Molekulární modelování a bioinformatika. Hmotnostní spektrometrie I

Transkript

1 Molekulární modelování a bioinformatika Hmotnostní spektrometrie I

2 Co nás čeká 1) Základy hmotnostní spektrometrie, ionizační techniky, analyzátory, fragmentační techniky. 2) Měření proteinů, peptidů, identifikace proteinů, analýza dalších biomolekul lipidy, sacharidy, nukleové kyseliny. 3) Aplikace MS biomolekul kvantifikace proteinů, identifikace mikroorganismů, studium prostorové struktury proteinů.

3 Historické okénko Počátky hmotnostní spektrometrie spjaty se studiem povahy hmoty Eugen Golstein studium kanálových paprsků Wilhelm Wien dráha kanálových paprsků může být zakřivena silným elektrickým a magnetickým polem.

4 Historické okénko 1913 J. J. Thomson studium kanálových paprsků. Objev isotopů neonu Athur Dempster sestavil hmotnostní spektrometr, jehož základní design se používá dodnes, ionizace elektronem Francis William Aston identifikoval 212 z 287 přirozeně se vyskytujících isotopů prvků.

5 Historické okénko 1931 Ernest O. Lawrence cyklotron Ernest O. Lawrence Calutron separace izotopů uranu 235 a 238.

6 Historické okénko 1946 William Stephens time of flight hmotnostní spektrometr F.W. McLafferty a R.S. Gohlke spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie F. H. Field a M. S. B. Munson chemická ionizace F.W. McLafferty a K.R. Jennings kolizí indukovaná disociace Malcolm Dole elektrosprayová ionizace Comisarow a Marshall iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací M. Barber Fast atom bombardment ionizace biomolekul.

7 Historické okénko 1987 K. Tanaka a M. Karas, F. Hillenkamp objev matricí asistované laserové desorpce ionizace J. Fenn elektrosprejová ionizace velkých proteinů (malé molekuly již 1984) A. Makarov orbitrap.

8 Základní princip hmotnostní spektrometrie Vytvoření iontů z anorganických nebo organických sloučenin vhodnou metodou, separace vzniklých iontů podle jejich poměru hmotnost-ku-náboji (m/z) a kvalitativní a kvantitativní detekce iontů dle jejich m/z resp. množství.

9 Součásti hmotnostního spektrometru Vstup - vstup vzorků do systému - pevná fáze, kapalina, plyn; deska se vzorkem, kapilára z HPLC, CE Zdroj - přeměna složek vzorku na ionty. Analyzátor - separace iontů dle m/z působením el. pole, mag. pole, doby letu. Detektor - detekce separovaných iontů - fotonásobič Zpracování signálu - A/D převodník, počítač.

10 Kolik máme hmotností? Používaná jednotka hmotnosti (u) neboli Dalton (Da) je definována jako 1/12 hmotnosti atomu 12 C: 1 u = 1 Da = 1, kg. Průměrná hmotnost vážený průměr všech přirozeně se vyskytujících izotopů. CH 3 Br = (12, , ,904) u = 94, u Nominální hmotnost počítá se použitím hmotnosti převažujícího izotopu každého prvku zaokrouhlené k nejbližší celé hodnotě. CH 3 OH = 12 C 1 H 3 16 O 1 H = ( ) u = 32 u Monoisotopická hmotnost počítá se z přesných hmotností izotopů s nejvyšším výskytem. CH 3 Br = 12 C 1 H 3 79 Br = ( ) u = u Hmotnostní defekt rozdíl mezi monoisotopickou a nominální hmotností.

11 Izotopový profil

12 Izotopový profil

13 Rozlišovací schopnost (RP) RP = m/δm Poměr hmotnosti iontu m1 a rozdílů hmotností iontů m1 a m2 s jednotkovým nábojem, přičemž platí, že píky obou iontů jsou stejně vysoké a údolí mezi píky je 10 %, tj. překrývají se z 10 %. Dnes - RP = m/δm, kde Δm, je šířka izolovaného píku v polovině jeho výšky (FWHM full width at half maximum)

14 Rozlišovací schopnost (RP)

15 Přesnost určení hmotnosti Rozdíl mezi teoreticky vypočtenou hmotností iontu a experimentálně získanou. Absolutní (Da): Δm = m exp - m teor Relativní (ppm): Δm = 10 6 (m exp - m teor )/m teor

16 Hmotnostní spektrum Graf závislosti iontového proudu dopadajícího na detektor na poměru hmotnosti a náboje iontu (m/z).

