Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Sledování obsahu fumonisinů ve vzorcích kukuřice Diplomová práce Vedoucí práce: Mgr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. Vypracoval: Bc. Andrea Lolková Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Sledování obsahu fumonisinů ve vzorcích kukuřice vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

3 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych na tomto místě poděkovala panu Mgr. Vlastimilu Dohnalovi, Ph.D. a paní Ing. Aleně Ježkové za vedení této diplomové práce, věcné připomínky, cenné rady a průběžné konzultace při psaní tohoto textu.

4 ABSTRAKT Do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti se stále více posouvá problematika mykotoxinů, spojená především s potenciálním ohrožením zdraví lidí a hospodářských zvířat. Mykotoxiny patří mezi významné toxiny přírodního původu. Často jsou členěny na tři základní skupiny podle hlavních producentů, kterými jsou plísně rodů Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp. Mezi poměrně novou skupinu fusariových mykotoxinů patří fumonisiny, nejčastěji izolované z kukuřice a kukuřičných výrobků. Fumonisiny bývají spojovány s výskytem karcinomu jícnu v Jižní Africe a v Číně a byly klasifikovány jako potenciální lidské karcinogeny. Proto byla na Ústavu technologie potravin vyvinuta a validována nová metoda pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. Mykotoxiny byly extrahovány ze vzorku směsí acetonitril/methanol/voda a stanoveny na kapalinovém chromatografu s hmotnostní detekcí. Klíčová slova: Fumonisiny, mykotoxiny, kapalinová chromatografie, extrakce, kukuřice ABSTRACT The problems of mycotoxins as gaining ground of the interest of experts and laic public. The mycotoxins are connected especially with potential risk to the health of people and of agricultural animals. Mycotoxins belong to the significant toxins of natural origin. They are sectioned into three basic groups by main producers, which are funguses genus Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp. Between young group of fusarium mycotoxins belong fuminosins. They are the most often izolated from corn and corny products. Fuminosins are connected with the appearance of carcinoma of gullet in South Africa and in China and they were clasified as a potentional human carcinogens. That s why at the Department of Food Technology were developed and validated new method of assesment of fuminomins in samples of corn. Mycotoxins were extracted from sample of mixture acetonitril/methanol/water and assesed on liquid chromatography with weight detection. Key words: Fumonisins, mycotoxins, liquid chromatography, extraction, maize

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE MYKOTOXINY OBECNĚ CHARAKTERISTIKA MIKROMYCETŮ Historie mikromycetů Charakteristika vláknitých mikromycetů CHARAKTERISTIKA MYKOTOXINŮ TOXINOGENITA ROZDĚLENÍ MYKOTOXINŮ PRODUCENTI MYKOTOXINŮ ROD ASPERGILLUS Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Aspergillus Aflatoxiny Ochratoxiny ROD PENICILLIUM Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Penicillium Patulin Kyselina cyklopiazonová ROD FUSARIUM Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Fusarium T-2 toxin Deoxynivalenol (DON) Zearalenon (ZEA) Fumonisiny PREVENCE VÝSKYTU MYKOTOXINŮ V POTRAVINÁCH FUMONISINY TOXICKÉ ÚČINKY VÝSKYT V POTRAVINÁCH Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva (RASFF) LEGISLATIVA STANOVENÍ FUMONISINŮ Příprava vzorku Metody stanovení Plynová chromatografie (GC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ELISA... 43

6 Ostatní metody stanovení VÝVOJ METODIKY PRO STANOVENÍ FUMONISINŮ V KUKUŘICI MATERIÁL A METODIKA Chemikálie a činidla Chromatografické vybavení Extrakce Analýza pomocí HPLC/MS Příprava standardních roztoků a vzorků kukuřice VÝSLEDKY A DISKUZE Optimalizace HPLC/MS Výsledky optimalizace MS Vliv octanu amonného Kalibrační křivka pro čistý standard linearita a limit detekce/kvantifikace Extrakce Vývoj extrakce Správnost, přesnost a výtěžnost metody FAPAS kruhový test ANALÝZA REÁLNÝCH VZORKŮ KUKUŘICE Charakteristika jednotlivých hybridů Výsledky měření reálných vzorků ZÁVĚR... 61

7 1 ÚVOD Do života každého člověka patří zcela neodmyslitelně potrava. V dnešní době již nestojí v popředí kvantita potravy, poněvadž, pomineme-li rozvojové země, je výroba potravin dostatečná, ale na její místo se dostává kvalita a zdravotní nezávadnost potravin. Což je způsobeno jednak rozšiřujícím se mezinárodním obchodem jednak zvyšující se vzdělaností lidí a jejich větším zájmem o zdraví a zdravý styl života. Tím jsou kladeny vyšší nároky na výrobu, produkci a distribuci potravin, které se projevují zejména ve zpřísňujících se hygienických požadavcích, kdy tyto požadavky mají zajistit zdravotní nezávadnost a biologickou hodnotu potravin. A právě se zvyšujícími se požadavky na bezpečnost a zdravotní nezávadnost potravin a krmiv se stále více posouvá do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti problematika mykotoxinů, spojená především s potenciálním ohrožením zdraví lidí a hospodářských zvířat. Mykotoxiny jsou sekundárními metabolity vláknitých mikromycetů. Poměrně novou skupinou mykotoxinů jsou fumonisiny. Jsou produkovány toxinogenními kmeny rodu Fusarim (nejčastěji se jedná o Fusarium moniliforme) a údajným producentem je i Alternaria alternata. Z chemického hlediska patří mezi diestery propan-1,2,3-trikarboxylové kyseliny, které mají na 19 a 20 uhlíku aminopolyhydroxyalkylový řetězec, který je pro tuto skupinu mykotoxinů charakteristický. Jedná se o patogeny nejčastěji izolované z kukuřice a kukuřičných výrobků. Fumonisiny bývají spojovány s výskytem karcinomu jícnu v Jižní Africe a v Číně jako následek spotřeby kontaminované kukuřice. V roce 1993 byly klasifikovány Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) jako potenciální lidské karcinogeny (třída 2B). Tyto skutečnosti byly impulsem k vývoji a zavedení metodiky pro stanovování fumonisinů v kukuřici na Ústavu technologie potravin. V této práci byla provedena inovace standardních postupů pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. A to kombinací vysoce účinné extrakce směsí methanol/acetonitril/voda za použití mixéru UltraTurrax a vysokotlaké kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Byly porovnány dva typy extrakce fumonisinů ze vzorků kukuřice. Došlo k optimalizaci HPLC/MS metody a k validaci této metodiky. K ověření metodiky jsme poté použili kruhový test FAPAS. Následně tato inovovaná metoda byla využita k analýze reálných vzorků, zejména kukuřice. 7

8 2 CÍL PRÁCE Vypracování literární rešerše o mykotoxinech. Vývoj a zvládnutí metodiky pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. Měřením vzorků kukuřice a následným vyhodnocením a zpracováním výsledků ověřit funkčnost metodiky. 8

9 3 MYKOTOXINY OBECNĚ 3.1 Charakteristika mikromycetů Historie mikromycetů Lidstvo od prvopočátku své existence sdílí své prostředí s řadou jiných organismů a mikroorganismů, které ho provázejí ve všech etapách vývoje. Mezi takové organismy patří rozmanité skupiny hmyzu, červů, hlodavců a jiných živočichů, ale především mikroorganismy reprezentované nesčetnými skupinami bakterií, prvoků, řas a mikroskopických hub. Mikromycety (mikroskopické houby) se staly neoddělitelnou součástí životního a pracovního prostředí člověka. Soužití s nimi zabezpečuje lidstvu už od nepaměti zdroje pro jeho výživu. Jsou využívány k produkci nejrůznějších druhů a typů potravin (mléčné výrobky, alkoholické nápoje, droždí, aj.) a organických látek (enzymy, kyseliny, vitaminy), včetně antibiotik (např.: peniciliny, cefalosporiny). Na druhé straně je člověk nucen se potýkat s negativními dopady působení hub, zejména pokud jde o degradaci dřeva a jiných surovin, potravin, krmiv, rozmanitých chorob zemědělsky využívaných rostlin, ale také zvířat. V neposlední řadě se jedná o nepříjemné zdravotní dopady na člověka, ať už formou infekčních onemocnění, alergií nebo otrav, včetně znehodnocení potravin mykotoxiny, které se ukazuje jako závažný celosvětový problém (Malíř, Ostrý aj., 2003). Mikromycety jsou rozšířeny po celém světě. Z praktického hlediska je dělíme na vláknité mikromycety (mikroskopické vláknité houby, plísně), kvasinky a kvasinkovité (yeast-like) mikroorganismy. S mikroskopickými houbami, které jsou pouhým okem nerozlišitelné, se mohl člověk blíže seznámit až s objevem mikroskopu a rozvojem mikroskopických metod pro jejich sledování. Vědci si v té době všímali nejen mikroskopických hub, které způsobovaly choroby rostlin (padlí, sněti, rzi apod.), ale i mikroskopických hub fermentujících rozličné substráty. V druhé polovině 19. století a počátkem 20. století se ke klasické mykologii, která se zabývala zejména popisem a systematikou hub, připojili další disciplíny jako fyziologie, biochemie a genetika hub. Došlo k rozvoji technické, půdní, lékařské a později environmentální mykologie. Neustále je zdokonalována systematika hub 9

10 s využitím nejmodernějších mikroskopických, biochemických, genetických, statistických a později i molekulárně biologických metod Charakteristika vláknitých mikromycetů Mikromycety jsou vícebuněčné nebo jednobuněčné (kvasinky) eukaryotní organismy s heterotrofní výživou. Živiny získávají absorpcí z okolního prostředí. Jedná se v převážné většině o saprotrofické organismy, které plní v ekosystémech nenahraditelnou roli destruentů a podílí se tak významně na koloběhu látek a energie v přírodě. Jen nepatrná část hub se přizpůsobila k parazitismu (paratrofii) jiných organismů, včetně člověka. Velká morfologická a fyziologická rozmanitost a adaptabilita mikromycetů k nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt prakticky všude tam, kde existuje organická hmota. To jim umožňuje osídlit řadu rozdílných biotopů. Spóry mikromycetů jsou jednobuněčné či vícebuněčné výtrusy sloužící k jejich rozmnožování, šíření a přežívání v nepříznivých podmínkách. V případě mnoha patogenních hub hrají spóry rovněž významnou úlohu v patogenezi myotických onemocnění (mykózy, mykotoxikózy, mykoalergie). V životním a. pracovním prostředí člověka jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, předmětů, na plochách, v krmivu, v potravinových surovinách rostlinného původu a potravinách. Zvýšený výskyt spór či fragmentů hyf (houbových vláken) v ovzduší závisí mimo jiné i na klimatických podmínkách a na stupni narušení biologické rovnováhy životního prostředí. Zvláště potraviny jsou z hlediska zdraví člověka velmi vhodným a potenciálně rizikovým substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních mikromycetů a následně pro produkci mykotoxinů (Malíř, Ostrý aj., 2003). 3.2 Charakteristika mykotoxinů Mykotoxiny jsou sekundární metabolity vláknitých mikromycetů. Mykotoxiny patří mezi významné toxiny přírodního původu. Sekundární metabolity proto, že nejsou nezbytné při rozvoji vláknitých mikromycetů jako například aminokyseliny, nukleové a mastné kyseliny nebo proteiny. Sekundární metabolismus se na rozdíl od esenciálního metabolismu primárního vyznačuje některými specifickými rysy, které lze v případě plísní (mikromycet) shrnout takto: Sekundární metabolity vznikají jen u určité skupiny druhů či kmenů. 10

