Kapilárn. rní elektromigrační metody. Zdeněk Glatz

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Kapilárn. rní elektromigrační metody. Zdeněk Glatz"

Transkript

1 Kapilárn rní elektromigrační metody Zdeněk Glatz

2 Historický přehled první elektroforetické separace Smirnow,Hardy regulační frunkce Kohlrausch volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) izoelektrická fokusace Svensson (Rilbe) SDS PAGE Laemmli D-elektroforéza O Farrell isotachoforéza Everaerts, Mikkers

3 Historický přehled CE 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten

4 Hjerten

5 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen

6 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers

7 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs

8 Jorgenson Lukacsová

9 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe

10 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten

11 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckman

12 Beckman

13 Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckmann Projekt lidského genomu

14 Projekt lidského genomu

15 Proč CE?

16 Výhody CE Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry

17 Výhody CE Aplikační diverzita Jednoduchá instrumentace

18 Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC

19 Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorku Rychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů

20 Koncentrační citlivost Nevýhody CE

21 Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE

22 Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE CE je komplementární k HPLC

23 CZE zdroje plynová chromatografie Křemenné kapiláry kapilární chromatografie Detekční systémy zónová elektroforéza Chemie pufrů

24 Aplikovatelnost CE Impurities 24% Small ions 11% Chiral 22% Assay 26% Identity 17% Altria KD and Kersey M, LG-CG Int., 8, April., 1995,

25 Teoretické aspekty CE

26 Mobilita - E F e F f + +

27 Elektrická síla F e F = E Q e E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = z i e [] Frikční síla F f F = v f f v=rychlost částice f(frikční koeficient) = 6π.η.r

28 Ustálený stav E Q = v f v E Q = f v mobilita µ = [m E -2 V -1 s -1 ]

29 Iontová mobilita (limitní zředění, teplota 298 K) KATIONTY µ ANIONTY µ H 3 O + Li + Na + K + Tris + β alanin ethanolamin imidazol OH - F - Cl - NO 3 - SO 4 - k.mléčná k.octová MES

30 Odhad iontové pohyblivosti - Joklova rovnice µ o = a z M r b a,b = empirické konstanty M r = relativní molekulová hmotnost

31 Vliv iontové síly - Onsagerova rovnice µ µ µ 9 = (. 023 zz z ) o o c 1 + I I z = náboj iontu z c = náboj protiiontu

32 Vliv teploty µ T = µ [ ( T T o)] To T o = standardní teplota T = pracovní teplota

33 Efektivní mobilita A 0, A 1, A 2,...A k µ 0, µ 1, µ 2,...µ k = = = = k i i i k i i i A A x c c µ µ µ c A = celková analytická koncentrace látky A x i = molární zlomek iontu i

34 Závislost efektivní mobility na ph pro slabou monovalentní kyselinu pro slabou monovalentní zásadu [ + ] H [ + ] A H µ = µ A K HA + [ + ] H [ + ] BH H µ = µ B K BH +

35 Sekundární jevy při CE Jouleovo teplo Elektroosmóza Difuze

36 Jouleovo teplo P E i 2 i = = S S κ 2 P = výkon [W.m -3 ] S = průřez [m 2 ] κ = vodivost [Ω -1.m -1 ] i = elektrický proud [A]

37 Jouleovo teplo

38 Elektroosmotický tok

39 Elektroosmotický tok ξ πηµ = 4 eo ε ξ = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy η = viskozita ε = dielektrická konstanta µ eo = elektroosmotická mobilita v eo = ε 4πη E ξ

40 Původ elektroosmotického toku Anode EOF Cathode

41 Původ elektroosmotického toku

42 Elektroosmotický tok Laminární tok

43 Elektroosmotický tok v různých kapilárách

44 Difuze c = c 0 e ( x 2 σ 2 ) σ = 2Dt σ 2 = rozptyl D = difuzní koeficient

45 Mody kapilární elektroforézy

46 Módy CE

47 Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře

48 Výsledná mobilita částic při CZE

49 Metody ovlivňování EOF v CZE

50 Běžně používané elektrolyty Elektrolyt pka s Fosfát 2.12 pka pka pka3 Citrát 3.06 pka pka2 Acetát 4.75 MES 6.15 PIPES 6.80 ACES 6.90 MOPSO 6.90 MOPS 7.20 HEPES 7.55 TRIS 8.30 Borát 9.24 CHES 9.50 CAPS 10.40

51 Separace při nízkém ph Detector response Time

52 Separace při nízkém ph Separační podmínky : 30 C, dávkování 5 sec. při 0.5psi, +13kV, 25mM NaH 2 PO 4, upraven na ph 2.5 koncentrovanou H 3 PO 4, 200nm, 37cm x 75µm kapilára

53 Sodium phosphate ph 2.5, normalní kapilára +30kV Sodium phosphate ph 2.5, pokrytá kapilára +30kV

54 Separace anorganický anionů s přímou UV detekcí

55 Separace při vysokém ph 2 4 UV response Neutrals sec

56 Separace při vysokém ph Separace kyselých léčiv separovaných v 15mM boratu s UV detekcí při 200 nm

57 Změna EOF přídavkem kationtového detergentu

58 Separace anorganických aniontů

59 Separace anorganických aniontů 2.25 pyromellitic acid, 6.5 mm NaOH, 0.75 mm hexamethonium hydroxide, 1.6 mm triethanol- amine, ph 7Negative polarity 465 V/cm, 9 µa 56/64.5 cm id=50 µm inj: 200 mbars Temp=25 C Indirect Detection Sig: 350,60 nm Ref: 245,10 nm

