Interpretace hmotnostních spekter měkkých ionizačních technik

Transkript

1 Interpretace hmotnostních spekter měkkých ionizačních technik

2 Poznámky k interpretaci API spekter vliv funkčních skupin na fragmentaci lze orientačně seřadit: nitrát > fosfát ~ sulfát >> sulfonová kyselina > karboxylová kyselina > hydroxy skupina > nitro skupina > halogeny > ostatní funkční skupiny ve velké většině ionty se sudým počtem e - štěpení menšího počtu labilních vazeb ve srovnání s EI minimum nebo absence fragmentových iontů v MS 1 fragmentace pomocí CID (MS/MS, MS n ) knihovny ESI/APCI spekter neexistují s výjimkou biomolekul a individuálních knihoven pro omezený rozsah látek

3 Pravidlo sudého počtu e - (Even-Electron Rule) měkké ion.tech. 1/ E + EE + + R 2/ EE + EE + + EI E + + EI E + + R 1/ Fragmentace iontů s lichým počtem e - (E + ) mohou vznikat opět ionty s lichým počtem e - anebo se sudým počtem e - 2/ Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE + ) - přednostně vznikají opět ionty se sudým počtem elektronů - vznik kation-radikálů při fragmentaci iontů se sudým počtem elektronů vyžaduje energeticky nevýhodné rozdělení elektronového páru (popsané výjimky)

4 Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro M R a E +. ): $ lichá M R = lichý počet dusíků v molekule $ sudá M R = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíku Pro ionty EE + přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků platí pro běžné organické prvky (C,,,, F, Si, P, S, Cl, Br, I) Počet dusíků m/z lichá m/z sudá 0, 2, 4,... (sudý) EE + E +. 1, 3, 5,... (lichý) E +. EE +

5 Dusíkové pravidlo Základní formulace (platí pro M R a E +. ): $ lichá M R = lichý počet dusíků v molekule $ sudá M R = sudý počet dusíků v molekule nebo bez dusíku Pro ionty EE + přesně naopak: lichá hodnota m/z znamená sudý počet dusíků nebo bez dusíku, sudá hodnota m/z lichý počet dusíků platí pro běžné organické prvky (C,,,, F, Si, P, S, Cl, Br, I) Počet dusíků m/z lichá m/z sudá 0, 2, 4,... (sudý) EE + E +. 1, 3, 5,... (lichý) E +. EE +

6 100 Určení molekulové hmotnosti (API-MS) Positive-ion APCI MW = [M+] + egative-ion 399 APCI m/z = 2 [M-] - % [M+a] % 0 [M+K] m/z m/z m/z = 22 [M+] + [M+a] + [M+K] + m/z = 17 m/z = 38 [M+ 4 ] + m/z = 16

7 ejběžnější typy molekulárních aduktů + -

8 bvyklé kroky při interpretace API spekter Určení M R, ověření správnosti podle charakteristických aduktů [M+a] +, [M+K] +, [M+ 4 ] + ; méně často adukty s mobilní fází typu [M++methanol] + nebo [M++acetonitril] +, výjimečně dimerní ionty typu [2M+] +, [2M+a] + -většina aduktů má malou intenzitu (obvykle nejintenzivnější [M+a] + ), ale jejich význam pro potvrzení správnosti určení M R je velký, protože aduktové ionty se obvykle nevyskytují u fragmentů (jsou výjimky) - u záporných iontů kromě [M-] - lze v závislosti na složení mobilní fáze a matrici vzorku očekávat např. [M+Cl] -, [M+C 3 C] -, [M+C] -, apod. - typ a relativní intenzita aduktových iontů velmi výrazně závisí na složení mobilní fáze a obsahu solí v eluentu či vzorku Dusíkové pravidlo M+2 prvky: určení počtu Cl+Br, event. odhad přítomnosti S+Si MS/MS (MS n ) spektra, měření přesných hmot Sumarizace všech získaných informací a návrh struktury Retenční chování ověřit soulad s návrhem struktury Potvrzení s komerčním nebo syntetizovaným standardem

9 Uhlovodíky (C x y ), alkyl/aryl substituce alkany, alkeny, alkiny, aromáty pro alkyl substituci na aromatickém nebo obecně cyklickém systému očekávány ztráty alkenu (nebo alkanu, zejména u druhé a další ztráty pro více přítomnost více alkylů) podobně pro aryl substituci jsou obvyklé neutrální ztráty C 6 4 ( m/z 76) nebo C 6 6 ( m/z 78) ztráty alkyl/aryl radikálů jsou méně obvyklé, někdy se vyskytují v záporném módu (zejména pro APCI / APPI) pro uhlovodíky bez funkčních skupin nejvhodnější APCI / APPI v kladném módu, v ESI jen pomocí tvorby aduktů (Li, Ag, a, apod.)

