Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost"

Alžběta Marie Štěpánková
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

2 Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6 Polybuffer 74 - ph 7-4 PBE94 Pharmalyte - ph 8-10,5 PBE118

4 Princip fokusace

5 MonoP Beads směs kvartérních a terciálních aminů

6 Dvoudimensionální chromatografie Beckman Coulter PF 2D

7 Dvoudimensionální chromatografie ph hydrofobicita frakce

9 Disulfidový můstek -oxidací SH skupin Cys -silná kovalentní vazba

10 Vodíková vazba příklady postranních aminokyselinových řetězců, které spolu mohou tvořit vodíkové vazby: dva alkoholy: ser, thr a tyr alkohol a kyselina: asp a tyr dvě kyseliny: asp a glu alkohol a amin: ser a lys alkohol a amid: ser a asn

11 Solný můstek - interakce mezi pozitivně nabitou amino- a záporně nabitou karboxy- skupinou

12 Hydrofobní interakce

13 Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn

14 Hydrofobní chromatografie

15 vliv soli na protein Stacionární fáze vazba hydrofobních oblastí na povrchu proteinu v H 2 O slabé interakce přídavek soli méně hydrofobní než RPC Mobilní fáze H 2 O/sůl (~1 M) nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4

16 Eluce klesajícím gradientem soli (1 M 0 M) stacionární fáze nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi hydrofobní látka velmi hydrofobní kontaminace

17 typy stacionární fáze výběr ligandu Ether < Isopropyl < Butyl < Octyl < Phenyl

18 efekt ligandu na purifikaci efekt mobilní fáze A B C

19 typy gradientů

22 stacionární fáze kolona mobilní fáze objem vzorku množství vzorku vysoké rozlišení (gradientová eluce) velikost částic µm mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) na objemu nezáleží Experiment délka 1-10 cm (krátká kolona nevhodná pro pozvolný gradient) 5-10 % celkové vazebné kapacity (bez ztráty rozlišení) skupinová separace (kroková eluce) velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) na objemu nezáleží ~ 40 % celkové vazebné kapacity

23 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separace proteinů na základě jejich hydrofobicity vhodná jako první nebo střední purifikační krok použití hydrofobní chromatografie skupinová separace (kroková eluce) koncentrace naředěného vzorku vhodná jako purifikační krok po precipitaci síranem amonným

Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je

24 Jako první krok purifikace alkoholdehydrogenasy z Pseudomonas sp. jste zvolili srážení síranem amonným (Mr 132,14 g/mol) a to do 50 %. Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je 20 ml). Jako další krok purifikace chcete zvolit hydrofobní chromatografii na koloně Butyl-Sepharose. Jak byste postupovali?

25 Chromatografie na reversní fázi

separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi hydrofobní interakce musí být podpořena solí eluce snižující se koncentrací soli lysozym

26 separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi hydrofobní interakce musí být podpořena solí eluce snižující se koncentrací soli lysozym stacionární fáze je vysoce substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H 2 O desorbce organická rozpouštědla (např. acetonitril v H 2 O) vysoká hydrofobicita nižší hydrofobicita vysoce hydrofilní méně hydrofilní

27 Mechanismus rozdělení látky mezi dvě fáze (různé polární vlastnosti)

28 Nepolarní látky Van der Waalsovy interakce odolné vůči polárním rozpouštědlům Polární látky dipolové interakce, vodíkové vazby Voda rozpouštědlo pro polární látky (HX- skupiny X: O, Cl, F, N)

29 Mechanismus adsorbce malé organické molekuly +/- rozpustné ve stacionární fázi Peptidy i proteiny mohou interagovat s hydrofobním nosičem Větší velikost nemohou být kompletně pohlceny hydrofobní stacionární fází Velká pravděpodobnost interakce více míst molekuly

30 Pokles polarity mobilní fáze oslabuje hydrofobní interakce Eluční křivka odpovídá distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.

31 Isokratická eluce vliv koncentrace organického rozpouštědla Gradientová eluce

32 nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi hydrofobní látka velmi hydrofobní kontaminace stacionární fáze Ekvilibrace Aplikace vzorku a promytí Gradientová eluce Regenerace

33 Vliv typu mobilní fáze Mobilní fáze Vliv koncentrace rozpouštědla

34 Mobilní fáze Organické rozpouště dlo Vhodné pro: Viskosita Poznámka Methanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisa ce struktury Ethanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisa ce struktury Isopropanol Proteiny Peptidy Vysoká nejmenší efekt na strukturu Acetonitril (ACN) Org. molekuly Proteiny Peptidy Nízká nízký efekt na strukturu

35 Spektrofotometrické vlastnosti rozpouštědel

36 Stacionární fáze Silikagel poresní silika gel zvýšení efektivního povrchu inertní materiál stabilní v ph 2-7,5 Polymerní nosič poresní polymer zvýšení efektivního povrchu nepolární stabilní v ph 2-11 Vliv délky řetězce na rozlišení hydrofobní organické látky peptidy, proteiny

37 Stacionární fáze - funkční skupiny

38 Vliv funkční skupiny na rozlišení

A214nm rozpouštědlový pík gradient Pufr A: 0,1 % TFA + H 2 O Pufr B: 0,1 % TFA + acetonitryl Čas % A % B 0 100 0 3 100

39 A214nm rozpouštědlový pík gradient Pufr A: 0,1 % TFA + H 2 O Pufr B: 0,1 % TFA + acetonitryl Čas % A % B retenční čas / min Sekvence M W R T 2 RGGGGIGLGK 871,0 15,0 1 RGGGGIGIGK 871,0 10,5 3 RGGGGLGLGK 871,0 20,5

40 stacionární fáze kolona mobilní fáze objem vzorku množství vzorku délka 1-10 cm Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce) velikost částic µm - pro purifikace 5-12 µm - pro analytiku polymerní lepší pro separaci proteinů (lze čistit pomocí NaOH) Oligonukleotidy alkalické podmínky Peptidy ACN, TFA ~ ph 2 0,5-5% objemu kolony při isokratické eluci bez omezení při gradientové eluci 5-10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení) skupinová separace (kroková eluce) velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok nemá významný vliv (50 %ACN) na objemu nezáleží 40 % celkové kapacity kolony

41 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separece peptidů, proteinů a oligonukleotidů podle jejich hydrofobicity Vhodná jako střední purifikační krok nebo závěrečný purifikační krok Purifikace syntetických peptidů Technika pro analysu peptidů a peptidové mapování použití RPC skupinová separace (kroková eluce) Zakoncentrování oligonukleotidů a peptidů Vhodná pro odsolování peptidů a oligonukleotidů Tipy pro přípravu pufru Upravte ph před přidáním organického rozpouštědla Upravte ph pufru při teplotě experinemtu Ověřte stabilitu proteinu Pro analytické experimenty použijte HPLC grade chemikálie Tipy pro přípravu vzorku Zfitrujte nebo stočte vzorek před aplikací na kolonu ph a iontová síla (!velký objem vzorku!) stejná jako ve startovacím pufru (PD10) Teplota vzorku stejná jako startovacího pufru (!velký objem vzorku!)

Podobné dokumenty

Hydrofobní chromatografie

Hydrofobní chromatografie Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn vliv soli na protein Stacionární