u chromozomů ztracen nebo se lokus se sekvencí specifického PCR markeru nenachází na Y chromozomu. Další 2 markery specifické pro samčí pohlaví byly získány testováním 22 ISSR primerů na 53 samičích a 32 samčích rostlinách (Danilova a Karlov, 6). U samčích rostlin bylo detekováno několik specifických fragmentů, které byly vyříznuty a sekvenovány. Tímto způsobem byly získány 2 markery STS-K a STS-K22. Danilova a Karlov (6) uvádí u prvního fragmentu, který byl amplifikován primery K, % homologii ke genům bohatých na glyciny (glycine-rich proteins) nebo mrna u několika rostlinných druhů jako je tabák (Nicotiana tabacum) či řepka (Brassica oleracea). Podobně i druhý fragment, amplifikovaný primery K22, odpovídá z části sekvencím v kódujících oblastech genů s neznámou funkcí. Do dnešní doby žádný jiný autor nepublikoval případné výsledky o fungování těchto markerů, a proto nelze posoudit jejich aplikovatelnost. Poslední získaný marker je, na rozdíl od předchozích markerů, kodominantním markerem. Tento marker byl získán během vytváření genomické SSR knihovny (Štajner et al., 5) a dále testován (Jakše et al., 8) na 74 planých a kulturních rostlinách chmele a dvou kombinačních křížení. Potomstvo prvního křížení vzniklo křížením mezi odrůdou Magnum a slovinskou samčí rostlinou 2/ a druhé křížením odrůdy Cascade a No3-38, což byla japonská samčí rostlina. Pomocí tohoto markeru Jakše et al. (8) detekovali tři velikostně specifické samčí alely 64, 65 a 23 bp a 4 velikostně specifických alel pro samičí rostliny. Na základě segregačních analýz 28

30 byla zjištěna těsná vazba na samčí pohlaví. Marker HlAGA7 má navíc jednu výhodu oproti dominantním markerům. Dominantní markery identifikují pohlaví na základě přítomnosti/nepřítomnosti markerovacího fragmentu. V předchozích případech je přítomnost fragmentu dávána do souvislosti se samčím pohlavím, ale v případě neamplifikace z jiných důvodů dojde k chybné identifikaci pohlaví. U markeru HlAGA7 se u samců vyskytuje jedna ze samčích alel a druhá alela z X chromosomu (samec je vždy heterozygot), kdežto u samic je nebo 2 alely, které se u samců nevyskytují. Nevýhodou tohoto markeru je vyšší časová a technická náročnost nezbytná pro přesnou analýzu vzhledem k vysoké variabilitě příslušného lokusu a velikostně malým rozdílům ( bp) mezi některými alelami specifickými pro jednotlivá pohlaví Tvorba genových map a QTL analýzy Z hlediska získání markerů souvisejících s žádoucími fenotypovými projevy, které se pak uplatňují v tzv. MAS (markery asistované selekci), je nezbytné vytvořit genovou a případně i fyzickou (sekvenční) mapu. Přestože se chmel řadí mezi hospodářsky významné rostliny nepatří z hlediska genetiky mezi modelové organismy. Proto je doposud známo relativně málo podrobně popsaných genů a vhodných mapovacích markerů (např. mikrosatelitních) či publikovaných sekvencí. Konstrukci první samičí a samčí vazebné mapy chmele pomocí 27 polymorfních AFLP fragmentů, 3 RAPD, jednoho STS a 3 SSR markerů, popisuje Seefelder et al. (b). Těmto autorům se podařilo zanést do samičí mapy AFLP a SSR markerů přiřazených k osmi vazebným skupinám, které pokrývaly celkem 346 cm. Samčí mapa byla vytvořena pomocí 43 AFLP a SSR markerů rovněž přiřazených k osmi vazebným skupinám. Samčí genetická mapa pokrývala celkem 29,8 cm. Na první pokus o tvorbu genetické mapy později navázala stejná skupina autorů, která ve stručnosti informuje o konstrukci genetické mapy v souvislosti s hledáním markerů rezistence proti padlí (Sphaerotheca humuli). Na základě mapování pomocí 6 AFLP a 8 SSR markerů se jim podařilo určit 2 AFLP markery ležící ve vzdálenosti,7 a 2,6 cm od lokusu R2 u kterého byla prokázána souvislost s rezistencí proti padlí (Seefelder et al., 3; Seefelder et al., 5). Řadu let probíhají pokusy o zkonstruování genové mapy na jejímž základě by bylo možné vytvořit markery vhodné k detekci QTL odpovědných za obsah α hořkých kyselin a výnos. Čerenak et al. (6) využili ke konstrukci genové mapy rovněž kombinaci AFLP a SSR markerů. Celkově se jim podařilo zanést do mapy 96 markerů (8 AFLP a 5 mikrosatelitních) do 9 vazebných skupin s pokrytím 66,9 cm. QTL analýzy byly provedeny na základě zjištěného obsahu α hořkých kyselin v průběhu tří let. Tímto způsobem se podařilo detekovat 4 předpokládané QTL značené alpha až 4. 29

31 Součástí mapování byla snaha určit polohu některých známých genů, které se účastní biosyntézy hořkých kyselin. V současné době byl detekován a izolován gen pro valerofenon syntázu (VPS) (Okada a Ito, ), což byl první popsaný homolog chalkon syntázy (CHS) u chmele. Později následovaly objevy dalších homologů pro CHS, které jsou u chmele značeny chs_h, chs2, chs3 a chs4 (Matoušek et al., 2; Novák et al., 3). Geny vps a chs4 se vůbec nepodařilo zanést do mapy a překvapivým zjištěním bylo přiřazení zbylých genů (chs_h, chs2, chs3) k jiným vazbovým skupinám, než ke kterým patří předpokládané QTL (Čerenak et al., 6). Z tohoto výsledku autoři odvozují, že detekovaná QTL budou mít pravděpodobně spíše regulační funkci (Čerenak et al., 6). V následujících letech byl zvýšen počet zanesených markerů a identifikováno 3 předpokládaných QTL pro obsah α hořkých kyselin, 3 pro hmotnost suchých hlávek a 8 pro hodnotu sklizňového indexu (Čerenak et al., 7; Čerenak et al., 9). Počet markerů zanesených do mapy se zvýšil na 99 (5 AFLP, 43 SSR, jeden marker určující pohlaví a pět homologů genů chs, přičemž pro gen vps a chs_h byly navrženy SNP markery), které vytvořily vazebných skupin (LG linkage groups). Detekované QTL vysvětlují celkovou genetickou variabilitu z 68,4 % pro α hořké kyseliny, 49,7 % pro hmotnost sušených hlávek a 72 % pro sklizňový index, což naznačuje velký vliv několika málo lokusů na sledovaných znak (Čerenak et al., 9). Tento závěr je podpořen poznatkem, že mezi některými QTL (α2-2 a α3-6) byl zjištěn silně interaktivní vliv naznačující dominantní nebo epistatický efekt mezi těmito QTL nebo QTL a prostředím (Čerenak et al., 9). O dominantním efektu jediného genu ovlivňujícího obsah α hořkých kyselin informuje i Okada et al. (7). Tito autoři vyvinuli 2 RFLP markery 7H a 3D3, které odvodili z cdna specifické pro lupulin. Marker 7H představuje QTL marker pro obsah α hořkých kyselin a 3D3 je markerem k odvození poměru kohumulonu a α hořkých kyselin. Obecnou aplikovatelnost těchto markerů poté testovali a potvrdili na 7 kombinačních kříženích. 3

32 3.2 MIKROSATELITY TANDEMOVĚ REPETITIVNÍ DNA ELEMENTY 3.2. KLASIFIKACE Schematické zařazení mikrosatelitů Protože podstatná část této kapitoly je zaměřena na jedinou skupinu opakujících se DNA sekvencí, je vhodné na začátku tuto skupinu, nazývanou mikrosatelity, zařadit z hlediska celkového kontextu. Z obrázku 3.5 níže je patrné, že mikrosatelitní sekvence tvoří jen nepatrnou (nikoliv významem) skupinu všech možných typů repetic. Na tomto vyobrazení je vidět základní členění repetitivních prvků na tzv. tandemové repetice (tandem repeats), kam mikrosatelity patří a roztroušené repetice (dispersed či interspersed repeats), které jsou dále členěny na několik podskupin. Nejdůležitějším rozdílem těchto dvou hlavních skupin je odlišný molekulární mechanismus jejich vzniku a šíření v genomech rozličných organismů. Obr. 3.5: Členění repetitivních elementů DNA Vysvětlivky: modré šipky znázorňují molekulární mechanismy, které souvisejí s šířením a evolucí repetitivních sekvencí, CGD celogenomová duplikace, GKO genová konverze, MMR mismatch repair, REP replikační sklouznutí, RTR reverzní transkripce, TRA transpozice (upraveno dle Richard et al., 8) 3

33 Nomenklatura satelitní DNA Třebaže na první pohled je zcela zjevné a samozřejmé, co je míněno termíny satelitní, minisatelitní a mikrosatelitní tandemová repetice, opak je pravdou. Dodnes není zcela striktně vymezeno, co danými termíny máme přesně na mysli, a to i navzdory pokusům některých autorů o sjednocení názvosloví a definování pojmů (Chambers a McAvoy, ; Richard et al., 8). Názvosloví je dáno historickým pozadím a k jeho úpravám přispívali objevitelé a výzkumníci zabývající se repetitivními sekvencemi z různých hledisek. S ohledem na tuto skutečnost budou použity charakteristiky především podle posledních dvou citovaných autorů, případně s doplňujícím komentářem. Tato relativně triviální záležitost může způsobovat, a pravděpodobně způsobuje, nemalé problémy. Pokud má každý autor jiná měřítka například pro definici mikrosatelitů z hlediska opakování, typu, délky a minimální délky sekvence, od které už mluvíme o mikrosatelitech apod., tak rozumná komparativní analýza mezi jednotlivými studiemi není prakticky možná. Situaci neulehčuje ani velké množství programů sloužících k vyhledávání repetitivních sekvencí, protože řada programů se od sebe liší svým vyhledávacím algoritmem a možností nastavení. Na druhou stranu byly provedeny srovnávací analýzy mezi pěti nejpoužívanějšími algoritmy na genomu kvasinky (S. cerevisiae). Přesto je z těchto důvodů nutno brát informace o výskytu, rozšíření mikrosatelitů apod. v dalších kapitolách s určitou rezervou. Členění a kategorie repetitivní DNA podle Chamber a McAvoy (): Satelity (Satellites): vysoce opakující se segmenty o délce a více nukleotidů (nt), vytvářející víceméně uniformní, souvislou řadu o celkové délce v rozmezí 3 až 7 nukleotidů. Minisatelity (Minisatellites): středně opakující se segmenty v opakování - nukleotidů, vytvářející víceméně uniformní, souvislou řadu o celkové délce v rozmezí 2 až 5 nukleotidů. Microsatelity (Microsatellites): krátké úseky o délce 2-6 nukleotidů, vytvářející víceméně uniformní řadu o délce do 2 nukleotidů. Mononukleotidové řady (Mononucleotide tracks): souvislá řada jednonukleotidových opakování jakékoliv délky. Naproti tomu Richard et al. (8) udává poněkud jiný typ kategorizace, kde je posuzován typ repetitivní DNA z hlediska délky opakujícího se motivu a zároveň celková délka v nukleotidech. Na základě těchto předpokladů rozlišujeme: Satelitní DNA (Satellite DNA): délka opakujícího se motivu je dána rozmezím 5 až více než nt a celková délka se pohybuje od > 4 po nevymezenou hodnotu. Důvod je ten, že ačkoliv délka satelitní DNA může nabývat i několika megabází, není maximální hodnota 32

34 známa. Příčinou je dosud malý počet kompletně osekvenovaných velkých genomů. Minisatelity (Minisatellite): délka opakujícího se motivu je dána rozmezím 9 až nukleotidů a celková délka se nachází v rozmezí 5 až 4 x 3 nukleotidů. Mikrosatelity (Microsatellite): délka opakujícího se motivu je dána rozmezím -8 nukleotidů a celková délka nabývá nukleotidů. Koncepce obou autorů se liší v počtu kategorií a především ve vymezení satelitní DNA. Richard et al. (8) zahrnuje do satelitní DNA i repetice s opakujícím se motivem o délce 5 nukleotidů. Důvodem jsou krátké satelitní repetice v oblasti centromer a telomer, které jsou často druhově specifické. Příkladem je repetice (TTAGGG)n u člověka (Homo sapiens sapiens), či (TTTAGGG)n u huseníčku (Arabidopis thaliana) a ječmene (Hordeum vulgare). Další zásadní rozdíl se týká vymezení délky mikrosatelitního motivu. Chambers a McAvoy () ponechávají mezeru 4 nukleotidů mezi mini- a mikrosatelity, protože v této době nebyla příliš známa dynamika takovýchto repetic. Podle Richard et al. (8) se oba typy repetic příliš neliší molekulárním mechanismem zodpovědným za změny v celkové délce repetice, ale přesto je lze od sebe odlišit na základě jejich rozšíření a funkcích v eukaryotních genomech. 33

35 Struktura mikrosatelitních sekvencí Většina studií se shoduje, že se jedná o jednotky tandemově se opakujících repetic v délce jednoho až šesti nukleotidů (Tóth et al., ; Hu, 3; Chen et al., 6), ačkoliv Legendre et al. (7) udává jako hranici repetitivní jednotky 9 bází a Mrázek et al. (6) dokonce bází. U mikrosatelitů se tedy dá mluvit o mono-, di-, tri-, tetra-, penta- a hexanukleotidových (případně dalších) opakujících se motivech. Nutno podotknout, že někteří autoři mononukleotidová opakování mezi mikrosatelitní sekvence nezařazují a jako první typ opakování uvádějí dinukleotidová (Zhu et al., ; Pompanon et al., 5). Kromě délky opakujícího se motivu (repeat unit či repeat type) jsou pro studii a klasifikaci mikrosatelitních lokusů důležité další dva základní parametry, které největší měrou ovlivňují jejich dynamiku. Jedná se nukleotidové složení opakujícího se motivu a celkový počet opakování (repeat number). Z hlediska kompozice tandemových repetic lze dle Oliveira et al. (6) řadit mikrosatelity do následujících kategorií: a) dokonalé (perfect či pure) u takovýchto mikrosatelitů není opakující se sekvence přerušena žádnou bází, která nepatří do opakujícího se motivu např. CGCGCGCGCGCGCGCG b) nedokonalé (imperfect) tyto mikrosatelity obsahují pár bází v opakujícím se motivu např. CGCGCGCGCGCTCGCGCGCG c) přerušené (interrupted) u těchto repetic se vyskytuje krátká sekvence nepatřící do daného opakujícího se motivu např. CGCGCGCTTAGCGCGCGCG d) složené (composite) jedná se o dvě nebo více přilehlých sekvencí lišících se typem opakování př. CGCGCGCGCGCGATATATATAT Navíc lze tyto typy i kombinovat, protože si lze představit složený mikrosatelit, přičemž jedno z opakování může být nedokonalé. Ve skutečnosti toto třídění záleží spíše na použitém vyhledávacím programu, protože v současné době není kupříkladu přesně určena maximální délka přerušení daného mikrosatelitu a poté není zcela zřejmé, jestli se jedná o jeden mikrosatelit či dva rozdílné. Tato nejednoznačnost rovněž přispívá k potížím při srovnávání výsledků jednotlivých studií. 34

36 3.2.2 HISTORIE OBJEVU SATELITNÍ DNA Ohlédneme-li se zpět do historie, zjistíme, že počátky objevů satelitní DNA spadají do 6. let minulého století. V této době se začaly provádět první pokusy s genomickou DNA v ultracentrifugách. Tato DNA byla separována v hustotním grandientu CsCl a na základě získaných údajů o vznášivostní hustotě jednotlivých částí DNA bylo možno vytvořit příslušnou křivku. Při studiu prokaryotních organismů měla křivka jediný vrcholek, kdežto u eukaryot se těchto vrcholů vyskytovalo několik. Přebytečné vrcholy ukazovaly, že se genomech eukaryot vyskytují části DNA, které mají jinou vznášivostní hustotu než jiné a byly pojmenovány satelity a příslušná DNA byla nazvána satelitní DNA (stdna). Velké množství repetitivních sekvencí v oblastech satelitní DNA bylo zjištěno na základě experimentů s denaturační-renaturační kinetikou DNA (Britten a Kohne, 968), přičemž tyto úseky často dosahovaly délky více než milion bází. Relativně nízká komplexita byla vysvětlením, proč měla křivka několik vrcholů. Tvar křivky je totiž určen obsahem a polohou G a C bází, a proto se průměrný obsah G a C párů mohl snadno lišit od průměrného obsahu G a C v ostatních částech genomu, ačkoliv to nemusí platit pro všechny satelitní sekvence. Pozdější objev kratších tandemových repetic pak vedl k odvození názvu minisatelity z předchozího termínu. Termín minisatelity byl pak běžně používán od druhé poloviny 8. let v souvislosti objevu různých rodin minisatelitů (Jeffreys et al., 985), zpočátku hlavně v lidském genomu. Právě počátkem 8. let došlo také k objevu krátkých tandemových repetic (jak je nazývá například Spritz (98) a jiní), které byly později celkem logicky nazvány mikrosatelity (Litt a Luty, 989). Minisatelitní a mikrosatelitní sekvence bývají některými autory (Harding et al., 992; Buschiazzo a Gemmel, 6) společně nazývány variabilní počet tandemových repetic (Variable Number of Tandem Repeats VNTR), přestože původně Nakamura et al. (987) navrhovali tento název pouze pro minisatelity. 35

37 3.2.3 VÝSKYT A ROZŠÍŘENÍ V GENOMU Řada studií analyzujících často ohromující množství sekvenačních dat prokázala nenáhodnou distribuci mikrosatelitů, odlišnosti v počtu a typu různých mikrosatelitních repetic mezi jednotlivými organismy (Schlötterer, ; Tóth et al., ; Oliviera, 6; Guo et al., 9). Převážná část mikrosatelitních sekvencí se vyskytuje v nekódujících oblastech (Ellegren, 4; Subirana a Messeguer, 8), tedy v intergenových oblastech či intronech. Jedním z důvodů je i značný selekční tlak v kódujících úsecích proti tzv. frameshift mutacím nebo-li mutacím způsobujícím posun čtecího rámce (Dokholyan et al. ; Metzger et al., ). Z hlediska denzity výskytu SSR v různých oblastech genomu je situace opačná. Rozsáhlá komparativní analýza na základě genomických a EST sekvencí několika rostlinných druhů, a to huseníčku (Arabidopsis thaliana), rýže (Oryza sativa), sóji (Glycine max), kukuřice (Zea mays) a pšenice (Triticum aestivum), prokázala mnohem vyšší frekvenci výskytu mikrosatelitů v transkribovaných oblastech, především v nepřekládaných regionech tj. 5 a 3 UTR, oproti výskytu v genomických regionech (Morgante et al., 2). Tento závěr potvrzuje Lawson a Zhang (6), kteří ve své studii uvádějí nejvyšší denzitu mikrosatelitů na megabázi v 5 UTR oblastech huseníčku a rýže. Navíc byl pro rostliny zjištěn distribuční gradient výskytu ve směru transkripce, opětovně s nejvyšší hustotou mikrosatelitů v 5 UTR oblasti (Fujimori et al., 3). Tento poznatek je typický (alespoň v rámci sekvenovaných druhů) pouze pro rostliny, protože podobná disproporce u lidí nebo myší zjištěna nebyla (Fujimori et al., 3). Důvodem mohou být rozličné regulační funkce příslušných SSR a s nimi spojená pozitivní selekce (Li et al., 2; Lawson a Zhang, 6). Rozdílná distribuce mikrosatelitů je rovněž patrná z hlediska oblastí chromosomu jako jsou centromerické nebo telomerické části. Byl zjištěn výrazně redukovaný výskyt (2 x až 5 x nižší) mikrosatelitních sekvencí pro pericentromerické a centromerické oblasti (Guo et al., 9), tedy oblasti obecně se vyznačující vysokou hustotou různých repetitivních elementů jako jsou α satelity a transponovatelné elementy (Ma et al., 7). Dalším zajímavým zjištěním je negativní korelace mezi množstvím mikrosatelitních lokusů a velikostí genomu (Morgante et al., 2), kdy s rostoucí velikostí genomu klesá výskyt SSR. Tento poznatek je v protikladu s představou o šíření mikrosatelitů pomocí retrotranspozonů (Ramsay et al., 999), protože velikostní expanze řady rostlinných genomů úzce souvisí s jejich aktivitou. Dokladem může být nedávno osekvenovaný genom kukuřice (Schnable et al., 9), naznačující rozdílný způsob šíření u jednotlivých rostlinných druhů. 36

38 S narůstající délkou opakujícího se motivu, ve většině případů, množství příslušných repetic klesá (Subirana a Messeguer, 8). Obecně však lze konstatovat převahu v celkovém počtu dinukleotidových repetic (Chistiakov et al., 6) s výjimkou u primátů, u kterých převládají mononukleotidové repetice (Tóth et al., ). U savců a octomilky je převládajícím dinukleotidovým motivem GT a naopak AT dominuje u Arabidopsis a kvasinky (S. cerevisiae) (Schlötterer, ). Velmi vzácné je naproti tomu opakování CG, protože CpG ostrůvky (islands) jsou důležitým epigenetickým signálem pro metylaci cytosinu (Subirana a Messeguer, 8). Trinukleotidová opakování jsou velmi běžná u všech taxonů, kde se vyskytují převážně v exonech (Tóth et al., ). Pro vyšší rostliny jsou typické motivy AAC a AAG (Tóth et al., ), nicméně Subirama a Messeguer (8) udávají jako nejrozšířenější motiv AAT napříč rostlinnými i živočišnými druhy na základě většího objemu sekvenčních dat. Řada tetranukleotidových motivů je velmi běžná především u lidských chromozomů, jedná se hlavně o motivy AAAN (jakákoliv báze kromě A) (Katti et al., ), které jsou u ostatních organismů mnohem vzácnější v porovnání s dia trinukleotidovými. Podobné mezidruhové rozdíly se objevují i u motivů s větším počtem repetic. Ukázkou může být analýza mikrosatelitních motivů pomocí microarray čipů. Galindo et al. (9) měřili globální rozdíly v množství všech možných SSR motivů v délce -6 bp u 25 kompletních genomů. Z výsledků vyplývá charakteristický vzorec v množství jednotlivých mikrosatelitních motivů a tedy možnost rozlišit jeden druh od jiného na základě intenzity hybridizačního signálu různých SSR (Galindo et al., 9). Dále se podařilo detekovat některé druhově specifické motivy jako TAGCC a TAGCCC pro šimpanze (Pan troglotydes) nebo AAAGTG u octomilky (D. melanogaster) (Galindo et al., 9). Příčiny enormního výskytu některých a nedostatek jiných mikrosatelitních motivů byly studovány především u živočichů, nicméně získané poznatky lze pravděpodobně zobecnit. Bacolla et al. (8) pomocí molekulárního modelu určoval chování řady tri a tetranukleotidových repetic z hlediska stability a schopnosti tvořit rozličné sekundární struktury na sekvencích genomů devíti druhů obratlovců. Na základě této analýzy prokázal, že nadbytek určitých tri a tetranukleotidových motivů je nepřímo úměrný schopnosti jednotlivých vláken tvořit smyčky či kvadruplexy o různé termodynamické stabilitě (Bacolla et al., 8). Tyto závěry nepřímo potvrzuje Wells et al. (5) ve svém přehledu o příčinách dědičných neurologických nemocí způsobených nestabilitou tri-, tetra- a pentanukleotidových repetic. Příslušné repetice spojené s danou chorobou mají totiž schopnost ovlivňovat různým způsobem prostorovou konformaci DNA jak je patrné na obr

39 Obr. 3.6: Konformace DNA na základě různých typů repetitivních sekvencí (upraveno dle Wells et al., 5) Svou roli na rozdílné distribuci odlišných mikrosatelitů má pravděpodobně i opravný systém DNA (Oliveira et al., 6) podrobněji probíraný v kapitole Je známa odlišná účinnost MMR podle typu chyb a tato účinnost není stejná mezi taxony (Marra a Schar, 999). V delším časovém měřítku se zpočátku malé rozdíly mohly postupně nahromadit a důsledkem jsou markatní rozdíly v distribuci a množství různých mikrosatelitních motivů mezi druhy (Schlötterer, ). 38

40 3.2.4 FREKVENCE MUTACÍ MIKROSATELITŮ Jedním z charakteristických znaků mikrosatelitních sekvencí je jejich vysoká frekvence mutací oproti standardní chybovosti, která se pohybuje v rozmezí na nukleotid na generaci (Leonard et al., 3). Nejběžněji udávaná frekvence mutací u mikrosatelitů se pohybuje v rozmezí na lokus na generaci (Ellegren, ). Existují i příklady extrémně vysokých či nízkých frekvencí mutací. Brohede et al. (4) studiem tří mikrosatelitních lokusů u španělské populace vlaštovek (Hirundo rustica) pozoroval 3 mutací v lokusu HrU9 na 894 meiózí, což znamená průměrnou frekvenci mutací rovnou,35. Naopak u octomilky (D. melanogaster) byla průměrná mutační frekvence 6,3 x -6 (Schug et al., 997). Vysvětlením je pravděpodobně obecně kratší celková délka repetivní sekvence než u jiných organismů (Schug et al., 997). Obdobně nízká frekvence mutací (3,2 x -5 až 7,9 x -5) byla zjištěna i chloroplastových mikrosatelitů (cpssr) nahosemenných rostlin (Provan et al., 999). Rozdílnost rychlosti mutací mikrosatelitů se vyskytuje prakticky na všech uvažovaných hierarchických úrovních, vlivem velikosti alely počínaje (Jin et al., 996), přes konkrétní lokus (Ellegren, 4), chromozom (Huang et al., 2), jednotlivce a konkrétním druhem či taxonem konče (Webster et al. 2). 39

41 3.2.5 MUTAČNÍ MECHANISMY Replikační sklouznutí S objevem satelitní DNA a především mikrosatelitů, vyvstala otázka, jaký molekulární mechanismus je zodpovědný za expanzi a kontrakci celkové délky repetitivního úseku. Bylo navrženo několik způsobů pomocí kterých dochází ke změnám v délce opakování. Prvním a pravděpodobně převládajícím mechanismem je tzv. replikační sklouznutí (replication slippage) během replikace či opravy DNA. Myšlenku replikačního sklouznutí shrnují ve svém review Levison a Gutman (987b), kde tento jev nazývají SSM - single strand mispairing. V tomtéž roce (Levison a Gutman, 987a) demonstrovali tento jev infikováním E. Coli fágem M3 s vloženou 4 bp repeticí CA/TG, protože po izolaci a sekvenaci jednotlivých plaků detekovali vysokou frekvenci inzercí/delecí právě v repetitivní oblasti. Podstatou replikačního sklouznutí je představa, že v průběhu replikace či opravy DNA dojde k disociaci a rychlé reasociaci v odlišné pozici u jednoho z vláken. Výsledkem je chybné párování bazí, kdy část vlákna vytvoří jakousi smyčku (loop). Důležité je, na kterém vláknu se takováto smyčka vytvoří. Pokud proběhne disociace u nově vznikajícího vlákna, výsledkem je přidání jednoho či většího počtu daného opakujícího se motivu. Naopak vznik smyčky na templátovém vlákně vede ke kontrakci a tedy zkracování dané repetice. Schematický průběh takovéhoto replikačního sklouznutí je ukázán na obr Obr. 3.7: Schéma replikačního sklouznutí Vysvětlivky: každá číslice reprezentuje jeden opakující se motiv (upraveno dle Ellegren, b) 4

42 Pomocí experimentů s několika purifikovanými prokaryotními a eukaryotními DNA polymerázami v in vitro podmínkách bylo potvrzeno, že enzymová aktivita polymerázy je dostačující k vysvětlení vzniku replikačního sklouznutí (Schlötterer a Tautz, 992). Sklouznutí je způsobeno zastavením DNA polymerázy v průběhu syntézy komplementárního vlákna a jejím odpojením se od DNA. Během této disociace se část koncového vlákna oddělí od templátu a reasociuje v jiném místě repetice (Hile a Eckert, 4). K replikačnímu sklouznutí také dochází při každé PCR amplifikaci mikrosatelitních lokusů, kdy se vytvářejí tzv. koktavé produkty (stutter bands). Walsh et al. (996) analýzou dvou mikrosatelitních lokusů s tetranukleotidovým opakováním prokázal, že koktavé produkty se liší od skutečné alely ztrátou jednoho nebo několika opakování. Navíc Shinde et al. (3) zjistil, pokusy provedenými v in vitro podmínkách, nárůst v množství koktavých produktů s celkovou délkou mikrosatelitu a naopak, že narůstající délka opakujícího se motivu frekvenci sklouznutí snižuje. Porovnáním četností změn v celkovém počtu opakujících se motivů způsobených inzercí nebo delecí příslušného motivu, byla zjištěna u Taq polymerázy mnohem větší frekvence změn vedoucích spíše ke zkracování než prodlužování repetice (Shinde et al. 3). Z toho lze vyvodit i závěr, že in vitro experimenty nejsou schopny zcela objasnit mechanismus vzniku mikrosatelitů v živých buňkách Rekombinace Za další možnou příčinu expanze či kontrakce repetitivních sekvencí jsou považovány jevy související s homologní rekombinací. Jedním z nich je crossing-over, který je definovaný jako vzájemná výměna genetické informace či genová konverze (gene conversion), což je nereciproký přenos genetické informace (Richard a Pâques, ). Dříve se předpokládalo, že genová konverze je hlavní příčinou nestability pouze u minisatelitních sekvencí a u mikrosatelitů je mechanismus odlišný (Richard et al., 8). Podrobnější analýzy řady chorob souvisejících s expanzí trinukleotivých repetic (TNR) však ukázaly, že za změnu je v mnoha případech zodpovědná právě genová konverze během meiózy, třebaže tato tzv. dynamická nestabilita vzniká spolupůsobením celé řady genetických, epigenetických a vývojových faktorů (Kovtun a McMurray, 8). Kromě genové konverze byl za další mechanismus způsobující kontrakci a expanzi mikrosatelitů považován nerovnoměrný crossing-over (unequall crossing-over), ale kupříkladu Jakupciak a Wells () nezaznamenali ani jeden případ při studiu příčin expanze CTG/CAG repetice oproti 5-ti genovým konverzím. Zdá se tedy, že k nerovnoměrnému crossing-overu dochází častěji u velmi dlouhých repetic (např. minisatelitních), neboť narůstá pravděpodobnost nepřesného párování chromatid (sesterských či nesesterských) a u relativně krátkých mikrosatelitů hraje minoritní roli i v porovnání s genovou konverzí. 4

43 Pro lepší pochopení příčin dynamických nestabilit byla zkoumána role tzv. DSB opravného systému a rekombinace (Wells et al., 5). Ukazuje se totiž, že právě způsob, jakým dochází k opravě dvouvláknových zlomů (DSB double strand breakage), je rozhodující pro změnu počtu repetic. Dnešní poznatky naznačují, že se jedná o komplexní jev, kdy během oprav DSB může či nemusí docházet ke crossing-overu, genové konverzi nebo replikačnímu sklouznutí. Složitost mechanismu je umocněna tím, že jmenované jevy se mohou vyskytnout jednotlivě, společně nebo v různých kombinacích. K vysvětlení těchto jevů byla vytvářena v průběhu let řada teoretických modelů a na obr. 3.8 je jeden ze současných modelů nazvaný DSB repair slippage. Pro ilustraci a srovnání je rovněž ukázán na obr. 3.9 nerovnoměrný crossing-over u sesterských chromatid. Obr. 3.8: Model DSB repair slippage Vysvětlivky: molekula s dvouvláknovým zlomem je značena modře, templátová (donorová) molekula je zobrazena červeně a nově syntetizovaná vlákna jsou značena oranžovou barvou, vertikální pruh značí repetitivní motiv; (A) po DSB dochází k zahájení genové konverze invazí jednoho vlákna, které vytvoří D-smyčku, (B) syntéza DNA uvnitř repetice, při které může a nemusí dojít k replikačnímu sklouznutí, po zachycení druhého vlákna opět může (D) a nemusí (C) dojít k replikačnímu sklouznutí; replikační sklouznutí může vést k expanzi (jak ukazuje C a D) nebo ke kontrakci, pokud sklouznutí nastane na templátovém vlákně; další alternativou, po zachycení obou vláken s následnou syntézou DNA, je možnost rozmotání těchto nově syntetizovaných vláken a jejich opětovné spojení, kdy dojde ke správnému spárování nebo k vzájemnému posunu obou vláken (nesprávné spárování), což má opět za následek expanzi nebo kontrakci repetic (E) (upraveno dle Richard et al., 8) 42

44 Obr. 3.9: Nerovnoměrný crossing-over sesterských chromatid Vysvětlivky: horizontální modrá a červená čára schematicky znázorňují sesterské chromatidy, vertikální čáry představují počet opakujících se motivů (upraveno dle Richard a Pâques, ) Mikrosatelity a transpozony Při řešení otázky vzniku a šíření mikrosatelitů se některé studie zaměřily na případnou spojitost mikrosatelitů a retrotranspozonů. U lidí byl v souvislosti s mikrosatelity studován nejčetnější SINE retropozon Alu element, jelikož obsahuje poly(a) konec a centrální linker bohatý na adeniny. Nadir et al. (996) prokázal, že mikrosatelity složené z [A(2-5)N]n (N představuje C, T nebo G) jsou vytvářeny expanzí s případnou mutací 3 konce polyadenylovaného retrotranskriptu. V této studii byla dokonce nalezena souvislost i s jinými typy mikrosatelitních motivů jako AC, AG či AT. Souvislost s Alu elementem byla objevena i při zkoumání původu nestabilní repetice ATTCT v genu ATXN u lidí, která je příčinou spinocerebelární ataxie typu (Kurosaki et al., 9). Jiný způsob vzniku mikrosatelitních lokusů pomocí transpozonů popisuje Wilder a Hollocher () u druhu Drosophila dunni a Drosophila nigrodunni. Dva typy mikrosatelitů (TA)n a (GTCY)n jsou zde vytvářeny uvnitř dvou regionů mini-me elementů (microsatellite initiating mobile elements). Autoři uzavírají svoji studii s tím, že tento mechanismus může být obecně aplikován u všech eukaryot, kde se vyskytují retropozony s konzervativními jednoduchými či kryptickými repeticemi. Že mini-me elementy nemusí být jedinými původci (proto-) mikrosatelitů dokazuje Chambers et al. (7) u jiného druhu řádu Diptera, který ve své studii identifikoval minimálně 5 dalších transpozonů souvisejících s 46 % identifikovaných mikrosatelitů. 43