60 Separace aniontů pomocí CZE

61 Borátová komplexace

62 CZE v nevodném prostředí µ eo = εξ wall / η Nejlepšé rozpouštědla mají vysoké hodnoy ε/η SOLVENT η ε ε/η UV Cut Off voda NMF ~ 260 DMF ~ 260 DMSO ~ 260 Acetonitril Methanol Ethanol

63 Selectivita - Solvatace -ph* - Rozpouštědla v různých poměrech Účinnost - nízký proud díky nízkým dielectrickým konstantám - Rychlé separace - >350,000 Vhodné pro soluty nerozpustné ve vodě (náhražka MEKC) CE-MS kompatibilní

64 A = Vodná CE B = Nevodná CE S.Hansen et al trends in analytical chem.,15, 175, 1996

65 1mM ph* 9.3 in 50/50 MeOH/MeCN UV@ 200nm Altria KD and Bryant SM, Chromatographia,

66 Non aqueous CE of inorganic anions 10mM KH Phthalate, 1mM TMAH methanol:dmf 7:3 Indirect 254nm Cl content in Azelastine HCL 8.59% theory 8.47 CE Suzuki et al J.Chromatogr.A 829 (1998(

67 Princip MEKC Micela a střed rozpustná v obou b silně hydrofilní nerozpustná v micele c silně hydrofóbní nerozpustná ve vodné fázi

68 Micelární elektrokinetická chromatografie

69 Kapacitní faktor a rozlišní v MEKC + + α α = 1 mc 0 mc s k t t 1 t t 1 1 k k 1 4 N R 0 r 0 r t t 1 1 t t k = α = selektivita

70 Separační okno v MEKC pro neutrální látky

71 Factory ovlivňující selektivitu Typ detergenu Různé čelní skupiny mají silný vliv (iontové interakce) Žlučové kyseliny Kationtové (otočení EOF) ph Ovlivňování ionizace Pufr Efekt aditiv je větší než u CZE Organické modifikátory Teplota Ovlivňuje chování micel 2ºC může značně ovlivnit separaci

72 Používané detergenty Typ Detergent CMC (mm) Agregační číslo aniontový SDS kationtový CTAB DTAB neiontový Oktylglukosid Dodecylmaltosid Triton X zwitterionty CHAPS CHAPSO žlučové kyseliny cholová k. deoxycholová taurocholová

73 OH COONa Na cholát OH OH Zvyšuje rozpustnost solutů více než SDS K dispozici různé deriváty Možno použít spolu s methanolem, propan-2-olem mM koncentrace

74 Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC

75 Analysis of organic acids using low ph MECC, SDS concentration = 60mM Key to figure: AP = 4-Acetamido-phenol, NA = β-naphthoxyacetic acid (sodium salt), S = Saccharin (sodium salt hydrate), BA = Benzoic acid (sodium salt), B = Barbital (sodium salt), SA = Salicylic acid.

76 MEKC derivativátů anilínu (a) SDS nebo (b) sodium laurylsulfoacetate surfactanty. Buffer: 0.02-M borate phosphate buffer (ph 7.0). Detection wavelength: 240 nm. Applied voltage: 20 kv. 1, aniline; 2, o-aniline; 3, m-aniline; 4, p-aniline; 5, o-toluidine; 6, m-toluidine; 7, p-toluidine; 8, o-nitroaniline; 9, m-nitroaniline; 10, p-nitroaniline; 11, o-chloroaniline; 12, m-chloro aniline; 13, p-chloroaniline; 14, acridine orange-10-dodecylbromide.

77 Optimalizace SDS MEKC Starting conditions - 15mM borate with 50mM SDS Small k Large k INCREASE SDS DECREASE SDS Insufficient resolution? Insufficient resolution? Lower ph, Lower voltage, Ion-pair reagent Organic solvents, Temperature, Electrolyte Organic solvents, Temperature, Electrolyte Ion-pair reagent, Lower ph, Lower voltage ALTERNATIVES Cationic surfactants Bile salts MIxed micelles Low ph

78 Mikroemulsní elektrokinetická chromatografie

79

80 Valko 5 (7,1) MEEKC retentce vs LogP logp vs migration time Retention time Phenacetine Response 9.83 Butyrophenone Valerophenone Hexanophenone Heptanophenone Acetophenone Acetanilide 3 Propiophenone 2.5 logp migration time Altria KD, J.Chromatogr.A 892 (2000)

81 Separace testovací směsi MEEKC Paracetamol Methyl paraben 4-hydroxyacetophenone Ethyl paraben Propyl paraben Naphthalene

82 Separace směsi vitaminů Vutamíny rozpustné ve vodě a tucích - nikotinamid - riboflavin - askorbová kyselina - thiamin - vitamin A - vitamin D

83 Chiralita chirální separace?

84 Thalidomid

85 Thalidomid

86

87 Chirální separace

88 Srovnání chirálních separací pomocí CZE a HPLC u hexabarbitalu CZE Rychlý vývoj metody Vysoké rozlišení Nízká cena reagencií Rychlost analýzy Analytické provedení HPLC Zdlouhavý vývoj metody Dlouhé doby analýzy Vysoká cena kolon Preparativní provedení

89 Cyklodextriny α CD - 6 glukosových zbytků β CD - 7 glukosových zbytků γ CD - 8 glukosových zbytků

90 Cyklodextriny Neaturalní α β γ Chemicky derivatispvané formy jako např. methyl, hydroxypropyl Nabité cyclodextriny, amino-, sulfo-, karboxy-