10 Iontové funkční skupiny orientační pravidlo - čím polárnější je funkční skupina, tím větší vliv na ionizační a fragmentační chování lze očekávat anionické funkční skupiny (sulfát, sulfo, karboxy) - výborná ionizační účinnost a tím i citlivost v záporném módu (obecně vhodnější ESI než APCI), signál v kladném módu horší nebo žádný, částečně může vylepšit jiná protonovatelná skupina (např. 2 ) intenzivní adukty se sodným iontem (popř. K +, 4+ ), typicky zasolené vzorky kationické funkční skupiny (např. kvartérní aminy) vynikající signál v kladném ESI módu, pozor na silné paměťové efekty (lépe se těmto látkám zcela vyhnout), signál v záporném módu obvykle neposkytuje Více anionických funkčních skupin často rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita [M-] - iontu vznik série násobně nabitých iontů typu [M-x] x- a jejich kombinace se sodnými adukty typu [M-(x+y)+ya] x- využití sérií vícenásobně nabitých iontů pro určení MW a počtu iontových skupin

11 Určení MW a počtu iontových skupin série iontů [M-x] x- a [M-(x+y)+ya] x- maximální pozorovaný náboj x a/nebo maximální počet vyměnitelných protonů y = počet iontových skupin Intens. 5 x m/z 0.25 C.I. Direct Green 26 MW = iontových skupin 1 Intens. 5 x m/z 1.25 M. olčapek, P. Jandera, J. Přikryl, Dyes Pigm., 43 (1999) m/z m/z

12 Funkční skupiny obsahující fosfor ( 31 P) Fosfor je monoizotopický R P R + P R P (R-) + P [M--P 3 ] - [ 2 P 4 ] -

13 Fosfátová skupina (RP 3 2 ) časté u biomolekul (peptidů, lipidů, cukrů) lze měřit nejlépe v ESI-, někdy i ESI+ (fosfolipidy), labilní iontová skupina adukty se sodným iontem a dalšími kationty diagnostické fragmenty m/z 79 [P 3 ] -, 97 [ 2 P 4 ] - [ 2 P 4 ] - [M-] - [P 3 ] - [M-- 2 ] - C. Antonio et al, J. Chromatogr. A 1172 (2007) 170

14 Funkční skupiny obsahující síru ( 32 S) M( 32 S) = 100% M+1 ( 33 S) = 0.79% M+2 ( 34 S) = 4.4% R S R + S R S (R-) + S [M--S 3 ] - [S 4 ] -

15 Sulfátová skupina (RS 3 ) [S 4 ] - m/z 97 - S 3 (- 80) S S S 4 (- 98) intenzivní adukty se sodným iontem pro polysulfatované látky rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita nebo absence [M-] - iontu (opakované ztráty 2 S 4 a/nebo S 3 ), násobně nabité ionty ideální pro ESI-, popř. MALDI- (APCI nelze)

16 Vliv zavedení iontové funkční skupiny (sulfát) APCI+ (alkohol) S 2 (C 2 ) 6 [M+] APCI+ MS 1 ESI- (sulfát) MS/MS [M+- (C ) -S ] [M+- 2(C 2) 6] [M+-2] S 2 (C 2 ) 2 S 3 - [M--S3-C3C] [M--S 3 ] 2 MS of m/z 404 [M-]

17 Sulfonové kyseliny (RS 3 ) R S R + [M--S 3 ] - S R S R.. + S [S 3 ] -.

18 Sulfonové kyseliny (RS 3 ) S ESI- (APCI-) - S 3 (- 80) S - S 2 (- 64) - [S 3 ] -. m/z 80 vynikající citlivost v ESI-, lze i MALDI-, pro mono- a disulfonané sloučeniny lze s horší citlivostí i APCI- a APPI- intenzivní adukty se sodným iontem pro polysulfonované látky série násobně nabitých iontů a jejich aduktů s a +, ale nikoliv fragmentace v MS 1, proto snadné určení MW a počtu sulfo skupin typické ztráty v MS/MS jsou m/z 80 = S 3 (někdy může poskytnout i sulfát) a m/z 64 = S 2 (naprosto charakteristické) a radikál anion m/z 80 = [S 3 ] -.