45 U ječmene (Hordeum vulgare) byla prokázána spojitost mezi dinukleotidovými repeticemi a retrotranspozony (Ramsay et al., 999). Příslušné SSR autoři rozdělili podle místa výskytu na mikrosatelity v blízkosti 3 nebo 5 konce transpozonu a ty, které vznikly z vnitřní sekvence transpozonu. Příčinou mají být rozličné scénáře vzniku a šíření mikrosatelitů. První kategorie (3 konec) má odpovídat způsobu podobnému vzniku souvisejícímu s Alu elementy u savců. Mikrosatelity druhého typu (5 konec) mají být naopak cílem pro zabudování retrotranskriptu. Pozdější objev retrotranspozónu Micron v genomu rýže (Oryza sativa), který cíleně vyhledává repetici (TA)n (Akagi et al., ) tuto domněnku podpořil. Poslední kategorie mikrosatelitů se vyvinula jako aktivní součást TE (transponovatelné elementy) a rozšířila se v genomu během období největší aktivity daného transpozonu. Mezi analyzovanými TE byl i BARE-, který je členem tzv. copia rodiny (Manninen a Schulman, 9). Transpozony copia rodiny jsou převládající třídou retrotranspozonů u všech rostlin (Wicker a Keller, 7) a lze proto v budoucnu, na základě genomických studií řady rostlinných druhů předpokládat upřesnění o tom, do jaké míry ovlivňují transpozony vznik a šíření SSR. Jen tak bude možné získané poznatky zobecnit, protože jak ukázal Schlötterer () na příkladu chromozomu 2 Arabidopsis thaliana pomocí upraveného schématu dle Lin et al. (999), vysoká denzita mikrosatelitů nemusí vždy korelovat s vysokou denzitou transpozonů. 44

46 3.2.6 GENEZE (PROTO-) MIKROSATELITŮ V současné době existuje několik názorů ohledně vzniku a původu mikrosatelitních sekvencí. Převládají dvě hypotézy, z nichž první (vznik pomocí transpozonů) byla podrobněji popsána v části věnované mutačním mechanismům. Tyto dva hlavní názorové proudy se navzájem nevylučují a naznačují, že skutečný průběh vzniku mikrosatelitů může být ještě složitější. Přestože množství studií zabývajících se mikrosatelitními tandemovými repeticemi neustále narůstá, dosud neexistuje ucelený teoretický model schopný zahrnout a vysvětlit veškeré jevy, které se jich týkají (vznik, dynamika šíření, relativně rovnoměrné rozšíření v genomu aj.). Druhý okruh názorů předpokládá, že mikrosatelitní sekvence vznikají uvnitř nerepetivních ( unikátních ) sekvencí, mluví se o tzv. de novo mikrosatelitech. Dochází tak ke vzniku tzv. protomikrosatelitů, což jsou sekvence s krátkým počtem opakování (běžně se uvádí 2-4 opakování), které následně expandují díky replikačnímu sklouznutí. Studiem prvního, kompletně osekvenovaného genomu u eukaryotního organismu (S. cerevisiae) o velikosti 2,6 Mb, došli Rose a Falush (998) k závěru, že existuje minimální hranice 8 nukleotidů na které se začíná projevovat rychlá expanze a proces dynamické mutace popisovaný ve studii Sutherlanda a Richardse (995) a dochází tedy k zrození (birth) mikrosatelitu. Tyto závěry vycházejí ze zamítnutí jejich nulové hypotézy, která se zakládá na tvrzení, že neexistuje žádný proces dynamické mutace a opakující se jednotky jsou náhodně rozprostřeny v genomu. Příslušná nulová hypotéza odpovídá představám jednoduchého vývoje genomu kdy nukleotidy mutují pomocí náhodné tranzice a transverze. Pokud však dynamická mutace existuje, bude vznikat přemíra dlouhých opakování oproti očekávanému výskytu a danou skutečnost ve své studii pozorovali pro všechny opakující se motivy. Právě od 8 nukleotidů a výše byly zjištěny významné odchylky, skoro pro všechny opakující se motivy, pozorovaného počtu dlouhých opakování oproti předpokládanému. Jako důvod pro hranici osmi nukleotidů Rose a Falush (998) uvádějí možné strukturní omezení opravného systému. Tento výsledek odpovídá i studii uskutečněné Messierem et al. (996). Příslušný model je často nazýván mezním či prahovým (treshold model). Naproti tomu Pupko a Graur (999) tvrdí na základě zkoumání genomu stejného organismu tj. S. cerevisiae, že není zapotřebí žádné kritické minimální délky mikrosatelitu. Ačkoliv pomocí regresní analýzy zjistili silnou lineární závislost v odchylkách od náhodné očekávané frekvence jak pro opakující se motiv, tak pro celkovou délku opakování. To znamená, že s narůstající celkovou délkou repetic (či opakujího se motivu) lineárně narůstá výskyt takovýchto mikrosatelitů oproti náhodné frekvenci výskytu. Důležitý je však poznatek, že neexistuje dolní hranice, kdy dochází k nárůstu těchto odchylek oproti očekávání na základě náhodného výskytu. U počtu opakování rovnému 2 byl výskyt i takovýchto proto-mikrosatelitů vyšší oproti očekávání. 45

47 Zhu et al. () si kladou otázku, co zapříčiňuje vznik krátkých repetic či protomikrosatelitů, jestliže ne replikační sklouznutí, vzhledem ke stanovené osmi nukleotidové hranici Rosem a Falushem (998). Ve své práci předkládají výsledky podporující hypotézu vzniku protomikrosatelitních opakování pomocí náhodné substituce a inserce několika nukleotidů. Třebaže tato teorie předkládá logická vysvětlení, je zapotřebí brát v úvahu její limity. V globálním měřítku nelze výše zmíněnou teorii aplikovat na všechny mikrosatelity u všech druhů, a to z několika důvodů, které uvádí Buschiazzo a Gemmel (6). Jejich argumenty se odvíjejí z úvah, že ačkoliv bylo použito relativně velké množství dat, tak už samotná data jsou zavádějící. Příčinou je za prvé zkoumání jediného druhu (H. sapiens sapiens) a za druhé srovnávání mikrosatelitů vyskytujících se v genech a nikoliv ve všech oblastech genomu. Proto bude zapotřebí mnohem rozsáhlejší a komplexnější výzkum k zodpovězení otázky vzniku mikrosatelitů, což začíná být v současné době uskutečnitelné vzhledem k rapidně narůstajícímu množství kompletně osekvenovaných organismů MUTAČNÍ MODELY Pro studování dynamiky mikrosatelitů, především u populací či různých druhů, bylo nutno vyvinout teoretické modely, pomocí kterých je možné statisticky testovat genetickou variabilitu, odvozovat očekávaný počet heterozygotů a porovnávat jej s počtem pozorovaným. Dále ze získaných výsledků zjišťovat historii populace, rychlost jejího šíření, frekvenci migrujících jedinců, příbuzenské vztahy mezi jednotlivci ap. Prvním modelem aplikovaným i na mikrosatelitní lokusy byl Infinite Allele Model (IAM), který popisuje ve své práci Kimura a Crow (964). Dle tohoto modelu každá mutace náhodně vytváří novou alelu s určitou frekvencí (μ). IAM je speciálním případem později uvedeného modelu K-alleles (KAM). V tomto modelu je K možných alel v daném lokusu a pravděpodobnost změny jakékoliv alely (K-) v jinou je stejná. Proto z dané alely vznikne jakákoliv ze zbývajících alel s frekvencí μ/(k-). IAM je speciálním případem KAM, protože je zde K =. Z principů výše uvedených modelů vyplývá, že u mikrosatelitních lokusů nelze sledovat historii vývoje daného lokusu na rozdíl od jiných mutačním modelů. Vývoj mikrosatelitů je dán především změnou v počtu repetic, ale z fylogenetického hlediska není pro tyto modely změna například o jednu repetici nebo o pět rozdílná, a proto nelze usuzovat na příbuznost jedinců apod. Úplně odlišný je model, který publikovali Kimura a Ohta (978) a nazývá se Stepwise Mutation Model (SMM). Základní varianta tohoto modelu popisuje se stejnou pravděpodobností zvýšení či snížení délky mikrosatelitu o jednu repetici. Tento model, či spíše jeho komplexnější varianty, je často využíván pro zjišťování příbuznosti jedinců a struktury populace, protože se předpokládá vyšší příbuznost jedinců, kteří mají podobný počet repetic. Na základě této teorie lze 46

48 sledovat historii populace a odvozovat některé události (například efekt hrdla láhve nebo efekt zakladatele) mající vliv na změnu frekvencí alel. Nežádoucím důsledkem SMM je i velikostní homoplasie (size homoplasy SH), podrobněji popsaná v kapitole S přibývajícími poznatky bylo nutné tento model upravit, protože některá experimentální pozorování jsou s ním v rozporu. Jedná se o zjištění, že velikost mikrosatelitů je z různých důvodů omezena (Garza et al., 995; Nauta a Weissing, 996) a pravděpodobnost přidání či ubrání repetice není stejná a u řady lokusů dochází spíše ke zvyšování počtu repetic než naopak (Dupuy, 4). Druhý zmiňovaný poznatek je přesným opakem k výsledkům in vitro pokusů (viz. výše), třebaže jeho platnost není absolutní (Huang et al., 2). SMM taktéž neobsahuje možnost přidání či ubrání více repetic najednou, což je zahrnuto v tzv. Two Phase modelu (TPM), kde k tomuto jevu může s nízkou frekvencí docházet (Rienzo et al., 994). TP model přiřazuje přidání či ubrání jedné repetice pravděpodobnost p a zároveň přidání či ubrání k repetic s pravděpodobností (-p). Následné studie u řady druhů ukázaly, že v některých případech může změna o větším počtu repetic dokonce převládat (Huang et al., 2). 47

49 3.2.8 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ FREKVENCE MUTACÍ Objev základního mutačního mechanismu podnítil další výzkum odhalující jevy ovlivňující frekvenci změn v počtu repetic mikrosatelitních lokusů. Možných příčin existuje celá řada a pravděpodobně mezi nejdůležitější lze zařadit činnost MMR (mismatch repair) systému, celkový počet opakujícího se motivu (repeat number), délku opakujícího se motivu (repeat type), lemující oblasti (flanking regions) a samotnou strukturu příslušného mikrosatelitu MMR (mismatch repair) systém Tento proteinový komplex je především zodpovědný za vyhledávání a opravu různých chyb vznikajících během replikace DNA. Význam opravného systému dokládá i vysoký stupeň konzervativnosti sekvencí u eukaryot i prokaryot (Jun et al., 6). MMR systém začal být podrobněji studován po zjištění, že některé druhy rakoviny souvisejí s jeho defekty (Peltomäki, ) a u řady typů nádorů byl jako průvodní jev zjištěna nestabilita mikrosatelitů (MSI microsatellite instability) (Dietmaier et al., 997), čehož se využívá i k predikci výskytu nádoru a odhadu úspěšnosti chemoterapie (Benatti et al., 5). Studie řady organismů prokázaly, že frekvence mutací s nefunkčním opravným systémem se může zvýšit až o několik řádů. Analyzované mutatní linie kvasinek (S. cerevisiae) s defektem v MMR vykázaly až násobné zvýšení frekvence mutací pro homopolymerové řady adeninu (A)4 až (A)4 oproti genotypu s funkčním MMR (Tran et al., 997). Důležitým genem, který je součástí MMR systému, je gen MSH2. U jedné skupiny C. elegans byl cíleně poškozen homolog MSH2 (msh-2) pomocí inzerce transpozonu Tc. To se projevilo vyšší frekvencí změn u různých typů mikrosatelitů přibližně o stonásobek oproti kontrolnímu souboru C. Elegans s funkčním homologem MSH2 (Degtyareva et al., 2). Rovněž u rostlin byl zkoumán vliv defektních homologů MMR na genomickou stabilitu. Leonard et al. (3) ve své studii analyzovali mutantní linii huseníčku (Arabidopsis thaliana), která má TDNA inzert v genu AtMSH2 způsobující defekt tohoto genu. Ke kvantitativní analýze inzercí/delecí vytvořili sadu genových konstruktů genu pro β-glukuronidázu (GUS) genů s různými typy a délkou repetic blíže 5 konci, způsobujících nefunkčnost konstruktu posunutím čtecího rámce (frameshit mutation). V případě mutace byla funkce genu obnovena a buňky se zbarvily do modra po ošetření látkou zvanou xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glukoronid). Studie potvrdila zvýšenou mutační frekvenci u MMR deficitních buněk, ale navíc ukázala, že u rostlin také záleží, jaká část rostliny je analyzována. U listových buněk byl zjištěn malý rozdíl mezi mutovanou a normální rostlinou, což podle autorů napovídá o méně účinném MMR systému oproti kvasinkovému či savčímu. Naopak u zárodečných buněk byly rozdíly mnohem patrnější, a proto se předpokládá, že zde je MMR systém stejně výkonný jako u živočichů a hub (Leonard et al., 3). 48

50 Poněkud paradoxní je zjištění, že některé geny tvořící MMR systém u člověka, kvasinky či huseníčku obsahují mononukleotidovou repetici adeninů či thyminů (Chang et al., ). Podle autorů funguje příslušná repetice jako přepínač (switch) umožňující regulovat frekvenci adaptivních mutací v evolučním časovém měřítku. Příkladem může být vysoká frekvence mutací u bakteriálních patogenů (Mrázek et al., 6) Počet opakujících se motivů Důležitým faktorem ovlivňujícím frekvenci mutací se ukázala být celková délka tj. počet mikrosatelitních opakování (repeat number) (Lai a Sun, 3). Základním poznatkem je, že s rostoucí délkou roste i počet mutací. Tento závěr se zdá být logický, protože narůstající počet repetic teoreticky zvyšuje šanci na replikační sklouznutí (Pearson et al., 5). Existuje řada příkladů kdy byla pozorována pozitivní korelace mezi délkou a mutační rychlostí. Pozorování kupříkladu vycházejí z rodokmenových studií (Vigoroux et al., 2; Seyfert et al., 8), komparativních studií (Dettman a Taylor, 4) a nebo studií využívajících plasmidové vektory s vloženými repeticemi (Wierdl et al., 997). Při řešení této otázky vyvstala další, která se týkala přesného typu závislosti tj. je-li je nárůst mutací s délkou lineárně nebo exponenciálně rostoucí. Ačkoliv stále ohledně tohoto tématu probíhají diskuse, současné poznatky podporují spíše exponenciálně rostoucí závislost (Lai a Sun, 3; Kelkar et al., 8) Rozsáhlou komparativní analýzou ortologních mikrosatelitních lokusů u lidí (Homo sapiens sapiens) a šimpanzů (Pan troglotydes) bylo prokázáno, že u mikrosatelitů s velkým počtem repetic (n>5) nejrychleji mutují tri- a tetranukletidové a naopak nejméně mononukleotidové motivy (Kelkar et al., 8). Důvodem je pravděpodobně schopnost tvořit rozličné sekundární struktury, například triplexy a kvadruplexy DNA, které následně narušují či přímo znemozňují správný průběh replikace (Wells et al., 5; Pearson et al., 5). Právě schopnost především trinukleotidových repetic tvořit sekundární struktury, bývá rozpoznávána jako příčina řady onemocnění (Usdin 8). 49

51 Další faktory Podrobněji byly popsány patrně nejdůležitější a nejvíce prozkoumané faktory ovlivňující frekvenci mutací mikrosatelitů (mutační mechanismy, MMR systém a závislost na délce mikrosatelitní repetice), ale mutační dynamika mikrosatelitních lokusů je značně komplexní, protože jevů více či méně ovlivňujících frekvence a typ mutací těchto lokusů existuje nepřeberné množství. Z tohoto důvodu lze zmínit jen několik málo příkladů. Příslušné faktory je možno rozdělit do pěti skupin (obr. 3.), a to z hlediska mutačního mechanismu, podstaty (nature) mikrosatelitu, genomického kontextu, individuálního biologického kontextu a vlivu různých typů selekce (Buschiazzo a Gemmell, 6). Nicméně tato kategorizace nevystihuje skutečnost, že řada jevů spolu nějakým způsobem souvisí či interferuje a není snadné jednoznačně rozpoznat příčinu způsobující změnu v daném lokusu. Navíc u mnoha faktorů existují studie potvrzující vliv příslušného jevu a naopak studie, které jakýkoliv vliv popírají nebo je jeho efekt statisticky neprůkazný. Proto řada poznatků zůstává v současné době kontroverzní. Obr. 3.: Faktory ovlivňující dynamiku mikrosatelitních lokusů (upraveno dle Buschiazzo a Gemmell, 6) 5

52 Důležitý vliv na mutaci mikrosatelitního lokusu může mít jeho lokalizace v určitém místě genomu či určitém chromozomu. Studium frekvence mutací mikrosatelitů na Y chromozomu člověka (H. sapiens sapiens) neprokázalo rozdílnost od frekvence mutací na autozomech (Kayser et al., ). Tento poznatek rovněž přispěl k zamítnutí rekombinace jako hlavního mutačního mechanismu pro mikrosatelitní sekvence. Naopak u X gonozomu Chow et al. (5) popisuje mnohem nižší polymorfismus a tedy i nižší frekvenci mutací oproti autozomálním chromozomům. Dále byla zjištěna řada mikrosatelitních lokusů v nekódujích regionech vyznačujících se vysokou konzervativností (Zhang et al., 6). Mikrosatelitní lokus v těchto případech hraje roli cis regulačního elementu některých genů (Zhang et al., 6; Buschiazzo a Gemmel, ) a je tedy vystaven značnému selekčnímu tlaku. Vliv polohy v genomu ukazuje i příklad mikrosatelitních lokusů s repeticemi (TA)n a (TAA)n, které se vyskytují v těsné blízkosti (27 bp) a navzájem se ovlivňují z hlediska expanze a kontrakce (Udupa et al., 4). Význam mají i faktory jakými je metabolismus, pohlaví a stáří daného organismu či prostředí ve kterém žije. Obecně je u samců předpokládána vyšší frekvence mutací než u samic, vzhledem k mnohonásobně většímu počtu meotických dělení samčích zárodečných buněk. Často se tedy mluví o tzv. male driven evolution či sex biased mutation. U lidí (Ellegren, a) a obecně vyšších primátů (Makova a Li, 2) byl tento předpoklad potvrzen zjištěním 2-6 x vyšší frekvence mutací u samců oproti samicím. Je doložen i opačný případ, a to u vlaštovek (Hirundo rustica), kde byla zjištěna neobvykle vysoká míra mutací v lokusech HrU6 a HrU u samic oproti samcům (Brohede et al., 2). Pro tento poznatek nemají vysvětlení ani autoři příslušné studie. Podobná analýza byla provedena u nahosemenných rostlin u chloroplastové (cpdna) a mitochondriální (mtdna) DNA. Výhodou analýzy nahosemenných rostlin je předávání cpdna nebo mtdna, v závislosti na příslušné čeledi, paternálně nebo maternálně, což umožnilo srovnání frekvence substitucí u neutrálních lokusů. Vyšší frekvence mutací u obou typů DNA byla zjištěna pro samčí gamety (samčí zárodečnou linii) (Whittle a Johnston, 2). Příkladem vlivu mikroklimatu je analýza ječmene (Hordeum spontaneum) v místě výstižně přezdívaném evoluční kaňon (Evolution Canyon), což je v tomto případě údolí, ve kterém na malé ploše existují kontrastní podmínky prostředí (Nevo et al., 5). Autoři zde detekovali řadu rozdílů ve variabilitě a frekvenci 9 SSR lokusů a ukázali silný vliv prostředí na adaptaci organismů. Přírodní výběr se ukázal být hlavní formující silou, ve srovnání s migrací či genetickým driftem, v diferenciaci a variabilitě mikrosatelitních lokusů (Nevo et al., 5). 5

53 3.2.9 MIKROSATELITY JAKO MOLEKULÁRNÍ MARKERY Výhody a nevýhody mikrosatelitních markerů Mikrosatelity nebo-li SSRs Simple Sequence Repeats či STRs Short Tandem Repeats jsou řadu let jedny z nejoblíbenějších molekulárních markerů (Schlötterer, 4). Důvod jejich obliby spočívá v řadě předností oproti jiným typům markerů. Mezi klady lze počítat výskyt ve všech dosud studovaných eukaryotních a prokaryotních organismech, vysoký stupeň variability a tedy informační hodnoty na lokus, jedná se kodominantní markery, a proto lze rozlišit homozygotní a heterozygotní jedince, dále se vyznačují specifičností, reprodukovatelností a tedy možností srovnání výsledků mezi laboratořemi (Powell et al., 996; Ellegren, 4; Oliveira et al., 6). Mezi další klady bývá obvykle řazeno relativně rovnoměrné rozprostření a vysoká abundantnost v genomu (Ellegren, 4), ale tato tvrzení mají v současné době již omezenou platnost. Jak již bylo uvedeno, řada studií ukázala rozdílnou denzitu mikrosatelitů v různých částech chromozómu (Guo et al., 9) a u rostlinných druhů negativní korelaci mezi velikostí genomu a počtem SSR (Morgante et al., 2). Proto u podrobně zkoumaných organismů nemusí být počet mikrosatelitních lokusů, a tedy potenciálních markerů, v některých oblastech genomu dostačující. V těchto případech bývají preferovány spíše SNP markery, ale u nemodelových organismů jsou mikrosatelity často nejlepší volbou. Do určité míry lze ke kladům počítat možnost aplikovat SSR markery vyvinuté pro jeden druh u jiného, blízce příbuzného druhu, úspěšnost se liší případ od případu. Jako každý typ markeru mají i mikrosatelity několik nevýhod vyplývajících z jejich biologické podstaty nebo z principu použité molukárně-genetické metody. Interpretaci výsledků ztěžuje komplexní dynamika, rozdílná frekvence mutací jednotlivých lokusů a molekulárně nedetekovatelná velikostní homoplasie. Některé nevýhody pramení ze skutečnosti, že veškeré metody využívající mikrosatelity jsou založeny na PCR. Mezi zápory lze proto počítat častý výskyt nulové alely (null allele), tvorbu koktavých produktů (stutter bands) způsobených sklouznutím polymerázy během PCR reakce a přidávání netemplátového A. 52

54 Typy SSR markerů a jejich využití Markery můžeme rozlišovat na markery typu I a II. Typ I jsou markery asociované se známými genovými sekvencemi a vyskytují se tedy v transkribovaných oblastech. Takovéto markery bývají odvozeny z publikovaných cdna, EST či genových sekvencí, a u mikrosatelitů proto mluvíme o EST-SSR nebo genových mikrosatelitech. Tyto markery bývají vyvíjeny často in silico přístupem, kdy je proveden data mining v databázích typu NCBI či EMBL obsahujících terabyty sekvenačních dat (Kantety et al., 2; Pashley et al., 6). EST-SSR markery jsou velmi vhodné pro fylogenetické nebo populační studie, poskytují dodatečné informace o případné funkci či vlivu na daný gen, umožňují zanést pozici genu na genové mapě, mají často vyšší kvalitu oproti genomickým SSR (Varshney, 5), a protože se vyskytují v kódujících oblastech, jsou mezidruhově dobře přenosné s více než 5% úspěšností uvnitř rodu (Saha et al., 4). Nevýhodou je obecně nižší variabilita markerů vzhledem k vyšší konzervativnosti takovýchto sekvencí. Určitým limitem je i množství EST sekvencí pro určitý druh, jelikož SSR sekvence se vyskytují ve 2 až 5 % genů (Varshney, 5). Tento problém se samozřejmě netýká modelových organismů, u kterých jsou dostupné i tisíce transkribovaných sekvencí (Kikuchi et al., 3; Qi et al., 4; Rota et al., 5). Na druhou stranu lze v mnoha případech využít homologie řady genů u příslušného modelového organismu a otestovat navržené markery u organismu, který je předmětem našeho zájmu. Typ II markerů byl do nedávné doby pro mikrosatelity typičtější. Jedná se především o anonymní genomické sekvence v nekódujících oblastech. Získávání takovýchto SSR markerů často probíhá na základě tvorby genomické knihovny, která je obohacena na požadované repetitivní sekvence (jedná se o tzv. de novo tvoření). Následuje screening, sekvenování a testování získaných markerů (Ritschell et al., 4; Hirata et al., 6). Tento způsob je náročnější z hlediska požadavků na výbavu laboratoře a materiálu, ale u málo prostudovaných organismů představuje prakticky jedinou možnost (Wang et al., 4). Výhodou genomických SSR je, že se zpravidla jedná o tzv. neutrální lokusy. U takovýchto lokusů probíhá pouze náhodná mutace a nebývají ovlivněny žádným typem selekce, čehož se využívá v populačních studiích nebo molekulárním datování, jelikož řada populačních modelů neutralitu předpokládá. Oba typy mikrosatelitních markerů patří mezi nejuniverzálnější markery vůbec (Buschiazzo a Gemmell, 6) jak dokládá celá řada aplikací v oblasti molekulárně-genetického a obecně biologického výzkumu. Velký význam měla a má tvorba mikrosatelitních rekombinantních map, kde genomické SSR umožňují zmapovat velké části chromozomů a EST-SSR markery mapu zahustí v místech genů. Takovéto mapování umožňuje provádět asociační studie k lokalizaci příčin řady dědičných chorob, poziční klonování pro QTL analýzy a komparativní analýzy (Kong et 53

55 al., 2; Somers et al., 4; Varshney et al., 5). Značného využití se mikrosatelity také dočkaly v populačních studiích při řešení otázek týkajících se struktury a dynamiky populace, genového toku, přiřazení jednotlivců k příslušné populaci, a frekvence migrací (Zastera et al., ). Samostatnou oblastí výzkumu se v poslední dekádě staly choroby spojené s expanzí tandemových repetic, zmiňované v přechozích kapitolách. Mikrosatelitní markery rovněž bývají často aplikovány v rodičovských analýzách při určování paternity a maternity (Chakraborty et al., 999), fylogenetických studiích (Matsuoka et al., 2) nebo ve šlechtitelských programech (Gupta a Varshney, ) kde mluvíme o tzv. markery asistované selekci (MAS) Chyby při genotypování u SSR markerů Nulové alely Ke zkreslení výsledků může docházet výskytem neamplifikujích čili nulových alel (null alleles). Dakin a Avise (4) definují nulovou alelu jako jakoukoliv alelu, u které opakovaně selhává amplifikace pomocí polymerázové řetězová reakce (PCR). Výskyt takovýchto alel popisuje celá řada studií jak u živočichů (Ishibashi et al., 996; Wang et al., ; Pokrywka et al., 4), tak u rostlin (Saito et al., 3). O vážný problém se může jednat především u populačních studií a značné komplikace mohou nulové alely způsobit také v rodičovských analýzách (parentage analysis). Detekce nulových alel je nesnadná a obtížná, protože se jedná z podstaty o recesivní mutaci. Pokud je tedy jedinec v daném lokusu heterozygot a jedna z jeho alel je nulová, pak se při elektroforetickém hodnocení jeví jako homozygot díky jediné aktivní alele (De Sousa et al., 5). Výskyt nulových alel může značně kolísat i v rámci jednotlivých lokusů a pokud se nevyskytují u relativně velkého počtu jedinců v dané populaci, tak nelze zaznamenat extrémní odchylku od HW rovnováhy. Odhadovaná či zjištěná frekvence nulových alel má značný interval rozpětí v závislosti na příslušné studii. Molekulární podstata nulových alel spočívá nejčastěji v mutacích typu substituce (Paetkau a Strobeck., 995; Ishibashi et al., 996) či inserce/delece (Jones et al. (998) v místě nasedání (priming site) jednoho nebo obou příslušných primerů, což znemožní následnou amplifikaci pomocí PCR. Zejména nesprávné spárování na 3 konci primeru, tedy místa kde dochází k elongaci řetězce, jsou považovány za obzvláště nežádoucí (Dieffenbach et al., 9; Ayyadevara et al., ;). Primery jsou navrhovány tak, že nasedají na lemující oblasti (flanking regions), tedy sekvence obklopující mikrosatelitní opakování, a pomocí PCR pak dochází k namnožení celého úseku DNA, který zahrnuje i části sekvencí předcházejících a následujících tu mikrosatelitní. Variabilita mikrosatelitního lokusu je poté vyhodnocena na základě rozdílné velikosti amplikonu, o které se 54

56 předpokládá, že je způsobena rozdílem v počtu mikrosatelitního opakování. Mnohem méně se už bere v úvahu i variabilita lemujících oblastí, ačkoliv Lehmann et al. (996) tuto variabilitu zahrnuje ve své studii o evoluci mikrosatelitních lokusů. Druhou možnou příčinou výskytu nulové alely může být jev nazývaný selektivní či preferovaná amplifikace jedné alely (short allele dominance či long allele dropout) u heterozygotního jedince (Walsh et al., 992). Během amplifikace je kratší alela amplifikována s vyšší účinností oproti druhé delší alele. Díky tomuto PCR artefaktu lze pak snadno zaměnit heterozygotního jedince za homozygotního. Asymetrie při amplifikaci může být způsobena řadou faktorů ve složení reakční směsi jako je obsah MgCl2, přidání různých aditiv (DMSO, formamid apod.) či množstvím a typem polymerázy, dále teplotním profilem průběhu reakce a počtem cyklů PCR, což dokládají ve své studii na několika minisatelitních VNTR Kaiser et al. (2). Navíc Wattier et al. (998) jednoduchým a elegantním pokusem ukázal, že dominance kratší alely je způsobena také kompetitivní povahou PCR a není dána jen rozdílnou délkou alel. Podstata pokusu spočívala ve vytvoření 4 velikostních tříd alel (A až D) na základě jejich délky ze 7 haploidních jedinců Gracilaria gracilis a smícháním dohromady způsobem každý s každým (př. AC, AD atd.). Smícháním různě velkých alel dvou haploidů tak vznikl diploidní heterozygot. Bylo zjištěno, že ve všech případech bez ohledu na délku alely, byla každá alela mnohem lépe viditelná pokud byla testována samotná, což potvrdilo hypotézu kompetice mezi alelami. Z výše zmíněných důvodů bývají nulové alely, které jsou důsledkem selektivní amplifikace, nazývány částečně nulovými (partial nulls), protože je lze vizualizovat pouhou úpravou reakčních podmínek. Poslední důvod neamplifikace mikrosatelitního lokusu spočívá v nízké kvalitě templátové DNA, která může být silně degradována či znečištěna látkami inhibujícími amplifikaci a nebo v jejím malém množství obsaženém v reakční směsi. Tato příčina se těžko odhaluje, pokud nedochází k amplifikaci jen u několika genotypů či málo lokusů a všechny vzorky byly izolovány stejnou metodou. V dnešní době jsou používány různou měrou dva způsoby řešení problematiky výskytu nulových alel. První okruh zahrnuje několik statistických přístupů k problematice a jedná se tedy o řešení nepřímá. Jedněmi z nejčastěji používaných metod jsou ty, jež využívají vztahu mezi frekvencí nulových alel a deficitu heterozygotů v populaci. První, kdo s úvahami o vlivu nulových alelel na deficit heterozygotů (či nadbytek homozygotů) v populaci oproti H-W rovnováze přišel, byl Chakraborty et al. (992). Tentýž autor zavedl v současnosti hojně užívané estimátory H E (heterozygosity expected čili heterozygotnost očekávaná) a HO (heterozygosity observed čili heterozygotnost pozorovaná). Hodnoty očekávané heterozygotnosti (H E) jsou počítány na základě H-W rovnováhy a tedy bez předpokladu výskytu nulových alel. Porovnáním se skutečným 55

57 výskytem heterozygotnosti (HO) lze pak zjistit významné diference těchto hodnot způsobené vysokou frekvencí homozygotů a upozornit na možný výskyt nulových alel. Na tuto studii navazuje Brookfield (996), který správně poukázal na to, že tento přístup nezahrnuje jedince se dvěmi nulovými alelami (jelikož Chakrabortyho metoda předpokládá technickou chybu v amplifikaci DNA apod.) a provedl korekci těchto estimátorů. Nevýhodou daných algoritmů je předpoklad populační rovnováhy a proto Van Oosterhout et al. (6) přišli s modelem pro populace, které v rovnovážném stavu nejsou. Na druhou stranu je pro jeho algoritmus zapotřebí znát jiné charakteristiky jako je inbrední koeficient ap. Ostatně při vyhodnocování odchylek od H-W rovnováhy je nezbytné brát v úvahu důvody těchto odchylek, kterou mohou být způsobeny právě inbrídingem či tzv. Wahlundovým efektem. V opačném případě může dojít k získání zkreslených údajů na základě předpokladu výskytu nulových alel, které tam však ve skutečnosti nejsou. Lehce odlišný způsob statistického řešení výskytu nulových alel je využití celé řady pravděpodobnostních algoritmů (Demster et al., 977; Kalinowski a Taper, 6), jež jsou součástí populačně-statistických programů mezi které patří například Genpop ver. 4. (Rousset, 8) či Cervus ver. 3. (Kalinowski et al., 7). Zde jsou využívány ke korekci vložených dat což znamená, že přítomnost nulových alel není předpokládána a priory, ale je brána v úvahu až dodatečně. Tento způsob analýzy dat má zabránit nadhodnocení frekvence nulových alel, je-li nadbytek homozygotů způsoben jinou příčinou (viz. výše). V současnosti také narůstá množství počítačových simulací studujících evoluční dynamiku mikrosatelitních lokusů, což zahrnuje i vliv a četnost nulových alel na výsledky populačních či příbuzenských studií (Chapuis a Estoup, 7). Tento in silico přístup umožňuje porovnávat jednotlivé algoritmy mezi sebou nebo testovat nové (Wagner et al., 6) a určit jakou mají předpovídací schopnost vzhledem k empiricky získaným údajům. Přímým řešením je navržení nových primerů a (v případě úspěšné amplifikace) sekvenovaní a porovnání daných sekvencí. Tímto způsobem Jones et al. (998) odhalili v jedné populaci ryb rodu Cyprinodon tularosa z čeledi halančíkovcovitých tři nové polymorfní alely u jedinců, kteří předtím nevytvářeli žádný viditelný PCR produkt. Paetku a Strobeck (995) odvodili existenci nulové alely v lokusu GP u asijských černých medvědů (Ursus thibetanus) díky chybějícímu spojení mezi otcem a jeho dvěma potomky. Navíc se v tomtéž lokusu u severoamerických černých medvědů (Ursus americanus) projevil nadbytek homozygotů. Navržením nových primerů a sekvenováním odhalili, že příčina výskytu nulové alely spočívala v transverzi G na C v 3 konci originálního primeru. Otestováním u ostatních druhů bylo zjištěno, že C alela se vyskytuje pouze u 4 druhů medvědovitých a u dalších 4 nikoliv. 56

58 Velikostní homoplasie Homoplasie je termín původem z evolučních studií, kterým se vystihovala skutečnost, že určitá vlastnost přítomná u dvou či více druhů nemusí mít stejný původ (tj. nepochází od společného předka) a její příčinou je evoluční konvergence, paralelismus či reverze (Estoup et al., 2). Mikrosatelitními alelami, z hlediska elektroforetických separačních technik, rozumíme různě velké fragmenty DNA a můžeme tedy mluvit o elektromorfách (Adams et al., 4). Elektromorfy se mohou jevit jako stejné (mají stejnou velikost), ale nemusejí mít stejný původ a proto hovoříme o tzv. velikostní homoplasii (size homoplasy - SH). Pro určitou kategorii mikrosatelitů lze detekovat část alel stejné velikosti. K detekci sekvenčních rozdílů lze využít několik molekulárních technik, například SSCP (Angers et al., ) a sekvenování (Culver et al., ) či jejich kombinaci. Takto detekovatelnou SH obvykle definujeme jako molekulárně dosažitelnou velikostní homoplasii (MASH). Evoluci řady mutací majících za následek velikostní homoplasii však vůbec nelze molekulárními technikami postihnout a proto je nelze mezi MASH zařadit (např. dva jedinci mají mikrosatelitní opakování (TTC)6, u jednoho však vzniklo replikačním sklouznutím přidávajícím opakování z (TTC)5 na (TTC)6 a u druhého naopak sklouznutím ubírajícím opakování tj. z (TTC) 7 na (TTC)6 apod. a příčina stejné velikosti je tedy ve většině případů molekulárně nedetekovatelná). Eliminovat nesprávné údaje na základě SH není nikdy možné, ale komplexním studiem mikrosatelitních lokusů lze alespoň snížit množství chybně získaných dat a případnou dezinterpretaci výsledků. Vzhledem k výše zmiňované skutečnosti lze pouze odhadovat dopad na výsledky studií o diverzitě, evoluci a struktuře populací. Stejně jako u nulových alel se frekvence výskytu SH může značně lišit i mezi jednotlivými lokusy (Culver et al., ). Současné studie ukazují, že MASH se vyskytuje ve větší míře mezi druhy a u jednoho druhu spíše mezi populacemi než v rámci jedné populace (Estoup et al., 2). 57