91 Sulfatovaný cyklodextrin

92 Cyklodextriny Aplikace : nabité CD neutrální enantiomery neutrální CD nabité enantiomery

93 Separace terbutaline s různými cyclodextriny

94 Crown ethery O O H O H N + H O O R Vhodné pro primarní aminy jako např. aminokyseliny O

95 Dextranové polymery

96 Vancomycin Použití v chiralních CE separacích Vysoká UV absorbance

97 Chiralní CZE při nízkém ph A d + A d + A d + A l + A d + A d + A l + A l + A l + A l + A d + A d + A l + A d + A l +

98 Triethanolamine-fosfát BGE (ph 2.5) s α-cyclodextrinem. Detekce při 200nm

99 Optimalizace chiralní separace při nízkém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD ph 2.5 No resolution? Try different CD No resolution? Try crown ether Primary amine? SDS MECC + CD or bile salt

100 Chirální CZE při vysokém ph A l - A l - A d - A d - A d - A d - A l - A d - A l - A l - A l - A d - EOF FLOW

101 Optimalizace chiralní separace při vysokém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD borax No resolution? Try different CD No resolution? Try oligosaccharide SDS MECC + CD or bile salt

102 MEKC pro chiralní separaci A l A - l A l A d EOF A d A d - A d A l -

103 Optimalizaci MEKC pro chiralní separaci Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD, 50mM SDS, borax No resolution? Try different CD No resolution? Try bile salts Try mixed micelles

104 30 mm SDS, 100mM borate, 10mM HP-β-CD LOD of <0.06% (detection at 200nm) Noroski et al, J.Pharm.Biomed.Anal., 13, 1995, 45-52

105 Kapilární gelová elektroforéza

106 Polymerní matrice pro CGE

107 CGE fragmentů dsdna

108 CGE oligonukleotidů

109 Projekt lidského genomu sekvenace DNA

110 CGE bílkovin v přítomnosti SDS

111 Kapilární izoelektrická fokusace A + A + A A - A - A + A - A + A A - Low ph pi value High ph

112 Kapilární izoelektrická fokusace

113 CIEF EOF = 0 pokryté kapiláry Postup : 1. Vlastní fokusace - vzorek nanesen v celé kapiláře 2. Mobilizace - analyty musí projít detekční celou moblilizace elektroforetická hydrodynamická bez mobilizace EOF 0 nepokrytá kapilára, vzorek nanášen pouze v úzké zóně na začátku kapiláry

114 CIEF bílkovin pomocí tlakové mobilizace

115 Kalibrační křivka IEF

116 Kapilární izotachoforéza

117 ITP nukleotidů

118 Kapilární elektrochromatografie

119 Srovnání toku u LC a CEC LC CEC

120 CEC separace neutrálních látek

121 Instrumentace CE

122 Výrobci Agilent and Beckman Kč

123 Beckman MDQ

124 Agilent HPCE 3D

125 Bioanalyser Agilent 2100

126 Schéma zařízení pro CZE

127 Napájecí zdroj stabilizovaný ± 30 kv 300 µa konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy

128 Kapilára křemenná µm i.d µm o.d. délka až 100 cm délka polyimidové vnější pokrytí

129 Kapilára Id efektivní délka L celková délka Is short end injection Detector position l d L l s

130 Délka kapiláry

131 Modifikace kapiláry kovalentní Si - O - Si - R ph 4-7 Si -C-R ph 2-10 adsorbované dynamické celulosa, PEG, PVA, PEI detergenty hydrofilní polymery kvarterní aminy extrémy ph vysoká I

132 Dávkování

133 Hydrodynamické

134 Elektrokinetické

135 Elektromigrační disperze

136 Analýza kationů nepřímou detekcí

137 Detekce

138 Spektrofotometrická detekce

139 DAD detekční systém

140 Lineární detekční rozsah

141 Zvýšení citlivosti detekce

142 Zvýšení citlivosti detekce Agilent Flow cell

143 Rozlišení zón

144 Multireflekční cela

145 Fluorescenční detekce

146 Nepřímá detekce FS 1. Empty capillary 2. Filled capillary FS 0 0 FS 3. Separation 0

147 Nepřímá detekce

148 Separace anorganických aniontů

149 Separace organických aniontů Indirect UV detection at 254nm 0 mins 5 mins 27cm x 75micron, 3.0 sec injection, 0.5mM TTAB/5.0mM phthalate/50mm MES ph5.2, 30C, -3kV

150 CZE-MS

151 Schéma CZE-ESI-MS

152 CZE-ESI-MS analýza peptidů

153 Zvýšení citlivosti detekce

154 Efekt složení vzorku na separaci

155 Stacking

156 Transient ITP

157 Transient ITP

158 Transient ITP

159 Zakoncentrování pomocí IEF

160 Speciální aplikace

161 Multiplex CE instrument

162 1997 µce

163 Příprava mikrochipů UV Light Mask PDMS PDMS Photoresist Channel Silicon Mold wafer

164 Požívané materiály Sklo První použitý materiál Dobře známé vlastnosti Složitá konstrukce Polymery levnější Méněkřehké Více možností chemismu Nepříliš dobře charakterizované

165 Klasická CZE Absorbance (mau) Absorbance (mau) A B Cr Cr Cn Cn EDTA UA Time (min) UA Time (min)?

166 Microchip CZE 1.2 uric acid 1.0 Current (na) unknown Time (s)

167 Bioanalyser Agilent 2100

168 LIF - imunostanovení

169 LIF - imunostanovení

170 Využití CE pro analýzu biologicky aktivních látek v léčivých rostlinách a tělních tekutinách Hořčiny zeměžluč, hořec MEKC Glatz, Z. et al. J.Liquid Chromatogr. Rel. Technol., 2000, 23, Lignany schizandra činská CEC,MEKC Kvasničková, L. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s Štěrbová, H. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 253. Flavonoidy artyčok MEKC Ševčíková, P. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 249.

