1 destička - 96 testů destiček testů 72348

Transkript

1 Monolisa HBs Ag ULTRA 1 destička - 96 testů destiček testů SOUPRAVA KE STANOVENÍ POVRCHOVÉHO ANTIGENU VIRU HEPATITIDY B V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ METODOU ENZYMOVÉ IMUNOANALÝZY IVD Pouze pro diagnostiku in vitro Kontrola kvality prováděná výrobcem Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propuštěna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace vztahující se k výrobě a kontrole každé jednotlivé šarže jsou uchovávány naší společností.

2 OBSAH 1 - POUŽITÍ 2 - KLINICKÝ VÝZNAM 3 - PRINCIP TESTU Monolisa HBs Ag ULTRA 4 - SLOŽENÍ REAGENČNÍ SOUPRAVY Monolisa HBs Ag ULTRA 5 - METODICKÁ UPOZORNĚNÍ 6 - OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE 7 - POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ 9 - PODMÍNKY UCHOVÁVÁNÍ - SKLADOVATELNOST 10 - PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ 11 - PRACOVNÍ POSTUP 12 - ADAPTACE SYSTÉMU 13 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 14 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A REAGENCIÍ 15 - ÚČINNOST TESTU 16 - OMEZENÍ TESTU 17 - LITERATURA 2

3 1 - POUŽITÍ Monolisa HBs Ag ULTRA je test založený na technice jednokrokové enzymové imunoanalýzy sandwichového typu, určený ke stanovení povrchového antigenu viru hepatitidy B (HBs Ag) v lidském séru nebo plazmě. 2 - KLINICKÝ VÝZNAM Průkaz HBs Ag v séru indikuje infekci způsobenou virem hepatitidy B. HBs Ag je první marker jenž se objevuje během infekce a lze jej pozorovat již 2-3 týdny před projevem klinických a biologických symptomů nemoci. Doba, po kterou je antigen přítomen, může být velmi krátká (několik dnů) nebo dlouhá (několik roků). Je-li HBs Ag přítomen v séru déle než 6 měsíců, je známkou chronické hepatitidy. Vzhledem k přítomnosti velkého počtu asymptomatických chronických nosičů, představuje hepatitida B v transfůzní službě velké nebezpečí. Prevence jejího přenosu je založena na detekci HBs Ag u dárce při každém krevním odběru. 3 - PRINCIP TESTU Monolisa HBs Ag ULTRA Monolisa HBs Ag ULTRA je test jednostupňové enzymové imunoanalýzy sandwichového typu používající monoklonální a polyklonální protilátky, jež byly vybrány pro svou schopnost vázat se na různé subtypy HBs Ag, jež jsou nyní uznávány WHO a na většinu variantních kmenů HBV. Pevná fáze v testu Monolisa HBs Ag ULTRA je potažena monoklonálními protilátkami. Konjugát v testu Monolisa HBs Ag ULTRA je složen z myších monoklonálních protilátek a kozí polyklonální protilátky proti HBs Ag. Tyto protilátky jsou konjugovány s peroxidázou. Pracovní postup probíhá podle následujících kroků: 1. Pipetování kontrolních sér a vzorků do jamek mikrotitrační destičky. Tento postup lze vizuálně kontrolovat: je zde jasný rozdíl v zabarvení mezi prázdnou jamkou a jamkou se vzorkem. Kontrola může být prováděna rovněž automaticky odečítáním na spektrofotometru při vlnové délce 490/ nm (volitelné). 2. Pipetování červeně zabarveného konjugátu do jamek. Tento postup lze rovněž vizuálně kontrolovat: po přidání konjugátu se barva jamek mění v červenou. Kontrola může být prováděna rovněž automaticky měřením na spektrofotometru při vlnové délce 490/ nm (volitelné). V tomto kroku lze rovněž kontrolovat přidání vzorku automatickým měřením při vlnové délce 490/ nm. 3. Po inkubaci při 37 C po dobu 1,5 h se odstraní nenavázaný konjugát promytím. 4. Přidání barevného substrátového roztoku. Tento krok je možno vizuálně kontrolovat: mezi prázdnou jamkou a jamkou s růžovým substrátovým roztokem je jasný barevný rozdíl. Kontrolu přidání substrátu je rovněž možno provést automaticky měřením při 490 nm (volitelné). 5. Po 30 minutové inkubaci za přítomnosti substrátu ve tmě při pokojové teplotě (18-30 C) je komplex navázaného konjugátu prokázán změnou barvy. 6. Přidání zastavovacího roztoku. Přidání je možno vizuálně kontrolovat: původně růžový substrátový roztok se stane bezbarvým u negativních vzorků a zežloutne v jamkách s pozitivními vzorky. 7. Odečtení optických denzit při 450/ nm a interpretace výsledků. 3