59 Netemplátové přidávání nukleotidů a koktavé produkty Princip netemplátového přidávání nukleotidů během PCR odkazuje na vlastnost Taq polymerázy. Tento enzym při dokončování elongace vymezené sekvence někdy přidává za poslední nukleotid ještě jeden další, který nemá svou předlohu v templátu. Nejčastěji se jedná o adenin a proto se mluví o tzv. netemplátovém A či + A. Tato vlastnost pak komplikuje vyhodnocení velikosti příslušného fragmentu a ztěžuje detekci správné alely. Frekvence chybně vyhodnocených fragmentů se podle Smitha et al. (995) pohybuje od do 3 %. Ti však hodnotili přidávání netemplátového A pomocí kapilární elekroforézy s dodávaným softwarovým vybavením. Tato semiautonomní metoda je k chybám méně náchylná (Pompanon et al., 5). Jinými slovy to znamená, že chybovost při okometrickém hodnocení gelu může být znatelně vyšší. Dalším, částečně souvisejícím problémem, je výskyt tzv. koktavých produktů (stutter bands), které jsou důsledkem replikačního sklouznutí polymerázy během PCR. Během elongačního cyklu může malá procesivita polymerázy a další jevy způsobit, že při syntéze mikrosatelitní části sekvence polymeráza nenasyntetizuje celou délku mikrosatelitního opakování, ale o jedno až několik opakování méně. Výsledkem jsou fragmenty o příslušný počet opakování menší než skutečná alela. Mohou tak vznikat fragmenty o stejné intenzitě jako skutečná alela a proto se může stát, že jedinec je například chybně hodnocen jako heterozygot a ne jako homozygot. Situace je komplikovanější tím, že někteří jedinci mohou být heterozygotní a mít druhou alelu o jediné opakování kratší (Hoffman a Amos, 5). Oba zmiňované problémy se dají omezit optimalizací celého procesu analýzy, od kvalitně vyizolované DNA, přes složení reakční směsi až po průběh teplotního programu, čímž se zajistí specifický annealing příslušných primerů daného lokusu, ale nelze je zcela eliminovat. Každý mikrosatelit vyžaduje různé podmínky pro optimální amplifikaci a má větší či menší sklony k produkci těchto nespecifických amplikonů, proto je důležité provést kontrolu sporných alel zopakováním analýzy a popřípadě pomocí sekvenování. 58

60 4. MATERIÁL A METODY 4. OBECNÁ KONCEPCE KOMPLEXNÍ ANALÝZY MIKROSATELITŮ Před samotným výčtem použitého materiálu a metod je vhodné nastínit základní strategii a koncepci pokusů pro řešení problematiky týkající se charakterizace genových zdrojů chmele. Z hlediska cíle práce bylo nutné zohlednit řadu jevů souvisejících s mikrosatelitními lokusy, pokud chceme považovat analýzu za relativně přesnou a komplexní. Hlavním požadavkem je proto minimalizace a identifikace chyb, které se v průběhu analýz objevují, ověření základních předpokladů o mikrosatelitech, reprodukovatelnost výsledků a získání maximálního množství informací o studovaných lokusech. Kombinaci metod a postup řešení shrnuje schéma 4.. Obr. 4.: Schéma analýz mikrosatelitních lokusů 59

61 Mezi příčiny zvýšené nepřesnosti výsledků lze počítat tzv. přidávání netemplátového A, koktavé produkty (stutter bands), velikostní homoplasii (size homoplasy) a nulovou alelu (null allele). K eliminaci těchto chyb byla použita kombinace několika níže uvedených molekulárněgenetických technik (SSR, SSCP a sekvenování) a statistických analýz, protože každý jev, snižující vypovídací schopnost studie, vyžaduje odlišný způsob řešení. Aplikace více metod najednou navíc umožňuje nejenom snížení množství chyb vzájemnou kontrolou získaných údajů, ale také garantuje splnění přísných kritérií kladených na reprodukovatelnost výsledků. 4.. PŘIDÁVÁNÍ NETEMPLÁTOVÉHO A A KOKTAVÉ PRODUKTY Tyto dva jevy nelze úplně eliminovat a jsou nedílnou součástí každé analýzy mikrosatelitních lokusů. Je však možné snížit jejich výskyt na únosnou mez, aby nedocházelo k chybné identifikaci skutečných alel. Jedinou možností je kvalitní optimalizace jak amplifikace daných markerů tak použitých metod. Z těchto důvodů byla této části práce věnována značná pozornost. Podrobnější informace o výsledcích optimalizace jsou v kapitole 5. Výsledky a diskuze VELIKOSTNÍ HOMOPLASIE Detekce velikostní homoplasie vyžadovala kombinaci všech molekulárně genetických metod používaných v této práci. Detekce velikostní homoplasie byla koncipována jako třístupňový proces, uskutečnitelný i v podmínkách naší laboratoře. Nejprve byly detekovány všechny alely a porovnány veškeré vzorky pomocí SSR metody. Na základě výsledků SSR metody byly seřazeny a separovány vzorky se stejnou velikostí alel vedle sebe. Tímto způsobem se zvýšila přesnost SSCP metody při identifikaci rozdílných elektromorf, které byly nakonec vyříznuty a osekvenovány NULOVÁ ALELA Z výše uvedeného schématu lze nabýt dojmu o snadnosti detekce nulové alely, ale opak je pravdou. Řada statistických programů (Cervus 3., Genpop 4. aj.) může napomoci při odhalování nulových alel, především na základě zjištění odchylek od H-W rovnováhy, ale právě tato skutečnost je i jejich slabinou. Frekvence nulových alel nemusí být vysoká a tedy statisticky detekovatelná nebo může existovat jiná příčina nerovnovážného stavu. Navíc je tento způsob nepoužitelný u světové kolekce planých chmelů, jelikož se v pravém slova smyslu nejedná o populaci. Proto byl zvolen způsob přímé detekce nulové alely a byly prověřeny polymorfní lokusy s vysokou frekvencí homozygotů nebo počtem neamplifikujících vzorků, které v jiných lokusech bez problémů amplifikují. Jediné možné řešení pro ověření hypotézy o výskytu nulové alely tedy bylo navržení nové sady primerů a opakování SSR analýzy. Detekované nulové alely pak byly osekvenovány. 6

62 4.2 ROSTLINNÝ MATERIÁL Pro analýzu bylo použito celkem 349 rostlin planého a kulturního chmele (Humulus lupulus L.), 5 rostlin chmele japonského (Humulus japonicus Sieb. et Zucc.) a 3 samičí rostliny konopí setého (Cannabis sativa L). Z hlediska prováděných genetických analýz je vhodné tyto materiály rozdělit do dvou následujích skupin s počtem vzorků uvedeným v závorkách První skupinu tvořily plané chmely pocházející z kolekce genobanky Chmelařského institutu s.r.o. v Žatci. Tyto vzorky (8) byly získány z různých geografických oblastí celého světa. Konkrétně se jednalo o vzorky z Francie (23), Kavkazu (32), Kanady (4), USA (25), Belgie (3), Bulharska (2), Rakouska (2), Španělska (28), Švýcarska () a České republiky (5). Jedná se o náhodné odběry v řadě lokalit daného regionu, které slouží jako potenciální genový zdroj pro novošlechtění. Do druhé skupiny jsou řazeny rodiče a potomstvo kombinačního křížení. K analýze bylo vybráno kombinační křížení Kombinace. Toto křížení má původ v dnes již registrované odrůdě Vital opylené otcovkou komponentou značenou /5. Do analýzy bylo zahrnuto, kromě obou rodičů, celkem 8 potomků. Každý odebraný genotyp z tohoto křížení byl označen třímístným číselným kódem dle značení Chmelařského institutu s.r.o. Třetí skupina byla tvořena 48 vybranými registrovanými odrůdami nebo materiálů z novošlechtění z jedenácti zemí původu. Seznam těchto odrůd je uveden v tabulce 8. v kapitole 8. Přílohy. 4.3 IZOLACE DNA Z každé rostliny bylo odebráno několik listů a z nich izolována DNA pomocí komerčního kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Izolace byla provedena dle manuálu výrobce s přidáním mg PVP (polyvinylpyrrolidon) do každého vzorku. Při izolaci DNA ze starých listů či vzorků s extrémně vysokým obsahem polyfenolických a jiných látek byl postup upraven dle Landergott et al. (6). Modifikace spočívala v přidání μl 25% (w/v) roztoku PVP v kroku, který slouží k vysrážení bílkovin. Po navázání DNA na membránu bylo aplikováno 2x 6 μl tzv. odsolovacího pufru [4 mm NaCl, mm Tris (ph 7,5), 2 mm EDTA (ph 7,5) a ethanol (5% v/v)] a poté x 5 μl 8% (v/v) roztoku ethanolu. 6

63 4.4 PCR 4.4. MIKROSATELITNÍ MARKERY K analýze byly vybrány mikrosatelitní lokusy a použity primery jejichž sekvence publikovali Jakše et al. (2), Hadonou et al. (4), Štajner et al. (5), Bassil et al. (5), Jakše et al. (7), Patzak et al. (7) a Jakše et al. (8). Konkrétně byly testovány lokusy HlGA3, HlGA4, HlGA9, HlGA29, HlGT, HlGT4, HlGT5, HlGT6, HlGT9, HlGT, HlGT2 (Jakše et al., 2), EMHL58 (Hadonou et al., 4), HLC-A, HLC-D, HLC-2B, HLC3A, HLC-4B, HLC-5B, HLC-6, HLC-7 (Bassil et al., 5), HlAGA6, HlGA3, HlGT6, HlGT7, HlGA36, HlACA3, HlAGA8 (Štajner et al., 5), HlAGA7 (Štajner et al., 5; Jakše et al., 7), NDBP (Patzak et al., 7), ACC2-D3-3, GA2-L2-5, GA6-N2-4, GA4-K6-8, GA4-H5-8, GA6-P-4, AGA4-D6-2, ACC4-A8-9, GA7-I6-6 a GA5-G3- (Jakše et al., 8). Pro ověření hypotézy o výskytu nulové alely v lokusech HlGA9, HlGA29, HlGT5 a HLC-2B byly navrženy nové primery, jejichž sekvence uvádí tabulka 4.. Tab. 4.: Sekvence primerů k detekci nulové alely lokus HlGA29 HlGT5 HlGA9 HLC-2B primer sekvence primeru (5-3 ) HlGA29_CZU_F TGCTAAACATTCCCCTATTTCC HlGA29_CZU_R ACGTGGGTCTTGGTTTCGT HlGT5_CZU_F TTGATGCTAAGATTCCCCATC HlGT5_CZU_R AGAGGAAATCATGTTGTCATGG HlGA9_CZU_F CCTGAATTGGGAGAACAGAGA HlGA9_CZU_R AGACATAGACCCACCCCAAC HLC-2B_CZU_F TGAATTGTGACCCCAACAGA HLC-2B_CZU_R TGTGGAGTCATCCAGAACCA K dosažení optimálních reakčních podmínek a vysoké specifity amplifikovaných produktů bylo provedeno testování a případná optimalizace PCR. Testování nejprve spočívalo v ověření amplifikace daných markerů dle protokolů uvedených příslušnými autory. Pokud nebylo dosaženo požadované kvality amplikonů, bylo na základě výsledku od dalšího testování buď upuštěno a nebo byla provedena optimalizace, která se týkala především úprav koncentrace jednotlivých složek reakční směsi, annelační teploty a celkového teplotního profilu PCR. 62

64 4.4.. Singleplex PCR Optimalizovaná amplifikace jednotlivých mikrosatelitů probíhala v reakční směsi o finálním objemu 2,5 μl. Tato reakční směs obsahovala ng templátové DNA a,5 U Taq polymerázy (Roche). Reakční směs dále obsahovala x KCl [ mm Tris-HCl,,5 mm MgCl 2, 5 mm KCl, ph 8.3] či x (NH4)2SO4 pufr [75 mm Tris-HCl, mm (NH4)2SO4,.% Tween ],,2 mm dntp, 2 mm PCR Enhacer [TMA-oxalát] (Top-Bio),,4 μm pro každý z příslušného páru primerů a,4 μg μl- BSA. Finální koncentrace MgCl2, je uvedena v tab společně s optimálními annelačními teplotami, počtem cyklů a typem pufru. Tabulka 4.2 uvádí pouze úspěšně testované či optimalizované mikrosatelitní lokusy. Tab. 4.2: Teplotní profil singleplex PCR lokus HlGA3 HlGA9 GA2-L2-5 GA6-N2-4 GA4-K6-8 GA4-H5-8 HLC-D HLC-2B HLC-5B HlAGA6 HlGT7 HLC-2B_CZU HlGA4 HlGA29 HlGT5 HlGT9 HlGT HlGT2 HlGT5_CZU teplota init. Ta ( C) snižování na cyklus ( C) ,5 N Ta ( C) N2 pufr (NH4)2SO4 - KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl MgCl 2 (mm) 2,5 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5 2,5,5,5,5,5,5 Amplifikace SSR markerů byla provedena v termocykleru C (Bio-Rad) či DNAengine (Bio-Rad) s nebo bez počátečního touchdown protokolu (tzv. TD-PCR). Jednotlivé kroky PCR se skládaly z předdenaturace při 95 C 4 min. (platí pro TD-PCR i standardní PCR), poté následovalo v případě TD-PCR opakování denaturace při 94 C 45 s., annealingu při počáteční annelační teplotě (init. Ta) 3 s. a elongace při 72 C 9 s. po dobu N cyklů. Dále pokračuje (v případě TD-PCR) či začíná (v případě standardní PCR) opakování denaturace při 94 C 45 s., annealingu při příslušné annelační teplotě (Ta) a elongace při 72 C 6 či 9 s. po dobu N2 cyklů. Amplifikace byla ukončena finální elongací při 72 C 8 min. s následným ochlazením vzorků na 4 C. 63

65 Multiplex PCR K multiplexové PCR byly využity primery optimalizované pro klasickou gelovou elektroforézu, které byly doplněny několika primery testovanými pouze na kapilární elektroforéze. K testování takovýchto primerů byla využita metoda dle Schuelke (). Pro účely multiplexové PCR a následné separace pomocí kapilární elektorforézy byly všechny forward primery fluorescenčně značeny příslušným fluoroforem (tabulka 4.3), kdežto reverse primery zůstaly neznačené. Jednotlivé sety primerů pro multiplexovou PCR byly skládány na základě jejich kombinační schopnosti určené pomocí online verze programu Autodimer (Vallone and Butler, 4) a annelačních teplot. U všech kombinací bylo nutné provést optimalizaci, která se týkala především úpravy koncentrace jednotlivých primerů. Reakční směs pro PCR o finálním objemu 2,5 μl obsahovala ng templátové DNA a,5 U Taq polymerázy (Roche). Dále obsahovala x KCl [ mm Tris-HCl,,5 mm MgCl 2, 5 mm KCl, ph 8.3],,2 mm dntp, 2 mm PCR Enhacer [TMA-oxalát] (Top-Bio) a,4 μg μl - BSA. Koncentrace každého z páru primerů je uvedena v tabulce 4.3. U kombinací K, 2K a 5K probíhala amplifikace se všemi primery v jedné zkumavce. Pro kombinace 3K a 4K bylo nutné použít tzv. pseudomultiplex PCR, kdy probíhá několik PCR reakcí zvlášť a produkty daných reakcí jsou smíchány až před vlastní separací. V tabulce 4.3 jsou společně amplifikované primery u kombinací 3K a 4K označeny shodným písmenem. Amplifikace a separace lokusů GA6-N2-4 a GA4-H5-8 musela být provedena samostatně u vzorků z USA a Kanady. Rovněž u těchto vzorků musel být každý lokus kombinace 4K amplifikován samostatně a teprve poté smíchán a separován. Amplifikace fluorescenčně značených markerů byla provedena v termocykleru C (BioRad) či DNAengine (Bio-Rad) s nebo bez počátečního touchdown protokolu. TD-PCR byla použita u kombinací 3K a 4K. V těchto případech byla iniciační annelační teplota (init. Ta) o 5 C vyšší než je udávaná annelační teplota (Ta), přičemž docházelo ke snižování init. Ta o C/cyklus po dobu 5-ti cyklů. Další průběh TD-PCR je stejný jako pro standardní PCR. Jednotlivé kroky PCR se skládaly z předdenaturace při 95 C 4 min., a poté následovalo N cyklů kdy se opakovala denaturace při 94 C 45 s., annelace při příslušné Ta a elongace při 72 C 6 s. Amplifikace byla ukončena finální elongací při 72 C 8 min a ochlazením na 4 C. 64

66 Tab. 4.3: Kombinace pro multiplex PCR kombinace K 2K fluorofor koncentrace primerů (µm) GA2-l2-5 PET,32 GA6-N2-4 VIC,32 GA4-K6-8 NED,32 HlGT 6-FAM,2 HlGT2 6-FAM,2 HlGA9 PET,2 HlGT9 NED, 6-FAM,2 PET,24 PET,6 lokus HlGT5_CZU a HLC-D* a HlGA3* 3K VIC,2 GA4-H5-8 FAM,2 HlGT7c HlAGA6b b 4K 5K NED,6 HLC-4B d 6-FAM,2 HLC-5B d NED,2 HLC-2Be VIC, HlC-6e PET,32 HlAGA7 6-FAM,2 GA5-G3- NED,2 HlGA4 VIC,2 NDBP PET,4 Ta ( C) N cyklů * VIC,4 HLC-3 Vysvětlivky: a, b, c, d, e značí u pseudomultiplex PCR primery použité v jedné reakční směsi; * - primery amplifikující při dané teplotě 65

67 4.4.2 MARKERY K IDENTIFIKACI POHLAVÍ ROSTLIN Jako součást hodnocení variability byly studovány markery sloužící k identifikaci pohlaví analyzovaných rostlin. V současné době jsou publikovány 4 markery specifické pro samčí pohlaví, které byly otestovány a porovnány STS marker dle Polley et al. (997) Amplifikace tohoto STS markeru vzniklého konverzí RAPD markeru, byla provedena dle Patzak et al. (2), ale vzhledem k značnému množství nespecifických produktů bylo nutné optimalizovat složení reakční směsi a především annelační teplotu. Reakční směs v které probíhala amplifikace o finálním objemu 2,5 μl obsahovala ng templátové DNA a,5 U Taq polymerázy (Roche). Reakční směs dále obsahovala x KCl [ mm Tris-HCl,,5 mm MgCl2, 5 mm KCl, ph 8.3],,2 mm dntp, 2 mm PCR Enhacer [TMA-oxalát] (Top-Bio),,2 μm pro oba primery STSF a STSR a,4 μg μl- BSA. Amplifikace STS markeru byla provedena v termocykleru C (Bio-Rad). Teplotní profil PCR se skládal z počáteční předdenaturace při 94 C 3 min., poté následovalo 35 cyklů denaturace při 94 C 3 s., annelace při 57 C 6 s. a elongace při 72 C 9 s. Amplifikace byla ukončena finální elongací při 72 C min. a ochlazením vzorků na 4 C STS markery dle Danilova et al. (6) K testování obou markerů bylo nutné navrhnout vlastní primery (tabulka 4.4), jelikož předběžná analýza sekvencí (AJ8328. a AJ8329.) ukázala, že publikované primery nemají příliš kvalitní parametry pro PCR a primer 22-4F v těchto sekvencích ani nebylo možné najít. Tab. 4.4: Sekvence primerů pro marker STS29 a STS477 lokus marker K-47 STS29 K-684 STS477 primer STS29_F STS29_R STS477_F STS477_R sekvence primeru (5-3 ) TTTTGGCCGTCCTCTCTATC CTCCCGGCACACTAATCAAG CATTCTCCTCAGTCCCAAGC CTCTGTGCGAATGACCTCCT 66

68 Reakční směs o finálním objemu 2,5 μl obsahovala ng templátové DNA a,5 U Taq polymerázy (Roche). Reakční směs dále obsahovala x KCl [ mm Tris-HCl,,5 mm MgCl 2, 5 mm KCl, ph 8.3],,2 mm dntp, 2 mm PCR Enhacer [TMA-oxalát] (Top-Bio),,4 μm pro každý z párů primerů a,4 μg μl- BSA. Optimální annelační teplota byla určena pomocí teplotního gradientu v rozmezí ± 5 C od udávané Tm. Amplifikace STS markerů byla provedena v termocykleru C (Bio-Rad). Teplotní profil PCR se skládal z počáteční předdenaturace při 94 C 4 min., poté následovalo 35 cyklů denaturace při 94 C 45 s., annelace při 63 C 6 s. a elongace při 72 C 9 s. Amplifikace byla ukončena finální elongací při 72 C 8 min. a ochlazením vzorků na 4 C SSR marker dle Jakše et al. (7) Mikrosatelitní marker HlAGA7 s předpokládanou vazbou na samčí pohlaví byl součástí multiplexové kombinace 5K. Složení reakční směsi a teplotní průběh PCR reakce je uveden v části

69 4.5 ELEKTROFORETICKÉ METODY 4.5. AGAROZOVÁ ELEKTROFORÉZA Tento typ elektroforézy byl použit k separaci všech STS markerů souvisejících s pohlavím, čištění některých vzorků pro sekvenaci a při počátečním ověřování amplifikace testovaných SSR markerů. Separace fragmentů probíhala buď v,5% nebo 2% agarozovém gelu v x TBE pufru při napětí 4 V cm-. K určení velikosti jednotlivých PCR produktů byl použit hmotnostní standard DNARuler bp či DNARuler bp plus (Fermentas) AKRYLAMIDOVÁ ELEKTROFORÉZA SSR metoda Vzorky byly separovány v 6% denaturačním (8M močovina) polyakrylamidovém gelu (9:). Separace probíhala ve vertikální elektroforetické cele Sequi-Gen GT (Bio-Rad) v,5 x TBE při teplotě 4 C a výkonu 7 W nebo ve vertikální elektroforetické cele Sequi-Gen (Bio-Rad) při teplotě 45 C a výkonu 5 W po dobu 3 až 6 hodin v závislosti na velikosti daného mikrosatelitu. Složení použitých roztoků je uvedeno v kapitole 8. Přílohy. Jednotlivé kroky SSR metody zahrnovaly přípravu sekvenační cely (a), přípravu vzorků a jejich následnou separaci (b), barvení gelu (c). a) Příprava sekvenační cely odstranění nečistot absolutním etanolem u tzv. krátkého skla a jeho následné ošetření silanizačním roztokem ošetření tzv. dlouhého skla přípravkem Sigma-Cote (silikonový roztok rozpuštěný v heptanu, jedná se o,7-dichloro-oktamethyltetrasiloxan) (Sigma) b) Příprava vzorků a separace smíchání vzorků s denaturační barvou dle Benbouza et al. (6) v poměru : denaturace při 94 C 5 minut ponechání vzorků na ledu alespoň 3 minut separace c) Barvení gelu stříbrem dle Benbouza et al. (6) fixace vzorků pomocí fixačního roztoku (5 minut) barvení gelu pomocí barvícího roztoku (7 minut), do kterého je těsně před barvením přidáno,5 ml 37,5% formaldehydu na l barvícího roztoku rychlé opláchnutí gelu destilovanou vodou (3 s) 68

70 vyvíjení gelu pomocí vyvíjecího roztoku, do kterého je těsně před vyvíjením přidáno 3 ml 37,5% formaldehydu na l roztoku (doba dle potřeby) neutralizace hydroxidu pomocí fixačního gelu (přibližně 2 minuty) SSCP metoda Polymorfismus na základě konformací jednovláknové DNA byl detekován ve vertikální cele DCode System (Bio-Rad). Jednotlivá vlákna DNA byla separována v 8% nedenaturačním polyakrylamidovém gelu (37,5:) s % glycerolem v,5 x TBE při teplotě 4 C s teplotním gradientem -,5 C hod- a výkonu 3 W po variabilní dobu (3-5 hodin) v závislosti na velikosti daného mikrosatelitu. Z důvodu udržení nízké teploty během separace byla cela vložena do polystyrenové krabice (Z box) a obložena ledem. Příprava vzorků a barvení gelu probíhalo stejným způsobem jako u SSR metody. Posledním krokem po obarvení gelu bylo jeho ponoření do 3 % glycerolu příbližně minut. Poté následovalo vložení mezi dva celofánové obaly a přichycení na pevném podkladu (skle). Tyto celofány byly před použitím naloženy v 3 % glycerolu. 69

71 4.5.3 KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA Příprava vzorků Standardní procedura zahrnovala odebrání µl PCR produktu a naředění v 2x deionizované vodě. Ředící faktor se pohyboval od :2 do :39 v závislosti na příslušné multiplexové kombinaci. V případě pseudomultiplex PCR bylo nutné nejprve produkty ze všech PCR reakcí smíchat ve vhodném poměru. Z takto naředěné DNA byl opět odebrán µl a přepipetován do jednotlivých zkumavek obsahujících 2 µl Hi-Di formamidu (Life Technologies) a,2 µl hmotnostního standardu. Jako hmotnostní standard byl použit GeneScanTM 6 LIZ Size Standard (Life Technologies). Nakonec byly vzorky denaturovány při 95 C 5 min. v termocykleru C (BioRad) nebo DNAengine (Bio-Rad) Podmínky separace K separaci jednotlivých fragmentů byl použit genetický analyzér ABI PRISM 3 (Life Technologies). Separace probíhala v 47 cm dlouhé kapiláře s POP4 polymerem v x Running pufru (Life Technologies) při teplotě 6 C se základním modulem GS_STR_POP4_G5. Doba nástřiku byla 3-5 s. při napětí od 3 do 5 kv dle empiricky určeného optima u jednotlivých kombinací. Separace probíhala při napětí 5 kv a trvala v rozmezí 22-3 minut na vzorek dle velikosti fragmentu. Značení jednotlivých primerů odpovídá barevné sadě DS-33, na kterou byl přístroj nakalibrován součastně s tvorbou "multikomponentní" matice k filtrování překryvu spekter. 7

72 4.6 SEKVENACE DNA K sekvenování byly použity PCR produkty a sekvenace probíhala klasickou dideoxy terminační metodou (Sanger, 977). Některé fragmenty byly sekvenovány firmou BioGen pomocí sekvenátoru ABI33. V tomto případě bylo provedeno pouze čištění vzorků a kvantifikace DNA PURIFIKACE PŘED SEKVENAČNÍ REAKCÍ Před samotnou sekvenací bylo nutné jednotlivé vzorky připravit, vyčistit a kvantifikovat. Kvantifikace byla provedena pomocí UV spektrofotometru NanoPhotometer P3 (Implen). Byly použity tři způsoby čistění vzorků na základě vlastností daných amplikonů: ) U homozygotů byl PCR fragment připraven na sekvenační reakci přidáním,5 µl exonukleázy I (ExoI) a µl termosenzitivní alkalické fosfatázy (FastAP) (Fermentas) na 5 µl reakční směsi. Po promíchání byly vzorky inkubovány při 37 C min. Inhibice enzymů byla provedena zahřátím zkumavek na 85 C 5 min. s následným ochlazením na 2 C v termocykleru C (Bio-Rad). 2) U markerů STS29 a HlGT bylo nutné vyříznout skalpelem jednotlivé fragmenty z,5% agarosového gelu a izolovat pomocí MinElute PCR Purification Kitu (Qiagen). 3) Získání purifikovaných mikrosatelitních alel u heterozygotů zahrnovalo následující kroky: amplifikaci a separaci alel pomocí sekvenační cely v 6 % polyakrylamidovém gelu odebrání části gelu s požadovanými PCR produkty pomocí sterilních špiček do zkumavky s µl vody a ponechání přes noc při 4 C použití 2 µl na reamplifikaci PCR produktů na základě stejného teplotního profilu dle lokusu ověření úspěšnosti reamplifikace odebráním části produktu od každého vzorku s následnou separací v 2 % agarosovém gelu přidání exonukleázy a alkalické fosfatázy stejným způsobem jako u varianty SEKVENAČNÍ REAKCE Reakční směs o celkovém objemu µl obsahovala až 4 ng DNA, x sekvenační pufr (Life Technologies), 3,2 µm F či R primer a 2 µl sekvenační směsi BigDye Terminator v3. (Life Technologies). Pro sekvenační reakci byly využívány 2 teplotní profily dle Ta použitého primeru. První teplotní profil se skládal z předdenaturace při 96 C min. a dále se 25x opakovaly kroky denaturace při 96 C s., annelace při 5 C 5 s. a elongace při 6 C 4 min. Druhý teplotní profil zahrnoval předdenaturaci při 96 C min. a 25x opakovaným střídáním denaturace při 96 C s. a annelace spojené s elongací při 6 C 4 min. 7

73 4.6.4 PURIFIKACE PO SEKVENAČNÍ REAKCI Čištění vzorků po sekvenační reakci lze shrnout do následujících bodů: přidání a promíchání 2 µl glykogenu (Fermentas), 5 µl 96% ethanolu a 2 µl 3M octanu sodného ponechání 5 minut při laboratorní teplotě centrifugace 3 min. při 3 rpm opatrné odpipetování roztoku s ponecháním bílé sraženiny ve zkumavce a přidání µl 7% ethanolu centrifugace 5 min. při 3 rpm zopakování předchozích dvou bodů sušení vzorků při 5 C min. Na závěr bylo do každé zkumavky přidáno 2 µl Hi-Di formamidu (Life Technologies) a proběhla denaturace vzorků při 95 C 5 min. v termocykleru C (Bio-Rad) SEKVENACE Vlastní sekvenace byla provedena pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 3 (Life Technologies). Separace probíhala v 6 cm kapiláře s POP6 polymerem v x Running pufru (Life Technologies). V Data Collection Software 3.. by nastaven KB_3_POP6_{BDv3}_5Std Dye Set a jako základní modul byl zvolen Seq POP6 (ml)e. Doba nástřiku byla upravována na 5 až 3 s. při napětí 2,5 kv. Separace probíhala při 2,2 kv a teplotě 5 C po dobu 4- min. dle předpokládané velikosti fragmentu. K zajištění kvality a konzistence výsledků byly všechny fragmenty sekvenovány oboustraně a minimálně 2x. 72

74 4.7 ANALÝZA A STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ DAT Morfologické a chemické údaje byly poskytnuty pracovníky Chmelařského institutu s.r.o. v Žatci. Data ke komparativní analýze byla získána z databáze NCBI ( prostřednictvím programu BLASTN ver (Zhang et al., ). K hledání v proteinové databázi pomocí proteinového dotazu byl použit program BLASTP ver (Altschul et al., 997; Altschul et al., 5). Úpravy a porovnání získaných sekvencí byly provedeny v programu BioEdit ver. 7.. (Tom Hall, volně dostupný na Vícenásobná porovnání sekvencí byla provedena v programu ClustalW (Thomson et al., 994), který je součástí programu BioEdit. K navržení nových primerů byl použit program Primer3 ver..4. (Rozen a Skaletsky, ). Převod DNA sekvencí do proteinů, párové porovnání a odhad sekundární struktury byl proveden v programu CLC Main WorkBench ver. 6.2 (CLC bio). Hodnocení vhodnosti lokusů k markerování byl použit program SERV (Legendre, 7) se zabudovaným algoritmem programu TRF (Benson et al., 999) pro vyhledávání repetitivních sekvencí volně dostupný na Data z agarózové elektroforézy byla dokumentována pomocí systému GelDocXR (Bio-Rad) a hodnocena v programu Quantity One ver (Bio-Rad). Sběr dat kapilární elektroforézy byl proveden pomocí Data Collection Software ver. 3.. (Life Technologies) a velikost alel byla vyhodnocena v programu GeneMapper ver. 4. (Life Technologies). Exploratovní analýza dat (EDA) byla provedena pomocí softwaru QCExpert ver. 2.5 (TriloByte). Deskriptivní statistika udávající hodnoty heterozygotnosti pozorované a polymorfního informačního indexu (PIC) byly zpracovány v programu Cervus 3..3 (Kalinowski et al., 7 ) nebo TFPGA (Tools For Population Genetic Analyses) ver..3 (Miller, 997). Cervus ver byl také použit k detekci odchylek od H-W rovnováhy, odhadu výskytu nulových alel a identifikaci jednotlivých genotypů. Kruskal-Wallisova ANOVA, Mann-Whitneyův U test, χ2-test, PCA, MDS a CLU analýza byly provedeny v programu STATISTICA ver. 9. (StatSoft). Pro shlukovou analýzu byla vytvořena vzdálenostní matice (DA) matice dle Nei et al. (983) v programu Populations ver (vyvinutý O. Langellou, volně dostupný na Kontrolní PCA byla provedena v programu GENETIX ver. 4.3 (Belkhir et al., 2). Hodnoty kofenetického korelačního koeficientu byly zjištěny pomocí programu NCSS (Hintze, ). Výpočet LOD skóre a odhad frekvence rekombinací byl proveden zvlášť pro mateřský a otcovský genotyp v programu LINKFMEX ver. 2.3 (vyvinutý R. G. Danzmannem). 73

75 5. VÝSLEDKY A DISKUZE 5. OPTIMALIZACE SSR METODY 5.. TESTOVÁNÍ A OPTIMALIZACE PCR U SSR MARKERŮ Celkově bylo testováno 39 publikovaných SSR markerů a pro čtyři SSR markery (HlGA9, HlGA29, HlGT5 a HLC-2B) byly navrženy nové primery k přímé detekci hypotetické nulové alely. Přestože většina markerů na testovacích vzorcích amplifikovala bez problémů v 2 % agarozovém gelu, výsledky z polyakrylamidových gelů u některých z nich ukázaly příliš velké množství tzv. koktavých produktů (stutter bands) ztěžujících identifikaci skutečných alel. V případech, kdy na akrylamidové elektroforéze nebylo možné odlišit skutečné alely od nespecifických produktů či koktavých produktů, bylo od dalšího používání příslušného markeru upuštěno. Navíc se u chmelů rozdílného geografického původu vyskytly problémy s amplifikací u některých markerů (především HlGA4 na akrylamidovém gelu). Z těchto důvodů bylo nutné optimalizovat jak složení reakční směsi, tak teplotní profil reakce. V současné době bylo úspěšně optimalizováno 22 publikovaných SSR markerů, ale vzhledem k nereprodukovatelné amplifikaci GA6-N2-4 u amerických chmelů a problémům s netemplátovým A v lokusu HlAGA6 znemožňujícím identifikaci skutečné alely na kapilární elektroforéze byla analýza provedena u SSR. Marker HlGA4 lze považovat za optimalizovaný pouze pro kapilární elektroforézu, protože vykazuje na polyakrylamidovém gelu značně kolísavou kvalitu amplifikace z hlediska intenzity produktu pro jednotlivé vzorky navzdory testování mnoha teplotních profilů a složení reakčních směsí. Navíc velmi problematickou se ukázala být kvalitní amplifikace pro chmel z USA, což ilustruje obrázek 5., na kterém jsou dohromady chmely z Francie a USA. 74

