UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra biochemických věd

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd DETEKCE HISTIDINEM A FLAG PEPTIDEM ZNAČENÝCH REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Hradec Králové 2013 Bc. Lenka Javorská

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe tato diplomová práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne

3 PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat své školitelce RNDr. Lucii Škarydové, Ph.D. za velmi vstřícnou odbornou pomoc a mnoho cenných rad během vypracovávání této diplomové práce. Dále děkuji Mgr. Haně Štambergové, Mgr. Rudolfu Andrýsovi a Mgr. Tereze Lundové za uţitečné rady a ochotnou pomoc při práci v laboratoři. Velké poděkování patří také celé mojí rodině a přátelům za podporu nejen při vzniku této diplomové práce, ale po celou dobu studia.

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Lenka Javorská Školitel: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce histidinem a FLAG peptidem značených rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny jsou proteiny produkované geneticky modifikovanými organismy, prostřednictvím rekombinantní DNA technologie, jejímţ principem je vloţení DNA sekvence kódující cílový protein do buněk expresního systému, který zajistí jeho produkci. Tato technologie umoţňuje připravit v podstatě libovolný protein v jakémkoliv poţadovaném mnoţství. Rekombinantní proteiny jsou produkovány často ve formě fúzního proteinu s vhodnou afinitní značkou (např. histidinová nebo FLAG peptidová značka), která usnadní jejich purifikaci a detekci. Cílem této diplomové práce bylo zavést a optimalizovat univerzální metodu pro detekci rekombinantních proteinů značených histidinovou (6x histidin) a FLAG peptidovou značkou. Modelovým rekombinantním proteinem s histidinovou značkou byl enzym karbonylreduktasa 1 (CBR1) produkovaný expresním systémem bakterie Escherichia coli a pro rekombinantní proteiny značené FLAG peptidem enzymy DHRS12, HSD11β1, RODH4, DHRS3, DHRS7, DHRS8 (expresní systém hmyzí buňky Sf9). Pro separaci proteinů byla zvolena SDS polyakrylamidová elektroforéza a imunochemická detekce po metodě Western blotting za pouţití komerčně dostupné primární králičí protilátky Anti-6x His tag - ChlP Grade (abcam ) a sekundární prasečí protilátky konjugované s křenovou peroxidasou (Dako). Finální vizualizace byla provedena pomocí komerčně dostupného kitu (Amersham TM ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare Life science) na principu chemiluminiscence. Tato metoda bude pouţívána k hodnocení úspěšnosti produkce rekombinantních proteinů v Laboratoři geneticky modifikovaných organismů na Farmaceutické fakultě v Hradci Králové, Univerzity Karlovy v Praze.

5 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Lenka Javorská Supervisor: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D Title of diploma thesis: Detection of His-tag and FLAG-tag recombinant proteins Recombinant proteins are proteins produced in genetically modified organism by recombinant DNA technology that enable insert DNA sequence of target protein in expression cell. This technology allows preparation of actually any protein in any quantity without difficulties associated with demanding purification of native protein from tissues. Recombinant proteins are produced often in form of fusion proteins with suitable peptide tag (e.g. His-tag, FLAG-tag) that can help with their detection and enable simple purification. The aim of this diploma thesis was to introduce and optimize universal method for the detection of recombinant proteins labelled with His-tag (6x histidine) and FLAG-tag. The model recombinant protein with His-tag was enzyme carbonylreductase 1 (CBR1) produced by expression system Escherichia coli. For FLAG-tag labelled protein were chosen enzymes DHRS12, HSD11β1, RODH4, DHRS3, DHRS7, DHRS8 produced by insect cells (strain Sf9). SDS polyacrylamide electrophoresis for protein separation and immunochemical detection after Western blotting method with commercially available primary rabbit Anti-6x His tag - ChlP Grade (abcam ) and secondary polyclonal swine anti-rabbit antibody conjugated with Horseradish peroxidase (Dako) were used. Final vizualization was achieved by chemiluminiscent commercially available kit (Amersham TM ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare Life science). Optimization of antibody concentration by dot blot analysis leads to large saving of antibody. This method will be widely used to evaluation of production of diverse recombinant protein at the Laboratory genetically modified organisms, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague.

6 OBSAH A. ÚVOD... 4 B. TEORETICKÁ ČÁST Rekombinantní proteiny Exprese rekombinantních proteinů Získání fragmentu cizorodé DNA Vektory fragmentů cizorodé DNA Vnesení vektoru nesoucího fragment cizorodé DNA do buněk Izolace a purifikace rekombinantních proteinů Detekce Pouţívané expresní systémy Prokaryotické expresní systémy Expresní systém bakterie Escherichia coli Další příklady prokaryotických expresních systémů Eukaryotní expresní systémy Kvasinkové expresní systémy Hmyzí expresní systémy Savčí buněčné linie jako expresní systém Proteinové a peptidové afinitní značky Dělení afinitních značek Umístění afinitních značek Výběr vhodné afinitní značky a jejich porovnání Odstranění afinitní značky Příklady často používaných afinitních značek FLAG peptidová značka (FLAG-tag) Histidinová značka (His-tag) Glutation-S-transferasa (GST-tag) c-myc značka (c-myc tag) Hemaglutinin A značka (HA-tag) Streptavidin vázající proteinové značky (Strep-tag, Strep-tag II, SBP-tag) S peptidová značka (S-tag) Kalmodulin vázající peptid (CBP-tag) Celulózu vázající doménové značky (CBD-tag) Maltózu vázající protein (MBP-tag) Chitin vázající doména (ChBD-tag) C. CÍL PRÁCE D. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál

7 5.1 Přístroje a pomůcky Pomůcky Přístroje Chemikálie Standard molekulových hmotností Kity Protilátky Vzorky Metodika Zásobní roztoky: Stanovení koncentrace proteinu ve vzorku Bicinchoniovou metodou (BCA) SDS-polyakrylamidovágelová elektroforéza (SDS-PAGE) Příprava polyakrylamidového gelu Příprava vzorků pro elektroforézu Alternativní způsoby přípravy vzorků pro elektroforézu...44 Sníţení teploty přípravy vzorků na 65 C Pouţití chaotropního činidla- 8M močoviny Vlastní SDS elektroforéza Western blotting (WB) Western blotting - přenos proteinů z elektroforetického gelu na membránu Barvení gelu pomocí Comassie Blue Barvení membrány pomocí Ponceau S Blokace membrány Aplikace protilátek Králičí primární protilátka proti histidinové značce Králičí primární protilátka proti FLAG peptidu Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám Vizualizace a vyhodnocení Dot blot Optimalizace koncentrace protilátek pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám Optimalizace koncentrace protilátek pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičímprotilátkám Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů značených histidinovou značkou za optimalizovaných podmínek E. VÝSLEDKY Stanovení koncentrace proteinu ve vzorcích Optimalizace detekce proteinů značených histidinovou značkou

8 8.1 Detekce proteinů značených histidinovou značkou dle doporučení výrobce protilátek Detekce proteinů značených histidinovou značkou - optimalizace úpravy vzorků Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Detekce proteinů značených histidinovou značkou s aplikací výsledků získaných pomocí metody Dot blot Ověření funkčnosti protilátek při opakovaném použití Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů s histidinovou značkou za podmínek dle doporučení výrobce Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů s histidinovou značkou za optimalizovaných podmínek Optimalizace detekce proteinů značených FLAG peptidem Detekce proteinů značených FLAG peptidem dle doporučení výrobce protilátek Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Detekce proteinů značených FLAG peptidem s aplikací výsledků získaných pomocí metody Dot blot Optimalizace úpravy vzorků Sníţení teploty přípravy vzorků na 65 C Pouţití chaotropního činidla F. DISKUZE G. ZÁVĚR H. POUŢITÉ ZKRATKY I. SEZNAM OBRÁZKŮ J. SEZNAM TABULEK K. LITERATURA

9 A. ÚVOD Proteiny připravené rekombinantní DNA technologií hraji v dnešní době nezastupitelnou roli nejen ve výzkumu ale i v oblasti průmyslu. Tato technologie umoţňuje jednoduše připravit v podstatě jakýkoliv protein v libovolném mnoţství tím, ţe se jeho DNA sekvence začlení do genomu expresního organismu, který zajistí jeho produkci. Díky tomuto postupu se lze vyhnout procesům, při kterých se poţadované proteiny často sloţitými postupy získávají přímo z organismů, ve kterých se přirozeně vyskytují. Tento způsob produkce proteinů se stal natolik běţný a pouţívaný, ţe řada firem začala komerčně nabízet produkty potřebné k jeho realizaci, čímţ došlo k velkému zjednodušení a tak i moţnosti širšího uplatnění takto produkovaných proteinů. Lze tak vybírat z celé škály expresních systémů, které zajistí produkci rekombinantních proteinů s ohledem na jejich poţadované vlastnosti, vektorů slouţících k vnesení cizorodé DNA, značek zjednodušujících purifikaci a detekci připravených rekombinantních proteinů, protilátek, detekčních systémů a dalšího potřebného vybavení. Vše záleţí na podmínkách a finančních moţnostech dané laboratoře. Ale i přes všechna zjednodušení a komerční dostupnost všeho potřebného zůstává stále nezbytným krokem optimalizace podmínek pouţívané metody. Správně nastavené podmínky produkce, purifikace a detekce rekombinantních proteinů mohou vést nejen k úspoře času, materiálu a s ním souvisejících financí, ale i lepšímu a spolehlivějšímu výsledku. 4