19 ESI-MS barvivo Reactive Black SC 2 C 2 2 S S 2 C 2 C 2 S 3 3 S S 3 2 sulfát 2 sulfo 2 azo 1 hydroxyl 1 amino MW=901 [M-2] 2- = 449.5

20 Funkční skupiny obsahující dusík ( 14 ) R 3 R + 3 R C 3 R C + 3 [M+- 3 ] + [M+- 3 ] + M( 14 ) = 100% M+1 ( 15 ) = 0.37%

21 Funkční skupiny obsahující dusík ( 14 )

22 Alifatické nitráty - výbušniny (R 2 ) bez aditiv úplná absence [M+] + / [M-] - iontů, intenzivní fragmenty m/z 62 = [ 3 ] -, m/z 46 = [ 2 ] -, obtížně intepretovatelné adukty a fragmenty přídavek CCl 4 (nebo halogenidu, octanu, mravenčanu) velmi charakteristická tvorba aduktů [M+Cl] -, [M+C 3 C] -, atd. u APCI X.M. Zhao, J. Yinon, J. Chromatogr. A, 977 (2002) 59

23 itro sloučeniny (R 2 )

24 itro sloučeniny (R 2 ) známá výjimka tvorby molekulárního radikál aniontu M -. v APCI- obecně hodně radikálových ztrát pro nitro látky: m/z 46 = 2., m/z 30 =.,někdy i ztráta m/z 17 =. méně obvyklé ztráty m/z 31 =, m/z 47 = 2-2 (- 46) - (- 16) - - (- 30) - ztráta m/z 30 =. itroso sloučeniny (R)

25 Dusíkaté sloučeniny dusíkové pravidlo; dusík je obvykle místem protonace Primární aminy R 2 ztráta amoniaku [M+- 3 ] + je spíše výjimečná Sekundární a terciární aminy R 1 R 2 nebo R 1 R 2 R 3 ionty typu [R 1 3 ] + a [R 2 3 ] + (na aminoskupině dochází obvykle k protonaci apřenosu vodíku při fragmentaci), analogicky [R 1 2 R 2 ] + či [R 1 R 2 R 3 ] + ionty vedle toho mohou být přítomny též ionty [R 1 ] + a [R 2 ] +, méně časté neutrální ztráty R 1 R 2 vedou ke vzniku iontů např. [M+-R 1 R 2 ] +, typický příklad ztráta dimethylaminu či podobného dialkylaminu ztráty radikálů R. méně obvyklé, nicméně v APCI- existují, např. [M--butyl] -. Kvartérní aminy (R) 4 + X - velice stabilní ionty [(R) 4 ] + s vysokou ionizační účinností (např. tetrabutylamoniová ion-párová činidla), PZR: velmi silné paměťové efekty!!! záporný mód není vhodný

26 Azo sloučeniny organická barviva ( 2 )

27 Azo sloučeniny organická barviva ( 2 ) Y + 14 Y Y - 14 X - 14 X X (- 28) azo skupina je typicky doprovázené řadou dalších polárních funkčních skupin (sulfo, sulfát, karboxy, amino, atd.) v molekule barviva, které podléhají fragmentaci přednostně zajímavá a typická je přesmyková ztráta m/z 28 = 2 (analogie EI)