76 Obr. 5.: Marker HlGA4 Vysvětlivky: čísla odpovídají značení jednotlivých vzorků Tyto vzorky byly společně amplifikovány, ošetřeny stejným způsobem a separovány najednou, přesto je dobře patrný rozdíl v kvalitě. Naopak například u kombinačního křížení nebyl s amplifikací žádný problém. Z těchto důvodů lze prozatím aplikovatelnost markeru HlGA4 na polyakrylamidový gel považovat za omezenou. Mezi předpokládané faktory lze brát v potaz chyby způsobené lidským faktorem, obsahem inhibičních látek v PCR reakci nebo teoretickou substitucí v místě nasedání primerů u některých vzorků, která snižuje výtěžnost amplifikace, případně kombinace více faktorů najednou. Žádný z autorů (Murakami et al., 6a; Čerenak et al., 4), který používal zmiňovaný marker se o podobných problémech nezmiňuje. Pro optimalizaci složení reakční směsi byly v případě potřeby testovány různé typy pufrů (KCl nebo (NH4)2SO4 pufr), rozdílné koncentrace MgCl2 (,5 až 3 mm), primerů (,3 až,5 μm), DNA ( či ng) a různá aditiva zlepšující specifičnost a výtěžnost reakce - PCR Enhancer (2 mm) (Top Bio) či BSA (,4 μg μl-). K posouzení vzájemného vlivu aditiv a koncentrace DNA byl proveden tzv. křížový test. Konkrétní kombinace (značeny A - H) ukazuje tabulka 5. a výsledek testu obr Podmětem k testování PCR Enhanceru (Top-Bio), který obsahuje TMA-oxalát, byla práce Kovárové a Drábera (), ve které autoři uvádí zvýšení specifity a výtěžnosti PCR při optimální 2 mm koncentraci této látky. Křížový test nicméně ukázal, že největší vliv na amplifikaci má přítomnost/nepřítomnost BSA. Tento poznatek je v souladu s výsledky řady prací, přičemž pro některé analýzy se BSA v PCR reakci ukázalo jako nezbytné (Forbes a Hicks, 996; Kageyama et al., 3). 75

77 Tab. 5.: Křížový test Kombinace DNA Enhancer BSA (ng μl-) (2 mm) (,4 μg μl -) A + + B + C + D E + + F + G + H Vysvětlivky: + přítomnost, - nepřítomnost aditiva Obr. 5.2: Výsledek křížového testu Vysvětlivky: A-H označuje příslušné kombinace, čísla odpovídají testovaným genotypům 76

78 Dále byly prověřovány Taq polymerázy od různých výrobců (Fermentas, Roche a Chemos). Pro každou polymerázu bylo zapotřebí optimalizovat složení reakční směsi zvlášť. Podle informací od výrobců jsou všechny produktem stejného bakteriálního kmene E. Coli s vloženým genem pro Taq polymerázu, ale přesto se lišily schopností amplifikace, což bylo prokázáno u testovacího teplotního gradientu pro lokus HlGA3 na obr Výsledek gradientu na dvou genotypech byl nejprve ověřován na 2 % agarozovém gelu a pouze viditelné fragmenty pouštěny na akrylamidovém gelu. U žádné z polymeráz není uvedena jakákoliv modifikace těchto enzymů, a proto se lze domnívat, že důvodem může být rozdílné složení pufrů dodávaných přímo příslušným výrobcem. Na základě získaných poznatků byla vybrána pro další analýzy Taq polymeráza od firmy Roche. Obr. 5.3: Test polymeráz pomocí teplotního gradientu Vysvětlivky: čísla odpovídají dané teplotě [ C], - 6, 2-6, 3-62, 4-63, 5-64, 6-65, 7-66, 8-67, 9-68, - 69, M - hmotnostní standard Důležitou součástí byl teplotní profil průběhu PCR a určení optimální annelační teploty. Určení annelační teploty proběhlo pomocí teplotního gradientu v rozmezí ± 6 C od publikované annelační teploty nebo odvozením na základě spočítané Tm pro vlastní primery. U některých markerů se ukázalo vhodné použít tzv. touchdown protokol (TD-PCR), kdy je nastavena počáteční teplota o několik stupňů vyšší než annelační a během každého cyklu dochází k snižování teploty o určitou hodnotu (nejčastěji C). Tento způsob vede k nižší počáteční výtěžnosti PCR, a proto je vhodné nastavit více cyklů, ale měl by zvyšovat specifitu amplifikace. 77

79 5..2 OPTIMALIZACE PŘÍPRAVY AKRYLAMIDOVÉHO GELU Na základě technického manuálu firmy Bio-Rad a publikovaných článků (Benbouza et al., 6, Bassam et al., 99), bylo optimalizováno složení gelu, pracovní postup a způsob barvení gelu. Z hlediska složení byly testovány dva typy gelů - nedenaturační (bez močoviny) a denaturační (s 8M močovinou) s různou koncentrací gelu a tedy množstvím akrylamidu (9:). Jednalo se o 5, 5,5 a 6 % akrylamidové gely. Nejkvalitnější výsledek byl získán v 6 % denaturačním gelu. Kvalitu gelu také značně ovlivňuje doba polymerace. Technický manuál firmy Bio-Rad uvádí rozmezí 36 min., přičemž dolní časovou hranici tj. 3 min uvádí i Benbouza et al. (6). Ideální doba polymerace byla empiricky stanovena na minimálně 6, ale spíše 9 minut, protože publikované časy se ukázaly k vytvoření kvalitního gelu nedostatečné. Dlouhá polymerační doba je pravděpodobně způsobena velkými rozměry (38 x 5 cm) sekvenační cely, jelikož při použití menší cely Sequi-Gen s rozměry 2 x 4 cm bylo 3 minut pro kvalitní polymerizaci gelu dostačující. 78

80 5.2 OPTIMALIZACE SSCP METODY 5.2. OBECNÁ KONCEPCE SSCP ANALÝZY SSCP je teoreticky, z hlediska optimalizace, náročnější metodou než SSR, protože výsledky pokusu mohou být ovlivněny větším počtem faktorů jako je teplota při separaci, velikost DNA fragmentů, složení gelu, složení pufru, procento GC bází, struktura analyzované sekvence, typ a poloha detekované mutace a způsob barvení (Highsmith et al., 999; Nataraj et al., 999; Li et al., 3). Tato metoda je vzhledem k cílům práce považována za doplňkovou k SSR analýze a slouží ke kontrole, zkvalitnění a případnému zvýšení informační hodnoty získaných údajů. Navíc byla SSCP v laboratoři KGŠ úspěšně použita k řešení řady genetických otázek a lze ji v rámci laboratoře KGŠ považovat za standardizovanou metodu. Z těchto důvodů optimalizace a průběh analýz vycházel myšlenkově spíše z návrhů, které ve své práci uvádí Sunnucks et al. () než požadavků na extrémně vysokou přesnost SSCP v aplikované humánní medicíně. Přesto bylo před zahájením SSCP analýz nutné provést několik kroků, které měly zvýšit jejich vypovídací hodnotu. Nejprve bylo vyzkoušeno, jsou-li vůbec používané SSR markery pro SSCP analýzu aplikovatelné vzhledem ke skutečnosti, že během amplifikace vzniká celá řada různě velikých koktavých produktů (stutter bands). Toto testování bylo prováděno vždy na několika genotypech z různých oblastí. U řady lokusů nejsou stutter bandy problematické (např. HlGA9, 29), ale v některých případech (HlGA3) bylo nutno kromě předpokládaných alel vzít v potaz i celkový profil separovaného amplikonu. Největším problémem bylo udržení stabilní teploty v průběhu separace. Tento problém se ukázal být výhodou, protože z některých informací vyplývá lepší schopnost SSCP detekovat více mutací při různých teplotách spíše než při jedné konstantní (Kaczanowski et al., ). Na základě empirických pozorování lze teplotní profil stručně popsat následujícím způsobem. První hodinu separace se teplota pohybovala do 4 C a každou následující hodinu se samovolným ohřevem zvyšovala v rozmezí -,5 C. Separace byla ukončována při teplotách 9- C. 79

81 5.2.2 OPTIMALIZACE BARVENÍ Byla testována metoda barvení ethidium bromidem a tři metody barvení stříbrnými ionty, přičemž se jednalo o klasické barvení AgNO3 (Bassam et al., 99), dále barvení pomocí dichromanu draselného a barvení dle Benbouza et al. (6). Optimalizace barvení byla prováděna u SSCP metody vhledem k snadnější manipulaci s gelem, ale získané poznatky byly aplikovány i u SSR metody. Metodický postup barvení pomocí dichromanu je uveden v příloze. Poslední zmiňovaný způsob barvení se ukázal přes počáteční problémy jako nejvhodnější z několika důvodů. Prvním důvodem je nejvyšší kontrast a rozlišení barvených produktů vůči pozadí gelu, což umožnilo s vyšší přesností rozlišit jednotlivé alely vyskytující se i blízko sebe. Dalším kladem této metody je celková doba barvení, která se pohybuje v rozmezí 3-4 minut, což je minimálně,5-2 x kratší doba oproti ostatním testovaným metodám (s výjimkou barvení ethidiem). Právě ponoření gelu do jednotlivých roztoků na relativně krátkou dobu je pravděpodobně příčinou vysokého kontrastu barvených produktů. Benbouza et al. (6) uvádí jako další plus u své metody opakovatelnou použitelnost barvících roztoků, což značně snižuje finanční náklady. Při testování opětovné použitelnosti roztoků bylo zjištěno, že v principu to možné je, nicméně s počtem znovu použitých roztoků se značně snižoval kontrast vůči pozadí gelu (docházelo k celkovému tmavnutí gelu). Poslední výhodou je jistá robustnost metody z hlediska časové délky jednotlivých kroků oproti ostatním metodám barvení stříbrem. 8

82 5.3 ANALÝZA ZDROJŮ CHYB PŘI GENOTYPOVÁNÍ 5.3. VELIKOSTNÍ HOMOPLASIE Při analýze výskytu velikostní homoplasie se bohužel nepodařilo naplnit původní cíl, kterým byla analýza pomocí SSCP u všech vzorků genobanky. Důvodem jsou některé problémy s vyhodnocováním vzorků a vysoká časová a finanční náročnost. SSCP cela DCode System (BioRad) je konstruována maximálně pro 4 vzorků. Metoda vyžaduje celodenní úsilí k získání 2 gelů po vzorcích, což ve spojení s počtem mikrosatelitů znamená v ideálním případě minimálně další půl rok práce bez započítání doby optimalizace. Problematické je rovněž správné hodnocení heterozygotů, jelikož často dochází ke vzniku heteroduplexů, čehož se někdy využívá i k samotné analýze (Nataraj et al., 999). Navíc bylo zjištěno vysoké množství potenciálních alel k sekvenaci, která je finančně i časově nejnáročnější metodou. Především z těchto důvodů slouží získané poznatky jako demonstrativní a k prokázání existence tohoto jevu u chmele. Přesto se podařilo zjistit několik zajímavých skutečností Lokus HlGT Dokladem mutací v oblastech lemujících mikrosatelitní sekvence bez změny velikosti fragmentu je alela 22 lokusu HlGT. Na základě akrylamidové separace a fragmentační analýzy měly všechny později sekvenované genotypy Belg8, Belg84 a Belg85 homozygotní sestavu alel 22/22. Alela o velikosti 22 bp je navíc nejfrekventovanější alelou daného lokusu (,6366), a proto je velké množsví genotypů s touto sestavou alel očekávatelné. SSCP analýza však ukázala rozdílnou mobilitu a počet vlásenek u všech tří genotypů (obr. 5.4). Následná sekvenace odhalila příčinu těchto rozdílů, kterou je mutace na 59. nukleotidu (obr. 5.5). K porovnání byla k těmto vzorkům přidána i publikovaná sekvence dle Jakše et al. (2). V dané pozici má genotyp Belg85 thymin a je homozygotní, což odpovídá i publikované sekvenci. Genotyp Belg84 je rovněž homozygot, ale místo thyminu má cytosin. Poslední genotyp Belg8 je heterozygotní, přičemž jedna alela obsahuje thymin a druhá cytosin. Navíc mají všechny tři genotypy ve 84. pozici substituci A>G oproti publikované sekvenci, ale důležité je, že mezi sebou se v ničem kromě 59. pozice neliší. Výsledky sekvenace tak přesně odpovídají výsledkům SSCP analýzy. Tyto tři elektromorfy se vyskytují u řady dalších genotypů z kolekce genobanky i v rámci vzorků z jednoho regionu jak dokládají vzorky z Francie (obr. 5.4). Tímto způsobem byla potvrzena spolehlivost SSCP metody, alespoň v tomto lokusu, a ověřena existence velikostní homoplasie (SH). Dopad velikostní homoplasie na kvalitu analýzy nelze dobře zhodnotit. Estoup et al. (2) udává na základě simulací, že velikostně detekovatelná velikostní homoplasie (MASH) se vyskytuje spíše mezi druhy. Dále uvádí, že výskyt MASH rámci jednoho druhu, je častější mezi populacemi 8

83 než v jedné populaci. Toto vysvětlení se zdá být logické, ale jak ukázal Lia et al. (7) empirické poznatky často mohou přinášet protikladné výsledky. Studiem mikrosatelitů u kukuřice (Zea mays L.) prokázal SH u 8 lokusů, přičemž 74% elektromorf ukázalo na SSCP více než jednu konformaci. V případě studia mikrosatelitních lokusů u pumy (Puma concolor) bylo zjištěno, že až 5% testovaných lokusů by mohlo být chybně klasifikováno na základě předpokládaného počtu repetic a velikostí (Culver et al., ). Běžnou praxí totiž bývá sekvenace jedné nebo několika málo alel daného lokusu a odvozování počtu repetic na základě detekované velikosti. Důvodem této praxe je možnost testování dynamiky podle step-wise mutačního modelu (SMM), pro který je nutné znát počet repetic. Populační parametry jakými je FST či FIS nejsou homoplasií příliš ovlivněny (Estoup et al., 2), což potvrzuje i Adams et al. (4). Ten svou studii uzavírá konstatováním, že SH nepřekračuje běžnou úroveň chyb při genotypování odhadovanou na 5-7% (Adams et al., 4). Opět je třeba se bránit přílišnému zobecňování, jelikož simulační studie u cpssr naopak ukázala rozhodující vliv na genetické ukazatele diverzity a vzdálenosti (Navascués and Emerson, 5). Velikostní homoplasie může mít i přímý vliv na genotypování jak ukázala analýza mikrosatelitního lokusu HlGT9. Obr. 5.4: Elektroforeogram SSCP gelu pro lokus HlGT Vysvětlivky: čísla odpovídají značení jednotlivých genotypů, Y - pyrimidinová báze tj. C či T, C - cytosin, T - thymin 82

84 Obr. 5.5: Sekvence lokusu HlGT u genotypů Belg8,Belg84 a Belg85 Vysvětlivky: HlGT odpovídá publikované sekvenci (AF55723) dle Jakše et al. (2) 83

85 Lokus HlGT9 Tento lokus byl analyzován z důvodu rozporuplného počtu alel detekovaného pomocí akrylamidové a kapilární elektroforézy v HlGT9. Obecně je samozřejmě kapilární elektroforéza považována za kvalitnější metodu k určení velikosti, ale v tomto případě překvapivě selhala. Rozpor byl o to zvláštnější, že se jedná o lokus ve kterém jsou alely snadno a jednoznačně identifikovatelné, což nemusí pro jiné lokusy platit, a navíc se tento rozdíl týkal jediné alely. Podle výsledků z polyakrylamidového gelu (obr. 5.6) mají evropské a americké genotypy stejnou alelu velkou 84 bp. Naopak kapilární elektroforéza pro ty samé vzorky detekovala alely dvě - 84 bp u evropských chmelů a 86 bp u chmelů amerických (obr. 5.7). Analýzy byly zopakovány a výsledek zůstal stejný, a proto byly homozygotní jedinci - Cau97 a Can8 osekvenováni (obr.5.8). Obrázek 5.7 ukazuje výstup ze softwaru GeneMapper ver. 4. s vytvořenými biny pro jednotlivé alely. Sporná alela o velikosti 86 bp je zde značena růžovou barvou jako mutantní bin. Vzhledem k zobrazovacímu limitu jsou ukázány pouze 4 vzorky, které jsou patrné i na obrázku 5.6 ukazující akrylamidový gel s mezioblastním srovnáním vzorků*. Průběh separace u obou metod probíhá za denaturačních podmínek a zvýšené teploty, aby docházelo k separaci jednotlivých fragmentů čistě na základě velikosti. Přesto jsou výsledky rozdílné. Sekvenací bylo zjištěno, že studované úseky mají velikost shodnou, ale liší se několika bodovými mutacemi (obr. 5.8) i v porovnání s publikovanou sekvencí. Jediným možným vysvětlením je vliv sekundární struktury molekuly DNA na mobilitu. Existuje řada prací zabývajících se testováním kvality separace v kapilární elektroforéze a akrylamidovém gelu (Mansfield et al., 996; Moretti and Key, ; Delmotte et al., ) nebo teoretickým popisem vztahů mezi fyzikálně-chemickými jevy ovlivňujícími separaci (Kašička, 997; Heller, ), ale podobný případ nikdo neuvádí. Přesto o abnormální migraci některých hmotnostních standardů hovoří i manuál k softwaru GeneScan (Perkin-Elmer Corporation, 998), který je předchůdcem programu GeneMapper. Potvrzení této skutečnosti samozřejmě vyžaduje vícenásobnou sekvenaci většího počtu vzorků. Z neznámých důvodů se však zatím nedařilo osekvenovat heterozygotní jedince a možné řešení spočívá v ligování do plazmidů, které není v současných podmínkách laboratoře možné. * Důvodem značení vzorku VH_C22 a Can8 dvakrát je čistě technická záležitost, daná širší nanášecí "dvojjamkou", jelikož během mnoha provedených analýz došlo k odlomení některých zubů tzv. "sharktooth" hřebenu. To platí i pro další podobné obrázky. 84

86 Obr. 5.6: Elektroforeogram srovnání vzorků v lokusu HlGT9 na akrylamidovém gelu Vysvětlivky: 84 bp označuje velikost sporné alely, 78 bp je velikost alely viditelné i u vzorků na kapilární elektroforéze, USA - Spojené státy americké, Can - Kanada, Aus - Rakousko, Roz - Roztoky (ČR), VH - Vinařická hora, Sp - Španělsko, Bul - Bulharsko, Swi - Švýcarsko, CR - Česká republika 85

87 Obr. 5.7: Elektroforeogram vybraných vzorků pro lokus HlGT9 na kapilární elektroforéze Vysvětlivky: šedé pruhy znázorňují polohy binů pro jednotlivé alely, růžovou je značen "mutantní" bin značící spornou alelu s velikostí 86 bp u amerických chmelů 86

88 Obr. 5.8: Sekvence genotypů Cau97 a Can8 v lokusu HlGT9 Vysvětlivky: HlGT9 odpovídá publikované sekvenci (AF55722) dle Jakše et al. (2) 87

89 5.3.2 NULOVÁ ALELA Lokus HlGA29 Při analýze mikrosatelitního lokusu HlGA29 u kolekce planých chmelů genobanky Chmelařského institutu s.r.o. nebyl na obarveném gelu viditelný žádný fragment u řady vzorků původem z USA a Kanady a tudíž nedocházelo k amplifikaci (obr. 5.9). Tento efekt bývá známkou nulové alely vznikající v důsledku mutací v místě nasednutí příslušného primeru. Obr. 5.9: Nulová alela u kanadských planých chmelů v lokusu HlGA29 Vysvětlivky: M hmotnostní standard, čísla odpovídají značení jednotlivých vzorků Pro vyloučení jiných možností byla provedena druhá optimalizace složení reakční směsi a teplotního profilu PCR. Úpravy neměly na amplifikaci žádný vliv. Byla tedy přijata hypotéza o nulové alele, která byla nakonec potvrzena při testování kombinačního křížení Kombinace kde je u řady potomků patrný výskyt otcovské alely, ale chybí jim alela mateřská (obr. 5.). Obr. 5.: Nulová alela u kombinačního křížení Kombinace v lokusu HlGA29 Vysvětlivky: čísla odpovídají značení jednotlivých vzorků, u vzorků 24 a 27 je patrná pouze otcovská alela b, ale žádná mateřská alela 88

90 Pomocí kombinačního křížení byly identifikovány další dva lokusy s možným výskytem nulové alely. Obdobná situace jako v lokusu HlGA29 nastala pro lokus HlGT5 a HLC-2B, kde rovněž nebyla v řadě případů identifikována mateřská alela. Posledním ověřovaným lokusem byl HlGA9 vzhledem k velkému množství homozygotních jedinců u kanadských vzorků, které běžně naopak vykazují vysokou variabilitu. Opakovaná analýza s další sadou primerů potvrdila předchozí zjištění a předpokládaný výskyt nulové alely se nepotvrdil. K detekci nulové alely byly navrženy nové sady primerů (tabulka 4.). Tyto primery byly kombinovány i s původní sadou, aby bylo možné přesněji detekovat místo případné mutace. V případě lokusu HlGA29 tak bylo zjištěno, že mutace se vyskytuje v místě nasedání původního R primeru. Proto byl k amplifikaci a pozdějšímu sekvenování používán primer HlGA29_F a HlGA29_CZU_R. Došlo však k nežádoucímu efektu zvanému multibanding pattern, což pravděpodobně značí vysokou homologii sekvence primerů i k jinému místu v genomu. Tento efekt se nepodařilo eliminovat ani pomocí teplotního gradientu. Z tohoto důvodu bylo nutno sekvenovat všechny potenciální alely, aby bylo možné určit jejich případnou odlišnost. K sekvenaci byly vybrány alely u genotypu odrůdy Vital. Sekvenace byla úspěšná pouze ve dvou případech z pěti. Jelikož se přes řadu pokusů nepodařilo získat kvalitní profil amplifikovaného lokusu byl tento mikrosatelit úplně vyřazen a od dalších sekvenací upuštěno. Přesto se ukázala značná odlišnost sekvencí obou alel od sekvence, kterou publikoval Jakše et al. (2). Sekvenované alely se odlišují nejen řadou substitucí, ale také indely či změnami ve složení mikrosatelitního motivu (obr. 5.). V místě nasedání původního R primeru, které je vyznačeno šedým rámečkem, jsou vzhledem k publikované sekvenci patrné dvě a 5 bp inserce. Výskyt nulové alely v lokusu HlGA29 rovněž podporuje studie Murakamiho et al. (6b), který získal stejný výsledek u planých chmelů z amerického a japonského regionu. V rodokmenu rodičů Kombinace jsou pouze chmely náležící do evropského biogeografického regionu (V. Nesvadba, osobní komunikace) a jedná se tak o první zprávu o výskytu nulové alely v lokusu HlGA29 pro evropské chmely. 89

91 Obr. 5.: Porovnání sekvencí alely "" a "2" u odrůdy Vital pro lokus HlGA29 Vysvětlivky: HlGA29 odpovídá publikované sekvenci (AF5557) dle Jakše et al. (2), šedý rámeček ukazuje místo nasedání původního R primeru v publikované sekvenci 9

92 Lokus HlGT5 Pro marker HlGT5 je s původní sadou primerů typický výskyt velkého množství nespecifických amplikonů, nicméně ve většině případů se zdálo reálné určit jednotlivé alely. Tento předpoklad byl vyvrácen během ověřování výskytu nulové alely u mateřské rostliny Kombinace. Nové primery výrazně zlepšily kvalitu tohoto markeru, neboť prakticky nedocházelo k tvorbě nespecifických amplikonů, a umožnily detekovat "nulovou" alelu či spíše "částečně nulovou" mateřské rostliny. Při srovnání gelů, na kterých jsou fragmenty DNA namnoženy s pomocí původních a nových primerů, vyšlo najevo, že domnělá nulová alela se vyskytuje na obou gelech (obr. 5.2). Druhá alela odrůdy Vital však byla amplifikována s původní dvojicí primerů výrazně slaběji než první alela, a proto byla považována za nespecifickou amplifikaci (spodní šipka u genotypu Vital na obr. 5.2 vlevo). Toto zjištění má závažné důsledky z hlediska vypovídací hodnoty markeru HlGT5. Někteří autoři (Čerenak et al., 4; Patzak et al., 7) tento marker ve svých studích využili, ale vzhledem k výše uvedeným skutečnostem lze o spolehlivosti a kvalitě markeru s původními primery pochybovat a upozornit tak na úskalí při jeho aplikaci. V případě této domněle nulové alely stačí k nápravě využít nově navržené primery. Obr. 5.2: Porovnání kvality původních a nových primerů u Kombinace v lokusu HlGT5 Vysvětlivky: vlevo jsou fragmenty amplifikovány pomocí původní sady primerů a vpravo s pomocí nové sady; šipky označují skutečné alely u rodičů kombinačního křížení Kombinace 9

93 Lokus HLC-2B Největším překvapením bylo zjištění nulové alely v lokusu HLC-2B, protože primery tohoto EST-SSR markeru leží v exonu 2 a 3 genu HCH sloužícího k tvorbě prekurzoru endochitinázy (Henning a Moore, 999). Nově detekovaná alela se vyskytuje u obou rodičovských rostlin. Příčinou nulové alely je substituce G>A na 3 konci původního R primeru (obr. 5.3), tedy místu kde dochází k prodlužování řetězce během PCR. Na obrázku 5.3 jsou pro lepší názornost ukázány pozice původních i nově navržených primerů. Ze sekvenací vyplynulo, že otcovská komponenta /5 má jednu alelu "a" odpovídající publikované sekvenci s vyjímkou chybějícího thyminu na 22. pozici a druhou alelu "b", která se od té první i publikované značně liší. Mateřská rostlina je pro alelu "b" homozygotní. Navzdory sekvenování není otázka ohledně nulové alely v tomto lokusu uspokojivě vyřešena. Při testování kombinačního křížení došlo k situaci kdy pomocí původních primerů byla na fragmetační analýze u otcovské rostliny detekována pouze alela 86 bp (odpovídá sekvenované alele "a") a u mateřské rostliny pouze alela 76 bp. Všichni potomci by tak měli být heterozygoti s alelami 86/76. U řady jedinců však byla detekována pouze alela 86 a žádná mateřská. Logickým vysvětlení byla nulová alela u mateřské rostliny, což bylo ověřeno novou sadou primerů. Překvapivě se však nová alela objevila u rostliny otcovské a měla stejnou velikost jako původní mateřská tj. odpovídala alele 76 bp. Tento výsledek byl poněkud matoucí, jelikož u původní sady primerů byl detekován fragment 76 bp u mateřské rostliny a velkého množství potomků, ale chyběla u jedinců s otcovskou alelou 86. Což znamená, že nová otcovská alela nevysvětlovala chybějící mateřskou alelu. Sekvenací obou rodičů vyšlo najevo, že samec je heterozygot obsahující původní alelu "a" a mutovanou alelu "b" a samice homozygot s dvěmi mutovanými alelami "b". Správně by tedy nemělo docházet k amplifikaci žádného fragmentu u mateřské rostliny s původní sadou primerů, přesto právě tato situace nastala. V úvahu připadají dvě možná vysvětlení. Jelikož k amplifikaci s původními primery docházelo pouze u mateřské rostliny a nikoliv u otce zdá se, že afinita primerů byla dostatečná pro amplifikaci fragmentu detekovatelného pomocí kapilární elektroforézy navzdory mutaci na 3 konci. U heterozygotního otce však probíhala kompetice se sekvencí přesně odpovídající sekvenci primeru a polymeráza tak mnohonásobně častěji prodlužovala sekvenci odpovídající nemutované alele. Podobný případ však zdokumentován nebyl. Další vysvětlení je velmi málo pravděpodobné, ale přesto je nelze zcela vyloučit. Sekvence nově navržených primerů mohou nasedat v místě dosud neznámé mutace a neamplifikovat jednu alelu u mateřské rostliny. Jedině sekvenace fragmentů mateřské rostliny s původní sadou primerů může objasnit, která z navržených hypotéz je správná. V době vypracování této práce se již skutečný důvod zjistit nepodařilo. 92

94 Obr. 5.3: Porovnání sekvencí alely 76 u odrůdy Vital a genotypu /5 pro lokus HLC-2B Vysvětlivky: HLC-2B odpovídá části publikované sekvence genu HCH (AF47497) dle Henning a Moore (999), zelené značení odpovídá části exonů 2 a 3, žluté intronu

95 Z obrázku 5.3 je patrné, že v mutované alele je řada rozdílů oproti publikované sekvenci, které spočívají v substitucích a výskytu dvou 4 a 7 bázových delecích. Většina těchto mutací se vyskytuje v oblasti intronu a přímo tedy neovlivňuje výslednou podobu vznikajícího produktu, pokud nedochází k alternativnímu sestřihu. Byly však zjištěny i 3 substituce v exonech. Byla provedena analýza o jaký typ změn v kódující sekvenci se jedná a jestli tyto změny nějakým způsobem ovlivňují podobu vytvářeného proteinu. Proto byly použity sekvence kompletní CDS s mutovanou a nemutovanou alelou, převedeny do sledu aminokyselin a porovnány (obr. 5.4). První mutace v exonu 2 je synonymní a substituce G>T tedy nevede ke změně aminokyseliny, ale zbývající 2 mutace G>A a T>G už ano. První substituce vede ke záměně alaninu za serin a druhá k záměně valinu za methionin jak je vyznačeno na obrázku 5.4. Program CLC Main Workbench ver. 6.2 rovněž umožňuje analýzu některých vlastností studovaných proteinů a predikovat sekundární strukturu v proteinu. Z výsledků je patrné (obr. 5.5), že substituce V>M u mutované alely vede ke změně konformace β skládaného listu na α helix. Jaký způsobem ovlivňuje tato změna funkci proteinu nelze v současné době určit. Pomocí conserved domain databáze - CDD (Marchler-Bauer et al., ) byla detekována doména ChtBD odpovědná za rozpoznání chitinu nebo jeho podjednotek a doména řadící chitinázu do glykosid hydrolázové rodiny 9, třídy I (obr. 5.6). Chitinázy hydrolyzují glykosidickou vazbu chitinu (Patil et al., ) a vyskytují se u mnoha různých organismů od virů a bakterií přes houby až po rostliny a živočichy (Ubhayasekera et al., 9). Tyto enzymy mohou mít různé funkce zahrnující růst a vývoj organismu, patogenitu aj. U rostlin se předpokládá, že jejich hlavní rolí je obrana proti patogenům (Frettinger et al., 6) a schopností reagovat na stres (Kim et al., 3). Z těchto poznatků vyplývá pravděpodobný důvod vysoké variability zjištěné v tomto genu, jelikož vysoká mutační rychlost zajišťuje vznik nových variant proteinů schopných účinné obrany proti patogenům, kteří se dokáží velmi rychle adaptovat. 94

96 Obr. 5.4: Porovnání proteinů na základě kompletní CDS genu HCH u mutované a původní alely Vysvětlivky: zakroužkované úseky zobrazují rozdíly v dané aminokyselině způsobené detekovanými substitucemi u nové alely 95

97 Obr. 5.5: Sekundární struktura proteinu na základě kompletní CDS genu HCH u mutované a původní alely Vysvětlivky: strand - konformace β skládaného listu; helix - konformace α helix; šedé zvýraznění ukazuje rozdíl v sekundární struktuře proteinu na základě sekvence puvodní a mutované alely 96

98 Obr. 5.6: Konzervativní domény CDS sekvence genu HCH podle conserved domain database Vysvětlivky: grafické zobrazení ukazující polohy rozpoznaných domén, specificky byly nalezeny domény ChtBD a doména řadící chitinázu do rodiny GH 9; světle modré zvýraznění u sekvence ukazuje region s nejasným strukturním složením, tento region nebyl použit při hledání v databázi 97

99 Výskyt nulové alely Pomocí programu Cervus ver (Kalinowski et al., 7) byl odhadnut výskyt nulové alely v souboru testovaných rostlin. Ten používá k detekci iterativní algoritmus podle Summers a Amos (997) a výsledný odhad je založen na -ti opakování. Kladné vyšší hodnoty mohou indikovat nulovou alelu, ale tento předpoklad je založen na představě o H-W rovnováze v populaci. Studované genotypy nelze považovat ve smyslu klasické definice za populaci a z analýzy vyplynulo, že v řadě lokusů by tato hypotetická populace v rovnováze nebyla. Přesto může být tento odhad použit jako vodítko při hledání možné nulové alely. Výsledky pro celý soubor, jednotlivé skupiny planých chmelů a kultivarů ukazuje tab Tab. 5.2: Hodnoty předpokládaných frekvencí nulové alely v jednotlivých lokusech lokus vše a plané b plané_amc plané_kavd plané_evre kultivaryf HlAGA7 +,656 +,25 +,55 +,7353 +,33 -,695 HlGA3 +,97 +,99 +,326 -,854 +,554 -,534 HlGA4 +,3 +,784 +,2949 +,84 -,7 -,649 HlGA9 +,2853 +,3225 +,2844 -,32 +,48 +,769 HlGT5_CZU +,23 +,28 +,263 +,34 +,743 -,34 HlGT9 +,372 +,364 +,56 +,459 +,65 -,47 HlGT +,2368 +,2263 +,76 -,862 -,5 -,423 HlGT2 +,238 +,76 +,284 +,85 +,84 -,74 HlGT7 +,4 +,278 +,3659 -,5 +,4 -,856 GA2-L2-5 +,44 +,5 +,26 +,53 +,463 +,85 GA4-K6-8 +, +,6 +,522 +,72 +,256 -,443 GA4-H5-8 +,862 +,97 +,565 +,628 -,278 -,859 GA5-G3- +,36 +,497 +,535 -,4 +,75 -,57 HLC-D +,889 +,24 +,342 -,99 +,33 -,454 HLC-2B +,556 +,542 +,235 +,653 +,7633 +,4877 HLC-3A +,2672 +,356 +,439 +,765 +,2785 -,457 HLC-4B +,37 +,4538 +,369 +,49 -,5 -,587 HLC-5B +,243 +,23 +,32 -,88 +,2 +,485 HLC-6 +,357 +,4997 +,346 +,2398 +,74 -,284 NDBP +,398 +,945 +,2845 +,24 +,9 -,658 Vysvětlivky: a - soubor všech planých a kulturních chmelů dohromady, b - pouze plané chmely ze všech regionů, c -americké plané, d - kavkazské plané, e - evropské plané, f - kultivary Podle výsledků by se vyskytovala nulová alela prakticky v každém lokusu, což není reálné. Narušení H-W rovnáhy v mnoha lokusech naznačuje strukturování v populaci, dalším důvodem mohou být oblasti genomu, které jsou pod selekčním tlakem nebo se jedná o lokusy vázané na pohlaví. V tabulce 5.2 jsou tučně zvýrazněny některé extrémně vysoké hodnoty. V případě lokusu HLC-2B byla minimálně jedna varianta nulové alely potvrzena a pro kavkazskou oblast jsou z hlediska nulové alely zajímavé další 3 lokusy - HlAGA7, HlGT9 a HLC-3A. Příkladem může být marker HlAGA7, kde empirické pozorování ukázalo, že řada kavkazských genotypů pro marker HlAGA7 vůbec neamplifikuje a hodnoty porozorované heterozygotnosti jsou velmi malé (tab. 98