4 4 - SLOŽENÍ REAGENČNÍ SOUPRAVY Monolisa HBS Ag ULTRA Všechny reagencie jsou určeny výhradně pro diagnostiku in vitro. ŠTÍTEK R1 SLOŽENÍ REAGENCIE MIKROTITRAČNÍ DESTIČKA: 12 stripů po 8 jamkách, potažených monoklonálními protilátkami anti-hbs (myší). PROVEDENÍ ks 5 ks R2 KONCENTROVANÝ PROMÝVACÍ ROZTOK (20X) Tris NaCl pufr ph 7,4 Konzervační prostředek: ProClin 300 (0,04 %) 70ml 235 ml R3 NEGATIVNÍ KONTROLA: Tris HCl pufr obsahující BSA Konzervační činidlo: ProClin 300 (0,1 %) 2 lahvičky 2 x 2,5 ml 2 lahvičky 2 x 2,5 ml R4 POZITIVNÍ KONTROLA: Tris HCl pufr obsahující BSA s přídavkem směsi purifikovaného HBs Ag subtypů ad a ay. Konzervační činidlo: ProClin 300 (0,1 %) 2,5 ml 2,5 ml R6 ŘEDICÍ ROZTOK PRO KONJUGÁT: Tris HCl pufr ph 7,4 obsahující BSA, Tween 20, hovězí imunoglobulíny a myší imunoglobulíny s činidlem pro kontrolu přidání vzorku. Konzervační činidla: Ciprofloxacin (10 mg/ml), ProClin 300 (0,1 %) 8 ml 2 lahvičky 2 x 18 ml R7 KONJUGÁT: Myší monoklonální protilátky anti-hbs a kozí polyklonální protilátky anti-hbs navázané na peroxidázu. Lyofilizováno. 8 ml 2 lahvičky 2 x18 ml R8 SUBSTRÁTOVÝ PUFR: Roztok kyseliny citrónové a octanu sodného ph 4,0 obsahující H 2 O 2 (0,015 %) a DMSO (4 %) 60 ml 2 lahvičky 2 x 60 ml R9 CHROMOGEN RŮŽOVĚ ZABARVENÝ: Roztok obsahující tetramethylbenzidin (TMB) 5 ml 2 lahvičky 2 x 5 ml R10 ZASTAVOVACÍ ROZTOK: 1N roztok kyseliny sírové 28 ml 3 lahvičky 3 x 28 ml 5 - METODICKÁ UPOZORNĚNÍ Hodnověrnost výsledků závisí na dodržování následujících zásad správné laboratorní praxe: Název testu, stejně jako i specifické identifikační číslo testu, jsou vytištěny na rámečku každé mikrotitrační destičky. Toto specifické identifikační číslo je rovněž umístěno na každém stripu. Monolisa HBs Ag ULTRA: Specifické identifikační číslo = 51 Ověřte specifické identifikační číslo před každým použitím. Jestliže identifikační číslo chybí, nebo se liší od určeného čísla odpovídajícího prováděnému testu, strip nesmí být použit. Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Při provádění testu nesměšujte reagencie ze souprav s různými čísly šarží. POZNÁMKA: pro promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X, zelené zabarvení), peroxidázový substrátový pufr (R8, identifikace na štítku: TMB buf, modré zbarvení), chromogen (R9, identifikace na štítku: TMB 11x, purpurové zbarvení) a zastavovací roztok (R10, identifikace na štítku: 1N, červené zbarvení) je možno použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že stejná šarže se použije pro daný běh testu. Tyto reagencie mohou být použity s některými jinými produkty naší společnosti. Dále je možno promývací roztok (R2, identifikace na štítku: 20X zelené zabarvení) míchat se dvěmi dalšími promývacími roztoky, které jsou součástí některých dalších testovacích souprav firmy Bio-Rad (R2, identifikace na štítku: 10X modré zabarvení, 10X oranžové zabarvení) a jsou-li správně rekonstituovány a pokud je použita jedna směs během jednoho testu. Pro detailní informace kontaktujte lokální zastoupení BIO-RAD. 4

5 Před použitím ponechte reagencie ohřát při laboratorní teplotě po dobu 30 minut a naředěný promývací roztok R2 po dobu 1 hodiny. Reagencie pečlivě rozpusťte a během jejich přípravy zabraňte jakékoli kontaminaci. Test neprovádějte v blízkosti reaktivních výparů (kyseliny, alkálie, aldehydy) nebo v prašném prostředí, které by mohlo ovlivnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte pouze laboratorní sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo přednostně materiál pro jednorázové použití. Promyté mikrotitrační destičky nesmí před napipetováním další reagencie vyschnout. Enzymatická reakce je velmi citlivá na přítomnost kovů či kovových