28 ESI-MS/MS barvivo Mordant Black 15 MW = sulfo 1 nitro 1 azo 2 hydroxyl

29 itrily (RC) neutrální ztráta m/z 27 = C, tato ztráta může být běžně pozorována i u dusíkatých heterocyklických sloučenin (nebo ztráta m/z 41 = acetonitril či obecně alkylnitril) a aromatických aminů, málo specifické nepatří mezi příliš preferované fragmentační cesty, pokud je přítomna jiná polárnější funkční skupina, pak ztráta nitrilu obvykle málo významná -oxidy labilní vazba s iontovým charakterem, tato část molekuly bývá často primárním místem štěpení příklad: skupina,-dimethylaminooxid vznikající metabolizmem dimefluronu se primárně štěpí, čímž lze identifikovat místo oxidace v metabolitu pozorovaná preference tvorby aduktů s chloridem [M+Cl] - v záporném ESI módu (pro malé množství dat není jasné, zda lze zobecnit)

30 alogeny ( 19 F, 35 Cl, 79 Br, 127 I) R X R + X [M+-X] +

31 alogeny monoizotopické 19 F a 127 I monoizotopické prvky jsou oblíbené pro kalibrační směsi obecně ve spektrech ztráty F (20) nebo I (128), ale ztráta F vůbec nemusí být pozorována (zejména v případě substituce F na aromátu) a přítomnost F se pozná pouze podle zvýšení MW o 18 ( MW = F = 18) ionty m/z 19 [F] - nebo m/z 127 [I] - mohou být důležité diagnostické ionty při záznamu záporných iontů (MS nebo lépe MS/MS), pozor na nastavení m/z rozsahu (m/z 19 lze spolehlivě diagnostikovat na kvadrupólu, IT nelze) pro polyfluorované nebo perfluorované sloučeniny opakované ztráty F, F 2 nebo F., což může vést k poklesu intenzity [M+] + / [M-] - iontů, tento typ látek se měří spíše na GC/MS; typické ionty m/z 69 [CF 3 ] + pro perfluorované látky, m/z 113 [CF 3 C] - pro kyselinu trifluoroctovou a její deriváty přítomnost jódu v molekule je natolik neobvyklá, že je většinou očekávána předem na základě předběžných informací

32 alogeny Cl, Br Cl 100% Poměr izotopů - Cl (- 36) % 37 m/z 35 Cl : 37 Cl = 3 : 1 n * Cl = (3a + b) n Br Poměr izotopů 79 Br : 81 Br = 1 : 1 - Br (- 80) m/z n * Br = (a + b) n pro poly- a perhalogenované sloučeniny opakované ztráty X nebo X. (zejména Br. ), což vede k výraznému poklesu [M+] + či [M-] - iontů

33 Funkční skupiny obsahující kyslík ( 16 ) R R + R R + [M+- 2 ] + [M ] + R R + [M+- 2 ] +

34 Funkční skupiny obsahující kyslík ( 16 ) Methoxy skupina M( 16 ) = 100% M+1 ( 17 ) = 0.04% M+2 ( 18 ) = 0.2% R C 3 R + C 3 [M+-C 3 ] + R C 3 R.. + C 3 [M+-C 3 ] +.

35 Karboxylové kyseliny (RC) R C R C + [M+- 2 ] + R C R + C [M--C 2 ] -

36 Karboxylové kyseliny (RC) C APCI- ESI- C - - C 2 (- 44) lze použít záporný mód všech API technik i MALDI, v případě dalších funkčních skupin možný i záznam kladných iontů naprosto charakteristická ztráta m/z 44 = C 2, může být intenzivní již v MS 1, typické pro záznam záporných iontů, často i v kladném módu (další ztráty 2, C, 2 +C), u alifatických kyselin ztráta C 2 méně výrazná v oblasti nízkých m/z může být pozorován ion m/z 44 [C 2 ] -, jiné ztráty nejsou polykarboxyláty (nebo kombinace karboxy + sulfo skupin) tvoří aduktové ionty záměnou kyselých protonů za sodné ionty podobně jako sulfo kyseliny falešná interpretace m/z 44 téměř vyloučena, jediná možná záměna je ztráta radikálu 2 C. pro dusíkaté heterocykly obsahující karbonylovou skupinu, avšak tato ztráta nebývá jednotně 44 v obou módech polarity, ale doprovázena m/z 43 = C