11 Maximum produkce sekundárního metabolitu často nastává až po fázi vyrovnaného růstu, běžně je spojeno s morfogenetickými změnami, jako je sporulace (Velíšek, 2002). Název mykotoxiny byl poprvé použit Forgaczem a Carllem v roce Mykotoxiny jsou strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (až na výjimky nižší než 700 g/mol). Jsou nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a živé organismy. Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány, je vysvětlován tím, že jsou prostředkem vláknitých mikromycetů v boji o potravu a v boji o přežití (Malíř, Ostrý aj., 2003). O problému vymezení mykotoxinů bylo jednáno obcí československých mykologů a hygieniků na odborném semináři ČSVSM v Praze, roku 1983, kdy byla konsensem přijata následující definice (tato je pouze mírně stylisticky upravena): Mykotoxiny jsou toxické látky mikroskopických hub nebílkovinné povahy, toxické vůči člověku a (nebo) hospodářským zvířatům a k expozici jimi dochází proti vůli a zájmům člověka (Šimůnek, 2004). V současné době je známo 400 druhů mykotoxinů. I nadále jsou objevovány a chemicky charakterizovány další nové mykotoxiny. Základní toxikologický výzkum stávajících ani nově objevených mykotoxinů nebyl zatím ukončen a nadále probíhá (Nedělník, Moravcová, 2005). 3.3 Toxinogenita Toxinogenitou se nazývá schopnost organismu tvořit toxiny. Aplikováno na mikroskopické houby jde o schopnost tvorby mykotoxinů. Všechny kmeny druhů mikroskopických hub, u nichž byla zjištěna produkce určitého mykotoxinu, považujeme za potenciálně toxinogenní pro daný mykotoxin. Pozitivní toxinogenita znamená, že daný kmen je za určitých podmínek schopen produkovat daný mykotoxin. Vyšetření konkrétního kmene má tedy vždy vyšší výpovědní hodnotu než pouhé konstatování jeho příslušnosti ke druhu, který je schopen v některých případech produkovat mykotoxiny. Jak již bylo uvedeno výše, mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jedná se o sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na souhře enzymatických aktivit v buňce Na druhé straně ovšem neexistence genů pro klíčové enzymy této tvorby je spojena s naprostou neschopností kultury tvořit daný mykotoxin (skupinu mykotoxinů). Z hlediska druhových či genetických podmínek toxinogenity jde o schopnost houby produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně 11

12 prekursoru, zpravidla přes meziprodukty, na mykotoxin. Některé prekursory mohou být samy o sobě rovněž mykotoxiny. Nalézáme je u některých druhů, které jsou neschopné jejich další přeměny. U druhů, kde biochemická přeměna pokračuje k dalším látkám, je často nacházíme pouze ve stopových koncentracích. V některých případech je popsána schopnost produkovat více konečných sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Převahy určité konkrétní sloučeniny v kultuře lze potom dosáhnout např. změnou teploty nebo specifickými inhibitory některých enzymů (Šimůnek, 2003). Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu. Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, uvnitř kterého mohou být mykotoxiny vytvářeny, přičemž od optima směrem k limitům klesá jednak množství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné množství mykotoxinu. Důležité jsou také osmotické vlastnosti substrátu, charakterizované nejlépe tzv. vodní aktivitou (a w ). I zde existuje zpravidla rozmezí hodnot, uvnitř kterého lze zaznamenat produkci mykotoxinů. Je nutno zdůraznit, že posun a w mimo optimální hodnoty neznamená usmrcení kultury. Dochází k přežívání spor a za určitých okolností i myceliálních buněk. Jako fyzikální veličinu musíme rovněž chápat čas. I na něm závisí obsah mykotoxinů. Mycelium začne produkovat měřitelná množství mykotoxinů až po určité době a po vyčerpání zdrojů se produkce zastaví. Z chemických faktorů je důležitý přísun energie a nezbytných chemických látek, které buňky mikroskopických hub (mikromycet) potřebují jako vstup do svého metabolismu. Důležitý je přísun kyslíku. Při jeho nedostatku dochází k poklesu produkce mykotoxinů a posléze k zástavě růstu kultury. (Šimůnek, 2003) Významné jsou i faktory biologické. Je popsán prudký pokles produkce mykotoxinů ve směsných kulturách. Silný pokles produkce lze vysvětlit tím, že při pasážování kultury vznikají netoxinogenní mutanty. Jejich přibývání ve směsné kultuře poté vede k rychlé ztrátě tvorby mykotoxinů. Toxinogenita je stanovována zpravidla kultivací izolovaného kmene za standardních podmínek, které se podle autora metody blíží optimálním podmínkám produkce mykotoxinu. Stanovená toxinogenita by v případě negativního výsledku měla zaručit vysokou pravděpodobnost toho, že testovaný kmen nebude produkovat daný mykotoxin. Pozitivní výsledek znamená pouze to, že zachycený kmen je za jistých 12

13 okolností schopen stanovovaný mykotoxin tvořit. Je důležité podotknout, že přítomnost spor toxinogenního kmene neznamená zdaleka ještě výskyt mykotoxinů. V naprosté většině případů jsou samy o sobě prosty mykotoxinů, jen několik málo druhů plísní obsahuje významné množství svých mykotoxinů ve sporách (Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum). Znamená však, že jakmile nastanou vhodné podmínky pro růst mycelia a produkci mykotoxinů, pak k této produkci s vysokou mírou pravděpodobnosti také dojde (Šimůnek, 2003). 3.4 Rozdělení mykotoxinů Mykotoxiny lze rozdělit podle velkého množství kritérií. Stejně jako je tomu i v případě jiných sekundárních metabolitů, nelze mykotoxiny jednoduše klasifikovat do jednotlivých skupin pouze na základě chemické struktury bez současného zohlednění jejich výskytu, producentů či charakteru a intenzity vyvolávaných účinků. Jako přirozené kritérium klasifikace mykotoxinů lze použít mechanismus biosyntézy základního skeletu jejich molekuly. Řada významných mykotoxinů vzniká tzv. polyketidovou cestou, kde je intermediátem podílejícím se bezprostředně na výstavbě příslušného polyketidu acetylkoenzym A, jenž se v primárním metabolismu podílí na výstavbě mastných kyselin a jiných sloučenin. Druhý nejvýznamnější způsob biosyntézy vychází z mevalonové kyseliny. Z tohoto meziproduktu vznikají trichothecenové mykotoxiny, které obsahují ve své molekule seskviterpenový skelet. Pro úplnost je třeba zmínit existenci dalších metabolických cest, které se uplatňují při vzniku některých méně běžných mykotoxinů. Výchozím intermediátem cyklických polypeptidů, např.: malforminu C, jsou aminokyseliny. Reakcí aminokyselin s mevalonátem vznikají tzv. tremorgenní mykotoxiny. A reakcemi obdomnými pochodům Krebsova cyklu vznikají nonadridy (Velíšek, 2002). Členění mykotoxinů podle způsobu jejich biosyntézy je uvedeno v tabulce 1. Jak již bylo zmíněno, nelze mykotoxiny dělit jen podle jednoho kritéria. Ale jedním z nejčastěji používaných a nejjednodušších dělení je dělení dle chemické struktury. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Toto rozdělení je ukázáno v tabulce 2 (Šimůnek, 2004). V současnosti je však také věnována pozornost vázaným neboli konjugovaným mykotoxinům, které mohou být vázány ve formě glykosidů. Tyto konjugované mykotoxiny byly přítomny ve vysokých koncentracích v mnoho produktech na bázi cereálií. Přitom vázané mykotoxiny nelze běžnými analytickými postupy používanými 13

14 v kontrolních laboratořích stanovit. Existuje předpoklad, že tyto maskované formy jsou též toxické a představují riziko pro konzumenty (současné maximální limity jsou stanoveny jen pro volné mykotoxiny). V trávicím traktu člověka (obdobně i u hospodářských zvířat) může pravděpodobně docházet k uvolňování mykotoxinů z vazeb na více molekulární komponenty matrice a tak, de facto k navýšení toxické zátěže organismu (Kubíček, 2008). Tab. 1 Členění mykotoxinů podle způsobu jejich biosyntézy (Malíř, Ostrý aj., 2003) Kategorie biosyntézy Zástupce Decaketidy Diketidy Diketopiperaziny jednoduché Diketopiperaziny modifikované Diterpeny Heptaketidy Hexaketidy Monoterpeny Nonaketidy Octaketidy Pentaketidy Peptidy Seskviterpeny Tetraketidy Tetramická kyselina Aflatoxiny, erytroskyrin Moniliformin Kyselina aspergilová, echinuliny Brevianamidy, fumitremorgeny, roguefortin Aflatrem, lolitremy, paspalin, penitremy Rugulosin, viriditoxin, xanthomegnin Maltoryzin Viridikatumtoxin Citreoviridin, fumonisiny, zearalenon Luteoskyrin Citrinin, ochratoxiny Ergotamin, phomopsiny, rhizonin Trichotheceny Patulin, kyselina penicilinová Kyselina cyklopiazonová, kyselina tenuazonová Dále můžeme dělit mykotoxiny podle nejvýznamnějších toxických účinků. Toto dělení není ovšem zcela výstižné, poněvadž některé mykotoxiny mohou být zařazeny do více skupin (např.: trichotheceny mají účinky dermotoxické, neurotoxické i vůči zažívacímu traktu). V podobných případech bývá toxin často zařazen podle historického aspektu, které účinky byly objeveny jako první a více se vžily. Kvalitativní Austvickovo schéma, pro dělení mykotoxinů dle toxicity, z roku 1976 rozšířené z praktických důvodů o dvě poslední skupiny, je znázorněno v tabulce 3. 14

15 Tab. 2 Členění mykotoxinů podle chemické struktury Skupina Furanofurany Substituované pyreny a hydroxypyreny Substituované chinony Nenasycené laktony Griseofulviny Epoxytrichotheceny Polycyklické substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy Mykotoxiny jiné struktury Příklady Aflatoxiny, sterigmatocystin aj. Kyselina kojová, sekalonové kyseliny aj. Luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin aj. Patulin, kyselina penicilinová, ochratoxiny, citreoviridin, rubratoxin aj. Griseofulvin T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, vomitoxin (=deoxynivalenol), nivalenol, verrucariny, fusarenon, satratoxiny aj. Kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy aj. Gliotoxin, sporidesminy, roquefortin aj. Zearalenon, curvularin, citrinin, fumonisiny, moniliformin aj. Tab. 3 Dělení mykotoxinů podle toxicity kvalitativní Druh účinku Hepatotoxiny Nefrotoxiny Toxiny zažívacího traktu Neurotoxiny a mykotoxiny Dermotoxiny Toxiny dýchacího traktu Genitotoxiny Zástupce Aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatocystin aj. Ochratoxin A, citrinin aj. T-2 toxin, další trichotheceny Tremorgeny, citreoviridin, fumonisiny Verrucariny, sporidesminy, trichotheceny aj. Patulin Zearalenony Imunotoxiny Aflatoxiny, ochratoxin A, Toxiny nezařaditelné nebo málo prozkoumané trichotheceny aj. 15

16 Mykotoxiny jsou často členěny na tři základní skupiny podle hlavních producentů, kterými jsou plísně rodů Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp.. Tito producenti se dělí podle výskytu na plísně polní, skladištní, polní i skladištní (viz níže). Okrajově se lze ještě zmínit o méně používaných děleních, kdy mykotoxiny dělíme podle toxicity na silně, středně a slabě toxické nebo podle účinku na buňku na: Inhibitory tvorby energie (moniliformin) Inhibitory proteosyntézy (trichotheceny) Modifikátory cytoskeletu Estrogenní mykotoxiny (např.: zearalenon) Tremorgeny Karcinogenní mykotoxiny Je nutné znovu upozornit na fakt, že žádné z doposud používaných členění nelze považovat za univerzálně použitelné a že tato členění budou nadále obměňována a rozšiřována (Šimůnek, 2004). 16

17 4 PRODUCENTI MYKOTOXINŮ Mezi nejdůležitější rody, jejichž druhy produkují významné mykotoxiny, patří rody Aspergillus, Penicillium a Fusarium, přičemž rod Fusarium bude rozebrán podrobněji. Zároveň bude naznačena stručná charakteristika nejdůležitějších mykotoxinů jednotlivých druhů. Zvláštní důraz bude kladen především na fuzáriové mykotoxiny, konkrétně pak na fumonisiny. Těm bude věnována samostatná kapitola. 4.1 Rod Aspergillus Plísně rodu Aspergillus řadíme mezi plísně skladištní. Několik druhů rodu Aspergillus produkuje mykotoxiny, které mohou být toxické, mutagenické nebo karcinogenní. Některé druhy tohoto rodu jsou často půdní houby nebo saprofyté. Mohou napadat uskladněné plodiny, způsobovat choroby rostlin nebo mohou být lidskými čí zvířecími patogeny. Tyto houby je těžké kontrolovat. Rozšiřují se účinně prostřednictvím produkce asexuálních spór zvaných konidie. Existují druhy, které mohou přežívat v období nepříznivých podmínek tak, že vytváří ochranné struktury tzv. sklerocia. Kolonizace může být uskutečněna ještě před sklizní nebo až po ní. K napadení dochází v závislosti na podmínkách skladování a na životním prostředí (Dabrowski, 2005). Skladištní plísně jsou oproti polním plísním méně náročné na vlhkost prostředí. Jejich výskyt není vázaný na množství srážek v konkrétním roce, ale je ovlivněn zejména způsobem skladování, jak již bylo zmíněno. Zdrojem kontaminace zrn těmito houbami jsou nejčastěji zaplísněné rostlinné zbytky ve skladových prostorách a silech (Chloupek aj., 2005). Skladištím plísním nejlépe vyhovuje teplota prostředí v rozmezí od 5 do 45 ºC. Optimální pro jejich růst jsou teploty ºC a vlhkost zrna mezi %. Během skladování se mohou šířit další houby, pokud je zrno vlhké. V napadených partiích se proto může obsah mykotoxinů ještě zvyšovat. Také zrno s obsahem vody 15 % je jen omezeně skladovatelné, protože je hydroskopické a přijímá vlhkost ze vzduchu o vlhkosti vyšší než 65 %. Již za několik týdnů po uskladnění se proto mění druhové spektrum hub na uskladněném zrnu. Klesá podíl polních a zvyšuje se podíl skladištních druhů, avšak dosušením zrna na vlhkost pod 13 % a skladování při teplotě v rozpětí 4-9 ºC lze růst skladovaných plísní a produkci jejich metabolitů eliminovat (Nedělník, Bácová, 2000). 17