iontů. Proto nesmí roztoky obsahující konjugát či substrát přijít do kontaktu s žádnými prvky kovů. Chromogenní roztok (substrátový pufr s chromogenem) musí být růžový. Pokud se během několika minut po přípravě barva změní, je reagencie nepoužitelná a musí být vyměněna. Chromogenní roztok by se měl připravovat v plastových vaničkách na jedno použití nebo ve skleněných nádobkách předem vymytých 1 N HCl a důkladně opláchnutých destilovanou vodou a řádně osušených. Tato reagencie musí být uchovávána ve tmě. Pro každé sérum používejte novou pipetovací špičku. Kvalitní promytí je kritickým místem celého pracovního postupu: dodržujte předepsaný počet promývacích cyklů a přesvědčte se, že jsou všechny jamky zcela naplněné a po odsátí zcela prázdné. Nesprávné promývání může být příčinou chybných výsledků. Pro pipetování konjugátu a chromogenního roztoku nikdy nepoužívejte stejnou nádobku. Zkontrolujte přesnost a správnou činnost pipet a jiného náčiní. Neměňte pracovní postup. 6 - OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Všechny reagencie obsažené v soupravě jsou určeny výhradně pro diagnostické použití in vitro. Během manipulace s reagenciemi a vzorky používejte ochranné rukavice určené pro jedno použití. Po ukončení práce si důkladně umyjte ruce. Nepipetujte ústy. Pozitivní kontrola R4 obsahuje purifikovaný HBs Ag ze subtypů ad a ay připravený z tepelně inaktivované lidské plazmy negativní na protilátky proti HCV, HIV-1 a HIV-2. Jelikož není žádná známá testovací metoda nemůže poskytnou naprostou jistotu, že nejsou přítomny žádné infekční agens, zacházejte s reagenciemi a pacientskými vzorky jako by byly schopny přenášet infekční nemoci. Jakékoliv náčiní, které přišlo do přímého kontaktu se vzorky a reagenciemi a stejně tak promývací roztok, musí být považováno za kontaminovaný materiál a s jako takovým se musí zacházet. Zamezte rozlití či rozstříknutí testovaných vzorků nebo roztoků obsahujících tyto vzorky. Potřísněná místa se musí dezinfikovat roztokem dezinfekčního přípravku (např. chlornan sodný o konečné koncentraci 10 %). Jedná-li se o kyseliny, musí být nejprve neutralizovány hydrogenuhličitanem sodným a pak vysušeny savým papírem. Použitý úklidový materiál se musí likvidovat jako infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a rovněž kontaminovaný materiál a produkty se musí před likvidací dekontaminovat. Dekontaminace se provádí - buď ponořením do 5 % roztoku chlornanu sodného (1 díl chlornanu sodného na 10 dílů kontaminovaného roztoku či vody) na 30 minut, - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu nejméně 2 hodiny. Autoklávování je nejlepší způsob inaktivace virů HIV a HBV. - ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ SE NESMÍ BÝT AUTOKLÁVOVÁNY! Nezapomeňte neutralizovat nebo autoklávovat všechny roztoky, tekutý odpad po promývání či jakoukoli tekutinu obsahující biologické vzorky před tím, nežli je vylijete do výlevky. Bezpečnostní list je k dispozici na vyžádání. S chemikáliemi se musí zacházet a provádět jejich odstranění dle předpisů správné laboratorní praxe. Vyvarujte se potřísnění kůže a sliznic substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem (riziko toxicity, podráždění nebo popálení). Některé reagencie obsahují ProClin 300 (0,04 %, 0,1 % a/nebo 0,5 %). Xi: Dráždivý R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. S28-37: Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody. Používejte vhodné ochranné rukavice. Bezpečnostní list je k dispozici na požádání. 7 - POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Destilovaná voda. Chlornan sodný a hydrouhličitan sodný. 5