171 Využití CE v klinické diagnostice Thiokyanát sliny, moč CZE Glatz, Z. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s Cystein moč MEKC Ševčíková, P. et al. J. Sep. Sci., 2003, 26, s Homocystein plasma MEKC Ševčíková, P. et al. J. Chromatogr. A, 2003, 990, s GSH erythrocyty MEKC Mašlaňová H., et. al. J. Chromatogr. A, 2000, 990, s. 197.

172 Využití CE pro separaci microcystinů CEC separace extraktu sinic Zeisbergerová, M. et al. J. Chromatogr. B 2006, 841, 140.

173 Využití CE pro separaci bakterií Dávkovaná kultura 700 mau DAD1 A, Sig=214,10 Ref=off (BACTERIA\05XII004.D) CZE separace bakterie Lactobacillus acidophilus SEMIPREPARACE Separovaná frakce min Šnajdrová, L. et al. Chemické Listy, 2002, 96, 6s. 432.

174 Využití CE při studiu enzymů

175 Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary On-capillary

176 Výhody CE Kapilára jako reakční prostor

177 Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary provedení : - kapilára je používána pouze pro separaci a detekci - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a separací

178 Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357.

179 End point stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, , 1229.

180 Studium enzymových reakcí pomocí CE On-capillary provedení : - kapilára je navíc využita i jako reakční prostředí - stanovení je automatizováno dávkování, smísení, inkubace, separace, detekce CE

181 Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře

182 EMMA - kontinuální mód A Substrate filled capillary Detection window E P -

183 EMMA zonální mód B Detection window S E P -

184 EMMA zonální mód Výhody : Menší spotřeba vzorků enzym, substráty, inhibitory Vyhodnocování

185 EMMA vyhodnocení Glu-6P + NAD + Kontinuální mód G6PDH 6P-Glu + NADH Zonální mód B.J. Harmon et al.,j. Chromatogr. A 726, 193 (1996). E.S.Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999).

186 EMMA využití Enzymové systémy Aktivita enzymů Koncentrace substrátů a inhibitorů Michaelisovy a inhibiční konstanty Neenzymové systémy GSH, HCys, Cys, DTT Ca(II) Gentamycin a kanamycin Kreatin Cr(VI) a Co(II) S. NOVÁKOVÁ, S. VAN DYCK, A. VAN SCHEPDAEL, J. HOOGMARTENS & Z. GLATZ* REVIEW: Electrophoretically Mediated Microanalysis J. Chromatogr. A 1032, 173 (2004). S. VAN DYCK, E. KAALE, S. NOVÁKOVÁ, Z. GLATZ, A. VAN SCHEPDAEL* & J. HOOGMARTENS REVIEW: Advances in Capillary Electrophoretically Mediated Microanalysis. Electrophoresis 24, 3868 (2003).

187 Studium enzymů pomocí CE? (pre-capillary versus on-capillary)

188 Rhodanasa (EC ) CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO 3 2- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí

189 rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Volba separačních podmínek, CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO mm β-alanin - HCl, ph 3.5 nízký EOF CN - = HCN

190 rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity ma U PEAK AREA S 2 O TIME [min] 15 min 12 min 9 min 6 min 3 min 0 min SCN min

191 rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Charakterizace enzymu z A.ferrooxidans EFFECT OF ph ON RHODANESE REACTION EFFECT OF TEMPERATURE ON RHODANESE REACTION 100 A - MES BUFFER B - HEPES BUFFER C - TRIS BUFFER D - BORATE BUFFER C RELATIVE ACTIVITY [%] B D REL.ACTIVITY [%] A ,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 ph TEMPERATURE [ o C] Stanovení pi 6.5 (chromatofokusace) Stanocení MW (gelová permeační chromatografie) Bouchal, P. et al. Folia Microbiol, 2001, 46, 385.

192 rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S 2 O 3 2-, SCN - ) probíhá nejlépe při nízkém ph základního elektrolytu eliminace EOF ph optimum rhodanasy: 8.5 Kombinace metody EMMA s "partial filling technique"

193 rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry Parametr Základní elektrolyt 100 mm β-alanin HCl (ph 3.5) Přesnost migračních časů (n=10) Přesnost ploch píků (n=10) Hodnota 0,23 % Dávkování 3,88 % mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s 2. Rhodanasa ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s 3. Substráty ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s - 25 mm HEPES (ph 8,5) Substráty v 25 mm HEPES (ph 8,5) Rhodanasa v 25 mm 25 mm HEPES HEPES (ph 8,5) (ph 8,5) + nástř Separační napětí Detekce

194 rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km

195 rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km 0,012 0,8 1/ plocha píku (mau*s) 0,01 0,008 0,006 0,004 0, ,75-0,5-0,25-0, ,25 0,5 0,75 1 1,25-0,004-0,006 1/ [Na 2 S 2 O 3 ] (l/mmol) úsek na ose x 1/K M (CN - ) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 1/K M (S 2 O 3 2- ) y = 0,5839x + 0,0768 0,1 0-0,6-0,4-0,2-0,1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2-0,2 1 mm KCN 2 mm KCN 5 mm KCN 10 mm KCN 1/ [KCN] (l/mmol) K M (CN - ) = 7.60 mm K M (S 2 O 3 2- ) = mm S 2 O 3 2- E SCN - E S 2 O 3 2- SO 3 2- ES CN -

196 Sulfotransferasa (EC ) cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) membránově vázaná - sulfatace glykoproteinů