18 Zemědělské komodity, které mohou být kolonizovány nebo napadeny touto houbou, zahrnují obilí, rýži, cereálie (Dabrowski, 2005) Dále pak podzemici olejnou a další druhy ořechů, kakaové a sojové boby. Z obilovin se nejčastěji vyskytují právě na kukuřici (Zedníková aj., 2006). Ovlivněny a zasaženy mohou být i jiné spotřební výrobky, protože při strávení kontaminovaného jídla zvířaty přechází mykotoxiny do masa, mléka a vajec. Mezi druhy rodu Aspergillus, které produkují mykotoxiny představující vážné zdravotní a ekonomické riziko, jsou: Aspergillus flavus (viz obrázek 1), Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus a Aspergillus fumigatus. Mykotoxiny produkované těmito druhy zahrnují: aflatoxiny, sterigmatocystin, kyselinu cyklopiazoniovou, ochratoxin, patulin, citrinin, glyotoxin, kyselinu penicilinovou a další (Dabrowski, 2005). Obr. 1 Aspergillus flavus Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Aspergillus Aflatoxiny Aflatoxiny jsou velmi stabilní chemické sloučeniny. Nedegradují je vysoké teploty a jsou stálé i během zpracování surovin. Dlouhodobým skladováním zrn obilovin se sice hladina mykotoxinů mírně snižuje, ale nalezeny byly i v obilovinách po sedmi letech skladování (Zedníková aj., 2006). 18

19 Celkem byly popsány aflatoxiny B 1, B 2, G 1, G 2. Jejich označení pochází od barvy fluorescence v UV oblasti: AFB 1 a AFB 2 poskytují modrou fluorescenci (Blue), AFG 1 a AFG 2 žlutozelenou (yellow-green). Později bylo popsáno i minoritní zastoupení aflatoxinů M 1, M 2 v mléce (Milk) krav krmených kontaminovanými pícninami. AFM 1 a AFM 2 jsou hydroxy deriváty AFB 1 a AFB 2. Neenzymovým působením především nízkého ph na AFB 1 a AFG 1 vznikají aflatoxiny B 2 A a G 2 A. Po metabolické přeměně se v intoxikovaném organismu mohou objevit i další aflatoxiny jako např. P 1 a Q 1 (Pohanka, 2008). Díky schopnosti poškozovat strukturu nukleové kyseliny jsou schopné indukovat mutace a mají karcinogenní efekt (Zedníková aj., 2006). Bylo dokázáno, že za 24 hodin od konzumace, dojnice přijímající B 1 v krmivu v dávce 300 mg.g -1, produkovala mléko obsahující 11 ng.ml -1 M 1. Analyzovatelné množství M 1 mizí za 4-5 dní od posledního kontaktu s krmivem (Nedělník, Moravcová, 2006). Působením aflatoxinů dochází k různému stupni poškození jater, snížení hmotnosti a k narušení obranných mechanismů organismu. Vnímavé jsou všechny druhy hospodářských zvířat, především drůbež, mláďata a březí samice. Nejčastějšími příznaky intoxikace jsou nechutenství, gastroenteritidy, podkožní krvácení, krvácení z tělních otvorů a úhyny (Zeman aj., 2006) Ochratoxiny Ochratoxiny jsou skupinou mykotoxinů zahrnující sedm izokumarinových derivátů vždy spojených s fenylalaninem, které produkují druhy rodu Aspergillus nebo také Penicillium. Obr. 2 Aspergillus ochraceus V současné době jsou známy tři typy ochratoxinů, které se od sebe liší svou toxicitou. Ochratoxin A, B, a C. Nejtoxičtější je ochratoxin A, který působí na vyvíjející se centrální nervový systém, poškozuje ledviny a potlačuje imunitní reakce organismu (Hrdina aj., 2004). Mechanismus jejich toxicity spočívá v tom, že fenylalaninová část molekuly je zaměněná t-rna za fenylalanin. Ten je však v ochratoxinu navázán na 19

20 kumarinovou část, která brání jeho navázání do proteinového řetězce. Tím dojde k zastavení syntézy proteinů s fenylalaninem (Chloupek aj., 2005). (chemická struktura jednotlivých ochratoxinů je naznačena na obrázku 3) Je produkován během skladování zrn plísní Aspergillus ochraceus (viz obrázek 2). Vzniká již od 16 % vlhkosti zrna a při teplotě ºC, takže bývá častější než aflatoxin. Ochratoxin B a ochratoxin C jsou méně toxické. Krmivo obsahující ochratoxin A v množství 200 ng.g -1 způsobuje otoky ledvin charakterizované atrofií proximálních tubulů. Biologický poločas ochratoxinu A v tkáních prasete je 4,5 dne. Úplná eliminace mykotoxinu vyžaduje několik týdnů od expozice (Hrdina aj., 2004). 4.2 Rod Penicillium Obr. 3 Chemická struktura ochratoxinu A, B a C Tento rod je příbuzný předcházejícímu, existuje dokonce i skupina druhů na jejich pomezí. Považuje se za fylogeneticky mladší, což se mj. projevuje velmi malými rozdíly v utváření rozmnožovacích orgánů jednotlivých druhů. Nepohlavní orgány jsou rovněž tvořeny konidioforem, palidami a konidiemi. Palidy jsou však na neztlustlém konidioforu sestaveny do tvaru štětičky, odtud i český název štětičkovec (Šimůnek, 2004). 20

21 Příslušníci rodu Penicillium patří k nejrozšířenějším vláknitým mikromycetům teplého a mírného klimatu. Jejich spóry jsou prakticky všudy přítomné, a proto jsou tyto mikromycety také velmi častými kontaminanty potravin, životního a pracovního prostředí. Jediný pravidelný patogen rodu Penicillium je dimorfní druh Penicillium marneffei, který způsobuje systémové infekce u pacientů s AIDS, a to převážně v endemických oblastech jihovýchodní Asie (Thajsko, Vietnam, Čína) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Mezi významné druhy tohoto rodu patří: Penicillium expansum (viz obrázek 4), Penicillium viridicatum, Penicillium commune atd. Jejichž mykotoxiny jsou: xantomegnin, viomellein, vioxanthin, patulin, citrinin, cyklopiazonová kyselina apod. (Šimůnek, 2004). Obr. 4 Penicillium expansum Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Penicillium Patulin Patulin byl původně popsán jako antibiotikum a dokonce po krátký čas léčebně využíván. Po objevení karcinogenity vůči zvířatům byl stažen a dnes je považován za významný mykotoxin. Mezi další producenty tohoto mykotoxinu patří ještě rody Aspergillus a Byssochlamys. V přírodě je poměrně rozšířen, důležitá je zejména jeho produkce na kazícím se ovoci, velice často v jablkách. Jsou rovněž popsány otravy dobytka ze zaplesnivělých siláží. V ovoci se vyskytují ochranné látky (např. vitamin C), které zabraňují rozkladu patulinu při tepelném opracování kompotů, dření i moštů (čistý patulin se rozkládá při 80 ºC). Závažnou je zejména kontaminace ovocných dření, určených pro dětskou a 21

22 kojeneckou výživu. Důležitým faktorem je výrobní praxe, při níž dochází k mechanickému poškozování ovoce. Akutní otravy jsou popsány u dobytka, většinou dominuje poškození plic s edémem. Patulin je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů (Šimůnek, 2004) Kyselina cyklopiazonová Je produkována jak rodem Penicillium tak rodem Aspergillus. Byly popsány zejména změny v transportu iontů vápníku, vedoucí k osmotické smrti buněk. Při podání per os dochází především k postižení trávicí trubice a jater. V současné době se uvažuje o účasti kyseliny cyklopiazonové při turkey Х disease (náhlé úmrtí více jak krůťat v roce 1960 v Anglii), vedoucí k objevu aflatoxinů. V menším množství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem Penicillium camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech, plísňových salámech apod. Nedodržení klasické technologie camembertských sýrů může vést k mohutnému vzestupu její koncentrace v plísňovém pokryvu (Šimůnek, 2004). Toxicita kyseliny cyklopiazonové se projevuje různými příznaky u různých organismů, např. se jedná o nekrotické účinky na gastrointestinální trakt, ledviny, játra, kosterní svaly a další orgány. Byly také pozorovány degenerativní změny myokardu. Nejčastěji je kyselina cyklopiazonová označována jako gastroenterotoxin, hepatotoxin a nefrotoxin. Bylo zjištěno, že po aplikaci kyseliny cyklopiazonové došlo k ovlivnění neurotransmiterů v CNS (centrální nervový systém) (Malíř, Ostrý aj., 2003). 4.3 Rod Fusarium Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitizmu rostlin, část za určitých podmínek může být patogenní pro člověka i zvířata. Rod Fusarium náleží k významným potenciálně toxinogenním polním mikromycetům (Malíř, Ostrý aj., 2003). Z těchto polních plísní se v našich klimatických podmínkách vyskytuje tento rod nejčastěji (Ostrý, 2006). Historicky první záznam popisu mikromycetů rodu Fusarium je spojen se jménem německého botanika Johanna H. F. Linka. Další řadu druhů rodu Fusarium popsali Elias Magnus Fries a Pier Andrea Saccardo. Fusarium moniliforme Sheldon, významný 22

23 producent fumonisinů, byl poprvé popsán Saccardem v roce 1882 jako Oospora verticillioides Sacc. a později přejmenován na Fusarium verticillioides. Mikromycety rodu Fusarium byly v minulosti známy také u nás, o tom svědčí český název srpovnička pro makrokonidie fusarií. Při určování tohoto rodu sledujeme makrohabitus na sladinovém nebo bramboro glukózovém agaru, kde vytváří dobře vyvinuté vegetativní mycelium a konidiální aparát. Konidiální stádium vytváří buď volné jednotlivé konidiofory, na nichž se vytvářejí konidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářkovitých útvarů, zvaných sporodochia. V některých případech se vytvářejí souvislé konidionosné porosty pionéry. K typickému vytváření sporodochií a pionotů však dochází spíše na přirozeném substrátu. V kulturách se obvykle setkáváme pouze s volně rozmístěnými konidiofory ve vzdušném myceliu. Konidiofory jsou větvené málo nebo hojněji. Na ose konidioforu se tvoří vstřícné nebo přeslenité protáhlé fialidy, které plodí konidie, nebo se nejdříve vytvoří větévky, které nesou dvě i více vlastních konidiogenních buněk fialid v přeslenu. Jsou známy dva druhy konidií, makrokonidie a mikrokonidie. Makrokonidie jsou dvoubuněčné až vícebuněčné a mají typický srpovitý tvar. Po delší kultivaci se přestávají tvořit. Někdy je nutno jejich tvorbu pro potřebu identifikace vhodně stimulovat. Mikrokonidie jsou jednobuněčné a elipsoidní, oválné nebo široce vejčité. Mohou tvořit na konci konidiogenní buňky řetězce nebo shluky (Malíř, Ostrý a., 2003). Obr. 5 Mikroskopické znaky rod Fusarium Vysvětlivky: a monofialida a konidie ve shluku, b polyfialida, c konidie v řetízku, d makrokonidie, e různé tvary mikrokonidií 23