6 Automatické či poloautomatické nastavitelné či fixní pipety pro měření a pipetování objemu 50 l, 100 l, 1000 l a 10 ml. Kalibrované odměrné válce o objemu 100 ml a 1000 ml. Nádoba na kontaminovaný odpad. Vodní lázeň nebo inkubátor pro mikrotitrační destičky s termostatem nastavitelným na teplotu 371 C (*). Automatická, poloautomatická, nebo ruční promývačka mikrotitračních destiček (*). Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky vybavený filtry 450 nm, 490 nm a nm (*). Savý papír (*) Detailní informace o doporučeném zařízení poskytuje naše technické oddělení. 8 - PŘÍPRAVA REAGENCIÍ POZNÁMKA: Před použitím ponechte reagencie ohřát na laboratorní teplotu (18-30 C). 1) Reagencie hotové k použití Reagencie 1 (R1): Mikrotitrační destička Každý rámeček destičky obsahující 12 stripů je uzavřen v uzavíratelném foliovém sáčku. Rozstřihněte sáček nůžkami nebo skalpelem 0,5 1 cm nad zdrhovacím spojem. Otevřete sáček a vyjměte destičku. Nepoužité stripy vraťte do sáčku. Uzavřete sáček a uložte jej při +2-8 C. Reagencie 3 (R3): Negativní kontrola Reagencie 4 (R4): Pozitivní kontrola Reagencie 10 (R10): Zastavovací roztok 2) Reagencie, které je třeba připravit Koncentrovaný promývací roztok (20x): Reagencie 2 (R2): Nařeďte 1:20 v destilované vodě, abyste získali pracovní koncentraci promývacího roztoku. Připravte 800 ml pro jednu destičku s 12 stripy. Pracovní roztok konjugátu (R6 + R7) S lahvičkou s lyofilizovaným konjugátem (R7) lehce poklepejte o pracovní desku stolu, aby se z gumového uzávěru odstranil všechen přichycený lyofilizát. Opatrně odstraňte uzávěr a do lahvičky s lyofilizovaným konjugátem (R7) vlijte obsah lahvičky s ředicím roztokem pro konjugát (R6). Lahvičku opět uzavřete a ponechejte stát 10 minut. Občasné mírné třepání a obracení lahvičky usnadní rozpuštění lyofilizátu. Substrátový roztok: Reagencie 8 (R8) + Reagencie 9 ( R9): Chromogen (R9) nařeďte v substrátovém pufru (R8) v poměru 1 : 11 (např.: 1 ml reagencie R ml reagencie R8). Stabilita je 6 hodin od doby přípravy ve tmě. 9 - PODMÍNKY UCHOVÁVÁNÍ - SKLADOVATELNOST Soupravu uchovávejte při teplotě +2-8 C. Při této teplotě jsou všechny reagencie stabilní až do data exspirace, vyznačeném na obalu soupravy (s výjimkou zvláštních pokynů). R1: Po rozbalení vakuového balení jsou stripy mikrotitrační destičky použitelné po dobu 1 měsíce, jestliže jsou znovu pečlivě zabaleny a uloženy při +2-8 C. R2: Naředěný promývací roztok může být uchován při C po dobu 2 týdnů. Koncentrovaný promývací roztok (R2) může být skladován při teplotě C. R6+R7: Rozpuštěná reagencie je použitelný po dobu 1 měsíce, jestliže je uchovávána při teplotě +2-8 C a 8 hodin při pokojové teplotě (18-30 C). R8+R9: Připravená reagencie uložená ve tmě je použitelná po dobu 6 hodin od přípravy při uchovávání za pokojové teploty ( C) PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ Vzorky krve se odebírají běžným způsobem. Pro test může být použito neředěné sérum nebo plazma (odebraná do protisrážlivých činidel na bázi EDTA, heparinu, citrátu a ACD). Sérum nebo plazmu oddělte od sraženiny nebo červených krvinek co možno nejdříve, aby se zabránilo hemolýze. Značná hemolýza může ovlivnit účinnost testu. Vzorky obsahující shluky je nutno před vyšetřením vyčeřit centrifugací. Suspendované fibrínové sraženiny nebo částice by totiž mohly zapříčinit vznik falešně pozitivních výsledků. Pokud budou vzorky vyšetřeny během 7 dnů po odběru, mohou být skladovány při teplotě +2-8 C. Vzorky je možno rovněž skladovat zmrazené při teplotě -20 C po dobu několika měsíců. Vyhněte se opakovaným cyklům zamrazování a rozmrazováni. Vzorky, které byly rozmraženy a zamraženy více než 3x by neměly být použity. Při transportu musí být vzorky zabaleny podle platných předpisů pro transport etiologických agens. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, HYPERLIPEMICKÁ A SILNĚ HEMOLYZOVANÁ SÉRA NEBO PLAZMU. Poznámka: U vzorků obsahujících do 90 g/l albuminu, 100 mg/l bilirubinu, lipemických vzorků s obsahem do ekvivalentu 36 g/l triglyceridu a hemolyzovaných vzorků s obsahem do 1 g/l hemoglobinu nejsou výsledky nijak ovlivněny. 6