37 Kyslíkaté sloučeniny ztráta vody m/z 18 - teoreticky možná téměř pro všechny kyslíkaté sloučeniny diagnostická hodnota je malá, nutno posuzovat i intenzitu iontu alifatické alkoholy velice intezivní ztráta vody již v MS 1, v APCI většinou 100% intenzitu již v MS 1 (často i v ESI), v MS/MS ion [M+- 2 ] + opět převládá fenoly a chinony ztráta vody může být patrná, ale oproti alkoholům nižší relativní intenzita, někdy ztráta radikálu. (např. nitro látky), přesmyková ztráta m/z 28 = C polyhydroxylované sloučeniny (např. cukry) nutné použít ESI, opakované ztráty vody, pokles intenzity [M+] + / [M-] - ketony - analogicky -štěpení u EI vznikají [R 1 C] + a [R 2 C] +, někdy též ztráta vody [M+- 2 ] + s velmi malou intenzitou aldehydy ztráta C pozorovaná v obou módech polarity (nespecifické, běžné např. pro karbonyl v cyklické struktuře), někdy ztráta m/z 30 = C estery při absenci dalších funkčních skupin vhodnější záznam kladných iontů, typická ztráta alkoholu R 2 z esterové funkční skupiny R 1 CR 2 (např. ztráta methanolu u methylesteru) následovaná ztrátou C, dále vznik karbonylových iontů [R 1 C] + obecně výrazné analogie s EI, zejména při použití APCI

38 Shrnutí vlivu funkčních skupin na fragmentaci K. Levsen et al., J. Mass Spectrom.,42 (2007) 1024

39 becný postup PLC/MS/MS identifikace (analýza metabolitů, přírodních extraktů, syntetických produktů) A/ lavní (cílová, výchozí, parentní) látka struktura známá, dostatečné množství standardu -změření a detailní interpretace všech možných MS experimentů, lze využít i přímé infúze (různé ionizační techniky, obě polarity záznamu, různé typy analyzátorů, chromatografické chování, UV spektra z PDA detektoru) Cíl: a) znalost chování hlavní látky při ionizaci, fragmentaci a PLC retenci kvůli uplatnění analogie pro identifikaci vedlejších látek (metabolitů, meziproduktů, nečistot, minoritních složek, atd.) b) volba optimálních podmínek pro vlastní analýzu vzorku B/ Standardy vedlejších látek pokud jsou k dispozici, provést vše viz A/ C/ PLC/MS analýza vzhledem ke komplexnosti uvedených typů vzorků není vhodné vynechání separačního kroku, jinak ztráta informace - volba PLC podmínek optimalizace separace, MS kompatibilní podmínky -měřit oba módy polarity, podle charakteristických iontů určení M R všech hlavních složek a maximálního počtu minoritních píků -ověřovat a rozlišovat koeluce pomocí rekonstrukce iontových proudů (RIC)

40 becný postup PLC/MS/MS identifikace D/ PLC/auto MS/MS experimentálně lze provést zároveň s C/ PLC/MS - interpretace následně po určení M R z PLC/MS - optimální volba podmínek (práh citlivosti threshold ), počet iontů pro kolize, kolizní energie, exkluze iontů, ukončení exkluze, atd.) by měla zajistit změření MS/MS spekter pro všechny píky včetně koelucí, obvykle pro ionty [M+] + nebo [M-] -, možnost interaktivní úpravy nastavení v průběhu analýzy - ne vždy se podaří, obtížné nastavení u koelucí, chvostování píků, stopových složek (D2/ PLC/manuální MS/MS - dodatečné experimenty v případě chybějících důležitých MS/MS spekter, nutnosti doměření MS 3 či in-source CID +MS 2 ) E/ Měření přesných hmot pomocí QqTF, rbitrap, FTICR, určení elementárního složení pro prekurzorové i produktové ionty (kalibrace, <3 ppm) F/ Sumarizace a korelace všech dostupných dat retenční chování, UV spektra z PDA detekce, určení M R, interpretace MS/MS spekter, další spektrální informace + základní chemický cit = návrh struktury (nebo aspoň její části) G/ věření návrhu struktury pomocí identického standardu

41 100% PLC/MS/MS identifikace nečistoty ečistota 8.00 Acid Red UV chromatogram Int. Time [min] ESI spektrum nečistoty v záporném módu [M-] - ESI spektrum Acid Red 118 v záporném módu [M-]- M R =512 M M R =540 R =28

42 PLC/MS/MS barviva a nečistoty -S 2 (186) IDETICKÉ 3 C 2 S C 2 C (327) -S 3 (275) S 3 -S 2 (186) IDETICKÉ 3 C 2 S (327) -S 3 (275) S 3

43 Identifikace produktů syntézy Výchozí látka čekávaný produkt Cl C Cl C m/z 129 m/z 207 (E +. ) + = m/z 208 (EE + ) Zadání syntetika: Potvrdit strukturu očekávaného produktu syntézy. Cíl servisních měření: Co nejrychleji a nejsnadněji dát jasnou odpověď na otázku. Volba MS podmínek: 1/ Ionizační technika? Polarita záznamu? 2/ Separace? 3/ Měření přesných hmot?