24 Pro určení druhu jsou nejtypičtější makrokonidie. Sledujeme u nich počet buněk, velikost, tvar zahnutí. U mikrokonidií je charakteristický tvar, velikost a způsob vzniku. U některých druhů se vyskytují hojně chlamydospóry, které jsou různého tvaru a velikosti, o různém počtu buněk, často se zbarvenou stěnou, která mívá i bradavičnatou strukturu. Chlamydospóry vznikají buď na konci vláken, nebo mezi buňkami vlákna. Vedle chlamydospór některé druhy tvoří blastokonidie. U rodu Fusarium se setkáváme také se sklerocii tuhými kulovitými útvary. Mnohé druhy tvoří plodničky perithecia (Ostrý, 2006). Jak již bylo uvedeno, patří rod Fusarium mezi polní plísně, které se v klimatických podmínkách naší republiky vyskytují nejčastěji. Zástupci tohoto rodu se vyskytují především v obilovinách (např.: ječmen, pšenice, tritikale). Mezi další potraviny, kde můžeme tyto zástupce nalézt, patří: čirok, brambory, banány, sójové boby, arašídy, rajčata, lilek, rýže, fazole, pepř, cukrová řepa, paprika, česnek, ovoce a hlavně kukuřice (Zedníková aj., 2006). Jedna z nejčastějších chorob vyvolaná rodem Fusarium je sněť hlavová (FHB) v pšenici a méně běžně v ječmeni. FHB je častá v mírných podnebných pásmech. Dvě odrůdy rodu Fusarium byly izolovány z FHB a to: Fusarium graminearum a Fusarium culmorum. Z napadených plodin jsou často izolovány i jiné druhy například: F. verticillioides, F.crookwellense a F. avenaceum, avšak většinou jsou přítomné i druhy Fusarium graminearum a Fusarium culmorum. Následující druhy se vyskytují méně často a při nižších teplotách, ale i přesto je lze z plodin izolovat: Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae a F. equiseti (Dabrowski, 2005). Vzhledem k zaměření diplomové práce je třeba se poukázat i druhy, které napadají především kukuřici. Nejvýznamnější zástupci vyskytující se na palicích kukuřice je kmen F. graminearum, který nejčastěji produkuje mykotoxiny deoxynivalenol a zearalenon, a kmen F. moniliforme (syn.= F. verticillioides (Saccardo)) nejčastěji produkující fumonisiny. F. graminearum je růžovo-červená plíseň, která se po palici obvykle rozšiřuje z vrchních částí listenů kukuřice nebo kolem požeru zavíječe kukuřičného, zatímco bíle zbarvená plíseň F. moniliforme má tendenci se šířit po vláscích bliznách. Při společném výskytu na jedné palici, tak jak to může být i mezi jinými kmeny, může jeden kmen převažovat nad tím druhým. To však záleží na průběhu teplot v daném roce a lokalitě. F. moniliforme může mít výhodu v teplejším období a sušších rocích. Zvláště 24

25 pak, když během optimálního období pro růst F. graminearum (tj. během července až září) bude nižší vlhkost prostředí (Reid a kol., 1999). Celkově stupeň napadení zrn polními plísněmi závisí, díky jejich nárokům na vlhkost prostředí, především na klimatických podmínkách v době dozrávání a sklizně. Ve vlhkých a deštivých letech může být napadena i více než polovina porostů. Naopak suchá léta většinou růst polních plísní omezují. Kromě vlhkosti prostředí, rozvoj polních plísní a následná kontaminace kukuřice mykotoxiny závisí i na míře mechanického poškození zrn hmyzem, konkrétně zavíječem kukuřičným. Mechanické poškození zrna zvyšuje výskyt plísní díky tomu, že narušené zrno je polními plísněmi napadáno přednostně. Velmi často také dochází k tomu, že plíseň do zrna prorůstá z napadeného vřetene palice. Pokud se zrno po sklizni vysuší co nejrychleji, nejlépe pod 14 % vlhkosti, nejsou tyto plísně schopné dalšího růstu. Polní plísně většinou nepoškozují zárodek zrna, nezpůsobují biochemické změny ani samozahřívání (Chloupek aj., 2005). Obr. 6 Fusarium moniliforme (syn.= F. verticillioides (Saccardo)) Vysvětlivky: a Fusarium moniliforme na kukuřici, b makrokonidie F. moniliforme Mezi další významné druhy vyskytující se v potravinách náleží: Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. longipes, F. moniliforme, F. oxysporum, F. poae, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichioides a Fusarium subglutinans. V rodu Fusarium jsou zastoupeny i některé významné patogenní druhy. Jsou známy jako původci hyalohyfomykózy člověka. U relativně zdravých jedinců se jedná nejčastěji o mykotickou keratitidu, onychomykózu nebo o formu subkutánní mykózy 25

26 projevující se jako cysta nebo absces. V případě celkového oslabení organismu se mohou onemocnění rozvíjet jako systémové oportunní infekce. Nejběžnějšími původci jsou F. solani, F. oxysporum apod., případy lokalizovaných a systémových mykóz byly rovněž popsány u F. aquaeductum, F. chlamydosporum, F. proliferatum, F. sacchari a F. subglutinans. Laboratorní diagnóza infekcí vyvolaných rodem Fusarium je založena na histologickém vyšetření bioptických vzorků, v případě systémové formy na relativně časté pozitivitě hemokultivace. Byl rovněž vyvinut exoantigenní test pro identifikaci nejdůležitějších patogenních druhů. Pro izolaci fuzárií z potravinových surovin a potravin jsou v mykologii potravin doporučeny následující živné půdy: Czapek Iprodione Dichloran agar (CZID) Dichloran Chloramfenikol Pepton agar (DCPA) Pentachloronitrobenzen Pepton agar (PCBPA) Bramboro-glukózový agar s chloramfenikolem (PDA) Ke stimulaci tvorby makrospor se používají: Carnation-leaf agar (CLA) Syntetic nutrient agar (SNA) Někteří odborníci se rovněž zabývali přípravou diagnostických živných půd, které by sloužili k rychlé identifikaci a rozlišení fuzárií (konkrétně se jednalo o taxonomickou selekci Liseola, do které spadají např.: F. moniliforme, F. subglutinans aj.) (Malíř, Ostrý aj., 2003) Mykotoxiny, které produkují plísně rodu Fusarium, se označují jako fuzáriové mykotoxiny. Pro všechna hospodářská zvířata jsou fuzáriové mykotoxiny toxické. Závažnost intoxikace však závisí na specifickém toxinu, stupni a délce trvání expozice a na druhu zvířete. Nejběžněji se vyskytují trichothecenové mykotoxiny (deoxynivalenol, T-2 toxin), dále zearalenon, fumonisiny a verukariny (Zedníková aj., 2006) Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Fusarium T-2 toxin V roce 1968 byl poprvé T-2 toxin izolován Bamburgem z kultury Fusarium sporotrichioides Sherb., nesprávně identifikované jako Fusarium tricinctum. Tento toxin je snadno produkován během fermentace na Czapek-Doxově médiu obohaceném peptonem. T-2 toxin se řadí mezi významné zástupce mykotoxinů trichothecenové 26

27 skupiny. Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny (Malíř, Ostrý aj., 2003). Je produkován hlavně kmeny Fusarium poae, Fusarium solani a Fusarium sporotrichioides z jiných rodů pak Trichoderma lignorum. Existuje ale mnoho dalších producentů. Nejpravděpodobnější iniciála jeho škození je schopnost inhibice syntézy proteinů na polyribozomech či změny struktury membrán. Působí převážně kožní problémy, často se vyskytují krvácivá ložiska v oblasti hlavy a pohlavních orgánů zvířete. U prasat způsobuje nejčastěji poruchy reprodukce, u skotu sníženou imunitu telat, poruchy srážlivosti krve a hemoragie. Typickým projevem je hemoragický syndrom vedoucí ke značné ztrátě krve krvácením do střev a břišní dutiny, často končící uhynutím. T-2 toxin je známý svojí vysokou akutní toxicitou. U lidí je T-2 toxin vyvolávajícím či spoluvyvolávajícím faktorem nemoci tzv. Nemoci tří D (dermatitis, diarrhoea, demence) Pelagry (Ostrý, 2006). Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC/WHO) řadí T-2 toxin do kategorie 3, tj. zatím není klasifikován jako karcinogen pro člověka, i když např. u myší byla karcinogenita po podání toxinu pozorována. T-2 toxin je také považován za jednoho z pravděpodobných původců mykotoxikózy alimentární toxické aleukie (ATA) (Malíř, Ostrý aj., 2003). ATA probíhá ve třech fázích. V první dochází k prudkému nástupu příznaků bráně vstupu. Jde zpravidla o trávicí ústrojí záněty sliznice, zvracení, průjmy, které mohou být i krvavé. Ve druhé fázi se pak dostavuje zdánlivá úleva, doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek (úbytek červených krvinek u těžších případů nastává později). V poslední, třetí, fázi jsou nemocní postiženi jednak bakteriálními infekcemi, a to banální a pro zdravého člověka neškodnou flórou, jednak krvácením (i vykrvácení žen během menstruace). Často bývají postiženy krční mandle, proto byla choroba známa i po synonymem septická angína. Přeživší nemocní se dostávají do několikaměsíčního období rekonvalescence. Při chorobě je důležitý zejména přísun plnohodnotných bílkovin, který poněkud kompenzuje pokles proteosyntézy vyvolaný trichotheceny. Existence toxických látek v napadeném obilí byla při výzkumu ATA prokázána už ve 30. letech, ale pregnantní důkaz spojitosti této choroby s T-2 toxinem provedl až v 70. letech Ueno, Ačkoliv je T-2 toxin běžným kontaminantem krmiv rostlinného původu, v potravinách se vyskytuje méně často. Byl nalezen v ječmeni, kukuřici, ovsu, žitu, pšenici, fazolích, koření a pivu (Šimůnek, 2004). 27

28 Už méně je znám fakt, že s tímto mykotoxinem musíme počítat také v souvislosti s jeho možným zneužitím k vojenským nebo teroristickým účelům. A to proto, že získání tohoto mykotoxinu biotechnologickými metodami nepředstavuje žádný odborný problém pro výrobu, je dostatečně odolný, neničí se autoklávováním a nerozkládá se na světle. T-2 toxin může být požit, vdechnut nebo vstřebán kůží či sliznicí. Jeho účinky na kůži jsou podobné yperitu. Všechny tyto vlastnosti stejně jako mechanismus účinku, tzn. inhibice syntézy proteinů a nukleových kyselin, inaktivace různých enzymů a inhibice funkce mitochondrií, přímo vybízí k jeho zneužití (Vacková, 2006) Deoxynivalenol (DON) DON nezávisle na sobě objevili Yoshizawa a Mooroka v roce Jeho producenty jsou Fusarium culmorum, F. graminearum, F.poae, F. sporotrichioides. Jiné názvy známé pro DON: Rd toxin a vomitoxin. Patří také mezi trichotheceny (Malíř, Ostrý aj., 2003). DON je patrně nejfrekventovanější a zřejmě nejvíce se vyskytujícím trichothecenem v potravinách a krmivech. Společně s T-2 toxinem jsou původci alimentární toxické aleukie (Richard, 2007). Je spojován se vznikem akutních mykotoxikóz Asii. V roce 1980 došlo v Indii a v Číně ke vzniku mykotoxikózy tzv. otravě červenou plísní. Na základě současných poznatků akutní DON mykotoxikóza pro populaci ČR nehrozí (Ostrý a kol., 2001). Deoxynivylenol také ovlivňuje negativně funkce trávicího traktu zvířat, a to má za následek snížené vstřebávání živin, snížení přírůstků a zhoršení růstu. Kromě toho vykazuje také zánětlivé a imunosupresivní účinky. K velmi citlivým zvířatům na DON patří zejména prasata. Postižená zvířata odmítají krmivo, zvrací a trpí průjmy. K dalším projevům intoxikace patří poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích, aborty u březích samic či náhlý úhyn. Přežvýkavci jsou opět méně vnímaví, působení DON se projevuje např. snížením mléčné produkce, sníženou konverzí krmiva a průjmy (Böhm, 2006). Deoxynivalenol byl nalezen v mnoha druzích potravin: obiloviny a výrobky z nich, dětská výživa z obilovin, různé druhy kukuřice, chleba apod. DON je pravděpodobně nejběžnější mykotoxin kontaminující potraviny a krmiva z obilovin. Kontaminace deoxynivalenolem může být při pěstování eliminována dodržováním zásad správné zemědělské praxe a použitím vhodných agrotechnických opatření a prostředků na ochranu rostlin. V krmivech se nachází poměrně vysoké koncentrace 28