100 5.), přestože je tento marker velmi variabilní. V tomto směru by mohl pokračovat výzkum ohledně dalších nulových alel, které snižují kvalitu dat a zkreslují dosažené výsledky. Výskyt nulových alel lze považovat za jeden z nejběžnějších zdrojů chyb při genotypování ať už se jedná o skutečnou nulovou alelu nebo "částečnou" (Koblmuller et al., 9). Obzvláště pokud jsou navržené primery daného lokusu vytvořeny pro jeden druh a aplikované u jiného, blízce příbuzného druhu. O běžný jev se jedná i na vnitrodruhové úrovni, což dokládají studie na pšenici (Triticum aestivum), buku evropském (Fagus sylvatica), smrku ztepilém (Picea abies) a dalších (Saito et al., 3; De Sousa et al., 5; Oddou-Muratorio et al., 9). Nulové alely nejsou pouze doménou rostlinné říše, o čemž svědčí zprávy o jejich výskytu u lidí (Homo sapiens sapiens) (Wang et al., ), medvědů (Ursus thibetanus) (Paetkau a Strobeck, 995) nebo norníka šedavého (Clethrionomys rufocanus) (Ishibashi et al., 996) aj. V této práci byly s jistotou prokázány dvě skutečné a jedna "částečná" nulová alela u SSR markerů. To znamená 5% testovaných lokusů, což je podobné frekvenci 6,67% lokusů s nulovou alelou u pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) (Ardren et al., 999) nebo do 25% takovýchto lokusů u člověka (Homo sapiens sapiens) (Callen et al., 9). Frekvence lokusů s nulovou alelou může být mnohem nižší, příkladem je 6,45 % lokusů u bubeníka amerického (Sciaenops ocellatus) (Karlsson et al. 7) nebo % lokusů u jelena lesního (Cervus elaphus) (Slate a Pemberton, 2), a nebo naopak velmi vysoká (46,7 %) u ústřice obrovské (Crassostrea gigas) (Li et al., 9). V zatím nejrozsáhlejší studii Dakin a Avise (4) shrnuli odhady frekvencí (p) nulových alel na základě 233 článků. Skoro všechny články uváděly p <,4 a největší počet studií uvádělo p =,5 -,. Lokusy s příliš vysokou frekvencí nulové alely by měly být z dalších analýz vyloučeny (Selkoe a Toonen, 6). Ne vždy je to vhodné a nutné vzhledem k malému počtu markerů u některých druhů (Oddou-Muratorio et al., 9) a řadě možností statistické korekce, pokud je výskyt nulové alely znám. Lokus HlGA29 byl vyřazen z důvodu "multibanding" vzoru a protože sekvenace (obr. 5.) naznačují větší množství změn v lemujících oblastech než v samotné mikrosatelitní repetici. U lokusu HlGT5 byla zopakována analýza všech vzorků s novou sadou primerů a odhady nulové alely ukazují (tab. 5.2), že se v tomto lokusu další nulová alela nevyskytuje. V době vypracování této studie se nepodařilo zopakovat analýzu u všech vzorků pro lokus HLC-2B s novou sadou primerů a výsledky jsou tak zatíženy genotypovací chybou v daném lokusu. 99

101 5.4 VLASTNOSTNI STUDOVANÝCH LOKUSŮ Jedním z cílů vlastní práce byla nejen charakterizace genetických zdrojů chmele, ale i použitých markerů. Získané poznatky tak umožnily posoudit aplikovatelnost a vhodnost daných markerů pro další genetické analýzy TESTOVÁNÍ V RÁMCI ČELEDI CANNABACEAE Mikrosatelitní markery vytvořené pro jeden druh lze někdy využít k analýzám na jiném, blízce příbuzném druhu (Kirk and Freeland, ), což je zvláště výhodné u druhů s malým množstvím sekvenčních dat. Proto byly testovány chmelové markery u 5-ti rostlin blízce příbuzného druhu chmelu japonském (Humulus japonicus Sieb. & Zucc.) a 3 samičích rostlin konopí (Cannabis sativa L.). Výsledky testování ukazují tabulky 5.3 a 5.4, ve kterých jsou ukázány pouze lokusy kde proběhla úspěšná amplifikace. V současné době je v NCBI databázi evidováno pouze 5 SSR lokusů u konopí a žádný u chmele japonského, přestože není vyloučena možnost tvorby markerů z jiných sekvenčních dat např. EST či genů. V případě konopí lze brzy předpokládat značný nárůst v počtu markerů, protože byl v nedávné době osekvenován celý genom (van Bakel et al., ) a nabízí se tak spíše možnost navržení a testování konopných markerů u chmele. V době vytváření této práce se nepodařilo otestovat všechny lokusy, ale pouze 8 z nich. Detekovatelný fragment se vytvářel u 8 (Humulus japonicus) a 5 (Cannabis sativa) lokusů. Amplifikace v lokusu HlAGA7 proběhla u jediné rostliny konopí, a proto nelze s jistotou potvrdit funkčnost případného markeru. U některých lokusů jsou vidět značné rozdíly ve velikosti mezi druhy čehož se dá využít pro tvorbu tzv. "zakořeněných" (rooted) dendrogramů, kdy se při studiu jednoho druhu používá informací z jiného druhu (či taxonomicky vyšší jednotky) sloužícího jako "outgroup" skupina vůči které se vymezuje vše ostatní, což je výhodné zejména pro fylogenetické studie. Úspěšnost přenosu mikrosatelitního markeru daného druhu na jiný značně kolísá jelikož např. v rámci rodu slunečnice (Helianthus) kolem % u genomických a 7% u genových SSR (Pashley et al., 6), ale může se pohybovat i v průměru kolem 68% u gssr (Choumane et al., ) a 82,6% u EST-SSR jako u rodu cizrna (Cicer L.) (Choudhary et al., 9). U chmele podobné testování publikoval pouze Štajner et al. (5). V této práci autoři testovali 6 SSR markerů rovněž u chmelu japonského a konopí, ale ani jeden nebyl funkční. Z tohoto pohledu byla úspěšnost testování velmi vysoká.

102 Tab. 5.3: Velikosti alel u druhu Humulus japonicus Sieb. & Zucc. a Cannabis sativa L. (.část) označení HJ HJ2 HJ3 HJ4 HJ5 CS CS2 CS3 druh Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Cannabis sativa Cannabis sativa Cannabis sativa lokus GA2-L lokus HlGT lokus NDBP lokus HLC Tab. 5.4: Velikosti alel u druhu Humulus japonicus Sieb. & Zucc. a Cannabis sativa L. (2.část) označení HJ HJ2 HJ3 HJ4 HJ5 CS CS2 CS3 druh Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Humulus japonicus Cannabis sativa Cannabis sativa Cannabis sativa lokus HlGA lokus HlGT lokus GA5-G lokus HlAGA lokus GA4-K

103 5.4.2 VARIABILITA SSR LOKUSŮ Jak ukázal Kalinowski (2) z hlediska vyhodnocení dat není důležité jestli bylo testováno mnoho lokusů s malým počtem alel nebo několik lokusů s vysokým počtem alel. Informační hodnota mikrosatelitního lokusu je tedy dána počtem alel a v případě populačních studií i jejich frekvencí. Z hlediska praktického je však výhodnější testování menšího počtu variabilnějších lokusů, jelikož zvyšující se množství lokusů zároveň zvyšuje celkové náklady a časovou náročnost analýzy. Optimalizované SSR markery byly porovnány z hlediska předpokládané markerovací schopnosti ostatních lokusů. Z databáze NCBI byly získány všechny mikrosatelitní sekvence nalezené po zadání klíčových slov "humulus lupulus microsatellite". Výsledkem bylo 46 sekvencí obsahujících repetitivní motivy. Tyto sekvence byly analyzovány pomocí programu SERV (Legendre et al., 7), který umožňuje na základě tzv. VAR skóre posoudit kvalitu potenciálního markeru. Z těchto hodnot byly vybrány pouze kladné, jelikož markery se zápornou hodnotou nejsou přínosem, a stejným způsobem byly upraveny i analyzované markery. Výsledné hodnoty studovaných lokusů jsou zobrazeny na obr. 8. a obr. 8.2 v sekci 8. Přílohy. Souhrnná charakteristika vyjádřená hodnotou mediánu je,9928 u všech mikrosatelitních sekvencí a,9662 u použitých markerů. Vhodné k markerování jsou mikrosatelity s hodnotou VAR od do 3, přičemž pro účely studií zkoumajících vztahy uvnitř druhu by hodnota měla být vyšší a nižší než 2 (Legendre et al., 7). Naopak u blízce příbuzných jedinců by se tato hodnota měla blížit 3. Detailnější analýza testovaných markerů naznačuje, že samotná klasifikace založená na VAR skóre by byla poněkud zavádějící. Jak ilustruje graf 5., mezi hodnotami a počtem alel není patrný žádný trend, třebaže po pomyslném odstranění některých "problematických" EST-SSR a gssr markerů mírně stoupá počet alel s rostoucím VAR skóre. V tomto grafu je na x ose nejvyšší dosažená hodnota VAR skóre pro daný mikrosatelit, jelikož vyhledávací algoritmus programu Tandem Repeat Finder (Benson et al., 999), který je součástí SERVu, rozpoznává i více různých repetic v sekvenci a v jednom mikrosatelitním lokusu může být určeno i více hodnot VAR skóre. V případě markeru HLC-D bylo dosaženo pouze záporného VAR skóre a přesto se v souboru vzorků genobanky vyskytlo 5 různých alel. Obdobné výsledky jsou patrné i pro marker HLC2B, kdy je hodnota VAR -,2 a bylo nalezeno2 alel spolu s jednou nulovou. Tyto počty alel jsou stejné, ne-li vyšší, jako pro markery s hodnotami VAR blížících se. Příkladem může být lokus HlGT (VAR =,95) s -ti alelami nebo HLC-6 (VAR =,98) rovněž s alelami. 2

104 Graf 5.: Závislost počtu alel na VAR skóre u hodnocených SSR markerů 4 GA5-G3-35 GA4-H5-8 počet alel 3 HlAGA7 25 HlC-D 5 HlC-2B HlC-5B HlC-3A HlGA9 HlGT5_CZU HlGT7 GA2-L2-5 HlC-4B NDBP HlGA4 GA4-K6-8_ HlC-6 HlGT9 HlGT2 HlGT HlGA3 5 -,6 -,5 -,4 -,3 -,2 -,,,2,3,4,5,6,7,8,9,,2 VAR skóre Zde se ukázal význam shromažďování empirických poznatků, protože dynamika mikrosatelitů se liší nejen mezi lokusy u jednotlivce (Ellegren, b), ale i mezi populacemi téhož druhu a samozřejmě i mezi taxonomicky vyššími jednotkami (Ellegren, b). Autoři trénovali software na genomu kvasinky (S. cerevisiae) spolu s ověřením spolehlivosti predikce u řady jiných druhů. Jak se ukazuje ani takto není možné úplně zobecnit poznatky získané u jednoho druhu a používat je u jiných. Rovněž platí, že v globálním měřítku tj. měřítku celého genomu možná mají mikrosatelity predikovanou variabilitu dle SERVu, ale vždy bude záležet na dynamice v konkrétním lokusu (Bhargava and Fuentes, ). Přesto lze při vytváření a hledání vhodných markerů tento nebo obdobný software k předběžné analýze doporučit. 3

105 5.4.3 VAZBOVÁ A SEGREGAČNÍ ANALÝZA Testování na hybridním potomstvu se známými rodiči umožnilo ověřit několik předpokladů o vlastnostech mikrosatelitů. U kombinačního křížení Kombinace byla testována segregace u mikrosatelitů dle mendelistických pravidel, případná vazba mezi jednotlivými lokusy a výskyt nulové alely. U "Kombinace " je mateřskou komponentou nový český kultivar Vital a otcovskou genotyp značený /5. Celkově bylo hodnoceno 8 potomků tohoto křížení. Před samotnou analýzou bylo identifikováno genotypů, které nesplňovaly požavky k testování. U 9 genotypů byly přítomné alely, které se nevyskytovaly alespoň u jedno z rodičů. Pravděpodobný důvod spočívá v cizosprášení, chybě při odběru či genotypování nebo mutace v lokusu. Poslední genotyp značený 6 byl vyloučen kvůli výskytu tří alel v některých lokusech. Tento neobvyklý výsledek může naznačovat výskyt nerovnoměrného crossing-overu či genové konverze v blízkosti tohoto lokusu, protože k těmto jevům dochází relativně často v oblastech obsahujících tandemové repetice (Kashi a King, 6). Rovněž mohlo dojít k modifikaci meiozy, což ovlivnilo některá stádia mikrosporogeneze. Tyto meotické poruchy poté vedou k vzniku tzv. diplogamet (2n gamet). Jejich výskyt je dokumentován u řady rostlinných druhů například brambor (Carputo et al., 3), ale není známa žádná studie o diplogametách u chmele. Možnost výskytu triploidního genotypu lze testovat pomocí průtokové cytometrie (flow cytometry). Bohužel byl daný genotyp spolu s ostatními vyřazen po skončení testování daného křížení a nelze z něj tedy odebrat materiál k další studii. Z tohoto důvodu nelze vyloučit ani jednu z výše uvedených alternativ, kromě chyby genotypování, jelikož byl daný vzorek několikrát testován jak na polyakrylamidovém gelu tak na kapilární elektroforéze a výsledky obou analýz se shodovaly. 4

106 Segregační analýza Ověření štěpných poměrů bylo provedeno u 3 z mikrosatelitních lokusů, všech STS markerů k identifikaci pohlaví a u skutečného pohlaví. Zbylých sedm SSR lokusů nebylo možné otestovat, jelikož oba rodiče jsou homozygoti s velikostně stejnou alelou. Výsledky χ2 testu, předpokládané štěpné poměry, p hodnoty a další podrobnosti uvádí tabulky 5.5 a 5.6. Skutečný poměr pohlaví (2,5: ve prospěch samic) se statisticky významně lišil od očekávaného na hladině významnosti α =,. Tato skutečnost bývá u chmelu běžnou záležitostí jak dokazuje řada autorů. Neve (99) uvádí štěpný poměr 2:, Patzak et al. (2) udává štěpné poměry v rozmezí,4: až 4,25: dle kombinačního křížení a Čerenak et al. (6) dokonce 6,9:. Neve (99) popisuje, že příčinu nadbytku samičích rostlin první studoval Winkler (98), který uvádí jako pravděpodobný důvod partenogenezi. Ta však byla vyloučena po sérii izolačních testů (Haunhold, 99). Dále Neve (99) uvádí, že při dobré klíčivosti semen, které bylo docíleno působením chladu, byl nadbytek samčích rostlin způsoben kompeticí mezi pylovými zrny a ani odstranění této příčiny nevedlo ke stejnému poměru pohlaví. Lze tedy konstatovat, že důvod k preferování samičího pohlaví není v současné době znám. Podle očekávání všechny STS a jeden SSR marker k identifikaci pohlaví segregovaly ve shodě s příslušným pohlavím. Zbývající mikrosatelitní markery, s vyjímkou dvou, segregují dle mendelistických pravidel. U markeru HLC-D byl zjistěn statisticky významný rozdíl (p<,) proti předpokládané segregaci alel, který vedl k zamítnutí nulové hypotézy a přijetí alternativní o narušení předpokladu volné kombinovatelnosti. Podobná situace nastala u markeru HlGA4, kde však byla dosažena hodnota p vyšší než,. Statisticky nejkorektnější interpretací výsledku, v případě kdy je nulová hypotéza zamítnuta při α =,5, ale ne při α =,, bývá konstatování, že test pro výběr dané velikosti neposkytl dostatečnou informaci k rozhodnutí o významnosti či nevýznamnosti rozdílu (Meloun a Militký, 4). V biologii se běžně používá kritérium α =,5, protože existuje větší neurčitost měření a výsledek tak bývá zatížen vysokou hladinou šumu. Proto je hodnota p nižší než,5 rovněž považována za signifikantní. V tomto ohledu je důležitější biologické hledisko, které poskytuje vysvětlení pro porušení volné kombinovatelnosti. 5

107 Tab. 5.5: Výsledky segregační analýzy (.část) lokus/pohlaví Na Vitalb /5b teor. poměrc početd χ2e pf pohlaví F M : ,36, polley 5 2 : ,38,5 sts : ,38,5 sts : ,2857, HlGA : 5 56,339623,5648 GA4-K : 5 55,23895, GA4-H5-8 2 : 53 48,247525,68824 HLC-2B_CZU 4 2 : 49 55,34654, HLC-3A : 54 52,37736, Vysvětlivky: a- počet testovaných rostlin v lokusu; b - rodičovské sestavy alel; c - teoretický štěpný poměr; d - počet jedinců pro daný genotyp; e - hodnoty χ2 testu; f - p-hodnoty, červeně zvýrazné hodnoty jsou statisticky významné rozdíly pro α =,5 Tab. 5.6: Výsledky segregační analýzy (2.část) lokus Na Vitalb /5b teor. poměrc početd χ2e pf HlAGA ::: ,67925,47 HlGA ::: ,84957,9895 HlGT5_CZU ::: ,6459, HlGT ::: ,37255,76889 GA2-L ::: ,76476, GA5-G ::: ,6459, HLC-D 23 3 ::: ,56,5692 NDBP ::: ,,57247 Vysvětlivky: a- počet testovaných rostlin v lokusu, b - rodičovské sestavy alel, c - teoretický štěpný poměr, d - počet jedinců pro daný genotyp, e - hodnoty χ2 testu, f - p-hodnoty, červeně zvýrazné hodnoty jsou statisticky významné rozdíly pro α =,5 6

108 Důvodem narušení štěpného poměru bývá nejčastěji vazba na pohlaví, vliv selekce nebo výskyt analyzovaných markerů v lokusech organel místo v lokusech jaderného genomu (Selkoe a Toonen, 6). Odpověď nám poskytuje kombinace výsledků ze segregační a vazbové analýzy popisované v následující sekci. Marker HLC-D je mikrosatelit vyskytující se v 5 UTR oblasti genu pro farnesyl pyrofosfát syntázu (FPPS). Tento enzym je součástí biochemické dráhy pro syntézu terpenoidů (Okada et al., ). Složky silic v chmelových hlávkách mezi které patří humulen, myrcen, karyofylen nebo farnesen vznikají z prekurzorů vytvořených právě FPP syntázou. Jelikož je marker HLC-D součástí 5 UTR oblasti dochází pouze k jeho transkripci a neovlivňuje tak výslednou podobu vznikajícího enzymu. Nepřekládané oblasti však mohou hrát výraznou roli v regulaci exprese genu a tedy množství produkovaného enzymu (Mazumder et al., 3), jelikož repetitivní úseky slouží často jako rozpoznávací místa transkripčních faktorů (Gemayel et al., ) či jiných regulačních enzymů a jejich délka ovlivňuje afinitu nebo schopnost rozpoznávat patřičné úseky příslušnými faktory (Li et al., 2; Gemayel et al., ). V případě markeru HLC-D lze tedy předpokládat vliv selekce. U tohoto kombinačního křížení byly v lokusu HLC-D minoritně zastoupeny genotypy s kombinací alel o velikosti 247 a 255 bp. Alela 247 pochází od mateřské rostliny a alela 255 od otcovské, přičemž genotyp odpovídá mateřské sestavě alel (tabulka 5.6). Prozkoumání výskytu těchto alel v kolekci genobanky ukázalo, že alela 247 má relativní četnost,92 a alela 255 je nejfrekventovanější alelou lokusu s relativní četností,46. Obě alely mají poměrně vysokou frekvenci výskytu a ve studované kolekci rostlin by se genotyp 247/255 měl při náhodném výběru objevit ve 4% případů, což znamená u 9 vzorků. Tato sestava alel byla nalezena pouze u tří genotypů a ve všech případech se jedná o kultivary - slovinský Ahil, americký Columbus a samozřejmě český kultivar Vital, přestože se obě alely vyskytují i u planých chmelů. Předběžné srovnání pouze ukazuje, že všechny kultivary patří mezi vysokoobsažné chmely (high alfa) s obdobným celkovým obsahem silic, ale jednotlivé stanovované látky se co do množství značně liší. Tento poznatek není nijak překvapivý, protože obsahy chemických látek ovlivňuje řada genů a výraznou roli zde hraje i prostředí. Z výsledků LOD skóre (tabulka 5.7 a 5.8) je zřejmá nejpravděpodobnější příčina narušení štěpného poměru u lokusu HlGA4. Jak samičí tak samčí hodnoty LOD skóre naznačují vazbu mezi tímto lokusem a lokusem HLC-D. Samičí mapa ukazuje spíše na slabou vazbu (37% rekombinací) a samčí mapa na vazbu silnější (7% rekombinací). Dochází tak zřejmě k jevu zvaném "hitchhiking selection" nebo také "selection sweep" ("selekční svezení se"). Tímto způsobem se zvyšuje frekvence některých alel v populaci u neutrální lokusů spojených s genem či geny u kterých probíhá pozitivní selekce (Nielsen, 5). Podporu této domněnce může poskytnout 7

109 i výskyt jednotlivých alel v genobance. U planých chmelů se předpokládaný výskyt shoduje s náhodným, ale pokud vezmeme pouze kultivary tak současný výskyt alely 223 v lokusu HlGA4 s četností,28 a výskyt alely 239 s četností,9 v lokusu HLC-D by měl odpovídat přibližně 5% kultivarů (3 genotypy z 48), ale skutečný výskyt je 27% (3 genotypů). Samozřejmě je třeba vzít v potaz deformaci vstupních dat, jelikož kultivary mohou mít společné předchůdce v rodokmenu a navíc se jedná o již selektované genotypy. Na druhou stranu byl testovací výběr volen čistě náhodně bez preference některého kultivaru. Alternativní vysvětlení by navíc připisovalo aktivní roli lokusu HlGA4, který by mohl regulovat fungování genu fpps. Zjištěné poznatky momentálně neumožňují určit přesný typ vztahů mezi těmito lokusy, ale naznačují směr pro další potenciální výzkum. 8

110 Vazbová analýza K ověření předpokladu volné kombinovatelnosti mezi jednotlivými lokusy byla počítána hodnota LOD skóre, která udává logaritmus poměru pravděpodobnosti vazby mezi dvěma lokusy proti pravděpodobnosti volné kombinovatelnosti těchto lokusů. Hodnota LOD = 3, je považována za signifikatní pro vazbu (Botstein et al., 98). Bylo provedeno párové srovnání markerů u každého z rodičů. Výsledky tohoto srovnání ukazují tabulky 5.7 a 5.8. Vzhledem k velkému množství údajů, byly do těchto tabulek vybrány pouze vyšší hodnoty LOD skóre naznačující existenci vazby. Ostatní hodnoty jsou součástí tabulek 8.2 až 8.5 v kapitole 8. Přílohy. Tab. 5.7: Hodnoty LOD skóre pro samičí vazbovou mapu.lokus 2.lokus rekombinace* LOD** N*** HlGA9 GA5-G3-32,5 8 HlGA9 HlGT7 3,3 4 HlGT7 GA5-G3-3,3 4 HlGA4 HLC-D,37,46 2 GA2-L2-5 GA5-G3-,39,7 8 HlGT7 GA2-L2-5,39,2 4 Vysvětlivky: * - frekvence rekombinace, ** - hodnoty LOD skóre, *** - počet testovaných genotypů v daném lokusu Tab. 5.8: Hodnoty LOD skóre pro samčí vazbovou mapu.lokus 2.lokus rekombinace* LOD** N*** GA2-L2-5 GA4-K GA2-L2-5 GA4-H GA4-K6-8 GA4-H HlGT7 GA5-G3-28 sts29 HlAGA7 28 sts29 sts477, 25,6 sts477 HlAGA7, 25,6 polley sts29,2 23,8 polley HlAGA7,2 23,8 HlGT7 HlC-3A,2 23,8 GA5-G3- HlC-3A,2 23,8 polley sts477,3 22,24 pohlaví polley,9 6,5 pohlaví sts29,9 6,5 pohlaví HlAGA7,9 6,5 pohlaví sts477, 5,5 HlGA4 HLC-D,7 9,45 HlGA4 HLC-2B,35,73 HLC-D HLC-2B,35,73 HlGT5_CZU HLC-D,39,4 Vysvětlivky: * - frekvence rekombinace, ** - hodnoty LOD skóre, *** - počet testovaných genotypů v daném lokusu 9

111 U řady markerů byla prokázána velmi silná vazba nebo alespoň možnost vazby (hodnoty LOD > ) minimálně u jednoho z rodičů. Na základě těchto výsledků byly odvozeny možné vazbové skupiny z markerů pro hodnotu LOD 3 a vyšší jak je uvádí tabulka 5.9. U samce byly určeny 4 a u samice vazbová skupina. K potvrzení vazby na pohlaví u tří STS a jednoho SSR markeru bylo jako "marker" doplněno i skutečné pohlaví. Z tabulky je patrné, že všechny markery na pohlaví tvoří jednu vazbovou skupinu a lze tedy předpokládat, že se vyskytují společně na Y chromozomu. Byla odhadnuta vzdálenost mezi těmito markery v rámci vazbové skupiny (2,4 cm), ale pravděpodobně jí nelze přikládat příliš velkou váhu, jelikož mezi X a Y chromozomy bývá rekombinace velmi vzácná (Dellaporta a Calderon-Urrea, 9). Spíše se bude jednat o chybu způsobenou během amplifikace či hodnocení markerů. V rámci hledání QTL ovlivňujících důležité hospodářské znaky publikovali Čerenak et al. (6; 7; 9) genetické mapy obsahující ve finále 5 AFLP a 43 mikrosatelitních markerů. Právě výsledky z výše uvedených analýz lze doplnit informace o studovaných lokusech v této práci a provést případné srovnání. Zatím poslední verze genetické mapy (Čerenak et al., 9) ukazuje (obr 5.7), že marker HlGT7 pravděpodobně tvoří vazbovou skupinu s genem chs_h (?) a vzdálenost lokusů je přibližně 3 cm. Z článku není zcela jasné zda se skutečně jedná o chs_h, jelikož popisek udává název "CHS_gene", ale v textu se uvádí zanesení tohoto genu do mapy a jiný popis tomu neodpovídá. V této práci je marker HlGT7 součástí vazbové skupiny 3 obsahující marker HLC-3A, který je součástí genu chs_h a odhadnutá vzdálenost činí 2,8 cm. Součástí této skupiny je i marker GA5-G3-, který se však na mapě nevyskytuje. Přestože se odhad vzdálenosti liší, panuje shoda ve vytvoření vazbové skupiny a potvrzuje tak správnost provedené analýzy. Z mapy lze dále odvodit existenci vazby mezi markery, které v kombinačním křížení "Kombinace " neštěpily. Jedná se o marker HLC-6 v chs3 genu, marker HLC-4B v chs4 genu a marker HLC-5B v genu vps. Jak je z obrázku 5.7 patrné, mezi těmito markery je síla vazby přibližně cm. Tab. 5.9: Vazbové skupiny genotyp 475 /5 číslo vazbové skupiny HlGA9 + HlGT7 + GA5-G3- HlGA4 + HLC-D HlGT7 + GA5-G3- + HLC-3A GA2-L2-5 + GA4-K6-8 + GA4-H5-8 pohlaví + polley + sts29 + sts477 + HlAGA7 vzdálenost (cm) 5,6 2,8 2,4

112 Obr. 5.7: Vazbová skupina 8 (upraveno dle Čerenak et al., 9) Testování markerů nelze samozřejmě považovat za skutečnou tvorbu genetické mapy, protože mapování je běžně prováděno pomocí stovek až tisíců mikrosatelitních, AFLP, SNP a jiných markerů (Kong et al., 2). Přesto má takováto analýza smysl, jelikož umožňuje ověřit to, co řada autorů genetických studií pouze předpokládá. U chmele bylo publikováno 236 mikrosatelitních lokusů, přičemž jen velmi malé množství bylo ověřeno z hlediska markerovací kvality. Jelikož získávání nových gssr lokusů je do značné míry náhodný proces, dalo by se usuzovat, že většina těchto lokusů bude pocházet z rozličných oblastí genomu a různých chromozomů. Tento předpoklad se ukázal být značně zavádějící, jelikož u 9 z SSR markerů byla zjištěna vazba, což ovlivňuje možnosti jejich použití. Aplikace všech těchto markerů najednou je možná například pro účely DNA profilingu či fingerprintingu, mapování, porovnání variability ap. Nicméně využití mikrosatelitů, které jsou ve vazbě, k populačním studiím může způsobit problém ohledně vypovídací hodnoty těchto mikrosatelitů. Vazba mezi lokusy narušuje předpoklad volné kombinovatelnosti a vytváří vztah mezi informacemi poskytovanými těmito lokusy (Ardren et al., 999). S touto skutečností řada populačně-genetických parametrů a modelů nepočítá. Volná kombinovatelnost je důležitá při určení efektivní velikosti populace (effective population size - N e) nebo frekvence migrací (Beerli a Felsenstein, ), struktury populace, přiřazování jednotlivců k dané populaci (Pritchard et al., ) a genového toku (Hey a Nielsen, 4). Proto lze k populačním studiím doporučit využívat pouze jeden lokus z dané vazbové skupiny nebo použít modely, které s touto možností počítají.

113 5.5 CHARAKTERIZACE GENETICKÝCH ZDROJŮ 5.5. IDENTIFIKACE GENOTYPŮ První krokem charakterizace kolekce planých chmelů genobanky bylo testování síly markerů k jednoznačné identifikaci každého genotypu. Výsledky tab. 5. zahrnují pouze plané chmely, kompletní tabulky 8.6 a 8.7 zahrnující i shodné kultivary jsou v kapitole 8. Přílohy. Ukázalo se, že ani často velmi variabilních SSR markerů nedokázalo odlišit všechny rostliny. V tabulce 5. hodnoty označené jako pid ukazují pravděpodnost s jakou bude mít nepříbuzný jedinec stejnou sestavu alel, přísnější kritérium hodnoty pravděpodobnosti pidsib udává pravděpodobnost s jakou bude mít jedinec stejnou sestavu alel pokud sdílí jednoho z rodičů s testovaným genotypem. V obou případech se jedná o extrémně malé hodnoty, ale na druhou stranu už byla dokázána vazba u řady lokusů zvyšující šance některých alelických sestav. Přesto jen velmi malé množství genotypů planých chmelů sdílí stejnou kombinaci alel pro všechny lokusy. U kultivarů je úspěšnost mnohem menší, což bude dáno způsobem selekce a sdílením některých rodičovských rostlin v rodokmenech. Podařilo se odlišit celkem 32 unikátních genotypů reprezentovaných jedním kultivarem. Celkem bylo detekováno 36 různých genotypů, ale 4 genotypové sestavy byly shodné pro 2 a více kultivarů. Nejzajímavější je shoda planého chmelu Can86 s řadou kultivarů. Jedná se o jeden ze dvou planých chmelů, které nelze rozlišit od kultivarů a navíc se shoduje s jemnými aromatickými chmely převážně tvořenými výběry žateckého poloraného červeňáku jakými je Osvaldův klon 3, 55 a 47. Druhý planý Cau8 se shoduje s odrůdou Agnus. Jednalo by se opravdu o zvláštní náhodu, a proto se dá předpokládat záměna u rostlin nebo chyba při odběru či popisu vzorků pro genetické analýzy. U většiny zbylých genotypů lze uvažovat o možné duplikaci při primárním odběru či během další manipulace. Ve všech případech shodné genotypy sdílejí jak pohlaví tak kombinace alel a navíc je u nich vidět navazující číselná posloupnost. Jedná se o sedm dvojic a sice Can56,57; CR42,43; Fr27,28; Fr37,38; Sp6,7; USA54, 55 a USA64, 65. Chmel je schopen i vegetativního rozmnožování a mohou tak vznikat porosty z jediné rostliny u kterých nelze pouhým pohledem určit jestli se jedná o stejné či jiné rostliny. Tato sada markerů prokázala vysokou rozlišovací schopnost, ale jistou nevýhodu představuje vazba mezi některými lokusy. V případě požadavku na vytvoření testovací sady podobné profilovacím kitům u člověka (Butler, 5; Hill et al., 9) a dalších organismů (van Asch et al., ), by bylo zapotřebí využít markery u kterých je známo, že jsou volně kombinovatelné. 2

114 Tab. 5.: Shodné genotypy v kolekci genobanky - pouze pro plané počet počet shodné odlišné.ida sex b hodnocených 2.IDa sex b hodnocených pidc pidsic typ shody lokusy lokusy lokusů lokusů Can_56 M Can_57 M 4,72E-44 5,54E- úplná Can_86 F 8 Cult_ F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_2 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_3 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_4 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_5 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_6 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_8 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_5 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_7 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_8 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_23 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Can_86 F 8 Cult_24 F 8 6,92E-9 4,25E-7 úplná Cau_8 F Cult_32 F 3,E-25 3,62E-8 úplná CR_42 F CR_43 F,43E-22 4,58E-8 úplná Fr_27 M Fr_28 M 3,66E-2 9,67E-8 úplná Fr_27 M Fr_35 M 3,66E-2 9,67E-8 úplná Fr_28 M Fr_35 M 3,66E-2 9,67E-8 úplná Fr_36 M Fr_37 M,4E-2 7,2E-8 úplná Sp_6 M Sp_7 M,8E-9,49E-7 úplná Swi_2 F Swi_9 F 2,36E-25 2,7E-8 úplná USA_54 M 9 USA_55 M 9 7,6E-36 5,74E- úplná USA_64 F USA_65 F 8 8 8,24E-3 4,24E-9 úplná Vysvětlivky: a - kódové označení.a 2. shodného genotypu, b - pohlaví dané rostliny, c - pravděpodobnost nalezení stejného genotypu u dalšího nepříbuzného jedince, d - totéž jako c ale pro jedince sdílejícího jednoho z rodičů 3

115 5.5.2 DESKRIPTIVNÍ STATISTIKA Celkově bylo hodnoceno 229 rostlin chmele z toho 8 planých a 48 náhodně vybraných registrovaných odrůd nebo materiálů z novošlechtění. PCA (principal component analysis) a CLU (cluster analysis) metody v sekci rozdělily plané chmely poměrně jednoznačným způsobem na tři podskupiny a kulturní chmely přiřadily jako nejpodobnější evropské podskupině. V tabulkách 5. až 5.3 je toto rozdělení zohledněno, a proto ukazují variabilitu jednotlivých podskupin planých chmelů zvlášť a dohromady, kultivarů a celého souboru rostlin. Dané členění lépe ukazuje rozložení variability, protože pouhé srovnání planých a kulturních chmelů je samo o sobě mírně zavádějící vzhledem k původu většiny kultivarů. K srovnání a popisu byly použity hodnoty heterozygotnosti očekávané - HO (tab. 5.), polymorfního informačního indexu - PIC (tab. 5.2) a porovnány počty alel - n na lokus (tab. 5.3) a souhrnné střední hodnoty vyjádřené formou mediánu a průměru. Hodnota aritmetického průměru byla použita pro účel srovnání s publikovanými výsledky ostatních autorů, kteří mediánovou hodnotu neudávají. Tab. 5.: Hodnoty heterozygotnosti pozorované (HO) lokus vše a plané b plané_amc plané_kavd plané_evre kultivaryf HlAGA7,64,57,62,9,68,88 HlGA3,42,48,6,75,27,23 HlGA4,63,55,3,69,69,92 HlGA9,4,38,26,8,3,5 HlGT5_CZU,54,48,23,8,54,77 HlGT9,32,36,63,6,22,9 HlGT,33,37,45,59,22,9 HlGT2,23,27,8,75,6,6 HlGT7,57,48,23,34,72,92 GA2-L2-5,65,65,54,63,74,67 GA4-K6-8,6,53,53,38,59,9 GA4-H5-8,72,74,68,69,8,64 GA5-G3-,88,85,84,94,83,96 HLC-D,52,49,65,75,27,65 HLC-2B,24,25,52,6,7,9 HLC-3A,47,39,6,3,38,74 HLC-4B,29,27,38,53,,38 HLC-5B,43,48,62,72,28,27 HLC-6,32,24,25,44,7,58 NDBP,63,57,3,69,72,87 průměr,49,47,47,55,44,57 medián,49,48,52,66,34,64 Vysvětlivky: a - plané a kulturní chmely dohromady, b - pouze plané chmely, c - chmely z americké oblasti, d - chmely z kavkazské oblasti, e - chmely z evropské oblasti, f - kulturní chmely 4