17 Ionizační techniky Tvrdé ionizační techniky ionizovaná molekula získá nadbytek vnitřní energie, což se projeví fragmentací molekuly na menší části (EI, CI). Měkké ionizační techniky ionizovaná molekula získá mnohem menší množství energie, a proto ve spektrech pozorujeme zejména (de)protonované molekuly a minimum fragmentových iontů (ESI, MALDI).

18 Ionizační techniky FAB Fast Atom Bombardment MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization ESI Electrospray Ionization APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization APPI Atmospheric Pressure Photoionization DESI Desorption Electrospray Ionization DART Direct Analysis in Real Time

19 Fast Atom Bombardment Analyzovaná látka je před měřením smíchána s netěkavou chránicí chemikálií (matricí - glycerol, triethanolamin ). Ve vakuu je vzorek bombardován svazkem vysokoenergetických atomů - typicky vzácné plyny (Ar, Xe), energie 4-10 kev. Vytváří především [M+H] + ionty, velmi nízká fragmentace při desorpci. V oblasti nízkých hmotností dominují píky matrice.

20 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization. Metoda umožňující odpaření a ionizaci (měkkou) netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné. Vzorek je smíchán s tzv. matricí (~1000 molární přebytek) a ozářen pulzním laserem (UV nebo IR) - odpaření a ionizace. Vhodné pro peptidy, proteiny, DNA, polysacharidy i některé synth. polymery.

21 MALDI Chrání vlastní vzorek před rozpadem. Napomáhá ionizaci a odpaření (desorpci) vzorku. Mechanismus není stále přesně znám. Důležitá je volba správné matrice vzhledem k analyzovanému vzorku.

22 MALDI - výhody Malá nebo žádná fragmentace. Převážně jednonásobně nabité ionty [M+H] +. Jednoduchá interpretace spekter. Relativně tolerantní k pufrům, solím, detergentům, Rychlá a jednoduchá příprava vzorku a jeho analýza. Lze analyzovat i komplexní směsi.

23 MALDI - nevýhody Hledání pravého místa na terčíku se vzorkem (sweet-spots). Intenzivní pozadí v oblasti nízkých molekulových hmotností od matrice, jejích klastrů se solemi a fragmentů. Vzájemné potlačování mezi analyty při ionizaci. Obtížné spojení s kapalinovou chromatografií (ale off-line LC- MALDI používané!). Obtížná kvantifikace (nutnost vnitřního standardu).

24

25

26

27 MALDI-terčíky

28 MALDI spektrum kuřecího lysozymu

29 MALDI spektrum kuřecího lysozymu štěpeného trypsinem

30 Electrospray ionization Ionizace vzorku probíhá z kapaliny - často směs vody nebo pufru/acetonitrilu/organické kyseliny. Kapalina pumpována skrze tenkou pokovenou kapiláru. Intenzivní elektrické pole mezi kapilárou a protielektrodou způsobí vystřikování kapaliny z kapiláry v podobě malých kapiček. Ionty jsou elektrickým polem urychleny do analyzátoru.

31 Electrospray ionization Kapičky nesou náboje na svém povrchu a zároveň se z nich odpařuje rozpouštědlo. Vzrůst hustoty povrchového napětí nad kritickou mez, rozpad na menší kapičky. Po odpaření rozpouštědla náboje skončí na molekulách analytu, které jsou několikanásobně nabité nebo přímý odpar iontů.

32 ESI - výhody Malá nebo žádná fragmentace. Možnost studovat i nekovalentní komplexy biomolekul. Vhodné pro proteiny, peptidy, sacharidy, nukleotidy, Snadné spojení s kapalinovou chromatografií. Koncentrační detektor!!!

33 ESI - nevýhody (?) Vznikají mnohonásobně nabité ionty. Komplikovanější interpretace spekter. Poměrně náročné na čistotu vzorku. Chromatografická separace často dlouhá.