29 DON. Krmivem je přenos na skot možný, ale v mléce jsou koncentrace DON extrémně nízké a přechod reziduí DON do masa, mléka nebo vajec je také zanedbatelný (Malíř, Ostrý aj., 2003) Zearalenon (ZEA) Tento mykotoxin byl izolován z kultury Gibberella zeae. Je dalším metabolitem rodu Fusarium. Původní název pro zearalenon byl F-2 toxin. Z chemického hlediska je charakterizován jako lakton β-resorcylové. V současné době bylo izolováno 15 derivátů základní struktury zearalenonu. Mezi producenty zearalenonu lze zařadit: F. culmorum, F. equiseti, F. moniliforme, F. oxysporum, F. graminearum, F. sambucinum, F. semisectum a Fusarium sporotrichioides. Z nichž se jako nejvýznamnější uvádí Fusarium graminearum (obrázek 7) a F. semisectum. Obr. 7 Fusarium graminearum Sice je zearalenon méně toxický než některé jiné mykotoxiny ( i akutní toxicita je nízká), avšak svými estrogenními účinky, při nichž poškozuje receptory estrogenů, způsobuje hyperestrogenismus a pokles plodnosti v chovech hospodářských zvířat. Bývá označován jako nesteroidní hormon (Nedělník, Moravcová, 2006). S ohledem na jeho estrogenní účinky se někdy používá i označení mykoestrogen. Zearalenon a některé jeho metabolity mají schopnost se vázat na estrogenní receptor v proteinech cytosolu a tak působit jako antagonisté estrogenu. U mladých jedinců je tento efekt výraznější (Velíšek, 2002). Mnoho problémů s reprodukcí v chovech je způsobeno právě tímto toxinem, kdy blokuje funkci přirozených hormonů (díky strukturní podobnosti se steroidními hormony estrogeny) a způsobuje zvětšení vulvy, dělohy a vaječníků, výhřezy pochvy a rekta, tvorbu folikulárních cyst, poruchy říje, plodnosti, vývoje plodu a podobně. To může mít za následek následnou infertilitu, popř. úhyn 29

30 zvířat z důvodu bakteriální infekce vyhřeznutých orgánů. Nejcitlivější na zearalenon jsou prasata, méně pak skot a drůbež. S výskytem zearalenonu se můžeme setkat v pšenici, ječmenu, ovsu a hojně v kukuřici. Zearalenon není pravděpodobně karcinogenní, i když podporuje rozvinutý karcinom. Ve skladovaném obilí je velmi stabilní, ani mechanické zpracování jej neničí, zůstává nezměněn i po tepelném zpracování či fermentaci. Závažný je přechod tohoto mykotoxinu do mléka, kam se dostává od krav ze zearalennony kontaminovaného krmiva (Hrdina aj., 2004) Fumonisiny Fumonisiny jsou relativně nově popsaná skupina mykotoxinů produkovaných druhy rodu Fusarium spp., konkrétně Fusarium moniliforme a částečně F. proliferatum, popř. dalšími kmeny rodu Fusarium, kteří neprodukují trichotheceny. Tyto patogeny jsou nejčastěji izolovány na kukuřici a na kukuřičných produktech (Richard, 2007). Podrobněji o fumonisinech v kapitole 6. 30

31 5 PREVENCE VÝSKYTU MYKOTOXINŮ V POTRAVINÁCH Prevence plísňové a mykotoxinové kontaminace je obtížná, neboť přítomnost plísní v zrninách a pícninách je ovlivňována řadou obtížně kontrolovatelných faktorů. Výskyt mykotoxinů má několik základních příčin, mezi nejdůležitější patří: Sklizeň vlhkých nevyzrálých obilovin, mechanické poškození povrchu zrna při nešetrné manipulaci při sklizni, skladování obilovin ve vlhkých a nevětraných prostorách Sušení, případná fermentace, resp. další manipulace s kořením, olejnatými ořechy, kávovými boby, ovocem volně na vzduchu při nevyhovujících hygienických podmínkách, při vysoké vlhkosti (časté srážky) a vysoké teplotě Použití poškozeného a zaplísněného ovoce k výrobě ovocné šťávy Delší uchovávání pečiva v nevyhovujících podmínkách (vyšší vlhkost) v domácnosti Zkrmování zaplísněných krmiv (kontaminace mléka, vnitřnosti) Z uvedených příkladů vyplývají preventivní opatření pro zábranu výskytu mykotoxinů v potravinách (Komprda, 2004). Tato preventivní opatření tedy zahrnují: Střídání plodin v osevních postupech, omezit vliv předplodin, riziková je z tohoto pohledu především kukuřice Zpracování půdy Výběr vhodné odrůdy, hybridu Protiplísňové ošetření osiv (fungicidy mořidla) Vyrovnaná výživa porostů Boj proti škůdcům a chorobám Boj proti plevelům (rezervoarní organismy) Šlechtění odrůd odolných proti houbovým chorobám a škůdcům (GM odrůdy) Dodržování všech agrotechnických zásad při pěstování kulturních plodin Udržování porostů v dobrém zdravotním stavu Využitím atoxigenních kmenů konkurenčně vyloučit z prostředí toxigenní plísně 31

32 Zabránit mechanickému poškození zrna (při sklizni a uskladnění nebo jakékoliv manipulaci) Kvalitní ošetření a uskladnění krmiv po sklizni Po sklizni cereálií do 48 hodin snížit vlhkost pod 14 % (Velíšek, 2002) Nesklízet vlhké, nevyzrálé suroviny (v případě nutnosti obiloviny dosoušet) Provádět patřičnou posklizňovou úpravu obilovin K výrobě ovocných šťáv používat pouze vytříděné, nepoškozené a plísní nenapadené ovoce Hospodářským zvířatům nepodávat zaplísněná krmiva (Komprda, 2004). 32

33 6 FUMONISINY Jak již bylo předestřeno fumonisiny jsou poměrně novou skupinou mykotoxinů. Poprvé byly objeveny a izolovány v roce 1988 v Jihoafrické republice z kukuřice, která byla napadena plísní Fusarium moniliforme. V současné době jsou intenzivně studovány (Soriano et al., 2004). Za hlavní producenty fumonisinů se považují plísně Fusarium moniliforme a Fusarium proliferatum. Z méně významných pak lze jmenovat Fusarium anthophilum, F. oxysporum, F. dlaminii, F. nygamai a Fusarium napiforme. Údajným producentem fumonisinů (konkrétně fumonisinu B 1 ) je i Alternaria alternata. Tento údaj však nebyl znovu potvrzen (Malíř, Ostrý aj., 2003). V současnosti je známo přes 20 různých fumonisinů a jejich metabolitů (např. A 1, A 2, B 1, B 2, B 3, B 4, C 1, C 2, C 3, C 4, P 1, P 2, P 3, aj.). Nejrozšířenější jsou fumonisiny řady B B 1, B 2 a B 3, z nichž nejtoxičtější a nejvíce zastoupeným je fumonisin B 1 (obvykle představuje okolo 70 % celkového obsahu fumonisinů). Fumonisiny řady B se běžně vyskytují v přírodě, jako kontaminanty potravin a krmiv (Malíř, Ostrý aj., 2003). Z chemického hlediska jsou fumonisiny diestery různých 2-amino-12,16- dimethylpolyhydroxyeikosanů, které mají hydroxylovou skupinu na C 14 a C 15 esterifikovanou propan-1,2,3-trikarboxylovou kyselinu. Z hlediska způsobu biosyntézy patří fumonisiny mezi nonaketidy. Obr. 8 Fumonisin B 1 Obr. 9 Fumonisin B 2 33

34 6.1 Toxické účinky Fumonisiny jsou strukturně podobné sfinganinu a sfingosinu a mohou tak uplatnit svou biologickou aktivitu v blokaci biosyntézy sfingolipidů (Ruprich, Ostrý, 1998). Bylo prokázáno, že fumonisiny inhibují biosyntézu sfingolipidů (sfingomyelinu a glykosfingolipidů), které se vyskytují ve větším množství v mozku a nervové tkáni a jsou potřebné pro stavbu a fyziologickou činnost buněčné stěny. Obr. 10 Sfinganin Obr. 11 Sfingosin Při inhibici biosyntézy sfingolipidů dochází k útlumu ceramidsyntázy (sfinganin a sfingosin N-acetyltransferázy). Důsledkem tohoto útlumu je akumulace produktů sfinganinu a sfingosinu, jejich 1-fosforylovaných metabolitů a zároveň snížení koncentrace komplexních sfingolipidů (ceramidů). To také bylo prokázáno u poníků, prasat, potkanů, opic. Nejvíce postiženými orgány u těchto zvířat byla játra, plíce, ledviny. Účinek fumonisinů na ledviny se zjišťuje na základě vyšetření sfinganinu a sfingosinu a následného sledování změny poměru sfinganin/sfingosin v moči a také v ledvinách. (Voss et al., 2007) Obr.12 Schéma metabol. sfingolipidů ukazující inhibici ceramidsyntázy fumonisiny 34

35 Právě hodnota poměru sfinganin/sfingosin v moči, krevním séru a ve tkáních byla navržena jako možný biomarker expozice fumonisinům i u člověka (Malíř, Ostrý aj., 2003). Tento poměr však lze účinně využít jen v průběhu expozice, respektive v krátké době po expozici, vzhledem k toxikokinetickým vlastnostem. O fumonisinech je totiž známo, že rychle mizí z krve, jejich akumulace v tkáních je nízká a ani vstřebávání v GIT (gastrointestinální trakt) není vysoké (Voss et al., 2007). Toxické účinky fumonisinů byly pozorovány a následně experimentálně ověřeny u hospodářských a laboratorních zvířat. Relativně nejnebezpečnější jsou pro koně, osly, prasnice a ovce, u kterých jsou jako důsledek příjmu kontaminovaného krmiva nejčastěji popsána závažná onemocnění typu encefalomalácie (ELEM). Jedná se o smrtelné onemocnění postihující mozek, játra, ledviny. Projevuje se svalovým třasem, poruchami koordinace pohybů, vrávoravou chůzí, natažením nohou a krku a může vést až celkovému ochrnutím (Böhm, 2006). Na leukoencefolomalacii uhynulo v roce 1995 v Kentucky a Virginii 38 koní. Bylo zjištěno, že přibližná dávka fumonisinu B 1 (FB 1 ) a B 2 (FB 2 ) vyvolávající ELEM u koní je asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Z dalších závažných onemocnění lze jmenovat plicní edém prasat (přibližně se jedná o dávku 100mg/kg tělesné hmotnosti), proximal jejunitis syndrom u koní a nádorové onemocnění jater u laboratorních potkanů (přívod zhruba 15 mg/kg tělesné hmotnosti) (Malíř, Ostrý aj., 2003). U drůbeže fumonisiny vyvolávají tzv. syndrom toxicity krmiva, při kterém dochází ke snížení hmotnosti, ke zvětšení jater a ke snížení produktivity. Bylo prokázáno, že působí synergicky s aflatoxiny při vzniku karcinomu u pstruhů (Morgavi, Riley, 2007). Mimo tato onemocnění byly zjištěny u imunotoxické a teratogenní účinky fumonisinů. Z těchto důvodů v USA Food and Drug Administration (FDA) doporučilo, aby koně, prasata, skot a drůbež nebyli krmeni krmivy s vyšším obsahem fumonisinů než 1, 10, 30 a 50 mg/kg krmiva. Kromě tohoto je známo, že fumonisiny jsou fytotoxické pro některé kulturní plodiny a plevele (Malíř, Ostrý aj., 2003). Dochází ke ztrátě elektrolytů a k vzájemnému ovlivňování s komplexem fytosfingolipidů (Voss et al., 2007). Bylo zjištěno, že fumonisin B 1 a ostatní fumonisiny vykazují pozdní toxické účinky a podle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny Světové zdravotnické organizace (IARC-WHO), jsou fumonisiny klasifikovány jako možné karcinogeny pro člověka (třída 2B). Lze předpokládat, že jsou příčinou vzniku karcinomu jícnu (Ostrý, 2006). V Číně, v severovýchodní oblasti Itálie a v některých oblastech Jižní Afriky, kde je pozorován vysoký výskyt karcinomu jícnu, byl fumonisin B 1 v kukuřici pozorován 35