116 Tab. 5.2: Hodnoty polymorfního informačního indexu (PIC) lokus vše a plané b plané_amc plané_kavd plané_evre kultivaryf HlAGA7,88,87,83,53,69,72 HlGA3,59,65,6,57,25, HlGA4,76,76,47,69,6,62 HlGA9,67,67,43,78,29,48 HlGT5_CZU,82,8,33,8,6,55 HlGT9,63,7,76,38,27,7 HlGT,44,49,6,38,9,6 HlGT2,32,37,26,72,8,6 HlGT7,82,8,4,32,75,76 GA2-L2-5,85,86,6,58,79,66 GA4-K6-8,7,7,67,43,54,63 GA4-H5-8,84,88,,76,72,53 GA5-G3-,94,94,,86,85,85 HLC-D,72,74,82,4,25,55 HLC-2B,78,79,8,58,45,48 HLC-3A,78,79,8,22,59,63 HLC-4B,6,65,79,68,9,3 HLC-5B,64,7,77,54,29,28 HLC-6,63,66,46,67,6,43 NDBP,82,8,5,66,7,74 průměr,7,73,64,58,46,49 medián,74,75,64,58,5,54 Vysvětlivky: a - plané a kulturní chmely dohromady, b - pouze plané chmely, c - chmely z americké oblasti, d - chmely z kavkazské oblasti, e - chmely z evropské oblasti, f - kulturní chmely Tab. 5.3: Počty alel na lokus (n) lokus vše a plané b plané_amc plané_kavd plané_evre kultivaryf HlAGA HlGA HlGA HlGA HlGT5_CZU HlGT HlGT HlGT HlGT GA2-L GA4-K GA4-H GA5-G HLC-D HLC-2B HLC-3A HLC-4B HLC-5B HLC NDBP celkem průměr 5,4 5,3,3 6,8 6,6 5,9 medián 3,5 3,5, 5,5 5, 6, Vysvětlivky: a - plané a kulturní chmely dohromady, b - pouze plané chmely, c - chmely z americké oblasti, d - chmely z kavkazské oblasti, e - chmely z evropské oblasti, f - kulturní chmely 5

117 Před samotným hodnocením byla provedena exploratorní analýza dat (EDA) sloužící k ověření vlastností datového souboru především z hlediska předpokladu normality rozdělení a homogenity. Z grafické diagnostiky obr. 8.3 až 8.5 v kapitole 8. Přílohy je patrná silná nehomogenita a z toho pramenící bimodálnost u řady skupin, asymetrie a odlehlé body. Úpravy dat pomocí logaritmické a Box-Coxovy transformace ke zlepšení nevedly, a proto musely být k testování použity neparametrické varianty příslušných parametrických testů. K testování rozdílů středních hodnot PIC, HO a počtu alel (n) u podskupin planých chmelů a kultivarů byla použita Kruskal-Wallisova ANOVA, která je neparametrickou variantou ANOVy jednoduchého třídění. Spíše k doplnění a orientačnímu srovnání byly rovněž posuzovány rozdíly v PIC, Ho a n mezi planými a kulturními chmely pomocí Mann-Whitneyho U testu představujícího neparametrickou alternativu k t-testu dvou nezávislých výběrů. Výsledky všech testů jsou zobrazeny spolu s krabicovými grafy na obr. 5.8, 5.9 a v tabulce 5.4 udávající vícenásobné porovnání p-hodnot u počtu alel k posouzení které konkrétní skupiny se statisticky významně liší od ostatních. Statisticky významné rozdíly jsou zvýrazněny červeně. 6

118 Obr. 5.8: Krabicové grafy pro HO a PIC spolu s výsledky Kruskal-Wallisovy ANOVy a Mann-Whitneyho U testu Vysvětlivky: stasticky významné výsledky na hladině α =,5 jsou zvýrazněny červeně 7

119 Obr. 5.9: Krabicové grafy pro n spolu s výsledky Kruskal-Wallisovy ANOVy a Mann-Whitneyho U testu Vysvětlivky: statisticky významné výsledky na hladině α =,5 jsou zvýrazněny červeně 8

120 Krabicové grafy zde slouží k částečné sumarizaci dat v grafické podobě, jelikož umožňují posoudit symetrii rozdělení v okolí kvantilů, zobrazují robustní odhad polohy v podobě mediánu a identifikovat odlehlé hodnoty (Meloun a Militký, 4). Použité grafy ukazují rozdělení v dolním (FD) a horním (FH) kvartilu a minimální a maximální hodnoty. Z grafů je nejlépe patrná častá asymetrie rozdělení např. pro HO a n u amerických, kavkazských a evropských planých chmelů. Tato asymetrie vyplývá už z povahy dat, protože hodnocené lokusy s největší pravděpodobností vykazují vzájemně rozdílnou mutační dynamiku, která se může lišit i rámci jednoho lokusu u chmelů z jiných regionů. Obecně platí, že s rostoucí vzdáleností a délkou času, který uplynul od rozdělení daných skupin narůstá pravděpodobnost diferenciace vlivem odlišných evolučních sil a spontánních mutací. Na základě testů vyšel statisticky významný rozdíl mezi planými a kulturními v hodnotách PIC (p =,26) a počtu alel n (p =,). V obou případech vykazují plané rostliny vyšší hodnotu polymorfního informačního indexu a počtu alel oproti kultivarům. V heterozygotnosti statisticky významný rozdíl prokázán nebyl. Při posuzování v rámci určených skupin planých chmelů nebyly zjištěny statisticky významné diference ani v H O ani v PIC. Pouze počtem alel se americká skupina planých chmelů odlišuje od všech zbývajících jak je patrné z tabulky mnohočetného porovnání (tab. 5.4). Tab. 5.4: Vícenásobné porovnání p-hodnot pro počet alel (n) Vysvětlivky: statisticky významné hodnoty pro α =,5 jsou červeně zvýrazněny Získané výsledky nejsou zcela v souladu s očekáváním, protože i zběžná prohlídka tabulek s hodnotami sledovaných parametrů ukazuje na poměrně markantní rozdíly mezi skupinami. Důvodem je pravděpobně obecně nižší síla neparametrických testů zamítnout nulovou hypotézu. Na druhou stranu aplikace parametrických testů v případě nevyhovujících dat vede mnohdy k nesprávným závěrům. Pouze Bassil et al. (8) ve své práci uvádí statisticky významné rozdíly ve všech sledovaných parametrech (HO, PIC i n) pro skupiny amerických a evropských chmelů, ale jediným výstupem jsou údaje o p hodnotách s 95% intervaly spolehlivosti, přičemž chybí informace o vlastnostech dat a použitém testu, což pro srovnání výsledků není dostačující. 9

121 5.5.3 STRUKTURNÍ ANALÝZA K odhalení vztahů a skryté struktury vícerozměrných dat lze s úspěchem využít řadu metod mezi které patří i analýza hlavních komponent (PCA) a shluková analýza (CLU). Standardní využití metody PCA umožňuje pomocí lineární transformace převést původní znaky na nové latentní proměnné nazývané hlavní komponenty. Cílem tohoto převodu je oddělení informace od šumu a redukce počtu znaků s minimální ztrátou informace. Tato redukce umožňuje zobrazit vícerozměrná data a zjednodušit řešenou úlohu, protože nejvíce informace je obsaženo v prvních několika málo hlavních komponentách. Ty pak slouží jako komplexní ukazatele, jejichž nejdůležitější vlastností je míra variability, kterou popisují. Nejvíce variability bývá vyjádřeno v první hlavní komponentě a nejméně v poslední. V genetice je snahou určit vztahy a strukturu mezi jednotlivci či populacemi pomocí molekulárních značek analyzujících úseky genomu daného organismu nebo organismů. Taková data mají přirozeně vícerozměnou povahu a nejmodernější sekvenační metody či metody na bázi microarray čipů umožňují v současné době studovat i tisíce lokusů najednou (Metzker, ; von Holdt, ). Z matematického hlediska jsou pak takováto data vnímána jako "mrak" n bodů uvnitř p-rozměrného prostoru, kde každá alela reprezentuje jednu dimenzi (Jombart et al., 9). Aby byla možná správná analýza genetických dat, je nutné při porovnávání jednotlivců převést hodnoty velikostí alel na jejich frekvence (Jombart, 6) čímž získáme matici s hodnotami, a,5. Z výše uvedených poznatků je patrný rozdíl ve využití PCA metody v genetice, kde často nelze smysluplně aplikovat standardní postupy zahrnující určení míry párových závislostí mezi proměnnými, průzkumovou analýzu pomocí symbolových a rozptylových diagramů ap. Vzhledem k nulové předchozí zkušenosti s takovouto aplikací PCA byla analýza provedena zároveň v programu STATISTICA ver. 9. a softwaru GENETIX, který obsahuje i modul PCA a je primárně určen pro genetická data. Porovnáním výstupů byla zjištěna naprostá shoda a k zobrazení byly použity výstupy z programu STATISTICA vzhledem k lepším diagnostickým a grafickým možnostem. Při srovnávání jednotlivců postrádá svůj skutečný účel i Cattelův graf úpatí vlastních čísel a grafy komponentních zátěží, které jsou tak ukázány čistě z ilustrativního hlediska (obr. 5.). Tyto ukazatele běžně slouží k identifikaci nejvhodnějšího počtu proměnných a určení síly a typu vazeb mezi proměnnými. K odhalení struktury tak mají největší význam rozptylové grafy komponentního skóre. Zde je tedy analýza hlavních komponent využita především k projekci vícerozměrných dat do roviny či prostoru, a zjištění vztahů mezi jednotlivými objekty, protože tyto projekce zachovávají vzdálenosti a úhly mezi studovanými objekty.

122 Obr. 5.: Cattelův indexový graf vlastních čísel a grafy kompomentních vah pro PC-3 2

123 Na obr. 5.2 jsou zobrazeny projekce objektů pro komponenty PC-2. První hlavní komponenta vysvětluje 8,66% a druhá 5,74% variability. Daný ukazatel tedy říká jaká část genetické variability je objasněna v dané komponentně. Využití i třetí hlavní komponenty na obr objasňující 2,73% variability příliš mnoho informací nepřinaší a projekce genotypů do dvou komponent se jeví jako dostačující. Jak ukazuje von Holdt et al. () i pouhých 2,7% vysvětlené variability odhalilo strukturu u desítek plemen psů a vlků s celého světa. U standardní PCA analýzy by se tyto hodnoty jevily jako nedostatečné, ale v daném případě je lepší řídit se pravidlem upřednostňujícím biologický smysl nad statistickými kritérii (Jombart et al., 9). Ostatně samotná PCA metoda je spíše považována za exploratorní než statistickou metodu (Meloun et al., 5; Hintze, 7). Na první pohled je zřejmá existence tří hlavních skupin objektů, která je ukázána v pravé dolní části obrázku. Vzhledem k velkému množství studovaných genotypů byla každá oblast zvětšena tak, aby umožňovala identifikaci jednotlivých vzorků. Pro snažší identifikaci byly genotypy barevně označeny způsobem odpovídajícím jejich původu. Detailnější pohled nám ukazuje, že tyto tři skupiny reflektují možné genofondy a odrážejí tak původ rostlin. První skupina, značená modře, obsahuje pouze genotypy pocházející z Kavkazu, druhá - červená skupina je tvořena kanadskými a americkými chmely a poslední zelená skupina se skládá z evropských chmelů. S touto skupinou se částečně překrývá většina kulturních chmelů (šedé značení) a trochu překvapivě i vzorky z Kyrgyzstánu (růžové a žluté značení). Genotypy z Kyrgyzstánu byly použity pouze u PCA a CLU analýz pro doplnění a srovnávací účely, jelikož se jedná o náhodně vybrané potomky pouhých dvou mateřských rostlin a neznámého počtu otcovských. Skrytou strukturou je geografický původ, který se projevuje na úrovni DNA a je v souladu se známými skutečnostmi. Přesnějším pojmenováním je, že se jedná o identifikaci geneticky izolovaných oblastí. Řada předchozích studií ukázala na existenci dvou bioregionů - evropského a amerického (Jakše et al., ; Jakše et al., 4; Murakami et al., 6a). K této primární divergenci na evropské a asijsko - americké chmely došlo před,5-,27 milionem let, přičemž dle analýz cpdna patří kavkazské chmely do evropské podskupiny (Murakami et al.; 6b). Příslušný poznatek se s výsledky této práce nevylučuje, jelikož frekvence mutací mikrosatelitů je výrazně vyšší než standardní hodnota -9 (Leonard et al., 3) a chloroplasty patří mezi nejkonzervativnější elementy v buňce z hlediska počtu mutací za jednotku času (Bock and Timmis, 8). Množství změn u jaderných mikrosatelitů proto musí být nutně mnohem vyšší než v nekódujících oblastech chloroplastu. V případě správnosti hypotézy o genetické izolovanosti kavkazského regionu od ostatních (Murakami et al., 6a) panuje shoda s dosaženými výsledky. Je zřejmé, že lze argumentovat i opačným směrem, konstatováním o podpoře dané hypotézy na základě dosažených výsledků. 22

124 Obr. 5.2: Graf komponentního skóre pro PC-2 s detaily jednotlivých skupin Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 23

125 Obr. 5.22: Graf komponentního skóre pro PC-2, PC-3 a CLU analýza Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 24

126 Detail evropské skupiny chmelu poskytuje informace ohledně křížení genotypů z různých bioregionů. Několik chmelů odebraných na americkém kontinentu bylo zcela jednoznačně přiřazeno do evropské skupiny. Jedná se o Can46, 47, 5, 52, 83, 84, 86, USA5, 74 a 39. Je vysoce pravděpodobné, že se jedná o křížence evropských a amerických genotypů. Chmel se přirozeně vyskytuje na severní polokouli (Jakše et al., 4) a evropský chmel byl pro pěstitelské potřeby dovezen i na americké území, kde se přirozeně rozšířil i mezi americké plané chmely (Reeves and Richards, ). Navíc důsledkem šlechtění vznikají odrůdy obsahující geny z obou genofondů a dochází tak k jejich opětovnému mísení. Dokladem tohoto jevu a vynikající rozlišovací schopnosti kombinace SSR markerů a PCA metody je i určení několika kultivarů vyskytujících se "mezi" oběmi skupinami. Jedná se o kultivary Columbus, Banner, Olympic, Alliance a Silnyj. U prvních tří bylo potvrzeno, že obsahují v rodokmenu evropské i americké odrůdy (V. Nesvadba, osobní komunikace). Informace k původu odrůdy Alliance poskytují webové stránky amerického ministerstva zemědělství (USDA) prostřednictvím ARS služby (Agricultural Research Service). Zde lze dohledat, že mateřskou rostlinou byla anglická odrůda Whitbread s Golding Variety křížená se samčí rostlinou C3. Genotyp C3 má v rodokmenu kultivar Brewer s Gold, který byl získán volným opylením samičí rostliny Wild Manitoba BB. Mateřská rostlina tohoto "kultivaru" Wild Manitoba BB je pokládána za opravdový severoamerický planý chmel. Informace o kultivaru Silnyj se nepodařilo získat, ale má ve všech lokusech stejnou sestavu alel jako kultivar Alliance (tab. 8.7 Cult a 47). Poslední publikovaná studie pomocí DArT (Diversity Arrays Technology) čipů porovnávající 92 kulturních i planých chmelů jednoznačně oddělelila studované genotypy na americké, evropské a hybridní tvořené kombinací prvních dvou skupin (Howard et al. ). V této studii se rovněž připouští možnost existence podskupiny kavkazských chmelů na základě studia dvou kavkazských genotypů. V souladu s předchozí analýzou Murakamiho et al. (6a) nelze jednoznačně rozdělit evropské chmely na regiony dle míst odběru, což vypovídá o rychlé expanzi chmele po celém území Evropy s pomocí člověka (Patzak et al., a; b). Zajímavé nicméně je, že by se měl v takovém souboru chmelů projevit tzv. efekt zakladatele, který se ve studii Murakamiho et al. (6b) nepodařilo zjistit. V Evropě je známa řada pěstitelských oblastí a například žádné detekované rozdíly mezi krajovými odrůdami Saazer, Spalter a Tettnanger (Haartl and Seefelder, 998) získaných pozitivním výběrem z homogenní populace chmele ukazuje na přenos rostlin s požadovanými vlastnostmi mimo původní území. Méně pravděpodobnou variantou je vznik dvou stejných náhodných mutací či mutací se stejným efektem na různých lokalitách. Žádná další studie zabývající se domestikací a šířením chmele nebyla dosud publikována. 25

127 Poslední poznatek o evropské skupině se týká evropských planých a kulturních chmelů. Z diagramu je viditelný překryv obou skupin, ale přesto je patrná slabá diferenciace a řada kultivarů je mimo oblast evropských planých chmelů. Jakše et al. (4) udává jednoznačné odlišení planých a kulturních chmelů na základě PCoA metody, bohužel však článek neobsahuje grafy dokládající toto tvrzení, které se navíc zakládá na analýze 4 SSR markerů. Novější studie s mnohem větším počtem markerů a genotypů podobně jednoznačnou diferenciaci neukazují (Patzak et al., a; Howard et al., ). Ostatní skupiny se vyznačují poměrně vysokou homogenitou, jelikož všechny kavkazské rostliny s vyjímkou genotypu Cau8 tvoří jeden celek, což platí i pro americké genotypy, třebaže u nich je patrná vyšší variabilita a netvoří tak sevřený shluk. Jedním z důvodů může být různě velký podíl sekvencí pocházejících z evropského genofondu. K posouzení správnosti interpretace, hlubšímu porozumnění výsledkům a pro vzájemné srovnání byla použita matematicky odlišná metoda analýzy shluků (CLU). Hierarchické shlukování bylo provedeno na základě distační matice (DA) (Nei et al., 983) a nejvhodnější metoda shlukování byla určena sérií testů všech dostupných metod v NCSS. Byly sledovány změny v hodnotách kofenetického korelačního koeficientu (CC), který odpovídá Pearsonovu korelačnímu koeficientu mezi skutečnou a předikovanou vzdáleností na základě dendrogramu (Meloun et al., 5). Posuzována byla rovněž změna (Δ) parametrů α a β, které měří stupeň transformace vzdálenosti objektů v původní matici dat a vzdáleností získanou z dendrogramu. Cílem bylo získat co nejvyšší hodnotu CC a nejnižší hodnoty změny pro α a β. Výsledek této analýzy ukazuje tabulka 5.5. Nejlepších parametrů CC a delta bylo dosaženo u metody UPGMA (tab. 5.5). Detailní studií různých shlukovacích metod pomocí reálných a simulovaných dat Odong et al. () potvrdil vhodnost CC jako ukazatele správného strukturování skupin. Hodnoty CC,8 lze považovat za spolehlivý ukazatel struktury (Odong et al., ), což přibližně odpovídá doporučované hodnotě nad,75 pro věrohodnost dendrogramu (Hintze, 7). Pro metodu UPGMA byla dosažena hodnota CC =,955, přičemž hodnoty CC,9 lze z genetického hlediska považovat za kvalitní i pro taxonomické studie (Odong et al., ). Tab. 5.5: Hodnoty CC a delta pro jednotlivé shlukovací metody Metoda CC Delta (,5) Nejbližšího souseda (NN),945,74476 Nejvzdálenějšího souseda (FN),8275,2269 Vážený průměr skupin dvojic (WPGMA),996,964 Nevážený průměr skupin dvojic (UPGMA),95583,7945 Vážený centroid skupin dvojic,956,96242 Nevážený centroid skupin dvojic,999,226 Wardova metoda,9385,9638 Vysvětlivky: šedé zvýraznění ukazuje metodu s nejvyšší hodnotou CC a nejnižší delta 26 Delta (),7985,2726,4279,3,9898,59,9723

128 Členění v dendrogramu na obr je ve shodě s výsledky dosaženými pomocí PCA metody (viz. projekce do dvou či tří PC os u obr. 5.22). Tento obrázek nám ukazuje čtyři skupiny značené A, B, C a D spolu s barevným kódem odpovídajícím barvám genotypům z příslušné oblasti v PCA a barvami jednotlivých genotypů. Díky tomu je vidět vysoká homogenita v rámci všech skupin s občasným přiřazením několika málo genotypů do jiné oblasti než patří původem. V rámci každé "hlavní" skupiny není patrná výraznější direfenciace svědčící o případných podskupinách. Podporu výsledků disertační práce rovněž nabízí studie Patzaka et al. (a) vzhledem k velkému množství vzorků a použití vícerozměrných metod. Navíc řada studovaných genotypů bude shodná, jelikož odebrané genotypy pocházejí z genobanky Chmelařského institu s.r.o. v Žatci. K analýze byla použita PCoA metoda na základě matice euklidovských vzdáleností. V článku Patzak et al. (a) ukazují strukturu a vztahy u 92 kulturních a planých chmelů pomocí metody PCoA. Jak je z obrázku 5.23 patrné, chmely tvoří čtyři odlišné skupiny - první tvoří evropské kultivary a plané chmely, druhá je složena z kavkazských chmelů, třetí obsahuje americké plané chmely a poslední skupina obsahuje americké kultivary nebo kultivary vzniklé křížením evropských a amerických odrůd. Obr. 5.23: Výsledek PCoA u 92 genotypů (upraveno dle Patzak et al., a) 27

129 5.5.4 KOMPARATIVNÍ ANALÝZA Informace o chemických a morfologických datech Díky laskavému poskytnutí údajů o obsahových látkách a hodnocení pomocí morfologických deskriptorů u planých chmelů, bylo možné doplnit a vzájemně konfrontovat výsledky tří značně rozdílných typů dat. Vzhledem k náročnému požadavku na kompletní údaje ze všech tří oblastí hodnocení bylo vybráno pouze 38 genotypů. Chemoklasifikace byla provedena na základě 9-ti chemických látek a 3 celkových obsahů u dané skupiny látek - α hořkých kyselin, β hořkých kyselin a silic. Jednotlivými stanovanými látkami byl kohumulon, kolupulon, xanthohumol (X), desmethylxanthohumol (DMX), myrcen, karyofylen, humulen, farnesen a selineny. Kompletní chemické údaje byly dostupné pouze pro rok 8. Pomocí morfologických deskriptorů byla hodnocena barva, postavení a počet výhonů, klasovitost, barva révy, výška rostliny, délka internodií, síla révy, pazochování, délka pazochů, kvetení k datu 5.6., 2.7. a Každá vlastnost je hodnocena pomocí rozdílné stupnice dané pro konkrétní znak. Rozmezí se standardně pohybuje od do 5. 28

130 Předúprava dat U mikrosatelitních markerů lze podobnosti genotypů vyjádřit pomocí řady distančních matic a jednou z nejpoužívanějších bývá tzv. D A matice dle Nei et al. (983), která však může být použita pouze pro NMMDS (Non-Metric Multidimensional Scaling - Hintze, 7), jelikož není založena na Euklidovských vzdálenostech (Jombart et al., 9). Z tohoto důvodu a pro srovnávací účely z hlediska stejného typu matic pro všechny druhy dat byla rovněž vytvořena matice na základě Euklidovských vzdáleností. Jak se později ukázalo, díky dobrému proložení příslušným MDS modelem mezi těmito typy matic nebyly výraznější rozdíly. Jelikož obsahy daných látek byly vyjádřeny rozdílnými způsoby a sice v % hmotnosti sušiny (% hm.s.) a v % relativního zastoupení (% rel.) dané látky v příslušné skupině látek, bylo před analýzou provedeno sjednocení na stejné jednotky (% hm.s.). Předchozí analýzy obsahových látek na větším souboru chmelů pomocí EDA (Exploratory Data Analysis), které nejsou součástí této disertační práce, ukázaly na řadu problematických vlastností. Jedná se o nehomogenitu dat, negaussovské rozdělení a vlivné body. Přes tato závažná zjištění nebylo zapotřebí provést transformaci, která naopak zavádí systematickou chybu do datového souboru, protože MDS (Multidimensional Scaling) a CLU metody nejsou na předpokladech o homogenitě a normalitě rozdělení založeny. Shlukovací metody jsou obecně citlivé pouze na rozdílné jednotky hodnocených znaků, které byly sjednoceny pro všechny látky díky převodu na % hm.s. a navíc byla provedena sloupcová standardizace, která eliminuje i rozdílnou stupnici. Pro ověření a kontrolu byla analyzována standardizovaná i nestandardizovaná data. Další nutností je eliminace vlivných bodů, a proto byl na základě výše uvedené exploratorní analýzy vyřazen genotyp USA74. U MDS by nehomogenita aj. byl problém pouze v případě použití korelační matice jako vstupního datového souboru. Veškeré analýzy však byly dělány na základě distančních matic. Morfologická data z hodnocení byla ponechána ve své původní podobě. 29

131 MDS a CLU Metoda vícerozměrného škálování objektů představuje alternativu k FA (faktorové analýze), ale na rozdíl od FA umožňuje vyjádřit podobnosti mezi objekty na základě jakékoliv matice korelační, podobnostní či vzdálenostní (Meloun et al., 5). Tato vlastnost je velkou předností MDS a umožnila provést srovnání tří odlišných typů dat pro stejné genotypy. Cílem metody je vytvoření subjektivní mapy objektů, které jsou přeuspořádány tak, že se blíží pozorovaným vzdálenostem (StatSoft, ). Navíc je možné posoudit kvalitu proložení dat příslušným modelem pomocí ukazatele stress a porovnat těsnost proložení pro SSR, obsahové látky a morfologické charakteristiky. Hodnota stress totiž udává rozdíl mezi původní a reprodukovanou vzdáleností na základě daného modelu. Prvotním cílem je zjistit vhodný počet souřadnic (dimenzí), které by nejlépe vysvětlovaly podobnosti či vzdálenosti mezi studovanými objekty. Standardní bývá posouzení pomocí Cattelova indexového grafu úpatí relativní velikosti stress, což je analogické využití jako pro PCA či FA metody. V tomto případě vycházela volba počtu souřadnic z cíle minimalizace počtu dimenzí s maximálním možným proložením. Nejdůležitějším kritériem však byla interpretovatelnost s ohledem na daný počet souřadnic, a proto nebyl brán Cattelův graf v potaz. Jako vhodný způsob k zjištění počtu souřadnic bylo vybráno testování modelů pro 2 a 3 dimenze u všech typů dat. Důvodem je skutečnost, že tento počet je nejobvyklejší a je-li zapotřebí k zobrazení vyšší množství dimenzí, pak se vícerozměrné škálování nejeví jako vhodná metoda (Meloun et al., 5). Na druhou stranu je zapotřebí se neřídit pouze dle hodnoty stress, protože ta se zlepšuje s rostoucím počtem souřadnic (Meloun et al., 5). Předběžně lze konstatovat, že byla vybráná varianta se 3 dimenzemi, protože poskytuje nejlepší vysvětlení. Testování bylo provedeno v programu STATISTICA, který poskytuje metrické i nemetrické výstupy vzdáleností D^ (metrické řešení dle Kruskala) a D* (nemetrické řešení dle Guttmana). Obvykle se používá metrické řešení, ale je-li výsledek kvalitní pro daný počet souřadnic, měly by být hodnoty obou ukazatelů podobné. Tabulka 5.6 ukazuje výsledky hodnot D^ a D* pro zvolený počet dimenzí. Tučně zvýrazněné jsou hodnoty stress dosažené pro jednotlivé typy dat a počet dimenzí. Potvrdilo se, že lepších hodnot stress je dosaženo pro více dimenzí. Kruskal (964) navrhnul hodnocení stress kde maximální hranicí je,2. Vyšší hodnoty stress už značí nedostatečné proložení daným modelem. Hodnoty stress u všech dat s vyjímkou morfologických údajů spadají do intervalu,5-, označované Kruskalem (964) jako "vyhovující", hodnota, u morfologických dat spadá do intervalu,-,5 a je "dostačující" (Hintze, 7). Nejnižší hodnoty stress bylo dosaženo pro obsahové látky (,66) následované mikrosatelity (,67 a,86) a nejvyšší (,9) pro morfologické hodnocení. 3

132 Tab. 5.6: Hodnoty stress, D* a D^ pro zvolený počet dimenzí SSR DA matice** SSR Euklid** 2 dimenze D* : Čistý stres = 4,3975; Alienace =, dimenze D* : Čistý stres = 9,4476; Alienace =, D^: Čistý stres =,8738; Stres =,86775 D^: Čistý stres = 6,6359; Stres =,67775 D* : Čistý stres = 22,432; Alienace =,24396 D* : Čistý stres = 3,3755; Alienace =,9643 D^: Čistý stres = 8,39; Stres =,9624 D^: Čistý stres =,69744; Stres =,8679 Obsahové látky D* : Čistý stres = 5,5475; Alienace =,235 Euklid** D^: Čistý stres = 2,88532; Stres =, D* : Čistý stres = 6,62492; Alienace =, D* : Čistý stres = 6,66222; Alienace =,38839 D* : Čistý stres = 2,53527; Alienace =,285 D^: Čistý stres = 5,548; Stres =,8886 D^: Čistý stres = 8,692; Stres =,9796 Morfologie Euklid** Vysvětlivky: ** - Euklidovské vzdálenosti 3 D^: Čistý stres = 5,482625; Stres =,6684

133 K posouzení volby správného počtu dimenzí lze použít i tzv. Shepardova rozptylového grafu (obr. 24). Tento graf vynáší vypočítané hodnoty vzdáleností (na y ose) proti skutečným hodnotám (na x ose). Součástí tohoto grafu jsou D^ hodnoty v podobě "schodovité funkce", které jsou výsledky monotónní transformace vstupních dat. Pokud většina bodů leží v okolí této "schodovité funkce" pak dochází k těsnému proložení ve zvoleném počtu souřadnic. K úplnému proložení by došlo pokud by všechny body spadly na tutu křivku. Z výstupů pro různé typy dat je patrné dobré proložení pro údaje z mikrosatelitních markerů s Euklidovskými vzdálenostmi a vynikající proložení u obsahových látek. Nejhoršího proložení je dosaženo u morfologických deskriptorů, což je pravděpodobně dáno i povahou původních dat. U druhé varianty SSR markerů založené na D A matici je vidět výrazné přerušení a existence dvou oddělených skupin hodnot. U všech studovaných typů dat lze potvrdit, že odhadnuté hodnoty vzdáleností poměrně dobře reprodukují původní hodnoty, třebaže s rozdílnou kvalitou proložení. Z hlediska hodnoty stress došlo zvýšením počtu dimenzí ze dvou na tři k razantnímu zlepšení především pro vysvětlení polohy objektů na základě morfologických dat. S ohledem na výsledky vyšetření ukazatelů stress a Shepardova diagramu byl tedy pro každý typ dat vytvořen MDS model se třemi dimenzemi. Výsledná MDS mapa s 2D projekcemi a celková mapa všech souřadnic pro příslušná data je ukázána na obrázcích 5.26 až K zvýraznění významu všech tří použitých dimenzí a pro prvotní vzájemné srovnání byl vytvořen obrázek 5.25, který obsahuje projekce pro dimenzi a 2 u každé kategorie dat. U mikrosatelitních dat se i touto metodou potvrdilo předchozí zjištění o existenci tří geneticky izolovaných skupin. Jak je patrné, první dimenze je určující hlavně pro rozdíly mezi evropskými a americkými chmely a druhá vymezuje především skupinu kavkazskou. V případě mikrosatelitních markerů, vzhledem k markantním rozdílům mezi skupinami, by stačila k odlišení jediná dimenze. U chemických dat slouží první osa k identifikaci amerických a evropských chmelů. Z hlediska chemie se pak kavkazská skupina ztrácí v evropské. Morfologická data nabízejí nejméně jasnou interpretaci. Je zřejmé, že americké a kavkazské chmely tvoří dva protipóly s prostorem, který vyplňuje široký pás evropských chmelů. Čím přesně by mohl být způsobem daný rozdíl však ani z původních dat není zcela jasné. Velkou roli na hodnoty v distanční matici by mohl mít znak délka pazochů, jelikož všechny kavkazské chmely je mají hodnoceny jako "velmi dlouhé - nad cm" a u amerických chmelů tento znak značně kolísá. Další rozdíl je ve stupni kvetení určovaného 3.července kdy kavkazské chmely nekvetou či jsou na počátku kvetení, ale americké jsou už na konci fáze kvetení a poslední znatelný rozdíl se týká výšky rostliny. Všechny kavkazské chmely dosahují výšky od 5 do 7 metrů, ale část amerických dosahuje výšky pouze do 3,5 m nebo do 5 metrů. Vícerozměrná data je však nutné chápat z hlediska celkového vzoru a nikoliv na základě jednotlivostí. 32

134 Obr. 5.24: Shepardův diagram 33

135 Obr. 5.25: Zobrazení genotypů dle SSR, obsahových látek a morfologických údajů pro D-2 Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 34

136 Přes zajímavé poznatky, které přináší projekce souřadnic na dvourozměrnou mapu, by použití pouze dvou rozměrů místo tří vedlo k přehlédnutí jedné velmi zajímavé skutečnosti. Důvod spočívá v genotypu s nic neříkajícím označením USA73. Nicméně po kontrole seznamů planých chmelů z předchozích let a srovnáním s testovanými genotypy v práci publikované Patzakem et al., (b) bylo zjištěno, že všechny americké genotypy použité pro srovnání pomocí SSR, obsahových látek a morfologických deskriptorů patří k varietě lupuloides, kdežto genotyp USA73 byl identifikován jako jiná varieta a sice neomexicanus. Třetí dimenze tak umožnila vzájemně odlišit americké variety. Jak je patrné z obrázku 5.25, při využití pouze dvou souřadnic by se genetická informace o rozdílech mezi americkými varietami ztratila. S ohledem na testované variety můžeme rovněž říci, že první osa odděluje evropskou varietu lupulus (evropské + kavkazské chmely) a americké variety lupuloides a neomexicanus, druhá osa vymezuje samostatnou podskupinu kavkazských chmelů v rámci variety lupulus a třetí odděluje americké variety lupuloides a neomexicanus mezi sebou (obr či 5.27). Díky MDS lze výsledky mezi různými typy dat nejen srovnávat z hlediska vypovídací hodnoty, ale i vzájemně kombinovat a právě zde se ukázala skutečná síla této metody. Analýzou výsledků na obrázcích 5.26 (5.27), 5,28 a 5.29 vyjde plně najevo unikátní projev tohoto genotypu. Jestliže z hlediska SSR analýzy patří USA73 jednoznačně mezi americké plané chmely, tak z hlediska obsahových látek je jako jediný americký genotyp řazen do evropské skupiny a jeho morfotyp je nejpodobnější poslední identifikované skupině a sice kavkazským chmelům. Tato varieta je kombinací všeho co charakterizuje každou skupinu chmelů. Buď se tedy jedná o zvláštní genotyp sám o sobě nebo se jedná o typického zástupce dané variety, což není možné posoudit s ohledem na jediný analyzovaný exemplář. Taxonomické členění chmele na pět variet bylo provedeno základě morfologického popisu a geografického výskytu (Small, 978). Toto členění bývá v současné literatuře obecně akceptováno přes výhrady některých autorů (Neve, 99). Výsledky výše uvedené analýzy o výrazných rozdílech mezi varietou neomexicanus a lupuloides podporuje Reeves a Richards (). V jejich studii, zabývající studiem jaká kritéria musí být splněna pro definování samostatného druhu, testují všechny americké variety chmele. Na základě řady analýz pak navrhují rozeznávat variety neomexicanus a pubescens jako samostatné druhy (Reeves and Richards, ). V tomto případě je shoda s pozorováním jiných autorů velmi důležitá, protože iterativní algoritmus programu STATISTICA provádí minimalizaci účelové funkce a hledá optimální sestavu vypočtených vzdáleností (Meloun et al., 5). Snaží se tedy najít nejlepší proložení, což se vždy nemusí shodovat se správným řešením. 35