44 Identifikace produktů syntézy 516[M+] + [M+] + [M+] [2M-2-Cl] M -. M

45 Identifikace produktů syntézy 228 MS/MS = MS/MS = Cl 228 MS/MS = C

46 Identifikace produktů syntézy Výchozí látka Cl Cl čekávaný produkt C C Produkt 1 Produkt 2 Produkt 3 C Cl

47 ESI-MS/MS analýza peptidů Schéma značení fragmentových iontů peptidů z 3 y 3 x 3 z 2 x 2 y 1 y 2 z 1 x 1 R1 R2 R3 R4 2 C C C C C C C C a 1 b 1 c 1 a 2 c 2 a 3 b 3 b 2 c 3 (typická písemková otázka)

48 ESI-MS/MS spektrum peptidu Série iontů typu b a y

49 Metabolismus xenobiotik Základní funkce metabolismu xenobiotik (látky cizí organismu léčiva, pesticidy, kontaminanty, atd.) je transformace na derivát s vyšší rozpustností ve vodě, kterýmůže být snáze eliminován z těla Metabolismus xenobiotik má dva základní kroky: I. fáze reakce funkčních skupin II. fáze konjugační reakce I. fáze II. fáze S 3 Experimentální přístup PLC/MS v obou módech polarity, správná volba ionizační techniky Určení molekulové hmotnosti: I. fáze APCI, ESI, APPI, II. fáze ESI Identifikace metabolitů je založena na interpretaci MS/MS spekter, retenčního chování, UV spekter z PDA detektoru, popř. informací z dalších spektrálních technik

50 Defekty atomových hmotností Element ominal atomic mass [Da] Mass defect [mda] C F Si P S Cl Br I ejběžnější metabolické reakce I. fáze Metabolic reaction (elemental composition change) -44 Decarboxylation (-C 2 ) Alcohol dehydration (- 2 ) Demethylation (-C 2 ) Ring formation (- 2 ) Ring opening (+ 2 ) ydroxylation and cyclization (+- 2 ) ydroxylation (+) Epoxidation (+) -5.1 xidation (+) Epoxidation and hydration (+ 2 2 ) +5.5 ominal mass shift [ΔDa] Exact mass shift [mda]

51 ejběžnější metabolické reakce II. fáze ominal mass shift [ΔDa] Conjugation reaction (elemental composition change) Drug functional group Exact mass shift [mda] +14 Methylation (+C 2 ) 2,, S Acetyl conjugation (+C 2 2 ) 2, 2, S 2 2, Glycine conjugation (+C 2 3 ) C Phosphorylation (+P 3 ) Sulfation (+S 3 ) 2, S 2 2, Glucosylation (+C ), C Glucuronidation (+C ) Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C ) 2 + C X Glutathione conjugation halide substitution (-X+C S) alide (X) Glutathione conjugation via epoxidation (+C S) Aromatic V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25 reakcí II. fáze M. olčapek, L. Kolářová, M. obilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962

52 Metabolismus dimefluronu Dimefluron (DMF) - 3,9-dimethoxy-5-(2-dimethylaminoethoxy)- 7-benzo[c]fluoren-7-one-hydrochlorid potenciální antineoplastikum vzorky: krysí výkaly C 3 3 C 3 C C 3 P. Císař et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 37 (2005) 1059

53 DMF MW = 377 C 3 I.S. MW = 391 C 3 3 C 3 C C 3 3 C C 3 C MW = 349 MW = C 3 C C 3 3,9--desmethyl DMF 3 C C 3 3--desmethyl DMF 4 5 MW = C MW = C C 3 3 C -desmethyl DMF C 3 3 C C 3 DMF -oxid 3 MW = 363 C 3 3 C C 3 9--desmethyl DMF 6 MW = C C 3 3 C C 3 redukovaný DMF

54 DMF (ESI-MS a MS n ) ESI+ C 3 [M+] + 3 C 3 C C 3 [M+a] + [M+K] + ESI- MW = 377 žádný signál MS 2 (378) MS 3 ( ) [378-C 3 C 3 ] + [333-C] + [333-2 ] + 378

55 9-- or 3--desmethyl DMF MW = 363 ESI+ 3 C [M+] + [M-] - 3 C C 3 [M+a] + [M+K] + [2M-] - MS 2 (364) MS 2 (362) [364-C 3 C 3 ] + [362-(C 3 ) 2 C 2 C 2 ] - [362-(C 3 ) 2 ] ESIshodná spektra pro 3,9--desmethyl DMF (MW = 349)

56 -desmethyl DMF ESI+ [M+] + C 3 3 C [2M+] + 3 C MW = 363 MS 2 (364) [364-C 3 2 ] + [364-C 3 CC 2 ] + ESI- žádný signál 364

57 Redukovaný DMF C 3 ESI+ 3 C 3 C ESI- [M+] + [M-] - C 3 MW = 379 [M+a] + MS 2 (380) [380-2 ] + [362-(C 3 ) 2 CC 2 ] + [319-C 2 ] + [362-C 3 C 2 ] MS 2 (378) [378-C] - [378-(C 3 ) 2 C 2 C 2 ] - [306-C] - [350-C 3 ] - 378

58 UV spektra DMF C 3 Redukovaný DMF C 3 3 C 3 C C 3 3 C 3 C C 3 mau 1000 mau nm nm

59 Standardy 1 1 PLC/ESI-MS 3-- 3, ESI+ ESI- 3 2 redukovaný 2 6 DMF 7 8 I.S desmethyl -oxid 1 - MW = MW = MW = MW = MW = MW = MW = MW = PLC podmínky: 0 min 40%, 20 min - 80% acetonitril / 5 mm C 3 C 4 ve vodě (p=3), kolona Supelco Discovery (250x4 mm), F=1ml/min, T=30 C.

60 PLC/ESI-MS Vzorky ESI+ 7 8 ESI min metabolity II. fáze ionty: [M+a] +, [M- 2 +] +, atd., sudé MW adukty s glycinem nebo kyselinou glukuronovou metabolity I. fáze od t r = 16 min

61 PLC/ESI-MS a MS/MS (zvětšená oblast metabolitů I. fáze od t R =16 min) ESI DMF I.S ,9--desmethyl DMF 9--desmethyl DMF 3--desmethyl DMF redukovaný DMF -desmethyl DMF -oxid DMF MW = 349 MW = 363 MW = 379 MW = 363 MW = 393 MW = 377 MW = 391

62 [M+] + MS 2 10 MW = C 3-31 C 2 CC C 3 C 3--desmethyl -desmethyl DMF C 2 C DMF 8 I.S. 3, redukovaný 6 -desmethyl -oxid 4 5

63 [M+] + [M+] + 13 MW = C 3-31 MS 2 C 2 CC C C 3 C 3 3 C -methyl redukovaný -desmethyl DMF C 2 C DMF 8 I.S. 3, redukovaný 6 -desmethyl -oxid 4 5

64 Metabolismus dimefluronu 1 3 C C 3 3 C 3 3 C C 3 C 3 3 C C 3 MW = 349 MW = 363 3,9--desmethyl DMF 9--desmethyl DMF MW = 365 reduk. 9--desmethyl DMF 15 3 C 2 3 C C 3 3 C MW = desmethyl DMF C 3 3 C C 3 DMF MW = C 6 C 3 3 C C 3 MW = 393 reduced DMF 3 C 3 C 14 3 C 3 C C 3 MW = 365 reduk. 3--desmethyl DMF MW = desmethyl -desmethyl DMF 3 C 4 MW = C 3 C 3 3 C MW = 379 -desmethyl DMF 3 C 9--desmethyl -desmethyl DMF 5 3 C 13 C 3 3 C C 3 3 C MW = 363 DMF -oxid C 3 3 C MW = 365 reduk. -desmethyl DMF