7 11 - PRACOVNÍ POSTUP Přesně dodržujte stanovený postup. Pro validaci výsledků testu použijte vždy v každém běhu testování negativní (R3) a pozitivní (R4) kontroly. Dodržujte následující zásady správné laboratorní praxe: 1. Pečlivě připravte plán rozmístění vzorků a identifikační plán. 2. Připravte promývací roztok naředěný na pracovní koncentraci (viz kapitola 8). 3. Připravte pracovní roztok R6+R7 (viz kapitola 8). 4. Z ochranného obalu vyjměte rámeček a potřebný počet stripů (R1). Nepoužité stripy vraťte zpět do sáčku a uzavřete jej. 5. Do jamek pipetujte následujícím způsobem (doporučený způsob pipetování do destičky): Jamky A1, B1, C1 a D1: 100 μl negativní kontroly (R3). Jamka E1: 100 μl pozitivní kontroly (R4). Jamka F1: 100 μl prvního neznámého vzorku jestliže tato jamka není použita jako jamka pro kontrolní ověření přidání vzorku a konjugátu (volitelné). Jamky G1, H1, atd.: 100 μl testovaného vzorku. V závislosti na použitém systému, je možné upravit umístění kontrol, nebo je možno změnit pořadí pipetování. POZNÁMKA: Pipetování vzorku je v tomto kroku možné vizuálně kontrolovat: mezi prázdnou jamkou a jamkou obsahující vzorek je jasný rozdíl v zabarvení (Informace o automatickém způsobu ověřování jsou uvedeny v kapitole 14 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A REAGENCIÍ). 6. Do všech jamek rychle napipetujte 50 μl pracovního roztoku konjugátu (R6 + R7), roztok konjugátu musí být před pipetováním promíchán. Promíchejte reakční směs. Poznámka: Napipetování vzorku, jako i napipetování konjugátu, může být v tomto kroku vizuálně kontrolováno: roztok konjugátu (R6+R7), který je červený, může být v tomto kroku vizuálně kontrolován (automatické ověření viz. odstavec 14). 7. Jestliže je to možné, překryjte destičku adhezívní fólií a inkubujte po dobu 90 minut (±5 minut) při teplotě 37±1 C. 8. Odstraňte adhezívní fólii, vyprázdněte všechny jamky odsátím a nejméně 5x je promyjte. Zbývající objem musí být nižší než 10 μl (jestliže je to nutné, osušte stripy obrácením horní stranou dolů na absorpční papír). 9. Do každé jamky rychle napipetujte 100 μl substrátového roztoku s chromogenem (R8+R9), připraveného těsně před použitím. Reakci nechte probíhat ve tmě po dobu 30±5 minut při pokojové teplotě (18-30 C). Během této inkubace nepoužívejte adhezívní fólii. Poznámka: napipetování substrátového roztoku, který je zbarven růžově, může být v tomto kroku snadno kontrolováno: mezi prázdnou jamkou a jamkou s růžovým substrátovým roztokem je jasný barevný rozdíl (viz odstavec 14 pro automatické ověření: Spektrofotometrické ověření pipetování vzorku a reagencií). 10. Do každé jamky přidejte 100 μl zastavovacího roztoku (R10). Zachovejte stejný sled pipetování a časové intervaly, jako při pipetování substrátového roztoku. Reakční směs promíchejte. Poznámka: Pipetování zastavovacího roztoku, který není zbarvený, může být v tomto kroku vizuálně kontrolováno. Po napipetování zastavovacího roztoku zmizí růžové zbarvení substrátu (u negativních vzorků) nebo ze změní z růžového na žluté (u pozitivních vzorků). 11. Pečlivě otřete dno destičky. Po napipetování zastavovacího roztoku počkejte alespoň 4 minuty a do 30 minut po napipetování zastavovacího roztoku změřte optickou densitu při 450/ nm na spektrofotometru pro mikrotitrační destičky. 12. Zkontrolujte soulad mezi spektrometrickým a vizuálním vyhodnocením destičky vzhledem k umístění vzorků a identifikačnímu plánu ADAPTACE SYSTÉMU PROMÝVÁNÍ: pečlivě dodržujte popsaný postup promývání, aby bylo dosaženo maximální účinnosti testu. U některých přístrojů může být nutné optimalizovat promývací postup (zvýšení počtu promývacích cyklů nebo objemu promývacího roztoku). V případě nutnosti adaptace přístrojů a nebo zavedení speciálních postupů kontaktujte naši společnost. 7