36 častěji a ve vysokých koncentracích (Morgavi, Riley, 2007). V roce 1997 byl pozorován ve 27 vesnicích v Indii hromadný výskyt onemocnění u venkovského obyvatelstva ve spojitosti s požíváním zaplísněné kukuřice a čiroku. Příznaky onemocnění byly provázeny bolestmi břicha, průjmy, které se dostavily během několika málo hodin po požití chleba ze zaplísněné kukuřice, ve které byl prokázán ve vysoké koncentraci fumonisin B 1. V těchto oblastech může navíc docházet k adici a potenciaci nežádoucích účinků fumonisinů na lidské zdraví z důvodu synergického působení dalších mykotoxinů např. aflotoxinů, T-2 toxinu, které se v menších koncentracích vyskytují v potravinách a krmivech také (Malíř, Ostrý aj., 2003). Dalším onemocněním, které pravděpodobně souvisí s fumonisiny je anencefálie. Byly zaznamenány 2 případy, kdy u dětí nedošlo k vyvinutí mozku a lebka zcela chyběla (Morgavi, Rilay, 2007). 6.2 Výskyt v potravinách K nejvýznamnějším zdrojům fumonisinů patří kukuřice, krmiva a potraviny na bázi kukuřice. Nejčastěji se v kukuřici vyskytuje fumonisin B 1 a B 2, ale také B 3. Přibližně 70 % celkové koncentrace fumonisinů v kukuřičných zrnech byl nejvíce zastoupený FB 1, a to v poměru 3:1 (FB 1 :FB 2 ) a v poměru 12:1 (FB 1 :FB 3 ) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Jak bylo dokázáno plísně rodu Fusarium (např. i Fusarium moniliforme či v menší míře F. proliferatum produkující fumonisiny) jsou izolovány ze všech částí rostliny kukuřice. Způsobují poškozování vzcházejících rostlin, vyvolávají hnilobu stébel a palic a v neposlední řadě také poškození zrn. Podle nejnovějších poznatků jsou ale listy a stébla v případě silné infekce zatíženy stejně jako palice. Ke kontaminaci dochází již v průběhu vegetace a stejně tak jsou v tomto období již detekovatelné významné hladiny toxických látek. Obsah mykotoxinů narůstá v posledních pěti až šesti týdnech před silážní zralostí, přičemž napadení je častější na odumřelých pletivech. Na napadení rostlin má vliv celá řada faktorů (např. typ hybridu). Experimenty naznačují, že hybridy kukuřice s rychlejším dozráváním zbytku rostliny vykazují vyšší obsah mykotoxinů. Teoreticky méně napadené by měli být tzv. stay green hybridy, u nichž do posledních fází před sklizní fungují fyziologické procesy. Jedná se především o obranné procesy, které u stay green hybridů pracují na relativně vysoké úrovni na rozdíl od rychle dozrávajících, kdy dozrávající pletiva jsou snadněji napadena mimojité proto, že obranné mechanismy jsou již utlumovány a i tito patogeni mají větší prostor pro napadení (Hrubý a kol., 2005) 36

37 V letech 1995 a 1996 bylo v ČR vyšetřeno 210 vzorků potravin na bázi kukuřice na obsah fumonisinů (FUM). Asi 89 % vzorků bylo pozitivních na obsah FUM v rozsahu ng/g potraviny. Z toho u 4 % vzorků byl obsah FUM větší než 1000 ng/g, u 10 % vzorků vyšší než 500 ng/g a u 38 % vzorků byl obsah FUM větší než 100 ng/g. Maximální koncentrace FUM byly stanoveny ve vzorku kukuřičného chleba (4594 ng/g), extrudovaných kukuřičných výrobků crips (1178 ng/g) a ve vzorcích polenty (1243 ng/g). Poměrně nízké koncentrace fumonisinů byly stanoveny u potravin jako je cornflakes (max. 328 ng/g) nebo popcorn (max. 128 ng/g) Dále bylo vyšetřeno 127 vzorků kukuřičných potravin pro bezlepkovou dietu a 88 % bylo pozitivních na obsah fumonisinů (Ruprich, Ostrý, 1998?). Fumonisiny byly dále nalezeny v nudlích, koření (např. kari, kari pastách, chilli papričkách), pivu a chlebě. Je diskutována i možnost vzniku reziduí fumonisinů v potravinových surovinách živočišného původu (např. mléce) po konzumaco krmiv na bázi kukuřice s vysokými koncentracemi fumonisinů. Maragos a Richard v roce 1994 testovali na obsah fumonisinů 165 vzorků syrového mléka metodou HPLC a ELISA. Pouze jeden vzorek byl pozitivní (Malíř, Ostrý aj., 2003) Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva (RASFF) Systém RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) slouží pro ohlašování rizikových potravin a krmiv za účelem zamezení jejich uvádění do oběhu nebo za účelem jejich stažení ze společného evropského trhu. Základním kritériem pro oznámení zasílané prostřednictvím Systému Rychlého varování pro potraviny a krmiva je poznatek, že rizikový výrobek (potravina) představuje přímé nebo nepřímé riziko pro zdraví a bezpečnost spotřebitele. V případě mykotoxinů v potravinách se jedná především o překročení limitů stanovených předpisy Evropských společenství (ES). V rámci systému RASFF existují tři kategorie oznámení: Varování (Alert notification) Informace (Information notification) Novinka (News) V případě Originální oznámení varování se jedná (vztaženo na mykotoxiny) o záchyt mykotoxinů v potravinách, které se vyskytují na trhu (obchodní síti), a tudíž je zapotřebí okamžitě zajistit závaznými normami. V případě Originální oznámení informace se 37

38 jedná o záchyt mykotoxinů v potravinách, které byly zadrženy na hranicích popř. v celním skladu před proclením nebo byly zachyceny náhodně a je nutno zabránit jejich vyvážení do jiného členského státu EU. Oznámení novinka (News) poskytuje informace vztahující se k bezpečnosti potravin, které nebyly oznámeny členským státem jako varování nebo informace, ale které jsou považovány za důležité pro dozorové orgány členských států, může se jednat i o informace organizačního rázu (Ostrý, 2006). Přehled originálních oznámení varování (Alert nortification), týkající se fumonisinů, členských států EU hlášený v systému RASFF v letech je uveden v tabulkách č. 4 a 5. Tab. 4 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v letech Datum Oznámeno z: Důvod Země původu Rok Holandsko FUM v kuk. mouce Itálie Rok Německo FUM v kuk. otrubách Německo Německo FUM v kuk. mouce Itálie Německo FUM v bezglutenových špagetách Itálie Holandsko FUM v kuk. mouce Itálie Německo FUM v kuk. mouce Itálie Německo FUM v kuk. mouce Itálie Německo FUM v polentě Itálie Německo FUM v bezglutenových špagetách Itálie 38

39 Tab. 5 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v roce 2006 Datum Oznámeno z: Důvod Země původu Rok Německo FUM v bezglut. těstovinách Itálie Německo FUM v kuk.krekrách Rakousko Německo FUM v kuk. lupínky/chleba Německo Německo FUM v bezglut. špagety Itálie Německo FUM v kuk. mouce Itálie Německo FUM v bezglut. těstovinách Itálie Německo FUM v kuk. mouce Itálie Slovinsko FUM v kuk. vločkách Itálie Německo FUM v kuk. chlebu Německo Francie FUM v kuk. mouce Francie Belgie FUM ve směsi cereálií Holandsko Německo FUM v kuk. mouce Itálie Holandsko FUM v kuk. mouce Itálie 6.3 Legislativa Stejně jako ve většině států světa, tak i v České republice jsou mykotoxiny v potravinách a potravinářských surovinách limitovány. Ve všech členských státech EU (tedy i v ČR) jsou limity mykotoxinů stanoveny nařízením (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. Toto nařízení bylo v určitých bodech pozměněno nařízením komise (ES) č. 1126/2007 ze dne 28. září 2007, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o fusariové toxiny v kukuřici a ve výrobcích z kukuřice. V doporučení komise (ES) č. 576/2006 ze dne 17. srpna 2006 o přítomnosti deoxynivalenolu, zearalenonu, ochratoxinu A, T-2 a HT-2 a fumonisinů jsou uvedeny směrné hodnoty pro jednotlivé produkty určené ke krmení zvířat. Pro fumonisiny (suma FB1 a FB2) je to směrná hodnota 60 mg/kg pro krmiva z kukuřice a produktů kukuřice. Pro doplnění lze dodat, pro kukuřici jako krmivo je stanoven obsah nežádoucích látek směrnicí (ES) č. 32/2002 ze dne 7. května 2002 o nežádoucích látkách v krmivech. Z hlediska mykotoxinů je zde stanoven pouze maximální obsah pro aflatoxin B 1. 39

40 Tab. 6 Maximální limity fumonisinů v potravinách kukuřičného původu Bod Potravina Suma FB1 a FB Nezpracovaná kukuřice kromě nezpracované kukuřice určené 4000 µg/kg ke zpracování mokrým mletím. (*) Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě, kukuřičné potraviny 1000 µg/kg k přímé lidské spotřebě kromě potravin uvedených v bodech a Kukuřičné snídaňové cereálie a svačinky z kukuřice 800 µg/kg Kukuřičné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti Mleté frakce kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů kódu KN nebo a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN µg/kg 1400 µg/kg Mleté frakce kukuřice s velikostí částic 500 mikronů kódu KN a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu µg/kg (*) Výjimka se týká pouze kukuřice, u které je zřejmé, např. na základě označování, místo určení, že je určena pouze k použití v procesu mokrého mletí (výroba škrobu). 6.4 Stanovení fumonisinů Ke stanovování látek jsou důležité jejich analytické vlastnosti, stejně tak je tomu i u fumonisinů. Z chemické struktury těchto mykotoxinů vyplývá, že se jedná o polární látky. Jsou tedy rozpustné v polárních rozpouštědlech, např. voda, acetonitril, methanol či jejich směsi a nerozpustné v nepolárních rozpouštědlech. Práce s fumonisiny probíhá v neutrálním či slabě kyselém prostředí (zvyšuje jejich ionizaci a tím i rozpustnost). V alkalickém prostředí částečně či úplně hydrolyzují. Mezi podstatné vlastnosti pro stanovení fumonisinů patří i nedostatek UV chromoforů, což je ovšem pozorováno i u některých jiných mykotoxinů (Voss et al., 2007) Příprava vzorku Stanovení fumonisinů se skládá z několika na sebe navazujících kroků, z nichž každý rozhoduje o výsledku analýzy. Významným krokem je příprava vzorku tzn. jeho homogenizace, extrakce a úprava vzorku před vlastním stanovením. Při extrakci dochází k rozpuštění fumonisinů do roztoku (volné a vázané fumonisiny) a k odstranění 40

41 matrice. Pro odstranění matrice při extrakci se u homogenizovaného vzorku fumonisinů využívá buď kapalinová extrakce nebo kontinuální superkritická fluidní extrakce (SFE) oxidem uhličitým. Kapalinová extrakce vzorku organickým rozpouštědlem (acetonitril/voda, methanol/voda, voda) se provádí nejlépe na laboratorní třepačce (třepání nejčastěji 30 min) nebo na homogenizátoru. Výtěžnost u tohoto typu extrakce je cca %. Naproti tomu je extrakce SFE oxidem uhličitým, který je modifikovaný organickým rozpouštědlem, rychlejší a asi čtyřicetkrát účinnější než kapalinová extrakce. Úpravou vzorku před vlastním stanovením se rozumí čištění extraktu. Čištění extraktu je nejpracnější a časově nejnáročnější částí postupu analytického stanovení. Vzorky fumonisinů jsou čištěny jednak na imunoafinitních kolonkách jednak na SPE kolonkách (solid phase extraction) plněných iontoměničem, reverzní fází či imunosorbentem (Voss et.al, 2007). Imunoafinitní kolonky Obr. 13 Příklady čištění extraktu na kolonkách SPE kolonky Extrakce na imunoafinitních kolonkách se v současné době používá častěji a to pro svoji vysokou specificitu, menší spotřebu organických rozpouštědel a menší časovou náročnost. Při čištění na imunoafinitních kolonkách se nechá přefiltrovaný a zředěný extrakt fumonisinů pomalu prokapat imunoafinitní kolonkou. V této fázi dochází k reverznímu specifickému spojení mezi protilátkami v kolonce a mykotoxinem z extraktu. Po promytí kolonky speciálním promývacím pufrem je mykotoxin v procesu desorpce (uvolnění adsorbovaných molekul z povrchu látky) z kolonky vyluhován eluční směsí (nejčastěji methanol, methanol/acetonitril apod.) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Klasickou technikou na SPE kolonkách je nejprve extrakt mykotoxinu odpařen na rotační vakuové odparce a obnoven v malém množství rozpouštědla. Po zasáknutí 41