10 B. TEORETICKÁ ČÁST 1 Rekombinantní proteiny Rekombinantní proteiny jsou proteiny vyrobené pomocí rekombinantní DNA technologie zaloţené na genových modifikacích. Principem této technologie je umělé vloţení DNA sekvence jiného organismus kódující poţadovaný protein do genomu expresního organismu, který zajistí jeho produkci. Tato technologie umoţňuje přípravu a modifikaci velkého spektra proteinů (Kodíček 2007, Internet 1). Překonává také řadu problémů, které souvisí se získáváním proteinů z nativních zdrojů, jako je například velká obtíţnost izolace konkrétního cílového proteinu často spojena s odejmutím určité části tkáně. Navíc zisk proteinů z lidských tkání pak naráţí na problémy etické. Řada proteinů a enzymů (např. cytokiny) se v tkáních vyskytuje ve velmi nízkých hladinách, coţ také komplikuje jejich izolaci nebo i produkci ve větším měřítku (Walsh 2001, Whitford 2005). Dalším problémem můţe být nebezpečnost a patogenita organismů (např. hadi, mikrobiální patogeny), ve kterých se mohou poţadované proteiny přirozeně vyskytovat. Tím, ţe technologie přípravy rekombinantních proteinů vyuţívá nepatogenních a netoxických hostitelských organismů se podstatně sniţuje riziko a náročnost získávání poţadovaných proteinů (Walsh 2001). Díky rekombinantnímu způsobu přípravy proteinů odpadla řada problémů, které často omezovaly a velmi komplikovaly jejich studium. Také produkce v libovolném mnoţství, která je nespornou výhodou tohoto přístupu, vedla k širší moţnosti aplikace proteinů v lékařství a průmyslových technologiích (Whitford 2005, Walsh 2001). 5

11 2 Exprese rekombinantních proteinů Exprese rekombinantních proteinů je proces sloţený z několika základních kroků, umoţňující připravit pomocí různých druhů expresních systémů poţadovaný protein kódovaný určitým genem nebo jeho částí. Připravený protein lze pomocí purifikačních metod oddělit od neţádoucích nečistot a získat tak čistý protein (Internet 4). 2.1 Získání fragmentu cizorodé DNA Prvním krokem produkce poţadovaného proteinu je izolace genu, který jej kóduje. V případě prokaryotických genů se izoluje celková DNA a poţadovaný gen se následně namnoţí pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Eukaryotické geny pro expresi v prokaryotických buňkách musí být pouţity ve formě komplementární DNA (cdna), protoţe ta neobsahuje nepřepisované úseky (introny). Komplementární DNA lze získat reverzní transkripcí z izolované mrna (Fusek a kol. 2012, Mülhardt 2007). V dnešní době tomuto kroku napomáhají genomové knihovny a internetové databáze, kde je moţné vyhledat odpovídající geny a jejich sekvence, podle kterých lze gen uměle připravit, případně zakoupit. 2.2 Vektory fragmentů cizorodé DNA Fragmenty DNA jsou do buněk expresních systémů vnášeny pomocí vektorů zkonstruovaných tak, aby odpovídaly pouţitému expresnímu systému (Alberts a kol. 2005). Nejčastěji pouţívaným vektorem jsou bakteriální plasmidy, které představují extrachromozomální DNA a jsou schopné autonomní replikace (Mülhardt 2007, Alberts a kol. 2005). Důleţité je aby tyto plasmidy obsahovaly určité sekvence jako replikační počátek, nezbytný pro produkci nových kopií, selekční marker, umoţňující identifikaci buněk nesoucích rekombinantní molekuly (často například gen kódující rezistenci k antibiotikům), polyklonovací místo, do kterého je moţné vloţit fragment cizorodé DNA, regulační sekvence transkripce (promotor a terminátor), a vazebné místo pro ribozomy (Fusek a kol. 2012, Mülhardt 2007). Polyklonovací místo se nachází těsně za promotorem a obsahuje rozpoznávací sekvence pro štěpení restrikčními endonukleasami (Mülhardt 2007, Fusek a kol. 2012). Takto upravené vektory (plasmidy) jsou dostupné i komerčně (Fusek a kol. 2012). 6

12 Obrázek 1: Ukázka schématu klonovacího vektoru - bakteriální plasmid (Internet 8). Aby mohl být fragment cizorodé DNA vloţen do plasmidu je nutné štěpit tento fragment i plasmid shodnou restrikční endonukleázou, čímţ se dosáhne vzniku kompatibilních míst u fragmentu DNA a plasmidu (Alberts a kol. 2005, Mülhardt 2007). Připojení fragmentu DNA k plasmidu zajistí enzym DNA-ligasa a vznikne tak kruhová rekombinantní molekula DNA. Následně je připravený plasmid vnesen do buněk zvoleného expresního systému (Alberts a kol. 2005). Obrázek 2: Inzerce fragmentu cizorodé DNA do plasmidu (Alberts a kol. 2005). Kruhová dvouřetězcová DNA plasmidu je nejprve štěpena restrikční endonukleasou, která vytvoří přeshující konce. Následně je přidán DNA fragment získaný štěpením stejnou restrikční endonukleasou jako DNA plasmidu. Dojde ke spárování kohézních konců DNA fragmentu a DNA plasmidu. DNA ligasa uzavře zlomy v řetězci a vznikne kruhová rekombinantní molekula DNA. 7

13 Plasmidový vektor je vhodný pro vnášení fragmentů DNA o velikosti do 10 kb. K vnášení větších fragmentů (15-20 kb) je moţné vyuţít jako vektor bakteriofág λ a pro velké fragmenty (kolem 45 kb) jsou vhodné cosmidy (Glick a kol. 2009, Mülhardt 2007). Geny lze do buněk vnášet i pomocí virových vektorů (in vivo i in vitro), které jsou konstruovány z replikačně kompetentních virů savců a ptáků nahrazením některých patogenních sekvencí podmiňujících patogenitu viru poţadovaným genem (Fusek a kol. 2012). 2.3 Vnesení vektoru nesoucího fragment cizorodé DNA do buněk U prokaryotických buněk se proces vnesení plazmidu (vektoru) nazývá transformace a u eukaryotických transfekce (Fusek a kol. 2012). Existují dva nejčastěji vyuţívané typy transformace. Prvním typem je metoda, při které je stěna prokaryotické buňky nejprve modifikována CaCl 2 a k vnesení plasmidu se vyuţívá teplotní šok 42 C. Druhý typem je elektroporace, kdy se k vnesení plasmidu vyuţívá krátkodobého elektrického pulzu, který mění polaritu membrány. Elektroporaci je moţné vyuţít i u eukaryotických buněk (Fusek a kol. 2012, Mülhardt 2007). Pro transfekci se nejčastěji vyuţívá kationtových činidel vytvářejících komplex s DNA a umoţňujících jeho fůzi s membránou nebo fosforečnanu vápenatého vytvářejícího s DNA mikroprecipitát vázající se na povrch buňky, který je následně endocytozóu vpraven do buňky. Transfekci lze provést také za vyuţití osmotického šoku pomocí dimetylsulfoxidu (DMSO) nebo glycerolu (Fusek a kol. 2012, Mülhardt 2007). 2.4 Izolace a purifikace rekombinantních proteinů Posledním krokem přípravy rekombinantních proteinů je jejich izolace a purifikace. Výběr vhodné metody závisí na vlastnostech rekombinantního proteinu a jeho způsobu exprese, která je ve většině případů intracelulární, ale u některých proteinů můţe byt i extracelulární (Fusek a kol. 2012). V případě izolace intracelulárních proteinů obsaţených v cytosolu buněk, je nutné nejprve tyto buňky rozrušit, aby se uvolnil jejich obsah do roztoku (lýza buněk). K tomu lze vyuţít metody mechanické a fyzikální, jako je rozbití buněk ultrazvukem, osmotická lýza, French press, opakované rozmrazování a zmrazování, mletí buněk s abrasivním materiálem (písek, sklo), chemické metody, kdy se vyuţívají různé 8

14 detergenty a činidla (dodecylsulfát sodný, Triton X-100, močovina, dithiotreitol) (Bhatia 2005, Whitford 2005) nebo enzymy, např. lysozym, který narušuje buněčnou stěnu Gram-negativních bakterií (E. coli) či chitinasy degradujících polysacharidy obsaţené v buněčné stěně kvasinek (Whitford 2005). Izolace extracelulárně exprimovaných proteinů je méně náročná, protoţe tyto proteiny jsou buňkami uvolňovány do okolního média a lze je z něj přímo izolovat (Bhatia 2005). Pokud je připravovaný rekombinantní protein sekretován v nerozpustné formě, získává se rozpuštěním inkluzních tělísek bakterií. Principem purifikace z inkluzních tělísek je několikanásobná lýza kultivovaného buněčného materiálu a centrifugace. Extrakce inkluzních tělísek můţe být prováděna například pomocí močoviny nebo guanidin chloridu (Internet 4). K purifikaci připravovaných rekombinantních proteinů bývají nejčastěji vyuţívány chromatografické metody - afinitní chromatografie, iontoměničová chromatografie, hydrofóbní chromatografie, gelová permeační chromatografie (Bhatia 2005). Velmi významnou roli zde hrají afinitní značky připojené k proteinům. Tyto značky umoţňují jednoduché, často i jednokrokové oddělení označeného proteinu přímo z komplexního buněčného materiálu. Obrázek 3: Purifikace rekombinantního proteinu značeného afinitní značkou a následné odštěpení afinitní značky (Wood 2003). Protein nesoucí afinitní značku interaguje při průchodu kolonou s ligandem (specificky odpovídající této značce) ukotveným na koloně a po promytí neţádoucích proteinů, které se nenavázaly (neobsahovaly příslušnou afinitní značku), je purifikovaný 9

15 protein uvolněn do čisté fáze (Internet 4, Wood 2003) (viz Obrázek 3). Tento způsob izolace a purifikace rekombinantních proteinů je daleko výhodnější neţ v případě nativních proteinů, které ţádné značky neosahují. Příklady pouţívaných afinitních značek a matric s odpovídajícími ligandy jsou uvedeny v kapitole Detekce K detekci a ověření čistoty exprimovaných rekombinantních proteinů lze vyuţít SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézu (SDS-PAGE) a Western blotting analýzu. Přesnou analýzu proteinu umoţňuje hmotnostní spektrometrie (Internet 4, Mülhardt 2007). Koncentraci připraveného proteinu lze stanovit spektrofotometrickými metodami (například metoda dle Bradfordové nebo Bicinchoniová metoda). 10