8 13 - VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 1) Výpočet průměrné hodnoty optické density negativní kontroly: OD R3 Příklad: Negativní kontrola R3 OD 1 0, , , ,027 Celková hodnota R3 OD = 0,120 Celková hodnota R3 OD/4 = 0,030 = průměrná OD R3 2) Výpočet hodnoty cut-off: Pro všechna provedení testu je hodnota cut-off rovna: OD R3 0,050 Příklad: OD R3 0,030 hodnota cut-off = 0, ,050 = 0,080 3) Podmínky validity Všechny hodnoty optické density negativních kontrol by měly být nižší nebo rovny hodnotě 0,080. Hodnota pozitivní kontroly (OD R4) musí být rovna nebo vyšší než 1,000. Jestliže jedna hodnota negativní kontroly nevyhovuje této normě, nebo je o 40 % vyšší než vypočtená průměrná hodnota negativních kontrol (OD R3), vyřaďte ji ze souboru a ze zbývajících tří vypočtěte novou průměrnou hodnotu. Tímto způsobem lze vyřadit pouze jednu hodnotu negativní kontroly. V případě velice nízké úrovně absorbance negativních kontrol R3 (průměrná hodnota je nižší než 0,010 OD) nepoužívejte pravidlo o vyloučení pro negativní kontroly R3. Jestliže všechny hodnoty kontrol nevyhovují uvedeným požadavkům, je třeba test opakovat. 4) Výpočet poměru vzorku Pro každý vzorek vypočítejte poměr: ODvzorku Pomě r hodnota cut off 5) Interpretace výsledků Vzorky s hodnotou poměru vzorku nižší než 1 jsou považovány v testu Monolisa HBs Ag ULTRA za negativní. Výsledky těsně pod hodnotou cut-off (poměr vzorku mezi 0,9 a 1) by se měly interpretovat s opatrností. V případě, že to používané systémy a laboratorní postupy umožňují, doporučuje se takové vzorky znovu vyšetřit dvojmo. Vzorky s hodnotou poměru větší nebo rovnou 1 jsou považovány za počátečně pozitivní a předtím než se provede závěrečná interpretace, měly by být znovu dvojmo vyšetřeny. Jestliže jsou po opakovaném testování vzorku dvojmo hodnoty poměru nižší než 1, počáteční výsledek je neopakovatelný a vzorek se hodnotí jako negativní v testu Monolisa HBs Ag ULTRA. Jestliže je po opakovaném testování vzorku dvojmo nejméně jedna hodnota poměru rovna nebo vyšší než 1, počáteční výsledek je opakovatelný a vzorek se hodnotí jako pozitivní v testu Monolisa HBs Ag ULTRA s přihlédnutím k omezením metodiky popisovaným níže. Vzorky, které byly testem Monolisa HBs Ag ULTRA opakovaně dvakrát testovány a byly vyhodnoceny jako negativní, ale s jednou hodnotou blízkou hodnotě cut-of (poměr mezi 0,9 a 1) musí být vyhodnoceny opatrně. Tyto vzorky se doporučuje vyšetřit jinou metodou nebo vyšetřit další vzorek. K ověření specificity reakce by měl být každý pozitivní výsledek v souhlasu s interpretačními kriterii testu Monolisa HBs Ag ULTRA konfirmován neutralizační metodou pro HBs Ag. Neopakovatelné reakce jsou často zapříčiněny: nedostatečným promýváním. kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým obsahem HBs Ag kontaminací substrátového roztoku oxidačními agens (chlornan sodný, ionty kovů, atd.) kontaminací zastavovacího roztoku. 8

9 14 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVĚŘENÍ PIPETOVÁNÍ VZORKŮ A REAGENCIÍ Ověření pipetování vzorku a konjugátu: 1) Ověření pipetování vzorku Přítomnost vzorku v jamce mikrotitrační destičky lze před napipetováním konjugátu ověřit automatickým změřením pomocí spektrofotometru při vlnových délkách 490/ nm: hodnota optické density jamky se vzorkem se musí nacházet mezi 0,050 a 0,900. Zbarvení prázdné jamky a slabě žluté jamky obsahující vzorek se zřetelně liší. 2) Ověření pipetování konjugátu Jestliže byla ověřena přítomnost vzorku automatickým měřením jak je popsáno výše, pipetování konjugátu může být kontrolováno automatickým měřením při 490/ nm: jamka obsahující konjugát a vzorek vykazuje optickou densitu vyšší než 1,100. Barva jamek obsahujících vzorky je slabě žlutá a změní se na červenou po napipetování konjugátu. 