137 Obr. 5.26: Zobrazení genotypů dle SSR na základě DA matice pro D-3 Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 36

138 Obr. 5.27: Zobrazení genotypů dle SSR na základě Euklidovských vzdáleností pro D-3 Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 37

139 Obr. 5.28: Zobrazení genotypů dle obsahových látek na základě Euklidovských vzdáleností Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 38

140 Obr. 5.29: Zobrazení genotypů dle morfologických deskriptorů na základě Euklidovských vzdáleností Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 39

141 Stejně jako v případě PCA analýzy byla zároveň provedena shluková analýza (obr. 5.3). Nejvhodnější shlukovací metodou byla pro SSR markery a morfologické deskriptory UPGMA metoda a pro obsahové látky WPGMA metoda. Optimální shlukovací metoda byla určena na základě sledování hodnot kofenetického korelačního koeficientu (CC) spolu se změnami (Δ) parametrů α a β jak je uvádí tabulka 5.7. S vyjímkou morfologických údajů byly u všech typů dat získány hodnoty CC překračující,9. U morfologických dat se hodnota pohybuje lehce pod hranicí věrohodnosti dendrogramu (CC =,69). Získané dendrogramy se výrazně shodovaly z rozdělením pomocí MDS. Komplexní analýza kombinující rozdílné informace ukázala zajímavé možnosti z hlediska hodnocení genotypů chmele. Rovněž byla porovnána vypovídací hodnota různých typů shromažďovaných dat a ukázán způsob jejich zkombinování. Lze samozřejmě argumentovat, že se analýza zakládá na poměrně malém vzorku genotypů a tedy nemá takovou vypovídací sílu. Zde je však limit v dostupnosti informací a jedině cílené shromažďování všech typů údajů může do budoucna poskytnout podklady pro rozsáhlejší studii, která potvrdí a upřesní získané poznatky nebo povede k zamítnutí zde uvedených informací. Další problém se týká hodnocení pomocí obsahových látek, jelikož je zde poměrně výrazný vliv ročníku (Krofta et al., 3). Jelikož nejsou dostupné údaje z více ročníků není možné odhadnout kolísání těchto látek u studovaných genotypů a použít nějaký typ robustní střední hodnoty k zvýšení vypovídací hodnoty takové studie. 4

142 Tab. 5.7: Hodnoty CC a delta pro jednotlivé shlukovací metody data SSR DA matice SSR Euklidovské vzdálenosti Chemie Euklidovské vzdálenosti Morfologie Euklidovské vzdálenosti metoda Nejbližšího souseda (NN) Nejvzdálenějšího souseda (FN) Vážený průměr skupin dvojic (WPGMA) Nevážený průměr skupin dvojic (UPGMA) Vážený centroid skupin dvojic Nevážený centroid skupin dvojic Wardova metoda Nejbližšího souseda (NN) Nejvzdálenějšího souseda (FN) Vážený průměr skupin dvojic (WPGMA) Nevážený průměr skupin dvojic (UPGMA) Vážený centroid skupin dvojic Nevážený centroid skupin dvojic Wardova metoda Nejbližšího souseda (NN) Nejvzdálenějšího souseda (FN) Vážený průměr skupin dvojic (WPGMA) Nevážený průměr skupin dvojic (UPGMA) Vážený centroid skupin dvojic Nevážený centroid skupin dvojic Wardova metoda Nejbližšího souseda (NN) Nejvzdálenějšího souseda (FN) Vážený průměr skupin dvojic (WPGMA) Nevážený průměr skupin dvojic (UPGMA) Vážený centroid skupin dvojic Nevážený centroid skupin dvojic Wardova metoda 4 CC,5255,3247,95267,953667,99488,898998,9243,94538,88849,77,9645,34597,75324,835528,9798,77397,9326,9828,872797,883249,8423,49977,626779,67473,683798,3874,545973,653 delta (,5),372322,7525,85,85852,77572,764,765725,882,44355,54448,5388,92457,82934,686495,65735,37362,7435,6737,7998,6889,79884,57856,3772,5338,4363,882577,8399,67354 delta (),46864,9887,547,439,83337,833844,88722,2959,6836,779,6943,96723,863267,747496,74963,42248,5956,99424,85978,73948,8563,67495,359538,946,8566,96355,895844,73263

143 Obr. 5.3: Podobnosti genotypů určené pomocí CLU pro SSR, obsahové látky a morfologické údaje Vysvětlivky: barevné kódy odpovídají místu původu; zelená - evropské chmely, modrá - kavkazské chmely, červená - americké chmely 42

144 6. ZÁVĚR Závěry a doporučení vycházejí ze stanovených cílů práce, které se podařilo ve všech bodech splnit. Stručné shrnutí poznatků je uvedeno v následujících bodech: Zavedení a celková optimalizace metod využívajících mikrosatelitních markerů umožnila aplikaci těchto postupů i u dalších studovaných organismů v rámci KGŠ. Bylo komplexně charakterizováno SSR markerů, které jsou účinným nástrojem pro identifikaci, hodnocení a další studium planých i kulturních chmelů. Byla zjištěna pozitivní selekce u genu pro FPPS (farnesyl pyrofosfát syntáza). Vzhledem zapojení enzymu FPPS do syntézy řady chemických látek by po objasnění příčiny selekce mohl být vytvořen marker pro novošlechtění nebo genový konstrukt využitelný k tvorbě transgenních odrůd. Byla osekvenována část genu HCH kódujícího prekurzor endochitinázy a popsána jeho nová alela, jejíž vliv na pravděpodobnou souvislost s odolností vůči patogenům může být předmětem dalších výzkumů. Analýzou struktury kolekce genetických zdrojů bylo možné odlišit tři geneticky izolované oblasti a ukázala se limitovaná variabilita evropského genofondu. V souladu s předchozími studiemi bylo potvrzeno, že kavkazské genotypy představují nový zdroj variability využitelný pro novošlechtění. Jednotlivé genotypy byly rozděleny na základě srovnání genetických, chemických a morfologických údajů odpovídajících nejen oblastem původu, ale i jednotlivým varietám. V kolekci planých chmelů byly identifinovány duplikace a záměny genotypů. Doporučení pro praxi a další výzkum Zde popsané mikrosatelitní markery jsou u chmele jedny z mála detailně studovaných, a proto je možné doporučit jejich využití v Národním programu konzervace genetických zdrojů. V rámci programu je důležitá charakterizace a hodnocení těchto zdrojů a SSR markerů je vhodným, rychlým a účinným prostředkem. Získané poznatky z charakterizace kolekce genobanky Chmelařského institutu s.r.o. mohou sloužit jako doporučení, které lokality či oblasti jsou zajímavé z hlediska shromaždování dalšího materiálu. Další přímá aplikace se nabízí v jednoznačné identifikaci genotypů, což lze využít jak u planých, tak kulturních rostlin chmele. Jediné limity této aplikace spočívají v malé rozlišovací síle u velmi podobných genotypů jakými jsou např. Osvaldovy klony. 43

145 Výsledky této práce jsou možným základem pro řadu návazných studií. Z hlediska aplikované molekulární genetiky by bylo vhodné detailněji analyzovat geny fpps a HCH vzhledem k jejich možnému přínosu v novošlechtění. Dále lze již získané markery rozšířit o další nové mikrosateliní lokusy, jejichž získání je v současné době mnohem snažší díky novým sekvenačním technologiím. Bylo by tak možné prohloubit a upřesnit získané poznatky. Komparativní a strukturní analýzy prokázaly rozdíly na úrovni variet, jejichž další studium z hlediska fylogentického a taxonomického přináší poznatky o šíření a diverzifikaci chmele jako druhu. 44

146 7. SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY Abbott, B. S., Fedele, M. J A DNA-based varietal identification procedure for hop leaf tissue. Journal of the Institute of Brewing, (4), Adams, R. I., Brown, K. M., Hamilton, M. B. 4. The impact of microsatellite electromorph size homoplasy on multilocus population structure estimates in a tropical tree (Corythophora alta) and anadromous fish (Morone saxatilis). Molecular Ecology, 3 (9), Akagi, H., Yokozeki, Y., Inagaki, A., Mori, K., Fujimora, T.. Micron, a microsatellitetargeting transposable element in the rice genome. Molecular Genetics and Genomics, 266 (3), Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25, Altschul, S. F., Wootton, J. C., Gertz, E. M., Agarwala, R., Morgulis, A., Schaffer, A. A., Yu, Y.-K. 5. Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices. FEBS Journal, 272 (), Angers, B., Estoup, A., Jarne, P.. Microsatellite Size Homoplasy, SSCP, and Population Structure: A Case Study in the Freshwater Snail Bulinus truncatus. Molecular Biology and Evolution, 7 (2), Araki, S., Tsuchiya, Y., Takashio, M., Tamaki, T., Shinotsuka, K Identification of Hop Cultivars by DNA Marker Analysis. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 56 (3), -98. Ardren, W. R., Borer, S., Thrower, F., Joyce, J. E., Kapuscinski, A. R Inheritance of 2 microsatellite loci in Oncorhynchus mykiss. Journal of Heredity, 9 (5), Ayyadevara, S., Thaden, J. J., Shmookler Reis, R. J.. Discrimination of Primer 3 Nucleotide Mismatch by Taq DNA Polymerase during Polymerase Chain Reaction. Analytical Biochemistry, 284 (), -8. Bacolla, A., Larson, J. E., Collins, J. R., Li, J., Milosavljevic, A., Stenson, P. D., Cooper, D. N., Wells, R. D. 8. Abundance and length of simple repeats in vertebrate genomes are determined by their structural properties. Genome Research, 8 (), Balloux, F. 4. Heterozygote excess in small populations and the heterozygote-excess effective population size. Evolution, 58 (9), Bassam, B. J., Annollés, G. C., Gresshoff, P. M. 99. Fast and sensitive silver staining of DNA 45

147 in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry., 96 (), Bassil, N. V., Gilmore, B., Oliphant, J. M., Hummer, K. E., Henning, J. A. 8. Genic SSRs for European and North American hop (Humulus lupulus L.). Genetic Resources and Crop Evolution, 55 (7), Bassil, N. V., Gilmore, B., Oliphant, J., Hummer, K., Henning, J. A. 5. GenBank-derived Microsatellite Markers in Hop. ISHS Acta Horticulturae, 668, I International Humulus Symposium. Beerli, P., Felsenstein, J.. Maximum likelihood estimation of a migration matrix and effective population sizes in n subpopulations by using a coalescent approach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 98 (8), Belkhir, K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N., Bonhomme, F. 2. GENETIX 4.4, Logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations, Université de Montpellier II, Montpellier, France. Benatti, P., Gafà, R., Barana, D., Marino, M., Scarselli, A., Pedroni, M., Maestri, I., Guerzoni, L., Roncucci, L., Menigatti, M., Roncari, B., Maffei, S., Rossi, G., Ponti, G., Santini, A., Losi, L., Di Gregorio, C., Oliani, C., Ponz de Leon, M. 5. Microsatellite Instability and Colorectal Cancer Prognosis. Clinical Cancer Research, (23), Benbouza, H., Jacquemin, J.-M., Baudoin, J.-P., Mergeai, G. 6. Optimization of a reliable, fast, cheap and sensitive silver staining method to detect SSR markers in polyacrylamide gels. Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement, (2), Benson, D. W., Silberbach, G. M., Kavanaugh-McHugh, A., Cottrill, C., Zhang, Y., Riggs, S., Smalls, O., Johnson, M. C., Watson, M. S., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Plowden, J., Kugler, J. D.999. Mutations in the cardiac transcription factor NKX2.5 affect diverse cardiac developmental pathways. Journal of Clinical Investigation, 4 (), Bhargava A., Fuentes, F. F.. Mutational Dynamics of Microsatellites. Molecular Biotechnology, 44 (3), Bock, R., Timmis, J. N. 8. Reconstructing evolution: gene transfer from plastids to the nukleus. BioEssays, 3, Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M., Davis, R. W. 98. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.the American Journal of Human Genetics, 9 (3), Brady, J. L., Scott, N. S., Thomas, M. R DNA typing of hops (Humulus lupulus) through application of RAPD and microsatellite marker sequences. Euphytica, 9 (3),

148 Britten, R. J., Kohne, D. E Repeated Sequences in DNA. Science, 6 (384), Brohede, J., Møller, A. P., Ellegren, H. 4. Individual variation in microsatellite mutation rate in barn swallows. Mutation Research, 545 (-2), Brohede, J., Primmer, C. R., Møller, Ellegren, H. 2. Heterogeneity in the rate and pattern of germline mutation at individual microsatellite loci. Nucleic Acids Research, 3 (9), Brookfield, J. F. Y A simple new method for estimating null allele frequency from heterozygote deficiency. Molecular Ecology, 5 (3), Buschiazzo, E., Gemmell, N. J. 6. The rise, fall and renaissance of microsatellites in eukaryotic genomes. BioEssays, 28 (2), 4-5. Buschiazzo, E., Gemmell, N. J.. Conservation of Human Microsatellites across 45 Million Years of Evolution [online]. Genome Biology and Evolution, 2, [cit. 6 4]. Dostupné na < Butler, J. M. 5. Constructing STR Multiplex Assays. In: Methods in Molecular Biology: Forensic DNA Typing Protocols, Carracedo, A. (ed.), Humana Press. Callen, D. F., Thompson, A. D., Shen, Y., Philips, H. A., Richards, R. I., Mulley, J. C., Sutherland, G. R. 9. Incidence and origin of null alleles in the (AC)n microsatellites markers. American Journal of Human Genetics, 52 (5), Carputo, D., Frusciante, L., Peloquin, S. J. 3. The role of 2n gametes and endosperm balance number in the origin and evolution of polyploids in the tuber bearing solanum. Genetics, 63 (), Culver, M., Menotti-Raymond, M. A., O Brien, S. J.. Patterns of Size Homoplasy at Microsatellite Loci in Pumas (Puma concolor). Molecular Biology and Evolution, 8 (6), Culver, M., Menotti-Raymond, M. A., O Brien, S. J.. Patterns of Size Homoplasy at Microsatellite Loci in Pumas (Puma concolor). Molecular Biology and Evolution, 8 (6), Čerenak, A., Jakše, J., Javornik, B. 4. Identification and Differentiation of Hop Varieties Using Simple Sequence Repeat Markers. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 62 (), -7. Čerenak, A., Javornik, B Application of male STS marker in hop (Humulus lupulus L.) breeding. Proceedings of the Scientific Commission of IHGC, Pulawy, Poland, July 27-3, Čerenak, A., Šatovič, Z. Javornik, B. 6. Genetic mapping of hop (Humulus lupulus L.) applied 47

149 to the detection of QTLs for alpha-acid content. Genome, 49 (5), Čerenak, A., Šatovič, Z., Jakše, J., Luthar, Z., Carovic-Stanko, K., Javornik, B. 7. QTL Mapping of alpha acid content in hop. Proceedings of the Scientific Commission of IHGC, Tettnang, Germany, June, Čerenak, A., Šatovič, Z., Jakše, J., Luthar, Z., Carovic-Stanko, K., Javornik, B. 9. Identification of QTLs for alpha acid content and yield in hop (Humulus Lupulus L.). Euphytica, 7 (-2), Čerenak, A., Šatovič, Z., Javornik, B. 6. Genetic mapping of hop (Humulus lupulus L.) applied to the detection of QTLs for alpha-acid content. Genome, 49 (5), Dakin, E. E., Avise, J. C. 4. Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity, (5), Danilova, T. V., Danilov, S. S., Karlov, G. I. 3. Assessment of Genetic Polymorphism in Hop (Humulus lupulus L.) Cultivars by ISSR-PCR Analysis. Russian Journal of Genetics, 39 (), Danilova, T. V., Karlov, G. I. 6. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica, 5 (), 5-2. De Sousa, S. N., Finkeldey F., Gailing O. 5. Experimental Verification of Microsatellite Null Alleles in Norways Spruce (Picea abies [L.] Karst.): Implications for Population Genetic Studies. Plant Molecular Biology Reporter, 23 (2), 3-9. Degtyareva, N. P., Greenwell, P., Hofmann, E. R., Hengartner, M. O., Zhang, L., Culotti, J. G., Petes, T. D. 2. Caenorhabditis elegans DNA mismatch repair gene msh-2 is required for microsatellite stability and maintenance of genome integrity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 99 (4), Dellaporta, S. L., Calderon-Urrea, A. 9. Sex determination in flowering plants. The Plant Cell, 5 (), Delmotte, F., Leterme, N., Simon, J. C.. Microsatellite allele sizing: difference between automated capillary electrophoresis and manual technique. Biotechniques.;3(4), 8, 846, 88. Dempster, A. P., Laird, N. M., Rubin, D. B Maximum Likelihood from Incomplete Data via the EM Algorithm. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 39 (), -38. Dettman, J. R., Taylor, J. W. 4. Mutation and Evolution of Microsatellite Loci in Neurospora. Genetics, 68 (3),

150 Di Rienzo, A., Peterson, A. C., Garza, J. C., Valdes, A. M., Slatkin, M., Freimer, N. B Mutational processes of simple-sequence repeat loci in human populations. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. 9. General concepts for PCR primer desing. Genome Research, 3 (3), Dietmaier, W., Wallinger, S., Bocker, T., Kullmann, F., Fishel, R., Rüschoff, J Diagnostic Microsatellite Instability: Definition and Correlation with Mismatch Repair Protein Expression. Cancer Research, 57 (2), Dokholyan, N. V., Buldyrev, S. V., Havlin, S., Stanley, H. E.. Distributions of Dimeric Tandem Repeats in Non-coding and Coding DNA Sequences. Journal of Theoretical Biology, 2 (4), Dupuy, B. M., Stenersen, M., Egeland, T., Olaisen, B. 4. Y-Chromosomal Microsatellite Mutation Rates: Differences in Mutation Rate Between and Within Loci. Human Mutation, 23 (2), Ellegren, H. a. Heterogeneous mutation processes in human microstellite DNA sequences. Nature Genetics, 24 (4), Ellegren, H. b. Microsatellite mutations in the germline: implications for evolutionary inference. TRENDS in Genetics, 6 (2), Ellegren, H. 4. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics, 5 (6), Estoup, A, Jarnet, P., Cornuet, J.-M. 2. Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and their consequences for population genetics analysis. Molecular Ecology, (9), Fleischer, R., Horlemann, C., Shwekendiek, A., Kling., C., Weber, G. 4. AFLP fingerprinting in hop:analysis of the genetic variability of the Tettnang variety. Genetic Resources and Crop Evolution, 5 (2), 2-2. Forbes, B. A., Hicks, K. E Substance Interfering with Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis in Clinical Specimens by PCR: Effects of Bovine Serum Albumin. Journal of Clinical Microbiology, 34 (9), Freeland,J. R., Kirk, H., Petersen,S. D.. Molecular Ecology, 2nd ed., Wiley-Blackwell, Chichester, p. 449, Frettinger, P., Herrmann, S., Lapeyrie, F., Oelmüller, R., Buscot, F. 6. Differential expression of two class III chitinases in two types of roots of Quercus robur during premycorrhizal interactions with Piloderma croceum. Mycorrhiza, 6 (3), Fujimori, S., Washio, T., Higo, K., Ohtomo, Y., Murakami, K., Matsubara, K., Kawai, J., 49

151 Carninci, P., Hayashizaki, Y., Kikuchi, S., Tomita, M. 3. A novel feature of microsatellites in plants: a distribution gradient along the direction of transcription. FEBS Letters, 554 (-2), Fukamizo, T.. Chitinolytic Enzymes: Catalysis, Substrate Binding, and their Application. Current Protein and Peptide Science, (), Galindo, C. L., McIver, L. J., McCormick, J. F., Skinner, M. A., Xie, Y., Gelhausen, R. A., Ng, K., Kumar., N. M., Garner, H. R. 9. Global Microsatellite Content Distinguishes Humans, Primates, Animals, and Plants. Garza, J. C., Slatkin, M., Freimer, N. B Microsatellite Allele Frrequencies in Humans and Chimpanzees, with Implications for Constraints on Allele Size. Molecular Biology and Evolution, 2 (4), Gemayel, R., Vinces, M. D., Legendre, M., Verstrepen, K. J.. Variable Tandem Repeats Accelerate Evolution of Coding and Regulatory Sequences. Annual Review of Genetics, 44, Guo, W.-J., Ling, J., Li, P. 9. Consensus features of microsatellite distribution: Microsatellite contents are universally correlated with recombination rate and are preferentially depressed by centromeres in multicellular eukaryotic genomes. Genomics, (4), Gupta, P. K., Varshney, R. K.. The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breedign with emphasis on bread wheat. Euphytica, 3 (3), Hadonou, A. M., Walden, R. Darby, P. 4. Isolation and characterization of polymorphic microsatellites for assessment of genetic variation of hops (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes, 4 (2), Harding, R. M., Boyce, A. J., Clegg, J. B The Evolution of Tandemly Repetitive DNA: Recombination Rules. Genetics, 32 (3), Hartl, L., Seefelder, S Diversity of selected hop cultivars detected by fluorescent AFLPs. Theoretical and Applied Genetics, 96 (), 2-6. Hartl, L., Seefelder, S Diversity of selected hop cultivars detected by fluorescent AFLPs. Theoretical and Applied Genetics, 96 (), 2-6. Haunold, A. 99. Cytology and cytogenetics of hops, in Tsuschiya, T., Gupta, P. R. (eds.), Chromosome Engineering in Plant Genetics and Breeding, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp He, G., Meng, R., Newman, M., Gao, G., Pittman, R. N., Prakash, C. S. 3. Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.)[online]. BMC Plant Biology, 3 5

152 (3), -6. Dostupné z < Heller, Ch.. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22, Henning, J. A., Moore, D. L., 999. Humulus lupulus endochitinase precursor (HCH) gene. NCBI database, AF Hey, J., Nielsen, R. 4. Multilocus methods for estimating population sizes, migration rates and divergence time, with application to the divergence of Drosophila pseudoobscura and D. persimilis. Genetics, 67 (2), Highsmith Jr., W. E., Nataraj, A. J., Qian, J., O Connor, J. M., El-Nabi, S. H., Kusukawa, N., Garner, M. M Use of DNA toolbox for the characterization of mutation scanning methods: II: Evaluation of single-strand conformation polymorphism analysis. Electrophoresis, (6), Hile, S. E., Eckert, K. A. 4. Positive Correlation Between DNA Polymerase α-primase Pausing and Mutagenesis within Polypyrimidine/Polypurine Microsatellite Sequences. Journal of Molecular Biology, 335 (3), Hill, C. R., Butler, J. M., Vallone, P. M. 9. A 26plex Autosomal STR Assay to Aid Human Identity Testing. Journal of Forensic Sciences, 54 (5), 8 5. Hintze, J.. NCSS. NCSS, LLC. Kaysville, Utah, USA. < Hintze, J. 7. NCSS help system [electronic manual]. Kaysville, Utah. NCSS. 7 [cit. 7-9]. Hirata, M., Cai, H., Inoue, M., Yuyama, N., Miura, Y., Komatsu, T., Takamizo, T., Fujimori, M. 6. Development of simple sequence repeat (SSR) markers and construction of an SSR-based linkage map in Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.). Theoretical and Applied Genetics, 3 (2), Hoffman, J. I., Amos, W. 5. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion. Molecular Ecology, 4 (2), Howard, E. L., Whittock, S. P., Jakše, J., Carling J., Matthews, P. D., Probasco, G., Henning, J. A., Darby, P., Cerenak A., Javornik, B.. High-throughput genotyping of hop (Humulus lupulus L.) utilising diversity arrays technology (DArT). Theoretical and Applied Genetics, 22 (7), Huang, Q. Y., Xu, F. H., Shen, H., Deng, H. Y., Liu, Y. J., Liu, Y. Z., Li, J. L., Recker, R. R., Deng, H. W. 2 Mutation patterns at dinucleotide microsatellite loci in humans. American Journal of Human Genetics, 7 (3), Chakraborty, R., De Andrade, M., Daiger, S. P., Budowle, B Apparent heterozygote 5

153 deficiencies observed in DNA typing data and their implications in forensic applications. Annals of Human Genetics, 56 (), Chakraborty, R., Stivers, D. N., Su, B., Zhong, Y., Budowle, B The utility of short tandem repeat loci beyond human identification: Implications for development of new DNA typing systems. Electrophoresis, (8), Chambers, E. W., Meece, J. K., McGowan, J. A., Lovin, D. D., Hemme, R. R., Chadee, D. D., McAbee, K., Brown, S. E., Knudson, D. L., Severson, D. W. 7. Microsatellite Isolation and Linkage Group Identification in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. Journal of Heredity, 98 (3), 2-2. Chambers, G. K., MacAvoy E. S.. Microsatellites: consensus and controversy. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & molecular biology, 26 (4), Chang, D. K., Metzgar, D., Wills, Ch., Boland, C. R.. Microsatellites in the Eukaryotic DNA Mismatch Repair Genes as Modulators of Evolutionary Mutation Rate. Genome Research, (7), Chapuis, M.-P., Estoup, A. 7. Microsatellite Null Alleles and Estimation of Population Differentiation. Molecular Biology and Evolution, 24 (3), Chen, Ch., Zhou, P., A Choi, Y., Huang, S., Gmitter Jr., F. G. 6. Mining and chracterizing microsatellites from citrus ESTs. Theoretical and Applied Genetics, 2 (7), Chistiakov, D. A., Hellemans, B., Volckaert, A. M. 6. Microsatellites and their genomic distribution, evolution and applications: A review with special reference to fish genetics. Aquaculture, 255 (-4), -29. Choudhary, S., Sethy, N. K,, Shokeen, B., Bhatia, S. 9. Development of chickpea EST-SSR markers and analysis of allelic variation across related species. Theoretical and Applied Genetics, 8, Choumane, W., Winter, P., Weigand, F., Kahl, G.. Theoretical and Applied Genetics,, Chow, J. C., Yen, Z., Ziesche, S. M., Brown, C. J. 5. Silencing of the Mammalian X Chromosome. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 6, Ishibashi, Y., Saitoh, T., Abe, S., Yoshida, M. C Null microsatellite alleles due to nucleotide sequence variation in the grey-sided vole Cletrhrionomys rufocanus. Molecular Ecology, 5 (4), Jakše, J., Bandelj, D., Javornik, B. 2. Eleven new microsatellites for hop (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes, 2 (4), Jakše, J., Javornik, B.. High Throughput Isolation of Microsatellites in Hop (Humulus 52

154 lupulus L.). Plant Molecular Biology Reporter, 9 (3), Jakše, J., Kindlhofer, K., Javornik, B.. Assessment of genetic variation and differentiation of hop genotypes by microsatellite and AFLP markers. Genome, 44 (5), Jakše, J., Luthar, Z., Javornik, B. 8. New polymorphic dinucleotide and trinucleotide microsatellite loci for hop Humulus lupulus L. Molecular Ecology Resources, 8 (4), Jakše, J., Šatovič, Z., Javornik, B. 4. Microsatellite variability among wild and cultivated hops (Humulus lupulus L.). Genome, 47 (5), Jakše, J., Štajner, N., Kozjak, P., Čerenak, Javornik, B. 8. Trinucleotide microsatellite repeat is tightly linked to male sex in hop (Humulus lupulus L.). Molecular Breeding, 2 (2), Jakupciak, J. P., Wells, R. D.. Gene Conversion (Recombination) Mediates Expansions of CTG CAG Repeats. The Journal of Biological Chemistry, 275 (22), Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature, 34 (66), Jin, L., Macaubas, C., Hallmayer, J., Kimura, A., Mignot, E Mutation rate varies among alleles at a microsatellie locus: phylogenetic evidence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, (26), Jombart, T. 6. A tutorial for the spatial Principal Component Analysis using the R package adegenet.2-2. Program manual. < Jombart, T., Pontier, D., Dufour, A.-B. 9. Genetic markers in the playground of multivariate analysis. Heredity, 2 (4), Jones, A. G., Stockwell, C. A., Walker, D., Avise, J. C The Molecular Basis of a Microsatellite Null Allele From the White Sands Pupfish. The Journal of Heredity, 89 (4), Jun, S.-H., Kim, T. G., Ban. Ch. 6. DNA mismatch repair system. Classical and fresh roles. The FEBS Journal, 273 (8), Kaczanowksi, R., Trzeciak, L., Kucharczyk, K.. Multitemperature single-strand conformation polymorphism. Electrophoresis, 22 (6), Kageyama, K., Komatsu, T., Suga, H. 3. Refined PCR protocol for detection of plant pathogens in soil. Journal of General Plant Pathology, 69 (3), Kaiser, R., Tremblay, P.-B., Roots, I., Brockmöller 2. Validity of PCR with emphasis on variable number of tandem repeat analysis. Clinical Biochemistry, 35 (),

155 Kalinowski, S. T. 2. How many alleles per locus should be used to estimate genetic distance? Heredity, 88 (), Kalinowski, S. T., Taper, M. L. 6. Maximum likelihood estimation of the frequency of null alleles at microsatellite loci. Conservation Genetics, 7 (6), Kalinowski, S. T., Taper, M. L., Marshall, T. C. 7. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assgnment. Molecular Ecology, 6 (5), Kantety, R. V., La Rota, M., Matthews, D. E., Sorrells, M. E. 2. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorgum and wheat. Plant Molecular Biology, 48 (5-6), 5-5. Karlov, G. I., Danilova, T. V., Horlemann, C., Weber, G. 3. Molecular cytogenetics in hop (Humulus lupulus L.) and identification of sex chromosomes by DAPI-banding. Euphytica, 32 (2), Karlsson, S., Ma, L., Saillant, E., Gold, J. R. 7. Test of mendelian segregation and linkagegroup relationships among 3 microsatellite loci in red drum, Sciaenops ocellatus. Aquaculture International, 5 (5), Kashi, Y., King, D. 6. Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolution. TRENDS in Genetics, 22 (5), Kašička, V Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod. Chemické listy, 9, Katti, M. V., Ranjekar, P. K., Gupta, V. S.. Differential Distribution of Simple Sequence Repeats in Eukaryotic Genome Sequences. Molecular Biology and Evolution, 8 (7), Kayser, M., Roewer, L., Hedman, M., Henke, L., Henke, J., Brauer, S., Krüger, C., Krawczak, M, Nagy, M., Dobosz, T., Szibor, R., De Knijff, P., Stoneking, M., Sajantila, A.. Characteristics and Frequency of Germline Mutations at Microsatellite Loci from the Human Y Chromosome, as Revealed by Direct Observation in Father/Son Pairs. American Journal of Human Genetics, 66 (5), Kelkar, Y. D., Tyekucheva, S., Chiaromonte, F., Makova, K. D. 8. The genome-wide determinants of human and chimpanzee microsatellite evolution. Genome Research, 8 (), Kikuchi, S., Satoh, K., Nagata, T., Kawagashira, N., Doi, K., Kishimoto, N., Yazaki, J., Ishikawa, M., Yamada, H., Ooka, H., Hotta, I., Kojima, K., Namiki, T., Ohneda, E., Yahagi, W., Suzuki, K., Li, C. J., Ohtsuki, K., Shishiki, T., Otomo, Y., Murakami, K., 54

156 Iida, Y., Sugano, S., Fujimura, T., Suzuki, Y., Tsunoda, Y., Kurosaki, T., Kodama, T., Masuda, H., Kobayashi, M., Xie, Q., Lu, M., Narikawa, R., Sugiyama, A., Mizuno, K., Yokomizo, S., Niikura, J., Ikeda, R., Ishibiki, J., Kawamata, M., Yoshimura, A., Miura, J., Kusumegi, T., Oka, M., Ryu, R., Ueda, M., Matsubara, K., Kawai, J., Carninci, P., Adachi, J., Aizawa, K., Arakawa, T., Fukuda, S., Hara, A., Hashizume, W., Hayatsu, N., Imotani, K., Ishii, Y., Itoh, M., Kagawa, I., Kondo, S., Konno, H., Miyazaki, A., Osato, N., Ota, Y., Saito, R., Sasaki, D., Sato, K., Shibata, K., Shinagawa, A., Shiraki, T., Yoshino, M., Hayashizaki, Y., Yasunishi, A. 3. Collection, mapping, and annotation of over 28 cdna clones from japonica rice. Science, 3 (563), Kim, J. S., Kim, Y. O., Ryu, H. J., Kwak, Y. S., Lee, J.Y., Kang, H. 3. Isolation of stressrelated genes of rubber particles and latex in fig tree (Ficus carica) and their expressions by abiotic stress or plant hormone treatments. Plant Cell Physiology, 44 (4), Kimura, M., Crow, J. F The number of alleles that can be maintained in a finite populations. Genetics, 49 (4), Kimura, M., Ohta, T Stepwise mutation model and distribution of allelic frequencies in a finite population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 75 (6), Koblmüller, S., Nord, M., Wayne, R. K., Leonard, J. A. 9. Origin and status of the Great Lakes wolf. Molecular Ecology, 8, Kong, A., Gudbjartsson, D. F., Sainz, J., Jonsdottir, G. M., Gudjonsson, S. A., Richardsson, B., Sigurdardottir, S., Barnard, J., Hallbeck, B., Masson, G., Shlien, A., Palsson, S. T., Frigge, M. L., Thorgeirsson, T. E., Gulcher, J. R., Stefansson, K. 2. A highresolution recombination map of the human genome. Nature Genetics, 3 (3), Kovárová, M., Dráber, P.. New specifity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Research, 28 (3), Kovtun, I. V., McMurray, C. T. 8. Features of trinucleotide repeat instability in vivo. Cell Research, 8 (), Krofta, K. 3. Comparison of quality parameters of Czech and foreign hop varieties. Plant, Soil and Environment, 49 (6), Kruskal, J. B Nonmetric multidimensional scaling: A numerical method. Psychometrika, 29 (2), Kurosaki, T., Matsuura, T., Ohno, K., Ueda, S. 9. Alu-Mediated Acquisition of Unstable ATTCT Pentanucleotide Repeats in the Human ATXN Gene. Molecular Biology and 55