34 Surové spektrum Spektrum po dekonvoluci

35 Spektrum polymeru PEG 5500 Intens. [a.u.] m/z

36 Atmospheric pressure chemical ionization Na výbojovou elektrodu je vloženo vysoké napětí (3-4 kv) a vzniká koronární výboj ionizující molekuly mobilní fáze. Ion-molekulárními reakcemi jsou následně ionizovány i molekuly analytu.

37 Atmospheric pressure photoionization Analogie APCI, místo koronárního výboje se k ionizaci použije UV lampa, přídavek dopantu k mobilní fázi. Užívané k ionizaci velmi hydrofobních látek (polyaromatické uhlovodíky, steroidy, flavonoidy, ).

38 Desorption Electrospray Ionization Sprejováním povrchu vzorku vhodným rozpouštědlem dochází k desorpci molekul a následné ionizaci. Není nutná příprava vzorku, ionizace i přímo z tkání. Mechanismus ionizace plně nevysvětlen.

39 Hmotnostní analyzátory Separace iontů podle poměru m/z. Statické ionty jsou přivedeny na centrální dráhu kombinací statických polí. Magnetický sektor, Elektrostatický sektor Dynamické pro dosažení stabilní dráhy mezi zdrojem a detektorem je třeba radiofrekvenční pole nebo se rozdělení iontů podle m/z určí z doby letu. Průletový analyzátor, Kvadrupól, Iontová past, Iontová cyklotronová rezonance, Orbitrap

40 Hmotnostní analyzátory TOF Time of Flight (průletový analyzátor) Q Quadrupole IT ion trap FTICR Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Orbitrap

41 Time of Flight Ionty jsou ze zdroje urychleny vysokým napětím do letové trubice bez el. pole. Separace dle doby letu k detektoru - závislá na m/z. E p = E kin = U z = 1/2mv 2... m/z ~ t 2. Malé ionty letí rychleji, dorazí k detektoru dříve než těžké ionty.

42 Time of Flight Lineární mód: menší rozlišení, větší rozsah - pro velké molekuly. Reflektorový mód: větší rozlišení, menší rozsah - pro malé molekuly, iontové zrcadlo vyrovnává různé počáteční rychlosti iontů se stejným poměrem m/z.

43 Výhody a nevýhody Teoreticky neomezený hmotnostní rozsah. Kompletní spektrum během každého pulsu laseru. Vysoká rozlišovací schopnost a přesnost. Pulzní charakter znesnadňuje spojení s kapalinovou chromatografií (ale off-line LC-MALDI používané).

44 Kvadrupól - konstrukce Tvořen čtyřmi stejnými kovovými tyčemi kruhového průřezu. Na dvě protilehlé tyče je přivedeno kladné stejnosměrné napětí, na druhé dvě záporné stejnosměrné napětí. Na všechny tyče je dále superponováno vysokofrekvenční střídavé napětí.

45 Princip separace Iont je přiveden do středu kvadrupólu a začne oscilovat. V daný časový okamžik pro určitý poměr U/V jsou oscilace stabilní pouze pro ion s určitým poměrem m/z, který projde kvadrupólem. Plynulou změnou (skenováním) poměru U/V jsou postupně propuštěny na detektor všechny ionty.

46 Mody měření Hmotnostní filtr je aplikováno stejnosměrné i střídavé napětí. Ion guide je aplikováno pouze střídavě napětí, kvadrupól propouští všechny ionty, které jsou oscilujícím polem fokusovány k ose kvadrupólu.

47 Relativně levné. Výhody a nevýhody Snadné spojení s plynovou a kapalinovou chromatografií. Pro kompletní spektrum je nutno skenovat jednotlivé frekvence. Nižší rozlišovací schopnost a přesnost. Omezený hmotnostní rozsah.

48 Kvadrupólová iontová past Skládá se ze 2 hyperbolických elektrod (čepičky) a jedné prstencové elektrody. Ionty zachyceny kombinací stejnosměrného a střídavého napětí. Past naplněna heliem (1 mtorr) - kolizní chlazení a zaostření iontů do středu pasti.

49 Princip separace MS spektrum získáno postupným zvyšováním rf napětí. Ionty vyletují z pasti v pořadí svých zvyšujících se m/z skrze díry v elektrodách. Lineární iontová past - 2D iontová past, vyšší kapacita.