42 obnoveného extraktu do náplně kolonky je chromatografický sloupec promýván doporučenými elučními soustavami, nejčastěji dvěma. První eluční směsí nebo rozpouštědlem se vymývá část koextračních látek, většinou lipidů a většinou lipidů a mykotoxin zůstává na startu kolonky. Druhou eluční směsí se ze sloupce vymyje mykotoxin (Malíř, Ostrý aj., 2003). Po těchto krocích je vzorek připraven k vlastnímu stanovení Metody stanovení Fumonisiny mohou být stanovovány chromatografickými metodami či metodami imunochemickými Plynová chromatografie (GC) GC je metoda separační a současně analytická. Umožňuje kvalitativní a kvantitativní analýzu plynných vzorků, popř. veškerých těkavých látek (kapaliny či tuhé látky), pokud je lze před separací převést v páry. Jak již ale bylo zmíněno fumonisiny mají vysokou polaritu a relativně vysokou molekulovou hmotnost (721,8). Jsou proto málo těkavé a pro stanovení plynovou chromatografií málo vhodné. Pro jejich stanovení pomocí GC by bylo nutné zvýšit jejich těkavost derivatizací (Voss et al., 2007) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokotlaká kapalinová chromatografie (High pressure liquid chromatography) je separační a současně analytická fyzikálněchemická metoda pro separaci a analýzu směsí, jejímž základním principem je rozdělování složek směsi mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fází je v případě HPLC kapalina. Stacionární fází je příslušný film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo na pevný adsorbent (Coufal, 2004). V chromatografii se uplatňují v různé míře vzájemné interakce mezi molekulami stacionární a mobilní fáze a mezi molekulami vzorku. Volbou mobilní a stacionární fáze lze ovlivnit proces separace a tím měnit eluční hodnoty separovaných složek. Mobilní fáze je silně polární a obvykle se jedná o směs vody a polárního organického rozpouštědla např. acetonitrilu, methanolu apod. Kapalinový chromatograf se skládá z částí, které zajišťují transport mobilní fáze, separaci složek, jejich detekci a automatický záznam. Schéma chromatografu je znázorněno na obrázku 14 (Malíř, Ostrý aj., 2003). 42

43 K separaci fumonisinů se používá především HPLC. A to především HPLC s fluorescenční detekcí nebo hmotnostní detekcí. Fotometrická detekce v UV či viditelné oblasti spektra je u těchto mykotoxinů velmi málo citlivá, což je způsobeno tím, že fumonisiny nemají silný chromofor (=uspořádání atomů v molekulách organických látek, jež způsobuje barevnost sloučeniny). Vzhledem k této jejich vlastnosti zavádí se do molekuly fumonisinů tzv. fluorofor (fluorescenční barvivo) a to reakcí vhodného činidla s aminoskupinou fumonisinů. Takto upravený vzorek je poté běžně detekován na fluorescenčím detektoru (Voss et al., 2007). Obr. 14 Schéma chromatografu ELISA ELISA (enzym linked immuno sorbent assay) je analytická metoda využívaná ke stanovení různých antigenů. Metoda je založena na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný nebo fluoreskující. Tento produkt se poté stanovuje spektrometricky nebo fluorometricky. Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul (Prknová, 2006). 43

44 Při stanovování fumonisinů touto metodou je velkou nevýhodou tzv. křížová reaktivita (crossreactivity), kdy jsou neselektivně stanovovány fumonisiny B 1, B 2, B 3, a není možné je kvantifikovat samostatně. V prodeji jsou sice i selektivnější ELISA kity ovšem za vyšší cenu. Další nevýhodou je i jejich relativně nižší přesnost a nedostatečná linearita. Tato metoda se tedy využívá spíše pro screening či pro prověřování celkového množství obsahu fumonisinů ve vzorku (Voss et al., 2007). Obr. 15 Schéma průběhu reakce ELISA Ostatní metody stanovení Fumonisiny lze dále stanovit chromatografiií na tenké vrstvě, ovšem tato metoda se používá spíše pro kvantifikaci a screening, nebo kapilární elektroforézou. Kapilární elektroforézou lze stanovit buď nativní fumonisin B 1 nebo fumonisiny derivatizované (Voss et al., 2007). Také bylo publikováno použití detektoru rozptýleného světla (ELSD = Evaporative light scattering detector), jenž vykazuje vyšší citlivost než některé jiné detektory pro stanovení metabolitů a toxických produktů mikroorganismů) ( 7 VÝVOJ METODIKY PRO STANOVENÍ FUMONISINŮ V KUKUŘICI Cílem bylo zavést novou metodiku pro stanovení fumonisinů z kukuřice. Byla provedena inovace standardních postupů pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2. A to 44

45 kombinací vysoce účinné extrakce směsí methanol-acetonitril-voda za použití mixéru UltraTurrax a vysokotlaké kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. 7.1 Materiál a metodika Chemikálie a činidla Octan amonný v analytické čistotě Standardní roztok fumonisinů B 1 a B 2 (koncentrace FB 1 =50,1 ± 0,7 µg/ml, FB 2 =50,2 ± 0,7 µg/ml, v roztoku acetonitril/voda 50=50) Rozpouštědla acetonitril a methanol o vysokém stupni čistoty (zakoupena z Sigma-Aldrich, s.r.o., Praha, Česká republika) Deionizovaná voda (přístroj Demiwa ros, Vatek, s.r.o., Česká republika) Všechny roztoky byly připravovány v deionizované vodě a uskladněny ve tmě při 4ºC, čistý standard fumonisinů v pevném skupenství uchováván při -20 ºC Chromatografické vybavení Byl použitý systém HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA) složený z: vakuového odplyňovacího přístroje (model G1322A) kvarterní pumpy (G1311A) autosampleru (G1313A) kvadrupolového hmotnostního spektrometru (G1946VL) s elektrosprejovou ionizací Pro chromatografické vyhodnocení a řízení chromatografického systému byl použit software ChemStation (Rev. A 10.02) Extrakce Proces extrakce je založen na modifikaci evropské normy EN :2004 Potraviny stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v potravinách s kukuřičným základem metodou HPLC s imunoafinitní čistící kolonou (European Standard EN :2004). Objem 25 ml extračního roztoku (methanol/acetonitril/voda, v poměru 1:1:2) byl přidán k 10 gramům pomletých kukuřičných zrn. Tato směs byla mixována na homogenizátoru Heidolph Diax 900 po dobu dvou minut. K mixování jsme použili třetí rychlostní stupeň mixéru. Vzorek byl centrifugován (Universal 32R, Hettich, Germany) při 4000 ot/min po dobu 5 min a supernatant poté převeden do odměrné baňky o objemu 50 ml. 45

46 Extrakce pevného zbytku byla provedena ještě dvakrát a to jednou s 20 ml a jednou s 15 ml extrakčního činidla a takto získané spojené extrakty doplněny na 50 ml. Před stanovením na HPLC/MS byl extrakt přefiltrován přes polytetrafluoroethylenový membránový filtr (SMI-LabHut Ltd., UK) s póry o velikosti 0,20 µm Analýza pomocí HPLC/MS Separace fumonisinů proběhla na koloně Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; velikost částic 5µm). Pro optimalizaci složení mobilní fáze byly připraveny následující roztoky: voda, octan amonný (1;2;5 nebo 20 mm, jejichž ph bylo upraveno koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 3). Byla použita lineární gradientová eluce (vymývání fumonisinů). Složení mobilní fáze se v průběhu analýzy měnilo. Na počátku analýzy tvořil podíl acetonitrilu v mobilní fázi 33 %, v osmé minutě pak 60 % a v deváté minutě znovu 33 %. Rychlost průtoku mobilní fáze byla 0,8 ml/min. Po každé analýze pak došlo k promývání kolony po dobu šesti minut mobilní fází o stejném složení jako na počátku separace. Celkový čas nutný pro analýzu, včetně kondicionace kolony činil 20 minut. Dávkovaný objem vzorku byl 5 µl. Všechna měření probíhala v laboratoři při teplotě 20 ºC. Obr. 16 Chromatografické vybavení Příprava standardních roztoků a vzorků kukuřice Kalibrační vzorky byly připraveny čerstvé ze zásobního roztoku fumonisinů B 1 a B 2 zředěním a smícháním s příslušným množstvím mobilní fáze. Před analýzou 46

47 uskladněny při 4 ºC na temném místě. Přidáním čistých mykotoxinových standardů do vzorků kukuřice byly připraveny modelové vzorky. Tyto modelové vzorky byly analyzovány jeden den po přídavku mykotoxinů, z důvodu umožnění jejich interakce s matricí. 7.2 Výsledky a diskuze Optimalizace HPLC/MS Abychom dosáhli co možná nejvyšší citlivosti kvadrupolového hmotnostního detektoru bylo nutné optimalizovat hodnoty všech parametrů. Nejprve došlo k optimalizování složení mobilní fáze. Při předběžném experimentu jsme zaznamenali pozitivní vliv kyselého roztoku octanu amonného na ionizaci. Efekt koncentrace octanu amonného byl testován na ionizaci a srovnáván s ionizací neutrální mobilní fáze (acetonitril/voda). Přítomnost octanu amonného v mobilní fázi vede ke zvýšení ionizace. Sledovali jsme účinek různých koncentrací octanu amonného. Nejlepší (nejvyšší) hodnoty byly získány při koncentraci octanu amonného 5 mmol/l. S vyšší koncentrací této soli dochází díky vysoké vodivosti aerosolu k výbojům ve sprejovací komoře, které mají za následek sníženou funkci elektrospreje. Obr. 17 Schématický diagram ESI MS 47

48 Regulace rozpadu nabitých sloučenin je možná úpravou kolizního napětí na fragmentoru. Kvadrupólový hmotnostní detektor toto nastavení napětí na fragmentoru umožňuje. Při nízkém napětí se tvoří sloučeniny kvazimolekulárních iontů se sodíkem nebo se složkami mobilní fáze. Nedochází tak ke vzniku jednou nabitých (protonovaných) kvazimolekulárních iontů a to vede ke snížení intenzity molekulárního signálu. Jestliže se tedy zvýší napětí, zvyšuje se i množství protonovaných kvazimolekulárních iontů a klesá množství sloučenin kvazimolekulárních iontů se sodíkem či s mobilní fází. Nejvyšší intenzity molekulového píku bylo dosaženo při napětí 300 V. Se zvýšením napětí nad tuto hodnotu se signál snižuje. Důvodem ke snižování signálu již není tvorba zmíněných sloučenin se sodíkem (či s mobilní fází) nýbrž fragmentace protonovaných kvazimolekulárních iontů. Závislost intenzity signálu na napětí kapiláry elektrospreje má hyperbolický tvar. Maximální napětí jaké jsme sledovali mělo hodnotu 6000 V. Na ionizaci naopak neměl téměř žádný vliv tlak nebulizéru (rozprašovače). Důležitým se však stalo stanovení správného tlaku dusíku jako sušícího plynu. Při nízkém tlaku dusíku se začaly vyskytovat problémy s nedostatečným odpařováním mobilní fáze, díky jejímu relativně vysokému průtoku (0,8 ml/min) a vysokému obsahu vody. Proto se jako optimální zdál a byl vybrán nejvyšší možný tlak 60 psig. K parametrům jejichž hodnoty byly optimalizovány, patří i průtok sušícího v nebulizéru (rozprašovač, zmlžovač). Při rychlosti průtoku sušícího plynu 12 l/min byla ionizace asi o 20 % vyšší než u průtoků, které takovéto rychlosti nedosahovali. Což bylo opět přisuzováno účinnějšímu odpařování nadbytku mobilní fáze. Protože jsou fumonisiny poměrně termostabilní látky (bod tání ºC ), mohla se použít vysoká teplota sušícího plynu. Při hledání nejvýhodnější teploty se testovalo rozmezí teplot od 150 ºC do 350 ºC. Nižší teploty, respektive teploty pod 200 ºC, znesnadňují ionizaci, protože vysoká vlhkost aerosolu způsobuje výboje. Nejlépe docházelo k ionizaci při teplotě 350 ºC. Problémem tedy byla vysoká rychlost průtoku mobilní fáze a relativně nízký obsah organického rozpouštědla v ní. Na druhou stranu, bylo při optimalizaci dosaženo kompromisu mezi dobou trvání analýzy a ionizací. 48

49 Graf 1 Optimalizace napětí na fragmentoru Graf 2 Optimalizace napětí na kapiláře Graf 3 Optimalizace průtoku plynu ve zmlžovači (nebulizéru) 49