16 3 Používané expresní systémy Výběr vhodného expresního systému hraje významnou roli při přípravě rekombinantních proteinů. Důleţitým kritériem je charakteristika připravovaného rekombinantního proteinu, jeho zamýšlená aplikace a výsledné mnoţství (Grabski 2009, Stevens 2000, Yin a kol. 2007). Výběr špatného expresního systému můţe způsobit, ţe protein bude exprimován ve špatné konformaci, bude postrádat potřebné posttranslační modifikace nebo naopak bude obsahovat neţádoucí modifikace, a nebo bude produkován v malém mnoţství (Grabski 2009). Expresní systémy vyuţívané pro produkci rekombinantních proteinů lze rozdělit na dvě základní kategorie: prokaryotické expresní systémy (bakteriální) a eukaryotické expresní systémy (kvasinkové, hmyzí, savčí) (Internet 4, Yin a kol. 2007). 3.1 Prokaryotické expresní systémy Prokaryotické expresními systémy jsou systémy tvořeny bakteriemi. V praxi patří mezi nejčastěji vyuţívané expresní systémy. Předností je jejich většinou dobře charakterizovaný genom, dostupnost stále se zvětšujícího mnoţství klonovacích vektorů a mutovaných expresních kmenů, a také finanční nenáročnost (Terpe 2006, Internet 4, Yin a kol. 2007). Nevýhodou ovšem je, ţe neumoţňují posttranslační modifikace a proto nemohou být zvoleny jako expresní systémy pro proteiny, jejichţ posttranslační modifikace jsou nezbytné pro jejich bioaktivitu (Terpe 2006, Stevens 2000) Expresní systém bakterie Escherichia coli Prototypem prokaryotických expresních systémů se stala bakterie Escherichia coli. Jedná o organismus s velmi dobře charakterizovaným genomem, který lze díky nenáročné manipulaci zavést téměř v kaţdé laboratoři (Terpe 2006, Koehen a kol. 2009). Je hojně vyuţíván také ve farmaceutické produkci a průmyslu (Terpe 2006). Varianty Mutacemi genů byla vyvinuta celá řada různě optimalizovaných kmenů E. coli s různými poţadovanými vlastnostmi (Fusek a kol. 2012). Mezi běţně pouţívaný kmen 11

17 patří BL21 (Internet 2), který je schopen silně růst i v minimálních médiích a je nepatogenní. Existuje mnoho variant tohoto kmenu, které umoţňují docílit exprese rekombinantních proteinů různých vlastností (Internet 2, Sørensen a kol. 2005). Dalším běţně uţívaným kmenem E. coli je kmen K12, který byl vyvinut pro účely klonování (Internet 2). Výhody a nevýhody Výhodou tohoto expresního systému je rychlý růst a exprese proteinů, vysoký výnos produktu, jednoduché genové modifikace a finanční nenáročnost (Koehen a kol. 2009, Stevens 2000, Yin a kol. 2007). Nevýhodou je obtíţná exprese proteinů obsahujících disulfidické vazby a také to, ţe neumoţňuje posttranslační modifikace proteinů, jako je například glykosylace, acetylace, fosforylace, které mohou být nezbytné pro správnou funkci proteinu (Stevens 2000, Yin a kol. 2007). Další nevýhodou je obsah lipopolysacharidu v buněčné stěně a tvorba endotoxinů, které kontaminují výsledný produkt, coţ můţe představovat problém pro farmakologické aplikace (Terpe 2006, Yin a kol. 2007). Komplikující je také produkce některých proteinů ve formě inkluzních tělísek (Chatterjee a kol. 2006, Janiczek 2012), jejíţ příčinou můţe být toxicita rekombinantního proteinu pro bakteriální organismus nebo nepřítomnost vhodného chaperonu (Janiczek 2012, Yin a kol. 2007). Proteiny obsaţené v inkluzních tělíscích jsou neaktivní, agregované, nerozpustné a vyţadují renaturaci (tzv. re-folding) (Janiczek 2012). Vektory cizorodé DNA K vnesení genu do buněk a jeho expresi se vyuţívají plasmidy (Fusek a kol. 2012, Mülhardt 2007). K dosaţení vysoké exprese, musí mít gen v expresním vektoru (plasmidu) silný a dobře kontrolovatelný promotor. Příkladem je promtor lac genu β-galaktosidasy E.coli. Transkripce je blokována vazbou lac represoru na operátorovou sekvenci DNA. Jako induktor se v praxi vyuţívá izoptopyl-β-d-galaktopyranosid (IPTG), coţ je analog laktózy. Dalším vyuţívaným promotorem je trp promotor reprimovaný tryptofanem. Rozšířené jsou také systémy s bakteriofágovými promotory (např. promotory bakteriofágů T3, T7 a SP6) (Fusek a kol. 2012, Koehen a kol. 2009). Nejvíce vyuţívanými plasmidy jsou pet 12

18 plasmidy, konkrétně plasmidy s promotorem bakteriofága T7 (Sørensen a kol. 2005, Yin a kol. 2007). Využití v praxi Bakterie E. coli se hojně vyuţívá pro produkci terapeuticky vyuţívaných rekombinantních proteinů. Jsou to například: lidský inzulín nebo jeho analog, lidský růstový hormon, parathyroidní hormon, interferon α, interferon β, faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF) (Chrastilová a kol. 2007) Další příklady prokaryotických expresních systémů Do popředí zájmu se dostávají grampozitivní baterie rodu Bacillus (Bacillus subtilis, B. megaterium, B. licheniformi, B. breviss) (Terpe 2006). Výhodou těchto systémů oproti expresním systémům E. coli je, ţe rody B. subtilis a B. licheniformis neprodukují škodlivé exotoxiny ani endotoxiny (Yin a kol. 2007). Mají přirozeně vysokou sekreční kapacitu, sekrece exprimovaných proteinů je extracelulární a probíhá přímo do média, coţ usnadňuje proces izolace a purifikace těchto proteinů (Yin a kol. 2007, Terpe 2006). Narozdíl od E. coli neobsahují tyto bakterie v buněčné stěně lipopolysacharid. Další výhodou je vyšší vyuţívání kodónů AGG, AGA, CUA, AUA, CCC, CGA (Terpe 2006). Nevýhodou je ale menší znalost o tvorbě tvorby disulfidických můstků a izomeraci (Terpe 2006). Díky stále více se rozvíjejícím poznatkům genomiky mohou být k expresi rekombinantních proteinů vyuţity v podstatě všechny druhy bakterií. Ale menší znalost regulace a mechanismů některých druhů, stejně tak jako komerční nedostupnost vhodných vektorů a systémů promotorů vedou k jejich menšímu vyuţívání. Příkladem mohou být rod Streptomyces, nebo druhy jako Entrococcus faecim, Anaeba sp., Staphylococcus carnous, Pseudomonas fluorescens a další (Terpe 2006). 3.2 Eukaryotní expresní systémy Kvasinkové expresní systémy Kvasinkové expresní systémy jsou také hojně vyuţívanými expresními systémy. Kvasinky patří mezi geneticky velmi dobře charakterizované organismy 13

19 (Demain a kol. 2009) a svými nároky na obtíţnost, laboratorní vybavení a finanční dostupnost se příliš neliší od bakteriálních expresních systémů (Internet 4). Varianty Nejpouţívanějšími druhy kvasinek jsou Saccharomyces cerevisiae a metylotrofní Pichia pastoris. Pro průmyslové účely existuje řada upravených mutantů se zvýšenou genetickou stabilitou a omezením produkce proteas (Fusek a kol. 2012, Yin a kol. 2007). Problém u druhu S. cerevisiae mohou představovat posttranslační modifikace typu N-glykosylace, protoţe dochází k tvorbě glykoproteinů obsahujících velké mnoţství manóz (50-150) spojené vazbou α-1,3, které mohou u člověka vyvolat imunologickou reakci (Demain a kol. 2009, Chrastilová a kol. 2007, Grabski 2009). Vhodnějším zástupcem kvasinek se proto zdá být Pichia pastoris, která glykosyluje proteiny podobným způsobem jako lidské buňky (Fusek 2012, Yin a kol. 2007). Připojované glykoproteiny obsahuji méně manózových molekul (do dvaceti) a neobsahuje α-1,3-mannosyltransferasu. Má schopnost vytvářet disulfidické vazby (Demain a kol. 2009, Grabski 2009). Vektory cizorodé DNA Plasmidy určené pro expresi rekombinantních proteinů v kvasinkách obsahují v podstatě podobné sekvence jako bakteriální plasmidy. Příkladem mohou být kvasinkové integrační plasmidy (YTp) a kvasinkové replikační plasmidy (YRp) (Fusek a kol. 2012). Existuje celá řada pouţívaných promotorů jako např. silný promotor GALI, který je indukovatelný galaktózou nebo promotor pro gen kódující alkohol-oxidasu 1 (AOX1) indukovaný methanolem (Fusek a kol. 2012, Pemberton a kol. 2004). Výhody a nevýhody Velkou výhodou kvasinek oproti bakteriálnímu expresnímu systému E. coli je schopnost provádět řadu posttranslačních modifikaci podobné těm v eukaryotických buňkách. Proto jsou tyto systémy vyuţívány pro produkci rekombinantních proteinů, které jsou špatně produkovatelné v bakteriích E. coli z důvodu absence posttranlačních modifikací (Demain a kol. 2009, Yin a kol. 2007). V produkci rekombinantních 14

20 proteinů vykazují vysokou výtěţnost, ale je niţší neţ v bakteriích (Chrastilová 2007). Exprese probíhá většinou intracelulárně, ale genetickou manipulací je moţné ji změnit na extracelulární (Bhatia 2005). Práce s těmito systémy je daleko méně náročná a ekonomičtější neţ při pouţívání expresních systémů vyuţívající hmyzí buňky a savčí tkáňové kultury (Demain a kol. 2009). Využití v praxi Kvasinkové expresní systémy jsou také vyuţívány pro produkci řady terapeuticky vyuţívaných rekombinantních proteinů: lidský inzulín a jeho analoga, lidský růstový faktor, faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) (Chrastilová a kol. 2007) Hmyzí expresní systémy Tyto expresní systémy jsou tvořeny kultivovanými hmyzími buňkami. Exprese rekombinantních proteinů je v těchto buňkách náročná na čas, provedení (nutné aseptické prostředí) a finance, ale nespornou výhodou s nimi spojenou je exprese v mnohobuněčném organismu (Internet 4). Varianty Hmyzí expresní systémy jsou tvořeny nejčastěji buňkami motýlů druhu Spodoptera frugiperda (kmeny Sf9 a SF21) a druhu Trichoplusia ni (Demain a kol. 2009, Grabski 2009). Vektory cizorodé DNA Nejčastěji vyuţívaným vektorem pro expresi rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách je bakulovirus Autagrapha californica obsahující dvouvláknovou DNA. Jedná se o přirozeného patogena motýlů a dalších bezobratlých organismů, pro člověka a rostliny je nepatogenní (Demain a kol. 2009, Yin a kol. 2007). Tento bakulovirus, nesoucí geny kódující poţadovaný rekombinantní protein, infikuje hmyzí buňky a ty pak produkují rekombinantní protein do dvou aţ třech dnů po infekci (Bhatia 2005). Velikost virového genomu je 130 kb, coţ umoţňuje vloţit větší fragment DNA neţ v případě plasmidu (Grabski 2009). 15