197 Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Reakce O O S O O - O P O - O CH 2 O N N NH 2 N N + OH SULT1A1 HO O - P O O CH 2 O N N NH 2 N N nm O - O S O O HO P O - O O OH NO 2 HO O P - O O OH NO 2 PAPS 4-Nitrophenol PAP 4-Nitrophenyl sulfate Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) ~1 mg 100 Velmi silný inhibitor reakce K I = 0.4 µm

198 sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Krok 1. Dávkování PAPS Zóna Tlak p i (psi) Čas (s) Napětí (kv) PAPS / 2. Předseparace od PAPS / / Dávkování S 4. Dávkování E Dávkování a inkubace 4-NP / SULT1A / 5. Smísen sení a enzymová reakce / / Inkubace / / Separace / / PAPS P + nástřik detekce

199 sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol 2.5 µm pnp 1.5 µm pnp 1 µm pnp 0.5 µm pnp 0.3 µm pnp 0.2 µm pnp 0.1 µm pnp K M = 0.8 µm

APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Princip: migrace elektricky nabitých částic v elektrickém poli Druhy iontů: +, -, obojaký (zwitterion), vícenásobný Typy migrace: a) přímá migrují ionty analytů b) nepřímá

Více

Katedra analytické chemie PřF UP Olomouc

Katedra analytické chemie PřF UP Olomouc Nanomateriály a kapilární elektroforéza Jan Petr Katedra analytické chemie PřF UP Olomouc Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza Migrace iontů Rychlost pohybu iontu: v = µe kde µ je elektroforetická

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE

PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Návod do cvičení PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE LABORATORNÍ CVIČENÍ Mgr. Aleš Mádr 2012 Vzniklo díky finanční podpoře Ministerstva

Více

Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS

Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS Úkol: Stanovte množství chininu v nealkoholickém nápoji (tonik) pomocí kapilární zónové elektroforézy ve spojení s hmotnostní spektrometrií Teoretická

Více

Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol

Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol Úkol: Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol pomocí CE-LIF Proveďte separaci a následné stanovení účinných látek (paracetamol, propyfenazon, kofein) v přípravku Valetol pomocí

Více

Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E

Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E Kapilární elektroforéza, CE I Capillary electrophoresis Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapilární elektroforéza Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance

Více

Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií

Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií Úkol: Proveďte extrakci organofosforových pesticidů z reálných vzorků vody a půdy. Dále proveďte jejich separaci

Více

Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou

Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou Úkol: Pomocí kapilární elektroforézy v nevodném prostředí semikvantitativně stanovte vybrané aniontové tenzidy v čisticím prostředku.

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém

Více

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání

Více

Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí

Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí Teoretická část Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí Mezi biochemicky významné flaviny patří kofaktory flavinmononukleotid (FMN) a flavinadenindinukleotid

Více

Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy.

Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy. 1. Analýza sacharidů v medu pomocí kapilární elektroforézy Med je přírodní produkt, který vyrábí včely z nektaru různých rostlin. Jedná se o vodný přesycený roztok sacharidů, který obsahuje také komplexní

Více

Chirální separace v CE

Chirální separace v CE Chirální separace v CE Chiralitu vykazují jak organické sloučeniny tak anorganické sloučeniny. Projevuje se existencí dvou konstitučně identických molekul (enantiomerů), které se liší pouze ve vzájemném

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Teorie HPLC Praktické

Více

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6

Více

Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou

Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou Úkol Stanovte obsah cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce pomocí kapilární elektroforézy. Teoretická část Cholesterol je steroidní

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

4. Elektromigrační separační metody

4. Elektromigrační separační metody 4. Elektromigrační separační metody Elektromigrační separační metody využívají dvou elektrokinetických jevů elektroforézy a elektroosmózy. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy

Více

Afinitní kapilární elektroforéza

Afinitní kapilární elektroforéza Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Afinitní kapilární elektroforéza Věra Pacáková a Tereza Vařilová PřF UK Praha Obsah 1. Úvod

Více

Aplikace elektromigračních technik

Aplikace elektromigračních technik Aplikace elektromigračních technik Capillary electrophoresis D.L.Barker High Performance Capillary electrophoresis M.G. Khaledi Analysis and detection by capillary electrophoresis M.L.Marina (ed.) Electrophoresis

Více

Látky obsahují aminoskupinu

Látky obsahují aminoskupinu Látky obsahují aminoskupinu pro aminy a aminokyseliny se běžně používají derivatizace (viz kapitola o derivatizaci), peptidy lze detekovat přímo při krátkých UV vlnových délkách (amidická vazba 200 nm),

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. Separační techniky Rovnovážné techniky Nerovnovážné

Více

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR SEPARACE PROTEINŮ Preparativní x analytická /měřítko, účel/ Zvláštnosti dané povahou materiálu

Více

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc.

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. IONOSEP v analýze vody Kapilární isotachoforesa nebo její kombinace se zónovou elektroforesou je svými vlastnostmi velmi

Více

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC Karel Lemr Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého tř. Svobody 8, 771 46 Olomouc lemr@prfnw.upol.cz Zentiva, Praha,

Více

Aplikace elektromigračních technik Laboratorní úlohy

Aplikace elektromigračních technik Laboratorní úlohy Laboratorní úlohy Výukový materiál vznikl za finanční podpory Fondu rozvoje vysokých škol v rámci řešení projektu č. 1377/2013 Vytvoření demonstračních úloh sloužících k inovaci předmětu Aplikace elektromigračních

Více

Analytické nástroje pro analýzu iontů v prostředí. Analytical tools for environmental metal ions determination

Analytické nástroje pro analýzu iontů v prostředí. Analytical tools for environmental metal ions determination Název: Analytické nástroje pro analýzu iontů v prostředí Analytical tools for environmental metal ions determination Školitel: Datum: Marie Konečná 6.6.2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název