50 Výhody a nevýhody Opakovaná akumulace pro další experimenty (MS/MS, MS 3 ). Vysoká citlivost. Relativně levné. Snadné spojení s kapalinovou a plynovou chromatografií. Omezený dynamický rozsah. Pro kompletní spektrum je nutno skenovat jednotlivé frekvence. Nižší rozlišovací schopnost a přesnost. U klasických pastí 2/3 rule malé fragmenty se neudrží v pasti, tudíž nejsou ani detekovány.

51 Iontový cyklotron s Fourierovou transformací Cyklotronová cela je tvořena dvěma koncovými elektrodami a párem excitačních a detekčních elektrod. Cela se nachází v jádru elektromagnetu s magnetickým polem o vysoké intenzitě (až 14 T).

52 Princip separace Jestliže se ion dostane do silného magnetického pole, začne se pohybovat po kruhové trajektorii s cyklotronovou frekvencí. ω c = Bz/m Každá hodnota m/z má charakteristickou cyklotronovou frekvenci.

53 Princip separace Po vstupu do cyklotronové cely jsou ionty zachyceny uvnitř nízkým napětím na koncových elektrodách. Pomocí excitačních elektrod jsou ionty podle m/z uvedeny na odpovídající trajektorii s vlastní cyklotronovou frekvencí. Oscilující ionty vytváří na protilehlých elektrodách napětí s odpovídající frekvencí, přítomnost iontů s různými m/z se projeví superpozicí sinusoidálních signálů.

54 Fourierova transformace Fourierova transformace slouží pro převod signálů z časové oblasti do oblasti frekvenční. Signály jsou dále převedeny na m/z.

55 Výhody a nevýhody Extrémní rozlišovací schopnost, přesnost a dynamický rozsah. Akumulace iontů pro další experimenty. Vysoká citlivost. Snadné spojení s plynovou a kapalinovou chromatografií. Pro kompletní spektrum není nutno skenovat jednotlivé frekvence, ale rozlišení spektra závisí na čase. Rozlišení klesá lineárně s m/z. Velmi vysoká cena a provozní náklady. Náročnější na obsluhu.

56 Orbitrap Skládá se z vnější elektrody tvaru barelu a centrální elektrody vřetenovitého tvaru. Ionty jednak krouží kolem centrální elektrody, jednak se pohybují podél této elektrody. Iontová past bez RF napětí a magnetického pole, pouze elektrostatické pole.

57 Orbitrap

58 Princip separace Ionty jsou pulzně přivedeny do Orbitrapu; přitažlivá síla vůči centrální elektrodě vyrovnává odstředivou sílu oscilujících iontů. Ionty o stejném poměru m/z oscilují v podobě prstenců okolo centrální elektrody.

59 Princip separace Oscilující ionty vytvářejí na detekčních elektrodách napětí s odpovídající frekvencí. Pouze frekvence oscilací podél osy z nezávisí na počáteční energii, úhlu a pozici iontů, takže může být využita pro hmotnostní analýzu. k m / z

60 Princip separace Vysoká iontová kapacita ionty rozprostřeny podél úzkých prstýnků. Přítomnost iontů s různými m/z se projeví superpozicí sinusoidálních signálů. Fourierova transformace potřebná pro získání frekvencí iontů o rozdílném m/z.

61 Výhody a nevýhody Levný provoz (odpadají náklady spojené s provozem supravodivého magnetu). Extrémní přesnost a rozlišení. Snadné spojení s plynovou a kapalinovou chromatografií. (Vysoké) pořizovací náklady. Stále relativně pomalé pro vysoké rozlišení nutná dlouhá doba detekce.

62 Detektory Faradayův pohárek Elektronový násobič Mikrokanálkový detektor Detekční elektrody (FTICR, Orbitrap)

63 Faradayův pohárek Kovový pohárek zachycující částice ve vakuu. Dopadající ionty vytvářejí malý el. proud, který je měřen.