21 Výhody a nevýhody Velkou výhodou tohoto systému je, ţe v hmyzích buňkách probíhá většina posttranslačních modifikací, které se vyskytují i v savčích buňkách. Dochází v nich i ke správnému skládání proteinů, coţ vede k tomu, ţe produkované rekombinantní proteiny zůstávají většinou rozpustné, na rozdíl od produkce v bakteriích (Demain a kol. 2009, Chrastilová a kol. 2007). Nevýhodou je ale odlišný typ N-glykosylace od savčích buněk. Tento problém byl ale vyřešen vytvořením kmene (Sf9) hmyzích buněk tvořícím N- glykanové komplexy normálně se vyskytujících v savčích buňkách (Grabski 2009). Použití v praxi Expresní systémy hmyzích buněk se jeví jako vhodné systémy pro přípravu glykoproteinů (Sethuraman a kol. 2006, Yin a kol. 2007). Pro terapeutické účely je rekombinantně v hmyzích buňkách připravován například erytropoetin nebo různé polyklonální protilátky (Chrastilová a kol. 2007) Savčí buněčné linie jako expresní systém Savčí expresní systém se pouţívá pouze ve specializovaných laboratořích. Z uvedených systémů patří k finančně nejnáročnějším. Varianty Nejčastěji pouţívanými buněčnými liniemi jsou buňky vaječníků Křečka čínského (CHO - chinese hamster ovary) (Chrastilová a kol. 2007, Fusek a kol. 2012, Omasa a kol. 2010). Tyto buňky byly geneticky modifikovány vnesením genu kódujícího lidskou glykosyltransferasu a je tak jejich výhodou, ţe glykosylují proteiny velmi podobným způsobem jako lidské buňky (Omasa a kol. 2010, Fusek a kol. 2012). Jsou bezpečné, protoţe se v nich nemůţe mnoţit řada lidských patogenů, jejich růst je moţný i v syntetickém médiu bez komponent ţivočišného původu (Kim a kol. 2012). Dalšími vyuţívanými buněčnými liniemi jsou buňky odvozené z fibroblatů Křečka syrského (baby hamster kidney, BHK21), endotelové buňky z opičích ledvin, lidské embryonální ledvinné buňky HEK293, a myší buňky NS0 a Sp2/0 (Fusek a kol. 2012, Kim a kol. 2012, Chrastilová a kol. 2007). 16

22 Vektory cizorodé DNA Geny do buněk lze vnášet pomocí plasmidů nebo virových vektorů (replikačně kompetentní viry savců a ptáků s nahrazenými sekvencemi nutnými pro patogenitu) (Verma a kol. 1998, Fusek a kol. 2012). Výhody a nevýhody Savčí buněčné linie jsou často pouţívané pro průmyslovou produkci farmaceuticky vyuţívaných rekombinantních proteinů. Hlavním důvodem je, ţe při jejich pouţití bývá dosaţeno podobného způsobu posttranslačních modifikací rekombinantních proteinů jako v lidském organismu (Hunt 2005, Omasa a kol. 2010, Koehen a kol. 2009). Nevýhodou je, ve srovnání s ostatními systémy, vyšší riziko kontaminace, protoţe kultivační média musí být vysoce bohatá na ţiviny, také laboratorní, časová a finanční náročnost způsobená vysokou cenou sloţek médií, náročností na sterilní matriál a drahá je i purifikace (Davies a kol. 2005, Chrastilová a kol. 2007, Fusek a kol. 2012). Savčí buňky mohou přenášet infekční částice (viry, priony) (Chrastilová a kol. 2007). Použití v praxi CHO expresní systém se pouţívá k produkci celé škály terapeuticky vyuţívaných rekombinantních proteinů, jako jsou například erytropoetin, interferon-β, faktory sráţení krve, monoklonální protilátky a řada dalších (Chrastilová a kol. 2007). Vero buňky se nejčastěji vyuţívají pro tvorbu rekombinantních vakcín (Fusek a kol. 2012) a myší buněčné linie NS0 a Sp2/0 pro produkci monoklonálních protilátek (Chrastilová a kol. 2007). 17

23 4 Proteinové a peptidové afinitní značky Zvyšující se produkce a vyuţívání rekombinantních proteinů nejen v oblasti výzkumu ale i průmyslových oblastech a zdravotnictví vedla k rozvoji metod usnadňujících jejich purifikaci a detekci. Velmi rozšířené se stalo pouţívání proteinových a peptidový afinitních značek. Jedná se o velmi jednoduchou proceduru, která byla poprvé pouţita na začátku roku 1980 a stala se od té doby značně vyuţívanou (Lee a kol. 2012). Proteinové a peptidové značky představují exogenní aminokyselinové sekvence mající vysokou afinitu k pro ně specifickým biologickým nebo chemickým ligandům (Arnau 2006, Falke a kol. 2004). Rekombinantní proteiny nesoucí tyto značky jsou snáze identifikovatelné a jejich purifikace je daleko jednodušší a rychlejší neţ u neznačených proteinů (Einhauer 2001, Terpe 2003, Justesen a kol. 2009). Tyto značky umoţňují snadno detekovat i proteiny, proti kterým nejsou dostupné protilátky nebo mající nízkou imunogenicitu (Brizzard 2008). S výhodou lze vyuţít jednokrokové purifikace značeného rekombinantního proteinu přímo z buněčného extraktu nebo supernatantu, bez předchozího odstranění nukleových kyselin nebo ostatního buněčného materiálu, pomocí chromatografických kolon naplněných příslušným afinitním sorbentem (Einhauer 2001, Lichty 2005). 4.1 Dělení afinitních značek Peptidové nebo proteinové afinitní značky lze rozdělit podle povahy jejich afinitních cílů do tří základních skupin: A. peptidy nebo proteiny mající afinitu k malým ligandům navázaným na pevném povrchu (například histidinová značka). B. peptidy nebo proteiny mající afinitu k jiným proteinům ukotveným v sorbentu chromatografické kolony (například kalmodulin vázající protein). C. peptidy nebo proteiny mající afinitu k protilátkám proti jejich specifickým epitopům (například FLAG peptid). Lze povaţovat za podskupinu druhé skupiny (Arnau 2006, Lichty 2005). 18

24 4.2 Umístění afinitních značek Afinitní značky lze připojit buď k N- nebo C-konci připravovaného rekombinantního proteinu (Justesen a kol. 2009, Falke a kol. 2004). Při některých aplikacích je moţné připojit značku na oba tyto konce (Falke a kol. 2004). Obrázek 4: Schéma umístění afinitní značky k cílovému proteinu (Malhotra 2009). (A) afinitní značka umístěna na N- konci proteinu, (B) afinitní značka umístěna C-konci proteinu, (C) kombinace dvou afinitních značek, umístění na N- i C-konci proteinu. Vedle kaţdé značky se nachází místo pro štěpení proteasou, umoţňující v případě potřeby její odštěpení. Připojení proteinové nebo peptidové značky můţe mít také pozitivní efekt na biochemické vlastnosti značeného proteinu. Můţe vést například k vyšší výtěţnosti rekombinantního proteinu, bránit proteolýze, usnadňovat renaturaci (re-folding) nebo zvyšovat rozpustnost daného proteinu (Arnau 2006). Tyto značky mohou mít také neţádoucí vliv na značené proteiny, jakým je například změna konformace proteinu, sníţení výtěţnosti, inhibice enzymové aktivity, změna biologické funkce a toxicita (Arnau 2006). 4.3 Výběr vhodné afinitní značky a jejich porovnání Poţadované rysy afinitních značek: snadná jednokroková purifikace značeného proteinu 19

25 minimální efekt na terciární strukturu a biologickou aktivitu proteinu snadné odštěpení od značeného proteinu spolehlivé stanovení variabilní pouţití (Terpe 2003). Existuje celá řada různých proteinů, domén a peptidů, které mohou být vyuţity k označení rekombinatních proteinů (Terpe 2003). Výběr vhodné afinitní značky záleţí na zvoleném způsobu následné purifikace proteinů. Například pokud proces purifikace zahrnuje denaturaci, je nutné zvolit takovou značku, která tomuto kroku odolá. Důleţité je zvolit i správnou velikost značky. Ta můţe být v rozmezí od jedné nebo několika aminokyselin aţ po kompletní protein (Einhauer 2001, Krogsdam 2003). Malé značky Mezi často pouţívané malé peptidové značky patří argininová, FLAG peptidová, histidinová, c-myc, Sterp, Strep II značka (tag). Tyto velmi malé značky neinterferují s proteiny, ke kterým jsou připojeny a pro některé aplikace nemusí být ani odstraňovány. Na rozdíl od velkých proteinových značek nejsou imunogenní a takto značené proteiny mohou být pouţity přímo jako antigeny k produkci protilátek. Vliv na terciární strukturu proteinu závisí na lokalizaci značky a jejím aminokyselinovém sloţení (Terpe 2003). Velké značky Pouţití velkých peptidových nebo proteinových značek (například GST nebo ProteinA) můţe zvýšit rozpustnost značeného proteinu, ale pro řadu metod jako je například krystalizace nebo produkce protilátek, musí být odstraněny (Terpe 2003, Krogsdam 2003). Jejich snadnější odstranění umoţní vloţení štěpného místa pro proteázu na N-konec značeného proteinu (Hunt 2005). Kombinace značek Často se vyuţívají i kombinace různých značek s odlišnými vlastnostmi, kdy jedna značka se pouţije z například z důvodu zvýšení rozpustnosti rekombinantního proteinu a druhá z důvodu jeho snadnější purifikace a detekce (Young a kol. 2012). Principu kombinace více značek vyuţívá i metoda tandemové afinitní purifikace (TAP), kdy dvě afinitní značky jsou exprimovány v tandemu. Příkladem takového 20

26 tandemového komplexu můţe protein A a kalmodulin vázající protein (CBP). Purifikace je potom vícestupňová a vede k vysokému stupni čistoty rekombinantních proteinů (Young a kol. 2012, Rohila a kol. 2004). Obrázek 5: Schéma tandemového umístění značek pro TAP (Malhotra 2009). Cílový protein je označený dvěma značkami (CBP a Prot A) zapojenými za sebou v tandemu. Vedle kaţdé značky se nachází místo pro štěpení nukleasou, umoţňující v případě potřeby odštěpení značky. Detekce takto značených proteinů je moţná pomocí metody Western blotting nebo dalšími imunoprecipitačními a imunochemickými metodami zaloţenými na vyuţití monoklonálních protilátek proti značkám označujícími stanovované proteiny (Brizzard 2008). 4.4 Odstranění afinitní značky Ne vţdy je ţádoucí, aby finální produkt rekombinantního proteinu obsahoval připojenou proteinovou nebo peptidovou značku. Aby bylo moţné odstranění této značky, vkládají se mezi DNA sekvenci značky a sekvenci poţadovaného proteinu štěpná místa a rozpoznávací sekvence pro restrikční proteasy. Příkladem těchto proteas jsou enterokinasa, faktor Xa, TEV (Tobacco etch virus) proteasa, chymosin (Justesen, a kol. 2009). 4.5 Příklady často používaných afinitních značek FLAG peptidová značka (FLAG-tag) Charakteristika FLAG peptidová značka je tvořená sekvencí osmi aminokyselin: DYKDDDDK. Aminokyselina tyrosin umístěná na druhé pozici sekvence této značky, byla zvolena z důvodu moţnosti uplatnění antigenních vlastností (interakce antigen-protilátka). Aromatické aminokyseliny jsou totiţ hlavním faktorem ve vzniku interakcí 21

27 antigen-protilátka. Negativně nabitá asparagová kyselina na N-konci peptidu podporuje antigenní vlastnosti následujícího tyrosinu. Hexapeptidová sekvence aminokyselin KDDDDK má vysoké hydrofilní vlastnosti a vykazuje také antigenní vlastnosti (Einhauer 2001, Nilsson 1997). Tato značka můţe být exprimována v různých expresních systémech, například v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích i v savčích buňkách (Terpe 2003, Nilsson 1997). Umístění FLAG peptidová značka můţe být umístěna jak na N- tak C-konci značeného proteinu. Výhodnější je ale její umístění na N-konci. Bylo prokázáno, ţe takto umístěná FLAG peptidová značka je stabilní a není štěpená proteasami E. coli při expresi rekombinantního proteinu (Einhauer 2001, Knappik 1994). Protilátky Proti FLAG peptidové značce existují tři monoklonální protilátky (M1, M2, M5) lišící se ve vazbě na cílové epitopy. M1 protilátka, nazývána také jako anti-flag nebo 4E11, je velmi často vyuţívanou protilátku pro detekci a purifikaci rekombinantního proteinu nesoucího FLAG peptidovou značku situovanou na N-konci. Váţe se na epitop FLAG peptidu způsobem vyţadujícím vápník. Její eluce je moţná pomocí chelatačního činidla (EDTA) (Einhauer 2001, Nilsson 1997). M2 protilátka nevyţaduje vápník a je vhodná pro rekombinantní proteiny značené FLAG peptidovou značkou, mající na N- konci metionin (Met-FLAG) a nebo FLAG peptidovou značku umístěnou na C-konci. (Einhauer 2001). M5 protilátka byla vyvinuta proti sekvenci N-MetAspTyrLysAsp 4 Lys- (Terpe 2003). Purifikace a detekce Purifikace a detekce takto značeného rekombinantního proteinu je moţná pomocí metody afinitní chromatografie vyuţívající například protilátky proti FLAG peptidové značce. Dále pomocí ELISA (Enzyme-linked imunosorbent assay) metody, imunoblottingu a dalších imunochemických metod (Einhauer 2001). 22

28 Odštěpení značky K odštěpení této značky se vyuţívají entrokinázy, které jsou specifické pro sekvenci AspAspAspAspLys. Dále proteázy jako například faktor Xa, genenasa I, trombin a 3C (proteasa 3C lidského rhinoviru Typu 14) (Einhauer 2001) Histidinová značka (His-tag) Charakteristika Histidinová značka je jedna z nejrozšířenějších afinitních značek vyuţívaných pro purifikaci a detekci rekombinantních proteinů (Müller a kol. 1998, Malhotra 2009). Nejčastěji je tvořena šesti molekulami histidinu (HHHHHH) (Hunt 2005, Malhotra 2009). Pouţívají se ale i varianty se dvěma aţ deseti na sebe navazujícími histidinovými molekulami (Young a kol. 2012). Jedná se o značku malé velikosti (0.84 kda) a slabém náboji, proto k interakci se značeným proteinem dochází velmi zřídka (Terpe 2003, Young a kol. 2012). Je stabilní i při denaturačních podmínkách (Waugh 2006, Young a kol. 2012) Lze ji vyuţívat při přípravě rekombinantních proteinů v řadě expresních systémů (bakteriálních, kvasinkových, savčích buněk, hmyzích) (Terpe 2003). Umístění Histidinové afinitní značky bývají běţně umístěny na N- nebo C-konci rekombinantního proteinu, v závislosti na biochemických vlastnostech a sloţení konkrétního proteinu (Terpe 2003, Linder a kol. 1997). Purifikace a detekce K purifikaci rekombinantních proteinů značených histidinovou značkou se vyuţívá metoda chelatační afinitní chromatografie (IMAC, Immolized Metal Affinity Chromatography) (Linder a kol. 1997, Müller a kol. 1998, Bornhorst a kol. 2000). Tato metoda je zaloţena na interakci mezi ionty přechodných kovů (např. Co 2+, Cu 2+, Ni 2+, Zn 2+ ) vázanými na pevné fázi (polymerním nosiči) chelátovým komplexem a aminokyselinovým postranním řetězcem (Janiczek 2012, Linder a kol. 1997, Bornhorst a kol. 2000). Aminokyselina histidin, obsaţena v histidinové značce, silně 23

29 interaguje s ionty kovu imobilizovanými v pevné fázi a funguje tak jako donor elektronů, prostřednictvím jejího imidazolového kruhu, a ochotně tak vytváří koordinační vazbu s ionty kovů (Terpe 2003, Linder a kol. 1997, Bornhorst a kol. 2000). Dochází tak ke snadnému záchytu a purifikaci rekombinantních proteinů obsahujících histidinovou značku (Terpe 2003, Müller a kol. 1998). Nejčastěji vyuţívanou pevnou chromatografickou fází je Ni 2+ -nitrilotrioctová kyselina (Ni 2+ -NTA) (Linder a kol. 1997), nebo novější TALON, který tvoří Co 2+ -karboxymethylaspartát (Co 2+ -CMA) (Terpe 2003, Janiczek 2012, Waugh 2006). K eluci vázaných proteinů na tyto pevné fáze můţe být vyuţito mM (často i mM) imidazolu, ph 5,0 nebo 10mM EDTA (Waugh 2006). Dalším způsobem purifikace je imunoafinitní chromatografie zaloţena na protilátkách proti histidinové značce (Müller a kol. 1998). Příkladem těchto protilátek jsou 3D5, PentaHis, 13/45/31, His1/MRGs-His (Müller a kol. 1998). Protilátky lze vyuţít i k detekci (Terpe 2003). Obrázek 6: Schéma vazby rekombinantního proteinu značeného histidinovou značkou (6x His) na Ni-NTA (Internet 7). Občas můţe při pouţití této metody purifikace docházek k nespecifickým vazbám proteinů expresních systémů. Tomu lze předejít například promytím kolony 2-30mM roztokem imidazolu (Young a kol. 2012). Odštěpení značky K odštěpení histidinové značky se vyuţívají nejčastěji komerčně dostupné endopeptidázy jako například trombin, tobacco etch virus proteasa (TEV) a faktor Xa. 24

30 Dále je moţné pouţít i exopeptidasy jako je například aminopeptidasa (Kuo a kol. 2010). Kombinace Díky malé velikosti, snadné purifikaci a detekovatelnosti se tato značka často pouţívá v kombinaci s dalšími značkami. Příkladem můţe být kombinace se značkami thioredoxin A (TrxA), protein disulfid isomerasa I (DsbA I), NusA protein (N-utilization substance A), které se pouţívají ke zvýšení rozpustnosti rekombinantních proteinů (Terpe 2003) Glutation-S-transferasa (GST-tag) Charakteristika Glutation-S-transferasa je enzym, který se v biologických systémech (aerobních) účastní antioxidačních procesů. Vyskytuje se v dimerní formě o velikosti 26 kda (Internet 9). Pro značení rekombinantních proteinů se vyuţívá GST pocházející z patogenního parazita druhu Schistosoma japonicum (Young a kol. 2012, Chatterjee a kol. 2006). GST značka chrání značený rekombinantní protein proti intracelulární proteolýze a stabilizuje jej v rozpustné frakci (Young a kol. 2012). Mírně ovlivňuje zvýšení rozpustnosti značeného rekombinantního proteinu, ale některé takto značené proteiny mohou zůstat nerozpustné (Young a kol. 2012). Pro expresi můţe být vyuţita celá řada expresních systémů (bakteriální, kvasinkové, savčí a hmyzí buňky) (Young a kol. 2012, Nilsson 1997). Umístění Tato značka můţe být umístěna na N- i C-konci rekombinantních proteinu (Young a kol. 2012). Purifikace a detekce Protein označený touto značkou můţe být purifikován přímo z buněčného lyzátu metodou afinitní chromatografie za pouţití kolony s imobilizovaným glutathionem (Tudyka a kol. 1997, Lichty 2005, Nilsson 1997). Eluce se provádí za nedenaturujících 25

31 podmínek redukovaným 10mM glutationem (Nilsson 1997). Detekce značeného proteinu je moţná metodou ELISA (Frangioni a kol. 1993, Young a kol. 2012). Odštěpení značky Expresní vektor nesoucí sekvenci pro GST afinitní značku obsahuje také specifická místa štěpená proteasami pro snadné odštěpení této značky (Nilsson 1997) c-myc značka (c-myc tag) Charakteristika c-myc protein je produkt protoonkogenu c-myc patřící do rodiny myc genů. Jedná se o protein podílející se na průběhu buněčného cyklu, apoptózy a buněčné transformace (Cibula 2009). Nejčastěji pouţívaná aminokyselinová sekvence této značky je EQKLISEEDL, lze pouţívat ale i její modifikace jako například KLISEEDL (Hilpert a kol. 2001, Buck a kol. 2004). Značka můţe být vyuţívána i v tandemu (Young a kol. 2012). Exprese rekombinantních proteinů značených c-myc značkou je moţná v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích i savčích expresních systémech (Terpe 2003). Umístění Umístění c-myc je moţné jak na N- tak C-konec rekombinantního proteinu (Young a kol. 2012). Protilátky C-myc značka má vysokou specifitu k protilátce anti-c-myc 9E10 (Hilpert a kol. 2001). Purifikace a detekce c-myc značka se vyuţívá hlavně pro detekci rekombinantních proteinů za pouţití metod jako jsou například Western blotting, průtokové cytometrie, imunoprecipitace, imunochemie a ELISA (Young a kol. 2012). Pouţití pro purifikaci je méně časté, ale moţné (Young a kol. 2012). 26

32 4.5.5 Hemaglutinin A značka (HA-tag) Charakteristika HA značka je tvořena sekvenci devíti aminokyselin: YPYDVPDYA. Je odvozena od hemaglutininu lidského chřipkového viru. Jedná se často pouţívanou značku a to zejména z toho důvodu, ţe má vysokou imunogenicitu a proto je snadno detekovatelná příslušnou protilátkou (Lee a kol. 2012). Výhodou je také, ţe zřejmě nezasahuje do bioaktivity výsledného rekombinantního proteinu (Lee a kol. 2012). Protilátky Mezi komerčně dostupné protilátky patří anti-ha 16B12 nebo 12CA5 (McLean a kol. 2006, Sells a kol. 1995). Purifikace a detekce K purifikaci rekombinantního proteinu označeného HA značkou lze s výhodou vyuţít matric se zakotvenou příslušnou protilátkou. Pouţití protilátek je vhodné i pro detekci (imunochemické metody detekce) (Lee a kol. 2012) Streptavidin vázající proteinové značky (Strep-tag, Strep-tag II, SBP-tag) Charakteristika Strep-tag Příprava značky streptavidin vázající protein (Strep-tag) byla popsána v roce 1993 (Schmidt a kol. 1993). Originálně se jedná peptid sloţený z devíti aminokyselin (WRHPQFGG) (Schmidt a kol. 1993). U této značky se nevyskytují nespecifické vazby k ostatním proteinům, má nízkou citlivost k bakteriálním proteasam a neovlivňuje skládání proteinů (Skerra a kol. 1999). Purifikace a detekce Strep značka má afinitu ke streptavidinu, čehoţ se vyuţívá při jednoduché jednokrokové purifikaci pomocí imobilizovaného streptavidinu. Následná eluce je prováděna pomocí biotinu nebo jeho analogů (Schmidt a kol. 1994). Mimo to je tato značka pouţívána také k detekci proteinů pomocí metody Western blotting a ELISA (Schmidt a kol. 1994). 27

33 Umístění Tato značka můţe být umístěna pouze na C-konec rekombinantně připravovaného proteinu (Schmidt a kol. 1994, Skerra a kol. 1999). Charakteristika Strep-tag II Pro větší flexibilitu a afinitu k uměle vytvořené variantě streptavidinu (Strep-Tacin), připraveného rekombinantně, byla vytvořena upravená varianta značky Strep-tag nazývána Strep-tag II s aminokyselinovou sekvencí WSHPQFEK (Skerra a kol. 1999, Junttila a kol. 2005). Jedná se o značku vysoce rezistentní k buněčným proteasam. Můţe být pouţita v kombinaci se slabými detergenty a je optimální pro purifikaci rekombinantních proteinů za fyziologických podmínek. Není příliš vhodná pro purifikaci vyuţívající denaturační podmínky (Skerra a kol. 1999, Young a kol. 2012). K expresi lze vyuţít bakteriální, kvasinkový, hmyzí, rostlinný i savčí expresní systém (Terpe 2003). Umístění Strep-tag II můţe být umístěn na C- i N- konec proteinu (Skerra a kol. 1999). Purifikace a detekce K uvolnění vazby mezi značkou Strep-tag II a Strep-Tacin je vyuţíváno D-biotinu nebo D -desthiobiotinu (Skerra a kol. 1999, Young a kol. 2012). Zájem o tuto značku v posledních letech velmi narostl. Je vhodná i pro purifikace enzymů obsahujících kov. Takto značené proteiny mohou být podrobeny krystalizaci i NMR a studiím zkoumajícím protein-protein interakce (Terpe 2003). K detekci se tato značka moc nepouţívá (Hunt 2005). Další variantou je SBP značka obsahující 38 aminokyselin s ještě vyšší afinitou ke streptavidinu (Young a kol. 2012). 28

34 4.5.7 S peptidová značka (S-tag) Charakteristika S značka je fúzní oligopeptid sloţený z patnácti aminokyselin: KETAAAKFERQHMDS. Obsahuje čtyři kationické, tři anionické, tři nenabité polární a pět nepolárních aminokyselinových zbytků, coţ vede k tomu, ţe je tato značka rozpustná a zvyšuje tak i rozpustnost značeného rekombinantního proteinu (Terpe 2003, Hunt 2005). Exprese je moţná v systémech bakteriálních, savčích buněk a hmyzích buněk infikovaných bakulovirem (Terpe 2003). Umoţňuje rychlou a senzitivní detekci rekombinantního proteinu a bývá často vyuţívána v kombinaci další značkou (Hunt 2005). Purifikace a detekce Princip detekce je zaloţen na silné interakci afinitní S značky s S proteinem (Hunt 2005, Kim a kol. 1993). Oba tito činitelé jsou odvozeni od RNAsy A (Kim a kol. 1993). Jako samostatné jednotky jsou neaktivní, ale po vytvoření komplexu získají aktivní formu ribonukleasy S (Hunt 2005). Pufr slouţící k eluci navázané S značky má ph 2, coţ představuje pro značené rekombinantní proteiny velmi tvrdé podmínky (Young a kol. 2012). K detekci je moţné pouţít kolorimetrickou detekci prostřednictvím Western blotting analýzy nebo rychlého detekčního testu zaloţeného na rekonstituci ribonukleolytické aktivity (Hunt 2005, Terpe 2003) Kalmodulin vázající peptid (CBP-tag) Charakteristika Kalmodulin vázající peptid je peptid odvozený od C-konců řetězců kinázy lehkých řetězců myosinu lidského kosterního svalu, který váţe pevně kalmodulin. Pro vazbu je nutná přítomnost CaCl 2. Je sloţený z 26 aminokyselin: KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL (Young a kol. 2012; Terpe, 2003). Jeho velikost je 4 kda (Klein 2003). Tato značka je vhodná zejména pro značení proteinů exprimovaných v bakteriálních expresních systémech (E. coli), protoţe jejich endogenní proteiny neinteragují s kalmomodulinem (Young a kol. 2012, Klein 2003). 29

35 Umístění Kalmodulin vázající peptidová značka můţe být umístěna na N- i C-konci rekombinantního proteinu (Klein 2003). Umístění na N-konci můţe sniţovat účinek translace, zatímco umístění na C-konci ke zvýšení hladiny exprese (Young a kol. 2012). Purifikace a detekce K purifikaci se pouţívá afinitní chromatografie s imobilizovaným kalmodulinem s následnou elucí 2mM ethylenglykol bis(2-aminoethylether)-n,n,n,n -tetraoctovou kyselinou (EGTA) (Klein 2003, Zheng a kol. 1997). Velmi pevná vazba mezi kalmodulin vázajícím peptidem a kalmodulinem umoţňuje razantnější podmínky promývání, coţ vede k tomu, ţe připravovaný rekombinantní protein je jen velmi málo kontaminován neţádoucími proteiny (Zheng a kol. 1997). Purifikovaný rekombinantní protein si zachovává biologickou aktivitu a CBP značka můţe být odstraněna pomocí trombinu (Zheng a kol. 1997). Detekce je prováděna pomocí protilátek nebo značeného kalmodulinu (Zheng a kol. 1997) Celulózu vázající doménové značky (CBD- tag) Charakteristika Existuje velké mnoţství těchto celulózu vázajících domén o velikosti od 4 do 20 kda (Tomme a kol. 1998, Levy a kol. 2002). Některé váţí celulózu ireverzibilně a mohou být tak vyuţiti k imobilizaci aktivních enzymů. Jiné naopak váţí celulózu reverzibilně a jsou tak vyuţívány pro separaci a purifikaci (Terpe 2003). Pouţití celulózy má výhodu v tom, ţe je inertní, má velmi nízkou nespecifickou afinitu a je dostupná v mnoţství rozdílných forem, je relativně levná a farmaceutický neškodná (Tomme a kol. 1998, Levy a kol. 2002). K vazbě CBD značek k celulóze dochází v širokém ph spektru (ph 3,5-9,5) (Levy a kol. 2002). Exprese takto značených rekombinantních proteinů je moţná v celé řadě expresních systémů (Tomme a kol. 1998). 30

36 Umístění K cílovému proteinu můţe být CBD připojena na jeho N- i C-konec (Tomme a kol. 1998). Purifikace a detekce K purifikaci se vyuţívají matrice s navázanou celulózou. Vazba mezi CBD značkou a celulózou je velmi silná a k jejímu uvolnění dojde při pouţití pufru obsahujícího močovinu nebo guanidin chloridu a je nutná renaturace (refolding) těchto proteinů. K eluci některých CBD (zejména rodiny II a III) stačí ethylenglykol (Terpe 2003). K detekci se tato značka moc nepouţívá Maltózu vázající protein (MBP-tag) Charakteristika Maltózu vázající protein je protein o velikosti 40 kda, který je kódovaný male genem bakterie E. coli kmene K12, který má vysokou afinitu k maltóze (Duplay a kol. 1988, Henning a kol. 1998). Jedná se o velmi často pouţívanou značku rekombinantních proteinů produkovaných v bakteriálních systémech (Lebendiker a kol. 2011, Pattenden a kol. 2007). Hlavní výhodou MBP značky je, ţe můţe zvyšovat rozpustnost rekombinantních proteinů a zabraňovat jejich agregaci, zejména u eukaryotních proteinů (Nallamsatty a kol. 2007, Lebendiker a kol. 2011, Henning a kol. 1998). Umístění Značka můţe být umístěna na N- i C- konec rekombinantního proteinu, pokud se jedná o expresi v bakteriálním systému (Nallamsatty a kol. 2007, Henning a kol. 1998). Purifikace a detekce Takto značený protein můţe být purifikován v jednom kroku metodou afinitní chromatografie, za pouţití amylosy ukotvené ve stacionární fázi (agaróza, magnetické kuličky) (Lebendiker a kol. 2011, Pattenden a kol. 2007). Následná eluce je prováděna 31

37 pufrem obsahujícím 10mM maltosu (Henning a kol. 1998). Nelze pouţít denaturační činidla (Lebendiker a kol. 2011, Young a kol. 2012, Pattenden a kol. 2007). Detekce je prováděna pomocí imunologických metod (Young a kol. 2012). MBP značka je často pouţívána v kombinaci s malými afinitními značkami, například His 6 -MBP, coţ vede k dosaţení účinnější purifikace (Nallamsatty a kol. 2007) Chitin vázající doména (ChBD- tag) Charakteristika Tato značka je pouţívána ke značení rekombinantních proteinů produkovaných zejména v bakteriálních expresních systémech (Szweda a kol. 2001, Ferrandon a kol. 2003). Pochází z bakterie Bacillus circulans WL12 a skládá se z 51 aminokyselin. Má vysokou afinitu k chitinu (Ferrandon a kol. 2003, Terpe 2003). Umístění Můţe být umístěna na N- i C- konec rekombinantního proteinu (Terpe 2003). Odštěpení značky Chitin-vázající doména se běţně pouţívá v kombinaci se samovyštěpovacím polypeptidem (tzv. intein), který odštěpí sám sebe i značku při zvýšení koncentrace SH skupin. K tomu dojde například při pouţití 1,4-dithiotreitolu nebo β-merkaptoethanolu (Xu a kol. 2000). Purifikace K purifikaci se vyuţívá afinitní chromatografie za pouţití chitinové matrice. Pouţití neiontových detergentů nebo vysoké koncentrace soli vede k redukci nespecifických vazeb. K detekci se tato značka většinou nepouţívá (Terpe 2003). 32

38 C. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo zavést univerzální metodu detekce rekombinantních proteinů značených histidinovou a FLAG peptidovou značkou, pro běţné vyuţití v Laboratoři geneticky modifikovaných organismů KBV FaF UK a také ji optimalizovat. Pro tyto účely byla zvolena metoda Western blotting. Cíle práce lze rozdělit do několika dílčích úkolů. Vyzkoušet detekci rekombinantních proteinů značených histidinovou značkou a FLAG peptidovou značkou metodou Western blotting dle pokynů výrobce protilátek Optimalizovat koncentraci primární králičí protilátky proti histidinové značce pomocí metody Dot blot Optimalizovat koncentraci primární králičí protilátky proti FLAG peptidu pomocí metody Dot blot Optimalizovat koncentraci sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pomocí metody Dot blot Prokázat účinnost optimalizovaného postupu a určení detekčního limitu takového postupu Ověřit moţnosti opakovaného pouţití protilátek v optimalizovaném postupu Optimalizovat úpravy obtíţně rozpustných vzorků rekombinantních proteinů 33

39 D. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5 Materiál 5.1 Přístroje a pomůcky Pomůcky Pomůcka Automatické pipety, špičky (0,5 µl 5 ml) Hypercassette TM Mikrozkumavky Skla pro elektroforézu Termo SCIENTIFIC CL-XPosure TM Film (Blue X-ray film) Trans-Blot Transfer medium Supported Nitrocelulosa Membrane (0,45 µm) Výrobce Biohit Amersham Biosciences Eppendorf Bio-Rad Thermo Fisher Scientific Bio-Rad Laboratorní sklo: kádinky, odměrné válce, Petriho misky Přístroje Přístroj Model Výrobce Analytické váhy Scaltec SBC22 Sartorius Centrifuga minispin plus Eppendorf Hlubokomrazící box Herafreeze Heraeus Kývačka UNIMAX 1010 Heidolph Magnetická míchačka Color Squid IKA ph metr Orion 410A Thermo Předváţky PT310 Sartorius Thermomixer Compact Eppendorf Ultradestilační přístroj Milli-Q Millipore Vertikální elektroforéza Mini PROTEAN Tetra System Bio-Rad Vortex MS 3 basic IKA Výrobník ledové tříště AF 80 Scotsman Western blotting Trans-Blot Turbo TM Transfer System Bio-Rad Zdroj pro elektroforézu PowerPac Universal Bio-Rad 34

40 5.2 Chemikálie Název 2-Merkaptoethanol Akrylamid, pro elektroforézu, 99% Blotting Grade Blocker Not-fat Milk Chlorid draselný, p.a. Chlorid sodný, p.a. Commassie Briliant Blue G-250 Dodecylhydrogensulfát sodný (SDS), 90% Glycin, pro elektroforézu 99% Hovězí sérový albumin (BSA) Hydrogenfosforečnan didraselný bezvodý, p.a. Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát, p.a. Isobutanol, p.a. Methanol, p.a. Močovina, p.a. N,N -Methylen(bisakrylamid), f.e. 99% Octová kyselina, 99%, p.a. Persíran amonný, pro elektroforézu, 99% Ponceau S TEMED, pro elektroforézu 99% Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, p.a. TWEEN 20, for molecular biology Univerzální rychloustalovač, FOMAFIX Vývojka, Fomadon LQN Výrobce Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Penta Penta Sigma-Aldrich Merck Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Penta Penta Penta Penta Penta Sigma-Aldrich Penta Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Penta Sigma-Aldrich Foma Bohemia Foma Bohemia 5.3 Standard molekulových hmotností Název Precision Plus Protein TM Standards, All Blue Výrobce Bio-Rad 35

41 5.4 Kity Název Amersham TM ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent Bicinchonic Acid Protein Assay Kit Výrobce GE Healthcare Life Science Sigma-Aldrich 5.5 Protilátky Název Výrobce Anti-FLAG (TM) antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich Polyclonal Swine Anti-Rabbit, Imunoglobulins/HRP Dako (1,3 g/l), F 1.0 Anti-6x His tag antibody-chip Grade abcam 5.6 Vzorky Pro optimalizaci detekce rekombinantních proteinů značených histidiny (6x histidin) byly pouţity vzorky připravené Mgr. Terezou Lundovou na Katedře biochemických věd, Faf UK. Jednalo se o vzorky z přípravy rekombinantního enzymu karbonylreduktasy 1 (CBR1). Jako expresní systém byla pouţita bakterie E. coli. Bylo pouţito několik typů vzorků, které odpovídají postupu přípravy rekombinantních enzymů v E. coli, která obsahuje plasmid nesoucí DNA pro příslušný protein, který je třeba připravit v rekombinantní formě (v našem případě CBR1): peleta E. coli před indukcí, peleta E. coli po indukci IPTG, peleta po rozbití E. coli Bug Busterem, supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru, purifikovaný protein CBR1. Tabulka 1: Koncentrace proteinů ve vzorcích. Vzorek Koncentrace (mg/ml) Supernatant po rozbití E.coli pomocí Bug Busteru 1,8 Purifikovaný protein CBR1 1,9 Stanovení koncentrace viz kap

42 Pro optimalizaci detekce rekombinantních proteinů značených FLAG peptidem byly pouţity vzorky připravené Mgr. Hanou Štambergovou v rámci její stáţe v Structural Genomic Consotium, Oxford, Velká Británie, popřípadě na Katedře biochemických věd, Faf UK. Jednalo se o rekombinantní, většinou málo popsané enzymy redukující karbonylové skupiny, nadrodiny dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR). Jako expresní systém byly pouţity hmyzí buňky Sf9. Vzorky enzymů: DHRS12, HSD11β1, RODH4, RODH4 (II), DHRS3, DHRS7, DHRS7 (II), DHRS8. Pouţívaná forma vzorků: mikrosomální frakce z Sf9 buněk obohacená o jednotlivé proteiny. Tabulka 2: Koncentrace proteinů ve vzorcích. Vzorek Koncentrace (mg/ml) DHRS12 12,0 HSD11β1 15,8 RODH4 17,0 RODH4 (II) 19,0 DHRS3 15,7 DHRS8 14,0 DHRS7 14,0 Hodnoty koncentrací poskytnuty Mgr. Hanou Štambergovou. 37

43 6 Metodika 6.1 Zásobní roztoky: 30% Akrylamid (AA) + 0,8% Bisakrylamid (bis-aa) Akrylamid 30 g Bisakrylamid 0,8 g Destilovaná voda 100 ml 1,5 M Tris-HCl pufr, ph 8,8 Tris Destilovaná voda ph upravit konc. HCl na hodnotu ph 8,8 18,5 g 100 ml 0,5 M Tris-HCl pufr, ph 6,8 Tris Destilovaná voda ph upravit konc. HCl na hodnotu ph 6,8 6 g 100 ml 10% SDS SDS Destilovaná voda 10 g 100 ml 0,5% Bromfenolová modř Bromfenolová modř Destilovaná voda 5 mg 10 ml 5x koncentrovaný elektrodový pufr, ph 8,3 Glycin 72 g Tris 15 g SDS 5 g Destilovaná voda 1000 ml ph upravit konc. HCl 38