Více

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA KPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZ Zadání úlohy Metodou kapilární zónové elektroforézy stanovte disociační konstantu p-nitrofenolu. Teoretický úvod Kapilární zónová elektroforéza (CZE capillary zone electrophoresis)

Více

THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS

THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS VYUŽITÍ ISOELEKTRICKÉ FOKUSACE BEZ NOSNÝCH AMFOLYTŮ (CAF IEF) PRO ANALÝZU STRESOVÝCH PROTEINŮ Procházková

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 16 Iontová chromatografie Iontová chromatografie je speciální technika vyvinutá pro separaci anorganických iontů a organických

Více

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie VYUŽITÍ MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÉ CHROMATOGRAFIE V ANALÝZE LÉČIV RIGORÓZNÍ PRÁCE HRADEC KRÁLOVÉ, 2009 Mgr. MARKÉTA

Více

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA: SIMULACE A EXPERIMENT

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA: SIMULACE A EXPERIMENT KPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZ: SIMULCE EXPERIMENT ZDÁNÍ ÚLOHY Navrhněte vhodný separační systém pro sadu analytů pomocí programu PeakMaster 5.1. Metodou kapilární zónové elektroforézy stanovte disociační

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektrický proud a přenos hmoty v elektrolytech Metody chemického výzkumu Elektrolyty = roztoky, které vedou elektrický proud = roztoky solí, kyselin a zásad Elektrolytická disociace = v látkách dochází

Více

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie Klinická a farmaceutická analýza Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Spojení separačních technik s hmotnostní spektrometrem Separační

Více

2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy

2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy 2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy Med je vodný přesycený roztok sacharidů, který se skládá převážně z fruktózy, glukózy a sacharózy. Kromě toho med obsahuje některé

Více

1/10/2014. Kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí. Historie

1/10/2014. Kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí. Historie Spřažené techniky (1. část) Historie Kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí K. Záruba kapilární elektroforéza + Jorgenson, Lukacs, 1981 (Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D., Anal. Chem. 1981, 53, 1298

Více

STUDIUM ENZYMOVÝCH REAKCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU V ON-LINE USPOŘÁDÁNÍ

STUDIUM ENZYMOVÝCH REAKCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU V ON-LINE USPOŘÁDÁNÍ STUDIUM ENZYMOVÝCH REAKCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU V ON-LINE USPOŘÁDÁNÍ ROMAN ŘEMÍNEK, MARTA ZEISBERGEROVÁ a ZDENĚK GLATZ Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta a Středoevropský technologický institut,

Více

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody 3. ročník Klinická biologie a chemie Princip elektroforézy I. Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ve stejnosměrném

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE A MOŽNOSTI JEJÍHO SPOJENÍ SE SEPARAČNÍMI METODAMI SEPARACE chromatografie CGC, GC x GC HPLC, UPLC, UHPLC, CHIP-LC elektromigrační m. CZE, CITP INTERFACE SPOJENÍ x ROZHRANÍ GC vyhřívaná

Více

Aplikační rozsah chromatografie

Aplikační rozsah chromatografie Chromatografické metody II. Aplikační rozsah chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) LPC Střednětlaká (4 Mpa) FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) HPLC Ultravysokotlaká

Více

Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Klinická a toxikologická analýza Bc. Tereza Kadlecová Kapilární elektroforéza s duální optickou a bezkontaktní vodivostní detekcí Capillary electrophoresis

Více

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Obsah 1. Úvod 1.1. Miniaturizace v analytické chemii 1.2. Přednosti a nevýhody kapilárních

Více

Ionexová chromatografie

Ionexová chromatografie Ionexová chromatografie Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli ph! Princip ionexové chromatografie

Více

Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.

Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6. Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY (přednášky pro magisterské studium) 1. ÚVOD...3 1.1. Význam kapilární elektroforézy...3 1.2. Historický vývoj...5 1.3. Různá prostředí pro elektroforézu...7

Více

Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny)

Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) 1. Přímé měření: analyzovaná kapalina většinou odvětvena + vhodný detektor 2. Kapalinová chromatografie (HPLC) Stanovení po předchozí separaci 3.

Více

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,

Více

volba separace pro následnou MS kvantifikaci proteinů Jan Havliš Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta, Brno Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční genomiky a proteomiky :: Centrální laboratoř

Více

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip Plynová chromatografie (GC) - princip Plynová chromatografie (Gas chromatography, zkratka GC) je typ separační metody, kdy se od sebe oddělují složky obsažené ve vzorku a které mohou být převedeny do plynné

Více

Metody separace. přírodních látek

Metody separace. přírodních látek Metody separace přírodních látek (5) Chromatografie; základní definice a klasifikace ruzných metod; kapalinová chromatografie, plynová chromatografie, přístrojová technika. Chromatografie «F(+)d» 1897

Více

Stanovení kreatininu v mase pomocí kapilární izotachoforézy

Stanovení kreatininu v mase pomocí kapilární izotachoforézy Stanovení kreatininu v mase pomocí kapilární izotachoforézy Úkol: Pomocí kapilární izotachoforézy určete, zda je v předloženém reálném vzorku (vařená šunka) obsažen kreatinin. 1. Teoretická část 1.1.Kreatinin

Více

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli)

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Přednáška 3 Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Studijní opora pro studenty registrované v akademickém roce 2013/2014 na předmět:

Více

Obr. 1. Struktura glukosaminu.

Obr. 1. Struktura glukosaminu. 3. Stanovení glukosaminu ve výživových doplňcích pomocí kapilární elektroforézy Glukosamin (2-amino-2-deoxyglukózamonosacharid je široce distribuován ve tkáních lidského organismu jako složka je klíčovou

Více

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE VYUŢITÍ ELEKTROFORETICKÝCH METOD V ANALÝZE LÁTEK PŘÍRODNÍHO PŮVODU HRADEC KRÁLOVÉ 2007 JAN HONEGR

Více

PEPTIDY A BÍLKOVINY. Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin

PEPTIDY A BÍLKOVINY. Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin PEPTIDY A BÍLKOVINY Obsah kapitoly Separace peptidů a bílkovin : kapalinová chromatografie Možnosti detekce peptidů a bílkovin Separace peptidů a bílkovin: elektromigrační metody Hmotnostní spektrometrie

Více

Mobilní fáze. HPLC mobilní fáze 1

Mobilní fáze. HPLC mobilní fáze 1 Mobilní fáze 1 VLIV CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK NA ELUČNÍ CHARAKTERISTIKY SEPAROVANÝCH LÁTEK - SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE Složení mobilní fáze má vliv na eluční charakteristiky : účinnost kolony; kapacitní poměr;

Více

Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Imunoelektroforéza Obvykle dvourozměrná elektroforéza na agarózových gelech V prvním rozměru

Více

Trendy v moderní HPLC

Trendy v moderní HPLC Trendy v moderní HPLC Josef Cvačka, 5.1.2011 CHROMATOGRAFIE NA ČIPECH Miniaturizace separačních systémů Mikrofluidní čipy Mikrofabrikace Chromatografické mikrofluidní čipy s MS detekcí Praktické využití

Více

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra analytické chemie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra analytické chemie UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie OPTIMALIZACE STANOVENÍ SEPTONEXU VE FARMACEUTICKÝCH PŘÍPRAVCÍCH METODOU KAPILÁRNÍ ZÓNOVÉ ELEKTROFORÉZY S VYUŽITÍM

Více

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI UNIVERZITA PALACKÉH V LMUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie SEPARACE PTICKÝCH ISMERŮ KAPILÁRNÍ ELEKTRFRÉZU CHIRÁLNÍ SEPARACE AMBRISENTANU BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Autor práce: Studijní obor: Petra

Více

Separační metody používané v proteomice

Separační metody používané v proteomice Separační metody používané v proteomice Proteome = komplexní směsi proteinů Lidská buňka 10,000 typů proteinů Rozdíl v koncentraci 10 6,plasma10 9 Nutnost separace, frakcionace Na úrovni Proteinů Obtížně

Více

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie STANOVENÍ PERORÁLNÍCH ANTIDIABETIK KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Autor práce: Studijní obor: Petr Cimbál Chemie

Více

kapalinové chromatografie selhalo na problému stanovení silně polárních látek pomocí HPLC, coţ 6-sulfatoxymelatonin beze sporu je.

kapalinové chromatografie selhalo na problému stanovení silně polárních látek pomocí HPLC, coţ 6-sulfatoxymelatonin beze sporu je. 1. Úvod Často, kdyţ pod starostmi kloní se uţ šíje, častokrát v bitvy vřavě zazní hlas, ozve se nevyslovitelná touha objevit ţivot skrytý kdesi v nás: ţíznivá touha napřít všechnu sílu a znovu hledat směr,

Více

Separace chirálních látek. Zuzana Bosáková

Separace chirálních látek. Zuzana Bosáková Separace chirálních látek Zuzana Bosáková Enantiomery opticky aktivní R-enantiomer S-enantiomer nechirální prostředí chirální prostředí živé organismy - chirální environmentální prostředí (proteiny L-aminokyselin)

Více

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Autorský kolektiv ústavu 402 VŠCHT Praha Část 1, Úvod Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Více

3 Acidobazické reakce

3 Acidobazické reakce 3 Acidobazické reakce Brønstedova teorie 1. Uveďte explicitní definice podle Brønstedovy teorie. Kyselina je... Báze je... Konjugovaný pár je... 2. Doplňte tabulku a pojmenujte všechny sloučeniny. Kyselina

Více

3 Acidobazické reakce

3 Acidobazické reakce 3 Acidobazické reakce Brønstedova teorie 1. Uveďte explicitní definice podle Brønstedovy teorie. Kyselina je... Báze je... Konjugovaný pár je... 2. Doplňte tabulku a pojmenujte všechny sloučeniny. Kyselina

Více

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro, č. dveří 140 Acidobazické rovnováhy

Více

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a Úvod do separačních metod pro analýzu léčiv Příprava předmětu byla podpořena projektem OPP č. CZ..7/3..00/3353 Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních

Více

STANOVENÍ MYORELAXANCIÍ ROKURONIA,

STANOVENÍ MYORELAXANCIÍ ROKURONIA, UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE STANOVENÍ MYORELAXANCIÍ ROKURONIA, VEKURONIA A PANKURONIA METODOU KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY S BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ

Více

Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii

Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii Kvantitativní analýza: F = k φ Φ o Vysoká citlivost metody: 2.3 c l ε použití laserů odezva na relativně malé změny v okolí

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MASS SPECTROMETRY (MS) Alternativní názvy (spojení s GC, LC, CZE, ITP): Hmotnostně spektrometrický (selektivní) detektor Mass spectrometric (selective) detector (MSD) Spektrometrie

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové

Více

[ ] d[ Y] rychlost REAKČNÍ KINETIKA X Y

[ ] d[ Y] rychlost REAKČNÍ KINETIKA X Y REAKČNÍ KINETIKA Faktory ovlivňující rychlost chemických reakcí Chemická povaha reaktantů - reaktivita Fyzikální stav reaktantů homogenní vs. heterogenní reakce Teplota 10 C zvýšení rychlosti 2x 3x zýšení

Více

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) Dělení látek mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílů v těkavosti a struktuře (separované látky vykazují rozdílnou chromatografickou afinitu) Metoda vhodná pro látky:

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE. 2012 Aneta Kyralová

UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE. 2012 Aneta Kyralová UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2012 Aneta Kyralová Univerzita Pardubice Fakulta chemicko-technologická Analýza fosforylovaných peptidů a proteinů s využitím kapilární

Více

Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu

Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu Š.Dušková, I.Šperlingová, L. Dabrowská, M. Tvrdíková, M. Šubrtová duskova@szu.cz sperling@szu.cz Oddělení pro hodnocení expozice chemickým látkám

Více

Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární izotachoforézy

Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární izotachoforézy Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární izotachoforézy Úkol: Pomocí kapilární izotachoforézy stanovte, zda je v reálném vzorku (kukuřičné lupínky Corn flakes) obsažena kyselina

Více

Sekunda (2 hodiny týdně) Chemické látky a jejich vlastnosti Směsi a jejich dělení Voda, vzduch

Sekunda (2 hodiny týdně) Chemické látky a jejich vlastnosti Směsi a jejich dělení Voda, vzduch Sekunda (2 hodiny týdně) Chemické látky a jejich vlastnosti Směsi a jejich dělení Voda, vzduch Atom, složení a struktura Chemické prvky-názvosloví, slučivost Chemické sloučeniny, molekuly Chemická vazba

Více

VÝUKOVÝ MODUL MEMBRÁNOVÝCH PROCESŮ TÉMATA PŘEDNÁŠEK

VÝUKOVÝ MODUL MEMBRÁNOVÝCH PROCESŮ TÉMATA PŘEDNÁŠEK VÝUKOVÝ MODUL MEMBRÁNOVÝCH PROCESŮ TÉMATA PŘEDNÁŠEK TRANSPORT LÁTEK MEMBRÁNAMI Transport látek porézními membránami - Plouživý tok nestlačitelných tekutin vrstvou částic - Plouživý tok stlačitelných tekutin

Více

NÁPLŇOVÉ KOLONY PRO GC

NÁPLŇOVÉ KOLONY PRO GC NÁPLŇOVÉ KOLONY PRO GC DÉLKA: 0,6-10 m VNITŘNÍ PRŮMĚR: 2,0-5,0 mm MATERIÁL: sklo, ocel, měď, nikl STACIONÁRNÍ FÁZE: h min = A + B / u + C u a) ADSORBENTY b) ABSORBENTY - inertní nosič (Chromosorb, Carbopack,

Více

ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY

ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY Klíčová slova: relativní atomová hmotnost (A r ), relativní molekulová hmotnost (M r ), Avogadrova konstanta (N A ), látkové množství (n, mol), molární hmotnost (M, g/mol),

Více

TYPY KOLON A STACIONÁRNÍCH FÁZÍ V PLYNOVÉ CHROMATOGRAFII

TYPY KOLON A STACIONÁRNÍCH FÁZÍ V PLYNOVÉ CHROMATOGRAFII TYPY KOLON A STACIONÁRNÍCH FÁZÍ V PLYNOVÉ CHROMATOGRAFII Náplňové kolony - historicky první kolony skleněné, metalické, s metalickým povrchem snažší výroba, vysoká robustnost nižší účinnost nevhodné pro

Více

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich

Více

Stanovení kyseliny mravenčí a citronové v kávě pomocí kapilární izotachoforézy

Stanovení kyseliny mravenčí a citronové v kávě pomocí kapilární izotachoforézy Stanovení kyseliny mravenčí a citronové v kávě pomocí kapilární izotachoforézy Úkol: Proveďte extrakci kyseliny mravenčí a citronové z reálného vzorku (káva). Pomocí kapilární izotachoforézy stanovte,

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz 1 Sylabus přednášky: Praxe v HPLC Mobilní fáze Chromatografická kolona Spoje v HPLC Vývoj chromatografické

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Chromatografie co je to? : široká škála fyzikálních metod pro analýzu nebo separaci komplexních směsí proč je to super?

Více

Roztoky - elektrolyty

Roztoky - elektrolyty Roztoky - elektrolyty Roztoky - vodné roztoky prakticky vždy vedou elektrický proud Elektrolyty látky, které se štěpí disociují na elektricky nabité částice ionty Původně se předpokládalo, že k disociaci

Více

ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016

ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016 ŘEŠENÍ Kód uchazeče.. Datum.. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 016 1 otázek Maximum 60 bodů Při výběru z několika možností je jen

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací

Více

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie ELEKTROFORETICKÉ STANOVENÍ VYBRANÝCH MYORELAXANCIÍ S VYUŽITÍM BEZKONTAKNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE Diplomová práce

Více

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti Vysvětlete co znamená pojem α-aminokyselina Jaký je rozdíl mezi D a L řadou aminokyselin Kolik je základních stavebních aminokyselin a z čeho jsou odvozeny

Více

12. Elektrochemie základní pojmy

12. Elektrochemie základní pojmy Důležité veličiny Elektroda, článek Potenciometrie Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti Důležité veličiny proud I (ampér - A) náboj Q (coulomb - C) Q t 0 I dt napětí, potenciál

Více

IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část

IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část IZOTACHOFORÉZA Teoretická část Izotachoforéza se liší od ostatních elektroforetických metod tím, že vzorek je vnášen mezi dva různé elektrolyty - vedoucí (leading L) a koncový (terminating T). Ty musí

Více

PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016

PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016 Kód uchazeče.. Datum.. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 016 1 otázek Maximum 60 bodů Při výběru z několika možností je jen jedna

Více