157 Evolution, 26 (), La Rota, M., Kantety, R. V., Yu, J. K., Sorrells, M. E. 5. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley [online]. BMC Genomics, 6 (), -2 [cit. 6 4]. Dostupné na < Lai, Y., Sun, F. 3. The relationship between microsatellite slippage mutation rate and the number of repeat units. Molecular Biology and Evolution, (2), Landergott, U., Naciri, Y., Schneller, J. J., Holderegger, R. 6. Allelic configuration and polysomic inheritance of highly variable microsatellites in tetraploid gynodioecious Thymus praecox agg. Theoretical and Applied Genetics, 3 (3), Langella, O Populations ver [program]. Dostupný na < Lawson, M. J., Zhang, L. 6. Distinct patterns of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genomes [online]. Genome Biology, 7 (2), -. Dostupné na < Legendre, M., Pochet, N., Pak, T., Verstrepen, K. J. 7. Sequence-based estimation of minisatellite and microsatellite repeat variability. Genome Research, 7(2), Lehmann, T., Hawley, W. A., Collins, F. H An Evaluation of Evolutionary Constraints on Microsatellite Loci Using Null Alleles. Genetics, 44 (3), Leonard, J. M., Bollmann, S. R., Hays, J. B. 3. Reduction of Stability of Arabidopsis Genomic and Transgenic DNA-Repeat Sequences (Microsatellites) by Inactivation of AtMSH2 Mismatch-Repair Function. Plant Physiology, 33 (), Levinson, G., Gutman, G. A. 987a. High frequencies of short frameshifts in poly-ca/tg tandem repeats borne by bacteriophage M3 in Escherichia coli K-2. Nucleic Acids Research, 5 (3), Levinson, G., Gutman, G. A. 987b. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology and Evolution, 4 (3), Li, L., Ximing, G., Guofan, Z. 9. Inheritance of 5 microsatellites in the Pacific oyster Crassostrea gigas: segregation and null allele identification for linkage analysis. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 27 (), Li, W., Gao, F., Liang, J., Li, Ch., Zhang, H., Tang, Z., Chen, L., Jin, Q., Tang, W. 3. Estimation of the optimal electrophoretic temperature of DNA single-strand conformation polymorphism by DNA base composition. Electrophoresis, 24 (4) Li, Y.-Ch., Korol, A. B., Fahima, T., Beiles, A., Nevo, E. 2. Microsatellites: genomic 56

158 distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Molecular Ecology, (2), Lia, V. V., Bracco, M., Gottlieb, A. M., Poggio, L., Confalonieri, V. A. 7. Complex mutational patterns and size homoplasy at maize microsatellite loci. Theoretical and Applied Genetics. 5, Lin, X., Kaul, S., Rounsley, S, Shea, T. P., Benito, M. I., Town, C. D., Fujii, C. Y., Mason, T., Bowman, C. L., Barnstead, M., Feldblyum, T. V., Buell, C. R., Ketchum, K. A., Lee, J., Ronning, C. M., Koo, H. L., Moffat, K. S., Cronin, L. A., Shen, M., Pai, G., Van Aken, S., Umayam, L, Tallon, L. J., Gill, J. E., Adams, M. D., Carrera, A. J., Creasy, T. H., Goodman, H. M., Somerville, Ch. R., Copenhaver, G. P., Preuss, D., Nierman, W. C., White, O., Eisen, J. A., Salzberg, S. L., Fraser, C. M., Venter, J. C Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature, 42 (6763), Litt, M., Luty, J. A A hybervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American journal of human genetics, 44 (3), Ma, J., Wing, R. A., Bennetzen, J. L., Jackson, S. A. 7. Plant centromere organization: a dynamic structure with conserved functions. TRENDS in Genetics, 23 (3), Makova, K. D., Li, W. H. 2. Strong male-driven evolution of DNA sequences in humans and apes. Nature, 46 (688), Manninen, I., Schulman, A. H. 9. BARE-, a copia-like retroelement in barley (Hordeum vulgare L.). Plant Molecular Biology, 22 (5), Mansfield, E. S., Vainer, M., S., Enad, Barker, D. L., Harris, D., Rappaport, E., Fortina, P Sensitivity, Reproducibility, and Accuracy in Short Tandem Repeat Genotyping Using Capillary Array Electrophoresis. Genome Research, 6, Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., DeWeese-Scott, C., Fong, J. H., Geer, L. Y., Geer, R. C., Gonzales, R. C., Gwadz, M., Hurwitz, D. I., Jackson, J. D., Ke, Z., Lanczycki, Ch. J., Lu, F., Marchler, G. H., Mullokandov, M., Omelchenko, M. V., Robertson, C. L., Song, J. S., Thanki, N., Yamashita, R. A., Zhang, D., Zhang, N., Zheng, C., Bryant, S. H.. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Research, 39, D225 D229. Marra, G., Schär, P Recognition of DNA alterations by the mismatch repair systém. The Biochemical Journal, 338 (),

159 Matoušek, J., Novák, P., Bříza, Patzak, J., Niedermeierová, H. 2. Cloning and characterisation of chs-specific DNA and cdna sequences from hop (Humulus lupulus L.), Plant Science, 62 (6), 7-8. Matsuoka, Y., Vigouroux, Y., Goodman, M. M., Sanchez, G. J., Buckler, E., Doebley, J. 2. A single domestication for maize shown by multilocus microsatellite genotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 99 (9), Mazumder, B., Seshadri, V., Fox, P. L. 3. Translational control by the 3-UTR: the ends specify the means. TRENDS in Biochemical Sciences, 28 (2), Meloun, M., Militký, J. 4. Statistická analýza experimentálních dat. 2. vyd., Academia Praha, ISBN: Meloun, M., Militký, J., Hill, M. 5. Počítačová analýza vícerozměrných dat v příkladech, Academia, Praha, s.449. Messier, W., Li, S. H., Stewart, C. B The birth of microsatellites. Nature, 38 (6582), 483. Metzgar, D., Bytof, J., Wills, Ch.. Selection Against Frameshift Mutations Limits Microsatellite Expansion in Coding DNA. Genome Research, (), Metzker, M. L.. Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews Genetics,, Miller, M. P Tools for population genetic analyses (TFPGA),3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data [program]. Dostupné na < Moretti, T. R., Baumstark, A. L., Defenbaugh, D. A., Keys, K. M., Brown, A. L., Budowle, B.. Validation of STR Typing by Capillary Electrophoresis. Journal of Forensic Sciences, Morgante, M., Hanafey, M., Powell, W. 2. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genetics, 3 (2), 94-. Mrázek, J.,Guo, X., Shah, A. 7. Simple sequence repeats in prokaryotic genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 4(), Murakami, A. a. Comparison of sequence of rbcl and Non-coding Regions of Chloroplast DNA and ITS2 Region of rdna in Genus Humulus. Breeding Science, 5 (3), Murakami, A. b. Genetic Distance Based on RAPD and its Application to Hop Breeding. Breeding Science, 5 (), Murakami, A.. Structural differences in the Intergenic Spacer of 8S-26S rdna and Molecular Phylogeny using Partial External Transcribed Spacer Sequence in Hop, 58

160 Humulus lupulus. Breeding Science, 5 (3), Murakami, A., Darby, P., Javornik, B., Pais, M. S. S., Seigner, E., Lutz, E., Svoboda, P. 6a. Microsatellite DNA Analysis of Wild Hops, Humulus lupulus L. Genetic Resources and Crop Evolution, 53 (8), Murakami, A., Darby, P., Javornik, B., Pais, M. S. S., Seigner, E., Lutz, E., Svoboda, P. 6b. Molecular phylogeny of wild hops, Humulus lupulus L. Heredity, 97 (), Nadir, E., Margalit, H., Gallily, T., Ben-Sasson, S. A Microsatellite spreading in the human genome: evolutionary mechanisms and structural implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, (3), Nakamura, Y., Leppert, M., O Connell, P., Wolff, R., Holm, T., Culver, M., Martin, C., Fujimoto, E., Hoff, M., Kumlin, E Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science, 235 (4796), Nataraj, A. J., Olivos-Glander, I., Kusukawa, N., Highsmith Jr., W. E Single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection. Electrophoresis, (6), Nauta, M. J., Weissing, F. J Constraints on Allele Size at Microsatellite Loci: Implications for Genetic Differentiation. Genetics, 43 (2), Navascués, M., Emerson, B. C. 5. Chloroplast microsatellites: measures of genetic diversity and the effect of homoplasy. Molecular Ecology, 4, Negrutiu, I., Vyskot, B., Barbacar, N., Georgiev, S., Moneger, F.. Dioecious Plants. A Key to the Early Events of Sex Chromosome Evolution. Plant Physiology, 27 (4), Nei, M., Tajima, F., Tateno, Y Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. Journal of Molecular Evolution, 9 (2), Neve, R. A. 96. In: Neve, R. A. 99. Hops, Chapman & Hall, London, p Neve, R. A. 99. Hops, Chapman & Hall, London, p Nevo, E., Beharav, A., Meyer, R. C., Hackett, C. A., Forster, B. P., Russell, J. R., Powell, W. 5. Genomic microsatellite adaptive divergence of wild barley by microclimatic stress in Evolution Canyon, Israel. Biological Journal of the Linnean Society, 84 (2), Nielsen, R. 5. Molecular Signatures of Natural Selection. Annual Review of Genetics, 39, Novák, P., Krofta, K., Matoušek, J. 3. Valerophenone synthase-like chalcone synthase homologues in Humulus lupulus. Biologia Plantarum, 46 (3), Oddou-Muratorio, S., Vendramin, G. G., Buiteveld, J., Fady, B. 9. Population estimators or progeny tests: what is the best method to assess null allele frequencies at SSR loci? 59

161 Conservation Genetics, (5), Odong, T., van Heerwaarden, J., Jansen, J., van Eeuwijk, F.. Determination of genetic structure of germplasm collections: are traditional hierarchical clustering methods appropriate for molecular marker data? Theoretical and Applied Genetics, 23 (2), 955. Okada, Y., Ito, K.. Cloning and Analysis of Valerophenone Synthase Gene Expressed Specifically in Lupulin Gland of Hop (Humulus lupulus L.). Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 65 (), Okada, Y., Koie, K., Inaba, A., Kaneko, T., Ito, K. 7. Molecular markers for alpha acids; study for practical application. Proceedings of the Scientific Commission of IHGC, Tettnang, Germany, June, Oliviera, E. J., Pádua, J. G., Zucchi, M. I., Vencovsky, R., Vieira, M. L.C. 6. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology, 29(2), Ono, T In: Neve, R. A. 99. Hops, Chapman & Hall, London, p Paetkau, D., Strobeck, C The molecular basis and evolutionary history of a microsatellite null allele in bears. Molecular Ecology, 4 (4), Parker, J. S., Clark, M. S. 99. Dosage sex-chromosome systems in plants. Plant Science, 8 (2), Pashley, C. H., Ellis, J. R., McCauley, D. E., Burke, J. M. 6. EST Databases as a Source for Molecular Markers: Lessons from Helianthus. Journal of Heredity, 97 (4), Pashley, C. H., Ellis, J. R., McCauley, D. E., Burke, J. M. 6. EST Databases as a Source for Molecular Markers: Lessons from Helianthus. Journal of Heredity, 97 (4), Patil, R. C., Patil, S. F., Mulla, I. S., Vijayamohanan, K.. Effect of protonation media on chemically and electrochemically synthesized polyaniline. Polymer International, 49 (2), Patzak, J.. Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica, 2 (), 9-8. Patzak, J. 2. Characterization of Czech hop (Humulus lupulus L.) genotypes by molecular methods. Rostlinná výroba, 48 (8), Patzak, J., Nesvadba, V., Henychova, A., Krofta, K. b. Assessment of the genetic diversity of wild hops (Humulus lupulus L.) in Europe using chemical and molecular analyses. Biochemical systematics and ecology, 38 (2), Patzak, J., Nesvadba, V., Krofta, K., Henychova, A., Marzoev, AI., Richards, K. a. 6

162 Evaluation of genetic variability of wild hops (Humulus lupulus L.) in Canada and the Caucasus region by chemical and molecular methods. Genome, 53 (7), Patzak, J., Vejl, P., Skupinová, S., Nesvadba, V. 2. Identification of sex in F progenies of hop (Humulus lupulus L.) by molecular marker. Rostlinná Výroba, 48 (7), Patzak, J., Vrba, L., Matoušek, J. 7. New STS molecular markers for assessment of genetic diversity and DNA fingerprinting in hop (Humulus lupulus L.). Genome, 5 (), Pearson, Ch. E., Edamura, K. N., Cleary, J. D. 5. Repeat instability: mechanisms of dynamic mutations. Nature Reviews Genetics, 6 (), Peltomäki, P.. Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer. Human Molecular Genetics, (7), Perkin-Elmer Corporation GeneScan Analysis Software Version 3. - User s manual. [electronic manual]. Pillay, M., Kenny, S. T Chloroplast DNA differences between cultivated hop, Humulus lupulus and the related species H. japonicus. Theoretical and Applied Genetics, 89 (2-3), Pillay, M., Kenny, S. T. 996a. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in hop, Humulus lupulus: level of genetic variability and segregation in F progeny. Theoretical and Applied Genetics, 92 (3-4), Pillay, M., Kenny, S. T. 996b. Structure and inheritance of ribosomal DNA variants in cultivated and wild hop, Humulus lupulus L. Theoretical and Applied Genetics, (3), Pillay, M., Kenny, S. T. 6. Structural organization of the nuclear ribosomal RNA genes in Cannabis and Humulus (Cannabaceae). Plant Systematic and Evolution, 258 (-2), Pokrywka, N. J., Meng, L., Debiec, K., Stephenson, E. C. 4. Identification of hypomorphic and null alleles of swallow via molecular and phenotypic analyses. Development Genes and Evolution, 24 (4), Polley, A., Ganal, M. W., Seigner, E Identification of sex in hop (Humulus lupulus) using molecular markers. Genome, 4 (3), Pompanon, F., Bonin, A., Bellemain, E., Taberlet, P. 5. Genotyping errors: causes, consequences and solutions. Nature reviews. Genetics, 6(), Powell, W., Machray, G. C., Provan, J Polymorphism revealed by simple sequence repeats. TRENDS in Plant Science, (7), Pritchard, J. K., Stephens, S. M., Donnely, P.. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 55 (2), Provan, J., Soranzo, N., Wilson, N. J., Goldstein, D. B., Powell, W A low mutation rate for 6

163 chloroplast microsatellites. Genetics, 53 (2), Pupko, T., Graur, D Evolution of microsatellites in the yeast Saccharomyces cerevisiae: role of length and number of repeated units. Journal of Molecular Evolution, 48 (3), Qi, L. L., Echalier, B., Chao, S., Lazo, G. R., Butler, G. E., Anderson, O. D., Akhunov, E. D., Dvorák, J., Linkiewicz, A.M., Ratnasiri, A., Dubcovsky, J., Bermudez-Kandianis, C. E., Greene, R. A., Kantety, R., La Rota, C. M., Munkvold, J. D., Sorrells, S. F., Sorrells, M. E., Dilbirligi, M., Sidhu, D., Erayman, M., Randhawa, H. S., Sandhu, D., Bondareva, S. N., Gill, K. S., Mahmoud, A. A., Ma, X. F., Miftahudin, J. P., Gustafson, E. J., Conley, E. J., Nduati, V., Gonzalez-Hernandez, J. L., Anderson, J. A., Peng, J. H., Lapitan, N. L., Hossain, K. G., Kalavacharla, V., Kianian, S. F., Pathan, M. S., Zhang, D. S., Nguyen, H. T., Choi, D. W., Fenton, R. D., Close, T. J., McGuire, P. E., Qualset, C. O., Gill, B. S. 4. A Chromosome Bin Map of 6 Expressed Sequence Tag Loci and Distribution of Genes Among the Three Genomes of Polyploid Wheat. Genetics, 68 (2), R.G. Danzmann. 6. LINKFMEX ver. 2.3 [program]. Ramsay, L., Macaulay, M., Cardle, L., Morgante, M., degli Ivanissevich, S., Maestri, E., Powell, W., Waugh, R Intimate association of microsatellite repeats with retrotransposons and other dispersed repetitive elements in barley. The Plant Journal, 7 (4), Reevers, P. A., Richards, Ch. M.. Species Delimitation under the General Lineage Concept: An Empirical Example Using Wild North American Hops (Cannabaceae: Humulus lupulus). Systematical Biology, 6 (), Richard, G. F., Kerrest, A., Dujon, B. 8. Comparative Genomics and Molecular Dynamics of DNA Repeats in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72 (4), Richard, G.-F., Pâques, F.. Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection. EMBO reports, (2), Ritschel, P. S., De Lima Lins, T. C., Tristan, R. L., Buso, C. G. S., Buso, J. A., Ferreira, M. E. 4. Development of microsatellite markers from an enriched genomic library for genetic analysis of melon (Cucumis melo L.) [online]. BMC Plant Biology, 4, -4 [cit. 6 4]. Dostupné na < Rose, O., Falush, D A threshold size for microsatellite expansion. Molecular Biology and Evolution, 5 (5),

164 Rousset, F. 8. GENEPOP 7: a complete re-implementation of the GENEPOP software for Windows and Linux. Molecular Ecology Resources, 8 (), 3-6. Rozen, S., Skaletsky, H. J.. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz, S., Misener, S. (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, Dostupné na < Rybáček, V., Fric, V., Havel, J., Libich, V, Kříž, J., Makovec, K., Petrlík, Z., Sachl, J., Srp, A., Šnobl, J., Vančura, M. 98. Chmelařství, Státní zemědělské nakladateství, Praha, s Saha, M. C., Mian, M. A. R., Eujay, I., Zwonitzer, J. C., Wang, L., May, G. D. 4. Tall fescue EST-SSR markers with transferability across several grass species. Theoretical and Applied Genetics, 9 (4), Saito, M., Konda, M., Vrinten, P., Nakamura, K., Nakamura, T. 4. Molecular comparison of waxy null alleles in common wheat and identification of a unique null allele. Theoretical and Applied Genetics, 8 (7), 5-2. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 74 (2), Seefelder, S., Ehrmaier, H., Schweizer, G., Seigner, E. a. Genetic diversity and phylogenetic relationships among accessions of hop, Humulus lupulus, as determined by amplified fragment length polymorphism fingerprinting compared with pedigree data. Plant Breeding, 9 (3), Seefelder, S., Ehrmaier, H., Schweizer, G., Seigner, E. b. Male and female genetic linkage map of hops, Humulus lupulus. Plant Breeding, 9 (3), Seefelder, S., Lutz, A., Seigner, E. 5. Mapping of powdery mildew resistance gene in hop (Humulus lupulus L.). Proceedings of the Scientific Commission of IHGC, George, SouthAfrica, February -25, Seefelder, S., Seigner, E. 3. Molecular markers for powdery mildew (Sphaerotheca humuli) resistance in hops. Proceedings of the Scientific Commission of IHGC, Dobrna-Žalec, Slovenia, June 24-27, 8-. Selkoe, K. A., Toonen, R. J. 6. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 9 (5), Seyfert, A. L., Cristescu, M. E. A., Frisse, L., Schaack, S., Thomas, W. K., Lynch, M. 8. The Rate and Spectrum of Microsatellite Mutation in Caenorhabditis elegans and Daphnia pulex. Genetics, 78 (4),

165 Shepard, H. L., Parker, J. S., Darby, P., Ainsworth, C. C.. Sexual Development and Sex Chromosomes in Hop. New Phytologist, 48 (3), Shinde, D., Lai, Y., Sun, F., Arnheim, N. 3. Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis: (CA/GT) n and (A/T)n microsatellites. Nucleic Acids Research, 3 (3), Schlötterer, C.. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma, 9 (9), Schlötterer, C. 4. The evolution of molecular markers just a matter of fashion? Nature Reviews Genetics, 5 (), Schlötterer, C., Tautz, D Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Research, (2), Schnable, P. S., Ware, D., Fulton, R. S., Stein, J. C., Wei, F., Pasternak, Liang, Ch., Zhang, J., Fulton, L., Graves, T. A., Minx, P., Reily, A. D., Courtney, L., Kruchowski, S. S., Tomlinson, Ch., Strong, C., Delehauty, K., Fronick, C., Courtney, B., Rock, S. M., Belter, E., Du, F., Kim, K., Abbott, R. M., Kotton, M., Levy, A., Marchetto, P., Ochoa, K., Jackson, S. M., Gillam, B., Chen, W., Yan, L., Higginbotham, J., Cardenas, M., Waligorski, J., Applebaum, E., Phelps, L., Falkone, J., Kanchi, K., Thane, T., Scimone, A., Thane, N., Henke, J., Wang, T., Ruppert, J., Shah, N., Rotter, K., Cordes, M., Kohlberg, S., Sgro, J., Delgado, B., Mead, K., Chinwalla, A., Leonard, S., Crouse, K., Collura, K., Kudrna, D., Currie, J., He, R., Angelova, A., Rajasekar, S., Mueller, T., Lomeli, R., Scara, G., Ko, A., Delaney, K., Wissotski, M., Lopez, G., Campos, D., Braidotti, Ashley, E., Golser, W., Kim, H.-R., Lee, S.-H., Lin, J., Dujmic, Z., Kim, W., Talag, J., Zuccolo, A., Fan, Ch., Sebastian, A., Kramer, M., Spiegel, L., Nascimento, L., Zutavern, T., Miller, B., Ambroise, C., Muller, S., Spooner, W., Narechania, A., Ren, L., Wei, S., Kumari, S., Faga, B., Levy, M., McMahan, L., Van Buren, P., Vaugh, M. W., Ying, K., Y, Ch.-T., Emrich, S. J., Jia, Y., Kalyanaraman, A., Hsia, A.-P., Barbazuk, W. B., Baucom, R. S., Brutnell, T. P., Carpita, N. C., Chaparro, C., Chia, J.-M., Deragon, J.-M., Estill, J. C., Fu, Y., Jeddeloh, J. A., Han, Y., Lee, H., Li, P., Lisch, D. R., Liu, S., Liu, Z., Nagel, D. H., McCann, M. C., Miguel, P. S., Meyers, A. M., Nettleton, D., Nguyen, J., Penning, B. W., Ponnala, L., Schneider, K. L., Schwartz, D. C., Sharma, A., Soderlund, C., Springer, N. M., Sun, Q., Wang, H., Waterman, M., Westerman, R., Wolfgruber, T. K., Yang, L., Yu, Y., Zhang, L., Zhou, S., Zhu, Q., Bennetzen, J. L., Dawe, R. K., Jiang, J., Jiang, N., Presting, G. G., Wessler, S. R., Aluru, S., Martienssen, R. A., Clifton, S. W., McCombie, W. R., Wing, R. A., Wilson, 64

166 R. K. 9. The B73 Maize Genome: Complexity, Diversity, and Dynamics. Science, 326 (5956), 2-5. Schuelke M.. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments.nature Biotechnology, 8(2), Schug, M. D., Mackay, T. F., Aquadro, C. F Low mutation rates of microsatellite loci in Drosophila melanogaster. Nature Genetics, 5 (), Sinoto, Y Chromosome studies in some dioecious plants with special reference to the allosomes. Cytologia,, 9. Slate, J., Pemberton, J. M. 2. Comparing molecular measures for detecting inbreeding depression. Journal of Evolutionary Biology, 5 (), -3. Small, E A Numerical and Nomenclatural Analysis of Morpho-geographic Taxa of Humulus. Systematic Botany, 3 (), Smith, J. R., Carpten, J. D., Brownstein, M. J., Ghosh, S., Magnuson, V. L., Gilbert, D. A., Trent, J. M., Collins, F Approach to Genotyping Errors Caused by Nontemplated Nucleotide Addition by Taq DNA Polymerase. Genome Research, 5 (3), Somers, D. J., Isaac, P., Edwards, K. 4. A high-density microsatellite consensus map for bread wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics, 9 (6), 5-4. Spritz, R. A., 98. Duplication/deletion polymorphism 5 - to the human beta globin gene. Nucleic Acids Research, 9 (9), StatSoft, Inc.. STATISTICA (data analysis software system), version 9.. [electronic manual], < StatSoft. STATISTICA 9 for Windows [program]. Subirana, J. A., Messeguer, X. 8. Structural families of genomic microsatellites. Gene, 48 (2), Summers, K., Amos. W Behavioral, ecological, and molecular genetic analyses of reproductive strategies in the Amazonian dart-poison frog, Dendrobates ventrimaculatus. Behavioral Ecology, 8 (3), Sunnucks, P., Wilson, A. C. C., Beheregaray, L. B., Zenger, K., French, J., Taylor, A. C.. SSCP is not so difficult: the application and utility of single-stranded conformation polymorphism in evolutionary biology and molecular ecology. Molecular Ecology, 9 (), Sutherland, G. R., Richards, R. I Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 92 (9),

167 Štajner, N., Jakše, J., Kozjak, P., Javornik, B. 5. The isolation and characterisation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.). Plant Science, 68 (), Štajner, N., Šatovič, Z., Čerenak, A., Jarovnik, B. 8. Genetic structure and differentiation in hop (Humulus lupulus L.) as inferred from microsatellites. Euphytica, 6 (-2), 3-3. Šustar-Vozlič, J., Javornik, B Genetic relationships in cultivars of hop, Humulus lupulus L., determined by RAPD analysis. Plant Breeding, 8 (2), Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids research, 22 (22), Tóth, G., Gáspári, Z., Jurka, J.. Microsatellites in Different Eukaryotic Genomes: Survey and Analysis. Genome Research, (7), Townsend, M. S., Henning, J. A., Moore, D. L.. AFLP Analysis of DNA from Dried Hop Cones. Crop Science, 4 (5), Tran, H. T., Keen, J. D., Kricker, M., Resnick, M. A., Gordenin, D. A Hypermutability of Homonucleotide Runs in Mismatch Repair and DNA Polymerase Proofreading Yeast Mutants. Molecular and Cellular Biology, 7 (5), Tsuchia, Y., Araki, S., Takashio, M., Tamaki, T Identification of Hop Varieties Using Specific Primers Derived from RAPD Markers. Journal of Fermentation and Bioengineering, 84 (2), 3-7. Ubhayasekera, W., Rawat, R., Wing Tak Ho, S., Wiweger, M., Von Arnold, S., Chye, M.-L., Mowbray, S. L. 9. The first crystal structures of a family 9 class IV chitinase: the enzyme from Norway spruce. Plant Molecular Biology, 7, Udupa, S. M., Malhotra, R. S., Baum, M. 4. Tightly linked di- and tri-nucleotide microsatellites do not evolve in complete independence: evidence from linked (TA) n and (TAA)n microsatellites of chickpea (Cicer arietium L.). Theoretical and Applied Genetics, 8 (3), Usdin, K. 8. The biological effects of simple tandem repeats: lessons from the repeat expansion diseases. Genome Research, 8 (7), -9. Vallone, P. M., Butler, J. M. 4. AutoDimer: a screening tool for primer-dimer and hairpin structures. Biotechniques, 37 (2), van Asch B, Pinheiro R, Pereira R, Alves C, Pereira V, Pereira F, Gusmão L, Amorim A.. A framework for the development of STR genotyping in domestic animal species: characterization and population study of 2 canine X-chromosome loci. Electrophoresis, 3 (2),

168 van Bakel, H., Stout, J. M., Cote, A. G., Tallon, C. M., Sharpe, A. G., Hughes, T. R., Page, J. E.. The draft genome and transcriptome of Cannabis sativa. Genome Biology, (2), R2. van Oosterhout, Weetman, D., Hutchinson, W. F. 6. Estimation and adjustment of microsatellite null alleles in nonequilibrium populations. Molecular Ecology Notes, 6 (), Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. 5. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. TRENDS in Biotechnology, 23 (), Vigouroux, Y., Jaqueth, J. S., Matsuoka, Y., Smith, O. S., Beavis, W. D., Smith, J. S. C., Doebley, J. 2. Rate and Pattern of Mutation at Microsatellite Loci in Maize. Molecular Biology and Evolution, 9 (8), von Holdt, B. M., Pollinger, J. P., Lohmueller, K. E., Han, E., Parker, H. G., Quignon, P., Degenhardt, J. D., Boyko, A. R., Earl, D. A., Auton, A., Reynolds, A., Bryc, K., Brisbin, A., Knowles, J. C., Mosher, D. S., Spady, T. C., Elkahloun, A., Geffen, E., Pilot, M., Jedrzejewski, W., Greco, C., Randi, E., Bannasch, D., Wilton, A., Shearman, J., Musiani, M., Cargill, M., Jones, P. G., Qian, Z., Huang, W., Ding, Z.-L., Zhang, Y., Bustamante, C. D., Ostrander, E. A., Novembre, J., Wayne, R. K.. Genome-wide SNP and haplotype analyses reveal a rich history underlying dog domestication. Nature, 464, Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T. Hornes, M., Friters, A., Pot, J., Paleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23 (2), Wagner, A. P., Creel, S., Kalinowski, S. T. 6. Estimating relatedness and relationships using microsatellite loci with null alleles. Heredity, 97 (5), Wagner, H. W., Sefc, K. M IDENTITY. [program], Centre for Applied Genetics, Univerzity of Agricultural Sciences Vienna. Dostupné na < Walsh, P. S., Fildes, N. J., Reynolds, R Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vwa. Nucleic Acids Research, 24 (4), Walsh, S. P., Erlich, H. A., Higuchi, R Preferential PCR Amplification of Alleles: Mechanisms and Solutions. Genome Research, (4), Wang, X. W., Kaga, A., Tomooka, N., Vaughan, D. A. 4. The development of SSR markers by a new method in plants and their application ot gene flow studies in azuki bean [Vigna 67

169 angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi]. Theoretical and Applied Genetics, 9 (2), Wang, Z., Niu, T., Lunetta, K. L., Xu, X., Fang, Z., Xu, X.. Observation of null alleles of microsatellite markers in a Chinese population. GeneScreen, (), Wattier, R., Engel, C. R., Saumitou-Laprade, P., Valero, M Short allele dominance as a source of heterozygote deficiency at microsatellite loci: experimental evidence at the dinucleotide locus GvCT in Gracilaria gracilis (Rhodophyta). Molecular Ecology, 7 (), Webster, M. T., Smith, N. G., Ellegren, H. 2. Microsatellite evolution inferred from humanchimpanzee genomic sequence alignments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States America, 99 (3), Wells, R. D., Dere, R., Hebert, M. L., Napierala, M., Son, L. S. 5. Advance in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases. Nucleic Acids Research, 33 (2), Whittle, C.-A., Johnston, M. O. 2. Male-Driven Evolution of Mitochondrial and Chloroplastidial DNA Sequences in Plants. Molecular Biology and Evolution, 9 (6), Wicker, T., Keller, B. 7. Genome-wide comparative analysis of copia retrotransposons in Triticeae, rice, and Arabidopsis reveals conserved ancient evolutionary lineages and distinct dynamics of individual copia famillies. Genome Research, 7 (7), Wierdl, M., Dominska, M., Petes, T. D Microsatellite Instability in Yeast: Dependence on the Length. Genetics, 46 (3), Wilder, J., Hollocher, H.. Mobile Elements and the Genesis of Microsatellites in Dipterans. Molecular Biology and Evolution, 8 (3), Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., Tingey, S. V. 99. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 8 (22), Winkler, H. 98. In: Neve, R. A. 99. Hops, Chapman & Hall, London, p Zastera, J., Roewer, L., Willuweit, S., Sekerka, P., Benesova, L., Minarik, M.. Assembly of a large Y-STR haplotype database for the Czech population and investigation of its substructure [online]. Forensic Science International: Genetics, 4 (3), [cit. 6 4]. Dostupné na <doi:.6/j.fsigen >. Zhang, L., Zuo, K., Zhang, F., Cao, Y., Wang, J., Zhang, Y., Sun, X., Tang, K. 6. Conservation of noncoding microsatellites in plants: implication for gene regulation [online]. BMC Genomics, 7, [cit. 6 4]. Dostupné na

170 < Zhdanova, O. L., Pudovkin, A. I. 8. Nb_HetEx: A program to estimate the effectivve number of breeders. Journal of Heredity, 99 (6), Zheng, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W.. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computional Biolology, 7 (-2), 3-4. Zhu, Y., Strassmann, J. E., Queller, D. C.. Insertions, substitutions, and the origin of microsatellites. Genetical Research, 76 (3), Zietkiewicz, E., Rafalski, A., Labuda, D Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, (2),

171 8. PŘÍLOHY 8. SLOŽENÍ ROZTOKŮ Silanizační roztok ml 96% etanolu 5 μl 99,5 % ledové kyseliny octové 3 μl silanu (3-methakryloxypropyltrimethoxysilan) ml 6% akrylamidového gelu obsahuje 5 ml 4% akrylamidového gelu (9:) ml x TBE (x TBE) 42 g močoviny (8M) Pro katalýzu polymerační reakce bylo do ml gelu přidáváno 833 μl % síranu amonného (APS) 5 μl TEMEDu (tetramethylethylendiamin) 4 ml denaturační barvy obsahuje 38,9 ml 99,5% formamidu (95% v/v) 4 μl M NaOH ( mm) μg bromfenolové modři (,5% w/v) μg xylencyálové modři (,5% w/v) litr fixačního roztoku obsahuje ml 96% ethanolu (~ % v/v) 5 ml 99,5% ledové kyseliny octové (,5% v/v) litr barvícího roztoku obsahuje,5 g AgNO3 (,5% w/v) litr vyvíjecího roztoku obsahuje 5 g NaOH (,5% w/v) 7

172 6 ml akrylamidového gelu obsahuje 2 ml 4% akrylamidového gelu (37,5:) 3 ml x TBE ( x TBE) 6 ml glycerolu (% v/v) Pro katalýzu polymerační reakce bylo do 6 ml gelu přidáváno 6 μl % síranu amonného (APS) 6 μl TEMEDu (tetramethylethylendiamin) 7

173 8.2 BARVENÍ GELU POMOCÍ DICHROMANU DRASELNÉHO ponořit do destilované vody, potom opatrně vodu odlít 2 x minut, % et-oh, ch3cooh 5 C fixace (4 96% et-oh ml H2O 384 ml roztoku, odebrat 4% - 38 ml + ml ch3cooh),4 g dichroman didraselný (K2Cr2O7)+ 5 ul HNO3 do 4 ml H2O 2 x 5 minut destilovaná voda minut,4 g AgNO3/ml min. Propláchnout destilovaná voda g Na2CO3 + 4 ml H2O před použitím přidat ul 37% HCOH nalít /3 roztoku, rychleji třepat, odsát nalít 2/3 roztoku, 2 minuty nalít 3/3 roztoku 3 minuty stop (5% CH3Cooh fixace) 72

174 8.3. SEZNAM ODRŮD A NOVOŠLECHTĚNÍ Tab. 8.: Seznam odrůd a novošlechtění ČR ČR ČR ČR ČR ČR ČR Polsko Anglie Anglie Německo Anglie Slovinsko Slovinsko ČR Slovinsko Německo Rakousko Anglie Anglie Anglie Německo Rusko Rusko Německo USA JAR ČR Ukrajina ČR Německo ČR Anglie Polsko Polsko ČR Německo Německo Slovinsko Polsko Německo USA Ukrajina Ukrajina Polsko Maďarsko Ukrajina USA Osvaldův klon 47 Mastýřovický Osvaldův klon 3 Roudnický Osvaldův klon 55 Semšův Planý D Polsko Wye Early Bird Early bird Golding Au-Hallertau Whitbread 47 Styrie Aurora Aromat Ahil klon Ascherslaben V-KAV Malling Progress Alliance Wye Viking Hallertauer Gold klon 5 Brjanskij Magnum Columbus Outeniqua Harmonie Aromat Polesja M 2/27 Taurus Agnus Herold Zula Iunga Vital Merkur Saphir Cerera Sybilla Herkules Banner Zaklad Smena klon 34 Francie F8 Silnyj Olympic 73

175 8.4. VAR SKÓRE 74

176 Obr. 8.: Hodnoty VAR skóre pro SSR markerů (.část) 75

177 Obr. 8.2: Hodnoty VAR skóre pro SSR markerů (2.část) 76