3) Současné ověření přítomnosti vzorku a konjugátu v jamkách (pouze spektrofotometrická verifikace) Jestliže přítomnost vzorku vzorků nebyla ověřena automatickým měřením jak je popsáno nahoře, současná přítomnost vzorku a konjugátu v jamkách může být ověřena automatickým měřením při 4910/ nm za přítomnosti jamky obsahující pouze konjugát. Delta (rozdíl) jejich optické density musí být vyšší než 0,35 při 490/ nm. [OD (vzorek+konjugát) OD samotný konjugát] 0,35. Ověření pipetování substrátového roztoku: Přítomnost růžového substrátového roztoku v jamkách je možno ověřit pomocí automatického měření při 490 nm: jamka se substrátovým roztokem musí vykazovat optickou densitu vyšší než 0,100 (nižší OD ukazuje špatné napipetování substrátového roztoku) ÚČINNOST TESTU Účinnost testu Monolisa HBs Ag ULTRA byla stanovena testováním nahodilých dárců krve, klinických pacientů s infekcí akutní a chronické hepatitidy nebo s nemocemi nesouvisejícími s infekcí hepatitidou B a na komerčních vzorcích a sérokonverzních panelech. Limit citlivosti byl navíc testován pomocí panelu SFTS a standardu WHO. Specifičnost Specifičnost u celkem 9894 náhodných dárců krve ze 3 různých míst byla 99,36 % (9886/9893). Jeden opakovaně reaktivní vzorek byl konfirmován jako pozitivní na povrchový antigen hepatitidy B. Studie specificity byly prováděny v klinické laboratoři (Hepatologické centrum). Z 200 testovaných klinických vzorků byly zjištěny 2 vzorky opakovaně reaktivní (jeden byl detekován jako podezřelý v prvním vyhodnocení s poměrem 0,97), pozitivní s poměrem 1,87 při opakování, druhý s poměrem 2,29 a 1, pacientů vykazujících různé patologické nálezy nebo status nesouvisící s hepatitidou B (těhotné ženy, revmatoidní faktor, anti-nukleární protilátky, anti-myší IgG nebo jiné virové a bakteriální infekce) bylo testováno testem Monolisa HBs Ag ULTRA. 11 opakovaně reaktivních vzorků bylo kontrolováno dostupnými komerčními EIA testy a neutralizačním testem. 10 z 11 opakovaně reaktivních vzorků v testu Monolisa HBs Ag ULTRA bylo vyhodnoceno jako pozitivní v komerčních testech na HBs Ag. Jeden vzorek vyhodnocený jako neinterpretovatelný pomocí neutralizačního testu byl vyloučen z konečného vyhodnocení. Dva vzorky nebyly neutralizovány, protože jeden byl vzorek s HSV IgG a druhý byl vzorkem myelomovým. Vzorky pozitivní ve všech komerčních EIA testech ukázali konečnou specificitu 99,28 % (276/278). Dalších 9 vzorků pozitivních na HSV IgG a myelom bylo v testu Monolisa HBs Ag ULTRA negativní. Analytická citlivost Limit citlivosti testu byl stanoven jako nižší než 0,060 ng/ml při evaluaci na francouzském panelu antigenu HBsAg SFTS 2001 a nižší než 0,050 IU/ml na WHO standardu. Subtypy adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5 a ayr francouzského panelu SFTS byly pozitivní v testu Monolisa HBs Ag ULTRA s hodnotami poměru více než 5. Citlivost Studie citlivosti, provedené na 428 pozitivních vzorcích sledovaných pacientů s chronickou nebo akutní hepatitidou B, ukázaly 100% citlivost. Byl testován panel 15 rekombinantních proteinů napodobujících hlavní mutace aminokyselinových sekvencí antigenu HBs a všechny byly testem Monolisa HBs Ag ULTRA detekovány Celkem 60 dobře dokumentovaných komerčních sérokonverzních panelů HBV (293 vzorků) bylo též studováno a porovnáno v komerčně dostupných testech EIA. Bio-Rad HBs Ag ULTRA vykazuje ekvivalentní výsledky jako u Monolisa Ag HBs PLUS na 29 panelech. Bio-Rad HBs Ag ULTRA je citlivější o jeden vzorek dříve na 28 panelech, o dva vzorky dříve na 2 panelech a o 5 vzorků dříve na 1 panelu. Reprodukovatelnost testu Reprodukovatelnost testu Monolisa HBs Ag ULTRA byla zjištěna analýzou 4 vzorků: 1 negativního vzorku, 2 vzorků pozitivních na HBs Ag (vzorek 2 a 3) a 1 vzorku vysoce pozitivního na HBs Ag. Opakovatelnost byla určena testováním těchto 4 vzorků 30-krát v jednom běhu, reprodukovatelnost byla určena testováním těchto 4 vzorků dvojmo během 20 dnů ve dvou nezávislých bězích každý den. Výsledky jsou shrnuty v následujících tabulkách: 9