64 Elektronový násobič Tvar trubky, znásobuje dopadající náboje. Vnitřek potažen vrstvou BeO. Sekundární emise - dopadající elektron vyrazí další elektrony. Vyražené elektrony urychleny el. polem a směřovány na další destičku, kde dojde k další emisi elektronů Podobně pracuje fotonásobič - iont vyvolá emisi elektronů, které vyvolají emisi fotonů

65 Mikrokanálkový detektor Plochá destička v principu podobná elektr. násobiči. Průměr 1-10 cm, tloušťka 1 mm, mohou být 2 za sebou. Kanálky mají průměr 3-20 μm, orientovány na šikmo a potaženy BeO.

66 Obvyklé konfigurace hmotnostních spektrometrů MALDI-ToF MALDI-ToF/ToF ESI-Qtrap/Lin. Trap ESI-TripleQuad ESI-QToF ESI/MALDI-FT-ICR ESI/MALDI-Orbitrap

67 Tandemová hmotnostní spektrometrie Značí se MSMS, dále MS n (MS 3 ). Umožňuje strukturní analýzu látek. Fáze: výběr prekurzoru (parent ion) fragmentace prekurzoru na dceřiné ionty změření MS spektra dceřiných iontů Uspořádání: 1) V prostoru - sériové uspořádání 2 nebo více analyzátorů. 2) V čase - výběr prekurzoru, fragmentace, sken hmotností v jednom analyzátoru (iontové pasti).

68 Fragmentační techniky Díky měkkým ionizačním technikám nedochází k fragmentaci přímo ve zdroji. Pokud chceme fragmentaci vyvolat je třeba iontům dodat energii. PSD Post Source Decay. CID Collision Induced Dissociation. ETD Electron Transfer Dissociation. ECD Electron Capture Dissociation. IRMPD Infrared Multi-photon Dissociation.

69 Post source decay Ionty získají při ionizaci (typicky MALDI) přebytek vnitřní energie. K fragmentaci dochází mimo iontový zdroj, ale před dopadem na detektor metastabilní disociace. Vznikají a, b a y ionty. Přítomny i fragmenty odpovídající ztrátě vody a amoniaku.

70 Fragmentace peptidů PSD a, b, y ionty CID - y, b ionty; high energy CID - možnost fragmentace i postranních řetězců ToF/ToF - a, b, y ionty ETD/ECD - c, z ionty IRMPD b, y ionty

71 Collision induced dissociation Srážky iontů s molekulami kolizního plynu (He, Ar) v kolizní cele - zvýšený tlak, dnes nejrozšířenější technika. Nízkoenergetické srážky - energie srážek ev, vibrační charakter excitace, nutno mnoho srážek, TripleQuad, pasti, QToF. Vysokoenergetické srážky - energie srážek kev, stačí jediná srážka k fragmentaci, ToF/ToF.

72 Electron transfer dissociation Fragmentace vyvolána přenosem elektronu z radikálového aniontu, vznikají c a z ionty. V hmotnostním spektrometru přítomen navíc zdroj pro chemickou ionizaci, produkující radikálové anionty (anthracen, azobenzen, fluoranthen). Fragmentace náhodně podél peptidového řetězce, vhodné i pro velké peptidy/proteiny. Zachovává labilní posttranslační modifikace fosforylace, glykosylace.

73 Electron transfer dissociation

74 Electron capture dissociation Fragmentace vyvolána záchytem nízkoenergetického elektronu. Zdrojem elektronů je žhavená katoda. Primárně dostupná na FTICR hmotnostních spektrometrech. Ostatní charakteristiky shodné s ETD.

75 Infrared Multi-photon Dissociation Iont absorbují fotony laserového záření. Excitace do vyšších vibračních stavů až dojde k prasknutí vazby (vazeb). Vznikají b a y ionty. Dostupné na FTICR hmotnostních spektrometrech.

76 MALDI-ToF/ToF Jednoduchá obsluha a interpretace spekter, možná automatizace. Netriviální on-line spojení s LC, ale vzrůstá popularita off-line LC-MALDI-ToF/ToF.

77 ESI-QTrap Lze provádět různé analýzy se širokým spektrem látek. On-line spojení s kapalinovu chromatografií. Možnost MS n - opakování kroků izolace prekursoru, fragmentace. Nižší rozlišení, nižší přesnost, 1/3 low mass cut-off u starších přístrojů při MSMS.