50 Graf 4 Optimalizace tlaku plynu ve zmlžovači Lze říci, že vyvinutá metoda je v porovnání s využitím metody s fluorescenční detekcí rychlejší, protože není třeba před stanovením provádět derivatizaci. Metodu lze aplikovat na vzorky potravin bez potřebné prekoncentrace. Je to dáno detekčními limity pro fumonisin B 1 a B 2. Vyvinutá metoda byla poté použita ke stanovení fumonisinů v několika různých vzorcích mletých zrn kukuřice (kukuřičná mouka). Obsah mykotoxinů v těchto vzorcích byl v rozmezí < LOD 10,878 mg FB 1 /kg a < LOD 2,114 mg FB 2 /kg. U všech vzorků, které byly pozitivní, byl stanovený obsah FB 1 vyšší než FB 2. Toto zjištění se shoduje s výsledky rozborů vzorků přirozeně kontaminovaných plísní Fusarium moniliforme (syn = F. verticillioides (Saccardo)), kde obsah FB 1 tvořil % a FB % z celkového množství fumonisinů (Magan, Olsen, 2004) Výsledky optimalizace MS Nejprve bylo potřeba nalézt nejlepší podmínky pro separaci a ionizaci fumonisinů. Optimalizace separace bylo dosaženo především úpravami mobilní fáze. Sledované parametry hmotnostního detektoru a rozsah jejich hodnot: průtok plynu v nebulizéru (5 13 l/min, interval změny 1 l/min) tlak nebulizéru (20 60 psig, interval 5 psig) teplota sušícího plynu ( ºC, interval 50 ºC) napětí na kapiláře ( V, interval 500 V) 50

51 napětí na fragmentoru (0 400 V, interval 25 V) K optimalizaci hodnot jednotlivých parametrů došlo při detekci pozitivních iontů s použitím ESI/MS. Fumonisin B 1 byl zjišťován jako [FB 1 + H + ] (722,4 m/z) a fumonisin B 2 jako [FB 2 + H + ] (706,4 m/z). Fragmenty m/z 334 a 352 pro FB 1 a m/z 336 a 318 pro FB 2 pak byly využity pro ověření. Optimalizace byla prováděna FIA analýzou (flow injection analysis) s roztoky standardů o různé koncentraci. Nejvhodnější nastavení ESI/MS detektoru bylo tedy takovéto: tlak nebulizéru 60 psig, průtok plynu v nebulizéru 12 l/min, teplota sušícího plynu 350 ºC, napětí na kapiláře 6000 V a napětí na fragmentoru 300 V. Pro přehlednost jsou parametry nastavení shrnuty v tabulce č. 7. Výsledné parametry hmotnostního detektoru jsme porovnali s jinými autory a pro srovnání jsou uvedeny v tabulce č. 8. Tab. 7 Parametry hmotnostního detektoru Parametr Optimální hodnota Rozmezí hodnot Jednotky Průtok sušícího plynu l/min Tlak nebulizéru 60 (414) ( ) psig (kpa) Napětí na kapiláře elektrospreje V Teplota sušícího plynu ºC Napětí na fragmentoru V Tab. 8 Srovnání parametrů hmotnostního detektoru s jinými autory Parametr Labuda Silva Richard (2005) (2009) (2008) Průtok sušícího plyn [l/min] Tlak nebulizéru [kpa] Napětí na kapiláře elektrospreje [V] Teplota sušícího plynu [ºC] Napětí na fragmentoru [V] FB FB Vliv octanu amonného Pro zlepšení ionizace fumonisinů byl použit přídavek octanu amonného do mobilní fáze. Připravili jsme pět testovacích roztoků. Prvním roztokem byla čistá deionizovaná voda. Zbývající čtyři roztoky byly roztoky octanu amonného o různých 51

52 koncentracích (1; 2; 5 a 20 mmol/l). U těchto roztoků octanu amonného jsme pomocí koncentrované kyseliny octové upravili ph na hodnotu 3. Nejlepších výsledků bylo dosaženo po aplikaci 5 mmol/l octanu amonného. Chromatogram čistého standardu znázorňuje graf č. 1. Graf 5 Chromatogram čistého standardu za optimálních podmínek Kalibrační křivka pro čistý standard linearita a limit detekce/kvantifikace V rozmezí koncentrací od 5µg/ml do 0,005 µg/ml (což koresponduje s koncentrací µg/kg) vykazuje vyvinutá metoda velmi dobrou linearitu. Mimo linearitu byl také sledován poměr mezi molekulárními ionty fragmenty molekul fumonisinů. Limit detekce (3x pomět signál/šum) je pro FB 1 0,0124 µg/ml (62,0 µg/kg) a pro FB 2 0,0117 µg/ml (58,5 µg/kg). Limit kvantifikace (rovná se desetinásobku poměru signál/šum) je pro FB 1 0,041 µg/ml (202,7 µg/kg) a pro FB 2 0,040 µg/ml (199,1 µg/kg) (uvedeno v tabulce č. 9). Tab. 9 Kvantifikace FB 1 a FB 2 s limitem detekce, limitem kvantifikace, relativní směrodatnou odchylkou (RSD) a parametry kalibrační křivky Fumon. LOD LOQ RSD r 2 Kalibrač. křivka µg/ml µg/kg µg/ml µg/kg (%; n=6) FB 1 0, ,0 0, ,7 1,95 0,9997 Y=43937x-390,08 FB 2 0, ,5 0, ,1 2,04 0,9997 Y=44927x-399,95 52

53 Graf 6 Kalibrační křivka Extrakce Při vývoji této metodiky jsme se snažili dosáhnout při extrakci co nejvyšší výtěžnosti mykotoxinů. V metodice jež doporučuje ČSN a Evropská norma je užito dvoukrokové extrakce na orbitální třepačce. Při každém kroku této extrakce dochází ke třepání po dobu 20 minut. Při tomto postupu je uváděna výtěžnost fumonisinů B 1 a B 2 75,6 resp. 72 %. Při našem způsobu extrakce jsme použili ponorný mixér (homogenizátor) ultraturrax a vzorky kukuřice byly postupně extrahovány ve třech krocích s 25, 20 a 15 ml extrakční směsi. Každý krok trval 5 minut. Při této podobě extrakce dosahovala výtěžnost v naspikovaném (tzn. vzorek kukuřice + standard FB 1 a FB 2 ) materiálu 94,7 100,6 % pro FB 1 a 93,9 99,6 % pro FB 2. Přidáním ještě jednoho kroku extrakce nedošlo k výraznému zvýšení výtěžnosti. Tříkrokové postup jsme tedy shledali jako dostačující. Námi vyvinutá metoda je tedy značně rychlejší a dosažená výtěžnost je vyšší než u metodiky uvedené v ČSN a v Evropské normě, což je dáno použitím invazivnějšího způsobu extrakce. Výtěžnost metody jsme prověřovali pomocí materiálu po přídavku čistého standardu. Tyto uměle kontaminované vzorky obsahovaly podlimitní, limitní a nadlimitní množství mykotoxinů. Výtěžnost byla velmi podobná na všech koncentračních hladinách. 53

54 Můžeme říci, že výtěžnost naší optimalizované metody je vysoká a to i v porovnání s jinými již validovanými metodami, u kterých se výtěžnost pohybuje velmi často v rozmezí % Vývoj extrakce K monitorování výtěžnosti fumonisinů během jednotlivých kroků extrakce jsme použili vzorky rozemleté kukuřice s přídavkem čistého standardu fumonisinů. Koncentrace fumonisinů v těchto vzorcích se pohybovala pod, nad a na úrovni maximálních limitů stanovených příslušnou legislativou (tzn. 100, 5000 a 2000 µg/kg). Postupně byl vyhodnocován každý vzorek zvlášť a každé stanovení bylo prováděno v pěti opakováních. V tabulce 10 jsou uvedeny hodnoty výtěžnosti naměřené během čtyř extrakčních kroků. Vzhledem k výsledkům shledali jsme, že třístupňový postup extrakce je optimální pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. Tab. 10 Výtěžnost fumonisinů během extrakce Extr. 100 µg/kg 2000 µg/kg 5000 µg/kg Krok FB 1 [%] FB 2 [%] FB 1 [%] FB 2 [%] FB 1 [%] FB 2 [%] 1 61,1 ± 2,0 53,5 ± 1,9 62,7 ± 1,5 56,9 ± 0,7 63,2 ± 1,6 56,2 ± 1,7 2 88,1 ± 2,1 83,3 ± 1,8 91,2 ± 1,8 85,0 ± 1,7 91,7 ± 1,7 88,3 ± 1,8 3 94,7 ± 2,2 93,9 ± 2,1 100,0 ± 1,9 95,3 ± 1,8 100,6 ± 1,8 99,6 ± 2,3 4 98,2 ± 2,2 96,4 ± 2,4 102,2 ± 2,2 99,0 ± 2,3 102,9 ± 2,1 101,0 ± 2,3 Ultraturrax Obr. 18 Postupy extrakce Třepačka V porovnání s postupem doporučeným v ES (Evropský standard) je přesnost vyvinuté metody přibližně čtyřikrát vyšší. To může být způsobeno rozdílným použitím nástrojů pro extrakci. Zatímco ES doporučuje extrakci na orbitální třepačce po dobu 20 54

55 minut, my jsme použili ponorný mixér ultraturrax po dobu 5 minut. Tento námi použitý postup byl publikován již dříve. Avšak jak se ukázalo během evropského mezilaboratorního porovnávání metod pro stanovení fumonisinů, byla pro extrakci těchto mykotoxinů více užívána orbitální třepačka než mixování, které poskytovalo výsledky s vyšší směrodatnou odchylkou (Visconti et al., 1996). V našem případě však žádné výraznější rozdíly mezi metodami, co se směrodatné odchylky týče, nebyly pozorovány Správnost, přesnost a výtěžnost metody U této metody jsme hodnotili její správnost, přesnost a výtěžnost stanovením s reálnými spikovanými vzorky, které byly upraveny vhodným množstvím standardu na koncentraci mezi 100 a 5000 µg/kg. Variační koeficienty inter-day (5 dní) a intra-day byly stanoveny analýzou 6 spikovaných vzorků. Každý den byla měřena kalibrační křivka a koncentrace analytů byla vypočtena z této křivky. Správnost byla posuzována porovnáním změřených koncentrací se známou koncentrací fumonisinů (viz Tab. č. 11). Tab. 11 Přesnost a výtěžnost při stanovení FB 1 a FB 2 ve vzorcích kukuřice (n=5) Látka Koncentrace látky [µg/kg] Naměřeno Výtěžnost Kukuřice Spike vzorek [µg/kg] [%] FB 1 Intra-day 101,2 ± 2,3 594,0 ± 18,9 101,3 (n=5) 485,2 ± 17,5 2013,2 ± 62,3 2558,4 ± 59,6 102,4 5092,3 ± 142,5 5728,1 ± 144,5 102,7 FB 1 Inter-day 107,3 ± 3,9 600,5 ± 23,2 100,2 (n=25) 492,5 ± 21,4 1995,6 ± 71,3 2518,0 ± 69,2 101,2 5021,2 ± 159,3 5563,3 ± 159,2 100,9 FB 2 Intra-day 102,1 ± 3,2 358,9 ± 15,9 98,3 (n=5) 263,6 ± 8,4 2024,0 ± 58,9 2239,6 ± 67,5 97,9 5008,3 ± 104,2 5177,0 ± 162,3 98,2 FB 2 Inter-day 99,7 ± 3,9 352,8 ± 29,2 98,1 (n=25) 259,9 ± 11,3 2079,3 ± 67,9 2339,2 ± 79,5 99,3 5052,4 ± 122,3 5264,5 ± 173,1 99,1 55

56 7.2.8 FAPAS kruhový test Závěrem byla správnost metody ověřena evropským mezilaboratorním porovnávacím testem (kruhovým testem) organizovaným Central Science Laboratory (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, UK). Tato organizace organizuje největší a nejobsáhlejší schéma testování analytických laboratoří v potravinovém sektoru FAPAS (food analysis performance assessment scheme). Více než 2500 laboratoří z 90 zemí celého světa má možnost ověřit si své laboratorní metody na širokém spektru matricí a analytů (nutriční komponenty, potravinové složky, přírodní, organické a anorganické kontaminanty, pesticidy, veterinární léčiva, aditiva, alergeny apod.). FAPAS zachovává naprostou důvěrnost informací. Pro porovnání jsou ve zprávách k dispozici anonymní výsledky účastnících se laboratoří. Pro usnadnění práce poskytuje FAPAS účastnícím se laboratořím poradenství v případě nevyhovujících výsledků kruhových testů. Obr. 19 Kruhový test testovaný vzorek kukuřice Zaslaný testovací vzorek kukuřice jsme zanalyzovali a naměřené výsledky jsme odeslali k hodnocení. Ty byly shledány jako správné a pohybovali se v přípustné toleranci. Můžeme tedy říci, že na naše metoda pro stanovení fumonisinů v kukuřičném materiálu je správná (Šuška, 2007). Proto byla vyvinutá metoda následně použita i pro rutinní stanovení fumonisinů v kukuřici. 56