10 Tabulka 1: Opakovatelnost testu n = 30 Vzorek 1 Vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 Průměrná hodnota 0,38 3,17 8,92 14,63 Směrodatná odchylka (SD) 0,04 0,12 0,34 0,91 Korelační koef. CV (%) 10,59 % 3,83 % 3,77 % 6,19 % Tabulka 2: Reprodukovatelnost testu n = 40 Vzorek 1 Vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 Průměrná hodnota 0,48 3,06 8,02 13,85 Směrodatná odchylka (SD) 0,087 0,251 0,751 1,471 Korelační koef. CV (%) 18,1 % 8,2 % 9,36 % 10,63 % 16 - OMEZENÍ TESTU Negativní výsledek testu indikuje, že testovaný vzorek neobsahuje HBs Ag prokazatelný testem Monolisa HBs Ag ULTRA. Poněvadž je však známo, že velmi nízké titry HBs Ag nemusí být prokazatelné, nevylučuje tento výsledek možnost expozice infekci virem hepatitidy B. Kromě toho, někteří autoři popisují v literatuře případy, kdy je virová DNA u virové hepatitidy B (akutní nebo chronické) detekovatelná, zatímco povrchový antigen není přítomen (HBs Ag negativní pacienti). Tyto abnormální profily, třebaže vzácné, jsou důsledkem možných genetických mutací, buď na S a pre-s genové úrovni (zabrání rozpoznání antigenu imunologickými reagenciemi) nebo, a to častěji, na X a pol genové úrovni, což způsobuje slabší replikaci viru. V těchto velice vzácných příkladech je proto doporučeno, pro stanovení konečné diagnózy infekce, provést testování ještě dalších markerů infekce (specifické protilátky proti HBs Ag nebo, je-li to možné, amplifikace virové DNA). Aby se ověřila specificita reakce, měl by se každý pozitivní výsledek (v souladu s kritérii interpretace testu Monolisa HBs Ag ULTRA) konfirmovat metodou neutralizace HBs Ag, jež je případně ve vzorku přítomen (např. test Monolisa HBs Ag Confirmation, katalogové číslo 72408). Kolorimetrická metoda používaná pro kontrolu přítomnosti vzorku, konjugátu a substrátového roztoku neumožňuje ověřit přesnost pipetovaného množství vzorků a konjugátu. Tato metoda prokazuje pouze přítomnost vzorku, konjugátu substrátového roztoku. Počet nesprávných odpovědí při použití této metody je úzce svázán s přesností používaného systému (variační koeficient dávkování a odečítání převyšující 10% výrazně snižuje kvalitu ověření). V případě velmi špatné účinnosti promývání po inkubaci s konjugátem může automatické ověření napipetování substrátového roztoku (při měření OD jamek při 490 nm) bez přítomnosti substrátového roztoku vykázat nesprávné výsledky s hodnotami OD vyššími než 0,100. Toto však nebylo nikdy pozorováno při evaluaci u 939 testovaných vzorků. 10

11 17 - LITERATURA 1. COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag : a study of their specificities for eight different HBs subtypes. Developments in Biological Standardization, 54, COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983) Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D.,(1981)Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981) Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited byszmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983) Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fordetection of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983) Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and theirutilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium onmonoclonal Antibodies : Paris, France. 7. SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983) Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, ). 8. WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981)Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci.,78, 2, M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'ag HBs (1985). Nouvelle RevueFrançaise d'immunohématologie (Springer International), 27, 2, J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985) Nouveaux réactifs de dépistage de l'ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-hbs. Nouvelle RevueFrançaise d'immunohématologie (Springer International), 27, 2,

12 /2010 code: