Figure 3-23 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Transkript

1 Figure 3-23 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

2 Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin ( 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (+další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy

3 Proteiny - vazba na jiné molekuly (ligandy) - SPECIFITA - vazebné místo - nekovalentní interakce Figure 3-36 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

4 Vazebné místo proteinu Figure 3-37a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

5 Figure 3-37b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Vazebné místo proteinu

6 Figure 3-38 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Konformace proteinu určuje chemické vlastnosti - vazebné místo chráněno (H 2 ) - reaktivita vazebného místa

7 Figure 3-40 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Interakce protein-protein

9 Síla vazby (protein ligand) rovnovážná konstanta Figure 3-42 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

10 Figure 3-43a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

11 Figure 3-43b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

12 Enzymy = biokatalyzátory Každá (metabolická) reakce má svůj enzym Ligand - substrát

13 Enzymy biologické katalyzátory

14 Table 3-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

15 Jak dosáhnouti úspěchu aneb Co musí umět enzym? účinné snížení aktivační energie specifita účinku (enzym katalyzuje jen jednu z četných termodynamicky možných přeměn látky - specifitu zprostředkuje bílkovinná část) specifita substrátová (látka, která se mění účinkem enzymu) regulovatelnost účinnosti (aktivity)

16 Figure 3-50a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

18 ENZYMVÁ AKTIVITA Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (ph, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min). PŘEVD: U=16,67 nkat 60 U=1 µkat Číslo přeměny: počet molekul substrátu, které se přemění za 1 minutu jednou molekulou enzymu

19

20 Vazba substrátu substrate binding site Indukované přizpůsobení

21 Indukované přizpůsobení Změna konformace hexokinasy způsobená vazbou substrátu

23 KINETIKA podle Michaelise a Mentenové Michaelisova konstanta koncentrace substrátu, při níž se dosáhne poloviny maximální rychlosti

24 Linerární transformace Lineweaver-Burk rovnici Michaelise a Mentenové (rovnice hyperboly) lze převést na rovnici přímky

25 Mechanismus dvousubstrátových reakcí Uspořádaný o vazba prvního substrátu (A) změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu (B) volný enzym má pro něj malou afinitu vznik komplexu EAB o přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty) o postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu

26 Neuspořádaný o pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů o enzym má přibližně stejnou afinitu k oběma substrátům

27 Ping-pong (double displacement) o vazba prvního substrátu na enzym, reakce, oddělení se prvního produktu o substrát předá skupinu uvolnění enzymu v pozměněné formě o připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prvního substrátu o uvolnění produktu a obnova enzymu

28 Enzym = buď jednoduchá bílkovina nebo apoenzym (peptidový řetězec) + kofaktor = holoenzym kofaktor: nepeptidová součást enzymu, která se přímo účastní chemické reakce (bez něj by to nešlo) oprosthetická skupina (př. FAD, PLP, hem) okoenzym (druhý substrát) (př. NAD(P),CoA, ATP) o"nespecifické" organické sloučeniny: - kyselina askorbová (komlex s Fe) - některé další vitaminy okovy přímo se účastnící reakce (metaloenzymy, Zn, Fe, Se, Cu...) ospecifické kovy, působící "nepřímo" (např. Mg a ATP)

29 Hem (hemoglobin) Retinal (rhodopsin) Figure 3-53 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

30 Table 3-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

31 Multienzymové komplexy Figure 3-55 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

32 Regulace enzymové aktivity: o perfect enzyme??? ona úrovni transkripce a translace (synthesa enzymu) opomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými enzymy) - nevratné (aktivace stìpením peptidové vazby - proenzymy) - vratné (fosforylace, adenylace...) oallosterické interakce oefektory (aktivátory a inhibitory) opřístup k substrátu (koncentrace)

33 AKTIVACE A INHIBICE FSFRYLACÍ

34 ALSTERICKÉ ENZYMY Zpětná vazba (P, syntéza cholesterolu) Sigmoidní závislost [v] - [S] často složeny z více podjednotek- podjednotky se vzájemně ovlivňují kooperativní efekt: vazba substrátu na podjednotku změny u ostatních podjednotek změna jejich afinity k substrátu

35 Alosterický aktivátor usnadňuje vazbu substrátu posun saturační křivky k nižším koncentracím substrátu saturační křivka méně sigmoidní, při vysoké koncentraci aktivátoru hyperbola Alosterický inhibitor znesnadňuje vazbu substrátu posun saturační křivky k vyšším koncentracím substrátu zesílení sigmoidního efektu

37 INHIBICE: - nevratná - vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive) e) smíšená

38 Kompetitivní inhibice (př. chemoterapie)

39 Nekompetitivní inhibice

40 Suicide inhibition Ireversibilní vazba inhibitoru (kovalentní) penicilin (G+)

41 Motor proteins Figure 3-77 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

42 pumps Figure 3-78b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

45 prilohy

46 Rozdělení enzymů 6 tříd 1. xidoreduktázy - biologické oxidace a redukce 2. Transferázy - přenos skupin (z donoru na akceptor) 3. Hydrolázy - hydrolytické štěpení vazeb 4. Lyázy - nehydrolytické nebo neoxidační štěpení (eliminační reakce) často za vzniku dvojných vazeb nebo adici na dvojné vazby 5. Izomerázy - intramolekulární změny (geometrické, strukturní) 6. Ligázy - (syntázy) syntéza molekul na tvorbu vazby energie ATP

47 Mechanismus katalýzy - Chymotrypsin serinová proteáza 1 2

48 3 4 5

49 Názvosloví enzymů triviální (pepsin, trypsin, elastasa, invertasa...) doporučené ("polosystematické") (alkoholdegydrogenasa...)

50 1. XIDREDUKTASY donor + akceptor oxidovaný donor + redukovaný akceptor Systematický název: donor : akceptor-oxidoreduktasa angl.: donor : acceptor oxidoreductase Triviální názvy: dehydrogenasa reduktasa (důležitější redukce substrátu) transhydrogenasa (vzácné, glutathion-cystin-transhyhrogenasa) oxidasa (přenos dvou elektronů na 2, obvykle vznik H 2 2 ) oxygenasa (1 nebo 2 atomy jsou inkorporovány do substrátu(ů), monooxygenasa: vzniká voda, dioxygenasa: nevzniká) peroxidasa (peroxid vodíku je akceptorem elektronů) katalasa (disproporcionace peroxidu vodíku)

51 donor akceptor 1.1. CH _ H (alkohol) 1.n.1 NAD + nebo NADP CH (aldehyd) 1.n.2 cytochrom 1.3. CH _ CH 1.n.3 molekulový kyslík 1.4. CH _ NH 2 1.n.4 disulfidová sloučenina 1.5. CH _ NH (sekundární amin) 1.n.5 chinon nebo příbuzné látky 1.6. NADH nebo NADPH 1.n.6 dusíkatá skupina 1.7. ostatní dusíkaté donory 1.n.7 FeS proteiny 1.8. sloučeniny síry 1.n.8 flavin 1.9. hemová skupina difenoly a příbuzné slouč peroxid vodíku jako akceptor vodík působící na jeden donor, do něhož se vnáší kyslík (oxygenasy) (14.) 11 až 18 (různé působící na dva donory, typy oxygenačních reakcí) které inkorporují kyslík superoxidový radikál jako akceptor kovové ionty _ CH _ 2 (vzniká alkohol) redukovaný ferredoxin redukovaný flavodoxin ostatní oxidoreduktasy 1.n.99 různé další akceptory

52 xidoreduktasy - příklady EC Methan,NAD(P)H:kyslík-oxidoreduktasa (hydroxylující) CH 4 + NAD(P)H + H CH 3 H + NAD(P) + + H 2 EC H 2 2 : H 2 2 -oxidoreduktasa, katalasa (též peroxid vodíku:peroxid vodíku - oxidoreduktasa) H H H EC donor: H 2 2 -oxidoreduktasa, peroxidasa donor + H 2 2 oxidovaný donor + 2 H 2

53 xidoreduktasy - příklady EC Alkohol:NAD + -oxidoreduktasa, alkoholdehydrogenasa CH 3 -CH 2- H + NAD + CH 3 -CH + NADH + H + EC D-Glukosa: 2-1-oxidoreduktasa, glukosaoxidasa -D-glukosa + 2 -D-glukono-1,5-lakton + H 2 2 EC Síra:kyslík-oxidoreduktasa, síradioxygenasa S + 2 S 2

54 2. TRANSFERASY donor _ SK + akceptor donor + akceptor _ SK Systematický název: donor : akceptor _ skupinatransferasa angl. donor : acceptor grouptransferase Triviální názvy: methyltransferasy, hydroxymethyltransferasy aminotransferasy (dříve transaminasy) kinasy = fosfotransferasy atd.

55 Kofaktory transferas (koenzym)

56 Kofaktory transferas (koenzym) přenos acylových zbytků

57 2. TRANSFERASY 2.1 Přenášející jednouhlíkatou skupinu Methyltransferasy Hydroxymethyltransferasy Karboxyl _ a karbamoyltransferasy Amidinotransferasy 2.2 Přenášející aldehydické nebo ketonické skupiny Transaldolasy a transketolasy 2.3 Acyltransferasy Acyltransferasy Aminoacyltransferasy

58 2. TRANSFERASY 2.4 Glykosyltransferasy Hexosyltransferasy Pentosyltransferasy Přenášející ostatní glykosylové skupiny 2.5 Přenášející akrylové nebo arylové skupiny jiné než methyl (velmi heterogenní skupina) 2.6 Přenášející dusíkaté skupiny Aminotransferasy ximinotransferasy Přenášející jiné dusíkaté skupiny

59 2. TRANSFERASY 2.7. Přenášející skupiny obsahující fosfor Fosfotransferasy s alkoholem jako akceptorem Fosfotransferasy s karboxylem jako akceptorem Fosfotransferasy s dusíkatou skup. jako akcept Fosfotransferasy s fosfátovou skup. jako akcept Difosfotransferasy Nukleotidyltransferasy Transferasy ostatních substituovaných fosf. skup Fosfotransferasy se dvěma akceptory 2.8. Přenášející sirné skupiny Sulfurtransferasy (sirné skupiny kromě a ) Sulfotransferasy (přenášející sulfát) CoA _ transferasy

60 Transferasy - příklady EC ,4- -D-Glukan:orthofosfát- -D-glukosyltransferasa, fosforylasa (1,4- -D-glukan) n + P i (1,4- -D-glukan) n-1 + -D-glukosa-1-fosfát EC L-Alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa, alaninaminotransferasa (AAT) + H 3 N C CH CH 3 C C CH CH 2 C L-Ala + 2-oxoglutarát pyruvát + C C CH 3 + H 3 N C CH CH 2 CH 2 C L-Glu

61 Transferasy - příklady EC ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa, hexokinasa ATP + D-hexosa ADP + D-hexosa-6-fosfát P P P N H 2 C H NH 2 N H H N N H P H H CH 2 H H H H H H H H

62 3. HYDRLASY A _ B + H 2 AH + HB Systematický název: substrát (skupina) hydrolasa angl.: substrate (group) hydrolase Triviální název: substrátasa, často zcela nesystematické názvy

63 3. HYDRLASY 3.1 Esterasy Estery karboxylových kyselin (lipasy) Monoestery fosforečné kyseliny (fosfatasy) Diestery fosforečné kyseliny (fosfodiesterasy, štěpení c-amp) _ 30 Endo _ a exo _ (deoxy)nukleasy 3.2 Glykosidasy Hydrolysující _ glykosidové vazby (amylasy, invertasa=sacharasa, celulasy) Hydrolysující N-glykosidové vazby 3.3 Působící na etherové vazby

64 3. HYDRLASY 3.4 Peptidasy _ Aminoacylpeptid hydrolasy (aminopeptidasy) Dipeptid hydrolasy Dipeptidylpeptid hydrolasy Peptidyldipeptid hydrolasy Serinové karboxypeptidasy Metallo _ karboxypeptidasy Cysteinové karboxypeptidasy Serinové proteinasy Cysteinové proteinasy Aspartátové proteinasy Metallo _ proteinasy Proteinasy neznámého katalyt. mechanismu 3.5 Působící na C _ N vazbu jinou než peptidovou

65 3. HYDRLASY 3.6 Působící na anhydridy kyselin Anhydridy fosforečné kyseliny (pyrrofosfatasa, nespec. ATPasy) a zprostředkující membránový transport (transportní ATPasy) umožňující pohyb (aktomyosinový komplex, složky cytoskeletu) 3.7 Působící na vazbu C _ C 3.8 Působící na vazby halogenů 3.9 Působící na P _ N vazby 3.10 Působící na S _ N vazbu 3.11 Působící na C _ P vazbu

66 4. LYASY substrát 1 (+ substrát 2) produkt 1 + produkt 2 (malý) Systematický název: substrát 1 (substrát 2)- produkt 2lyasa angl: substrate l (substrate 2)- product 2 lyase Triviální název: dekarboxylasa, hydrolyasy (=dehydratasa), ammonialyasa, aldolasa, synthasa (velmi riskantní)

67 4. LYASY 4.1 C _ C lyasy Karboxylyasy (dekarboxylasy) Aldehydlyasy (aldolasy) xo _ acid lyasy (např. citrátsynthasa) statní C _ C lyasy 4.2 C _ lyasy Hydrolyasy (např. fumarasa) Působící na polysacharidy (štěpí za vzniku deoxysacharidů) statní C _ lyasy 4.3 C _ N lyasy Ammonia _ lyasy (např. aspartátamonialyasa) 4.4 C _ S lyasy 4.5 C _ halogen lyasy 4.6 P _ lyasy 4.99 statní lyasy

68 4. LYASY Lyasy - příklady: EC pyruvát-karboxylyasa, pyruvátdekarboxylasa CH 3 -C-CH CH 3 -CH + C 2 EC karbonát-hydrolyasa, karbonátanhydrasa, karbonátdehydratasa H 2 C 3 C 2 + H 2

69 EC ATP-pyrrofosfátlyasa (cyklisující), adenylátcyklasa ATP camp + PP i H P H H H H H 2 C H N N N N NH 2 P P H P H H H CH 2 H N N N N NH 2 P P 4. LYASY +

70 5. ISMERASY Triviální názvy: (různé typy isomerací _ podobně i v systematickém názvu) racemasy, cis _ trans _ isomerasy, ketolisomerasy, mutasy, atd. Systematický název: substráttyp angl.: substrate type

71 5. ISMERASY 5.2 Cis _ trans _ isomerasy 5.3 Intramolekulární oxidoreduktasy Přeměňující aldehydy na ketony (ketolisomerasy) Přeměňující ketoskupiny na enoly (keto _ enolisomerasy) Posunující C=C vazbu ( n _ m isomerasy) Posunující S _ S vazbu (proteindisulfid _ isomerasa) statní intramolekulární oxidoreduktasy

72 5. ISMERASY 5.4 Intramolekulární transferasy (mutasy) Přenášející acylovou skupinu (acylmutasy) Fosfotransferasy (fosfomutasy) Přesunující aminoskupinu (aminomutasy) 5.5 Intramolekulární lyasy (decyklisující, intramolekulární adice) 5.99 statní isomerasy (např. DNA-topoisomerasy)

73 Isomerasy - příklady: EC Aspartátracemasa (s poloviční rychlostí působí též na Ala) EC Laktátracemasa EC D-Glyceraldehyd-3-fosfátketolisomerasa, triosafosfátisomerasa HC H 2 C C H H CH H 2 C P H 2 C P D-glyceraldehyd-3-fosfát dihydroxyacetonfosfát EC D-Fosfoglycerát-2,3-fosfomutasa, fosfoglycerátmutasa H C CH H 2 C P C P CH H 2 C H 3-fosfo-D-glycerát 2-fosfo-D-glycerát

74 6. LIGASY substrát 1 + substrát 2 + A(G) TP substrát 1 _ substrát 2 + ADP + P i nebo substrát 1 + substrát 2 + ATP substrát 1 _ substrát 2 + AMP + PP i Systematický název: substrát1: substrát 2 _ ligasa (tvořící ADP, AMP nebo GDP) angl.: substrate l : substrate 2 ligase (ADP, AMP or GDP _ forming) Triviální názvy: pokud možno substrát 1 _ substrát 2 _ ligasa (synthetasy jsou možné, často se však vyskytují i synthasy)

75 6. LIGASY 6.1 Tvořící C _ vazby (aminoacyl _ trna _ ligasy a podobné estery) 6.2 Tvořící C _ S vazby (kyselina _ thiol _ ligasy) 6.3 Tvořící C _ N vazby Acid _ ammonia (or amine) ligases (asparaginsynthetasa) Acid _ amino _ acid ligases (např. peptidsynthetasy) Cyklisující ligasy statní C _ N ligasy C _ N ligasy s glutaminem jako donorem dusíku (např. karbamoylfosfátsynthetasa) 6.4 Tvořící C _ C vazby (např. karboxylasy) 6.5 Tvořící estery kyseliny fosforečné (např. DNA-ligasa)

76 Ligasy - příklady EC L-Tyrosin:tRNA Tyr -ligasa (AMP-tvořící), tyrosin-trna-ligasa L-Tyr + trna Tyr + ATP L-Tyr-tRNA Tyr + AMP + PP i EC Acetát:CoA-ligasa (AMP-tvořící), acetát-coa ligasa CH 3 C - + HSCoA + ATP acetyl-scoa + AMP + PP i EC L-Aspartát:amoniak-ligasa (ADP-tvořící), asparaginsynthetasa L-Asp + NH 3 + ATP L-Asn + ADP + P i (EC AMP-tvořící) EC Pyruvát:oxid uhličitý-ligasa (ADP-tvořící), pyruvátkarboxylasa CH 3 -C-C - + HC 3 - +ATP - C-CH 2 -C-C - + ADP + P i EC Poly(deoxyribonukleotid): poly(deoxyribonukleotid)-ligasa (AMP-tvořící), DNA-ligasa ATP + (deoxyribonukleotid) n + (deoxyribonukleotid) m (deoxyribonukleotid) n+m + AMP + PP i

77

78 Svinování (folding)

79 Příklady posttranslačních modifikací Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy) obvykle na H skupinách zbytků serinu, threoninu, tyrosinu významný regulační prvek: aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována fosforylací na zbytku serinu v pozici 14 regulace transkripce role při přenosu signálu

80 Regulace transkripce fosforylací CREB (camp - responsive element binding protein) transkripční faktor fosforylace na serin 133 asociace s CBP; (CREB binding protein) CREB CBP komplex aktivuje CREB dependentní transkripci mj. i remodelací chromatinu acetylací histonů

81 Glykosylace připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny role glykosylace: často nutná pro správné svinutí proteinu stabilizace proteinu regulace rozpoznávání molekulové mezibuněčné obrovská variabilita řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

82 Mechanismus glykosylace na asparagin dolichol

83 Regulace transkripce glykosylací glykosylace CREBu brzda transkripce - působí opačně než fosforylace modifikován serin a threonin N- acetylglukosaminem

84 Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné interakce proteinů Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů farnesylace Acylace připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

85 Modifikace proteinu jiným proteinem - proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům lysinu jiného proteinu Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein) SUMylace (SUM: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem, regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď na stres

86 Acetylace - obvyklá na N koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou acetylace Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K) Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mono- nebo di- methylován methylace

87 Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku Sulfatace různé typy (-, S-, N-); na Tyr (protein protein interakce) Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po svinutí proteinu do (téměř) finální podoby Aktivace zymogenů - odštěpením sekvence, která kryje jejich aktivní centrum - proteasy (chymotrypsin, trypsin, trombin)

88

89