44 1x koncentrovaný elektrodový pufr 5x konc. elektrod.pufr, ph 8,3 Destilovaná voda 70 ml 280 ml Vzorkový pufr Glycerol 2 ml 0,5 M Tris-HCl pufr, ph 6,8 1 ml 10% SDS 3 ml 0,5% Bromfenolová modř 0,6 ml Destilovaná voda 1,3 ml Vzorkový pufr s 2- merkaptoetanolem 50 µl 2- merkaptoethanolu na 1 ml zásobního vzorkového pufru 0,1 M sodno-fosfátový pufr, ph 7,4 0,1 M Na 2 HPO 4. 12H 2 O 1000 ml 0,1 M Na 2 HPO 4. 2H 2 O 250 ml sléváním na ph 7,4 10% kyselina octová 99% kyselina octová 50,5 ml Destilovaná voda 449,5 ml Roztok na obarvení gelu- 0,25% Coomassie blue (CBBG) v 10% kyseliněoctové Coomassie blue 0,25 g 10% kyselina octová 100 ml 10% Persíran amonný (APS) Persíran amonný 10 mg Destilovaná voda 100 µl 39

45 Isobutanol nasycený vodou Isobutanol Destilovaná voda libovolné libovolné PBS pufr NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Destilovaná voda 8 g 0,2 g 3,58 g dodekahydrátu 0,2 g 1 l Blotovací pufry Anodový pufr 1 Tris MeOH ph 10,4 (neupravuje se) 36,42 g 200 ml Anodový pufr 2 Tris MeOH ph 10,4 (neupravuje se) 3,03 g 200 ml Katodový pufr Tris 3,03 g 6-aminocaproová kyselina 5,25g MeOH 200 ml ph 9,4 (neupravuje se) Promývací pufr PBS-T PBS Tween ml 1 ml 40

46 Roztok na obarvení nitrocelulózové membrány - 0,1% Ponceau S Ponceau S 0,1 g Destilovaná voda 100 ml Blokovací pufr 5% mléko v PBS-T Sušené odtučněné mléko PBS-T 5 g 100 ml 3% roztok sušeného mléka v PBS-T Sušené odtučněné mléko PBS-T 3 g 100 ml Vývojka (požadované ředění 1:14) Vývojka FOMADON LQN Destilovaná voda 6 ml 84 ml Ustalovač (požadované ředění 1:5) Univerzální rychloustalovač Destilovaná voda 15 ml 75 ml 6.2 Stanovení koncentrace proteinu ve vzorku Bicinchoniovou metodou (BCA) Koncentrace proteinu byla stanovována ve vzorku supernatantu po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru a u purifikované CBR1. Jako standard byl zvolen bovinní sérový albumin (BSA). Stanovení bylo prováděno v mikrotitrační destičce a absorbance byla měřena při 562 nm. Nejprve byla připravena kalibrační řada BSA (Tabulka 3). Zásobní roztok o koncentraci 1 mg/ml pro vytvoření kalibrační řady byl připraven rozpuštěním 1,5 mg BSA v 1,5 ml 1M fosfátového pufru. 41

47 Tabulka 3: Příprava kalibrační řady standardu BSA. Koncentrace v µg/ml Objem zásobního roztoku BSA v µl Objem 1M fosfátového pufru v µl Vzorek (supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru, purifikovaný protein CBR1) byl naředěn 1M fosfátovým pufrem v poměrech 1:1, 1:5, 1:20. Na mikrotitrační destičku bylo pipetováno 10 µl kaţdého ze vzorků (kalibračního i stanovovaného). Vzorky byly pipetovány do mikrotitrační destičky v kvadrupletech. Ke kaţdému vzorku (do jamky) bylo přidáno 200 µl činidla připraveného smísením roztoku A a B v poměru uváděném výrobcem kitu (50:1). Jako slepý vzorek byl pouţit 1M fosfátový pufr a činidlo. Absorbance byla měřena spektrofotometrem v absorbčním maximu 562 nm. Z naměřených hodnot byla sestavena kalibrační křivka a regresní rovnice, podle níţ byla stanovena koncentrace proteinu ve vzorku. 6.3 SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) Příprava polyakrylamidového gelu Pro přípravu polyakrylamidového gelu bylo pouţito sklo se spacery o hloubce 0,75 mm a tenké krycí sklo. Skla byla nejprve řádně omyta jarem, destilovanou vodou, opláchnuta lihometanolem a sušena ve vertikální poloze. Po oschnutí byla přiloţena k sobě a upevněna do nalévacího rámečku. Takto spojená skla byla umístěna do nalévacího stojanu. Pro separaci daných proteinů byl pouţit polyakrylamidový gel skládající se z 12,5% separačního gelu a 4% zaostřovacího gelu. Roztoky byly připraveny dle následujících 42

48 tabulek (Tabulka 4; Tabulka 5). Iniciátory polymerace (APS a TEMED) byly přidány jako poslední a roztok byl dokonale promíchán. Tabulka 4: Složení separačního gelu o koncentraci 12,5% a pipetovaná množství jednotlivých komponent (rozpis na1 gel o tloušťce 0,75 mm). Komponenta Objem Destilovaná voda 1,6 ml 1,5 M Tris-HCl 1,25 ml 10% SDS 0,05 ml 30% AA+ 0,8% bisaa 2,1 ml 10% APS 29 µl TEMED 2 µl Tabulka 5: Složení zaostřovacího gelu o koncentraci 4% a pipetovaná množství jednotlivých komponent (rozpis na1 gel o tloušťce 0,75 mm). Komponenta Objem Destilovaná voda 1,56 ml 1,5 M Tris-HCl 0,625 ml 10% SDS 0,025 ml 30% AA+ 0,8% bisaa 0,25 ml APS 15 µl TEMED 1,25 µl Připravené roztoky byly pomocí pipety nality mezi sestavená skla. Nejprve byl připraven a nalit roztok pro separační gel cca do ¾ výšky tenkého skla a převrstven nasyceným isobutanolem, pro zajištění rovného povrchu gelu a kvalitní polymerace. Gel se nechal polymerovat při pokojové teplotě minimálně 45 minut. Po uplynutí této doby byl isobutanol slit a povrch gelu byl opláchnut redestilovanou vodou. Prostor mezi skly byl vysušen filtračním papírem. Následovalo nalití roztoku pro zaostřovací gel po horní okraj tenkého skla. Do prostoru mezi skly byl zasunut hřeben, který vytvoří v gelu jamky pro dávkování vzorků. Polymerace gelu trvala minimálně 1,5 hodiny při 43

49 pokojové teplotě nebo přes noc v lednici. Po ztuhnutí gelu byla skla vyjmuta z nalévacího stojanu a rámečku. Opatrně byl vyndán hřeben a vzniklé jamky byly propláchnuty destilovanou vodou Příprava vzorků pro elektroforézu Vzorky proteinu v poţadovaném mnoţství/objemu (viz jednotlivé výsledky) byly smíchány se vzorkovým pufrem (s merkaptoethanolem) v poměru 4:1 v mikrozkumavkách Eppendorf. Následně byly pomocí termomixéru zahřívány na teplotu 95 C po dobu 3 minut Alternativní způsoby přípravy vzorků pro elektroforézu Byly pozměněny objemy pipetovaných vzorků, s ohledem na koncentraci proteinů v jednotlivých zásobních vzorcích, aby se dosáhlo stejného mnoţství proteinů v kaţdém vzorku. Zvolené mnoţství proteinu pro kaţdý testovaný vzorek bylo 20µg. Tabulka 6: Příprava vzorků pro elektroforézu s ohledem na koncentraci proteinů. Vzorek Koncentrace (mg/ml) Pipetovaný V vzorku (µl) DHRS12 12,0 1,67 HSD11β1 15,8 1,27 RODH4 17,0 1,18 RODH4 (II) 19,0 1,05 DHRS3 15,7 1,27 DHRS8 14,0 1,43 DHRS7 14,0 1,43 Objem pipetovaných vzorků byl doplněn 0,1M sodno-fosfátovým pufrem, tak aby celkový objem kaţdého připravovaného vzorku byl 10 µl. Ke kaţdému vzorku bylo přidáno 2,5 µl vzorkového pufru (s 2-merkaptoethanolem). 44

50 Snížení teploty přípravy vzorků na 65 C Připravené vzorky dle metodiky uvedené v kapitole a tabulce 6 byly po promíchání zahřívány na teplotu 65 C po dobu 10 minut pomocí termomixéru. Do jamek byl pipetován celý objem připravených vzorků. Dále následovala standardní SDS elektroforéza (viz kap. 5.3) a Western blotting (viz kap. 5.4). K detekci proteinů značených FLAG peptidem, bylo pouţito ředění 1:16000 u obou protilátek (králičí protilátka proti FLAG peptidu a prasečí protilátka proti králičím protilátkám). Protilátky byly ředěny 3% roztokem sušeného mléka v PBS-T. Vizualizace probíhala v temné komoře (viz kap ). Použití chaotropního činidla - 8M močoviny Byly pouţity stejné objemy vzorků, jako je uvedeno v tabulce 6 byly doplněny 0,1M sodno-fosfátovým pufrem na objem 10 µl. Ke kaţdému vzorku bylo dále přidáno 2,5 µl vzorkového pufru obsahujícího 8M močovinu (příprava viz Tabulka 7). Tabulka 7: Příprava vzorkového pufru obsahujícího 8M močovinu. Komponenta Množství Vzorkový pufr 100 µl 2-merkaptoethanol 5 µl Močovina 48mg Připravené a důkladně promíchané vzorky byly zahřívány pomocí termomixéru na teplotu 37 C po dobu 30 minut. Do jamek byl pipetován celý objem připravených vzorků. Dále následovala standardní SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (viz kap 5.3.) a Western blotting (viz kap. 5.4.). K detekci proteinů značených FLAG peptidem, bylo pouţito ředění u obou protilátek (králičí protilátka proti FLAG peptidu a prasečí protilátka proti králičím protilátkám) 1: Vizualizace probíhala v temné komoře (viz kap ) Vlastní SDS elektroforéza Skla s připravenými polyakrylamidovými gely byla upevněna do elektroforetického stojanu, tak aby skla se spacery byla na vnější straně. Skla byla zajištěna sponami. Vznikl tak prostor pro nalití 1x koncentrovaného elektrodového 45

51 pufru. Stojan byl vloţen do elektroforetické vany, která byla umístěna do nádoby s ledem z důvodu chlazení. Do jamek byly naneseny předem připravené vzorky. Krajní jamky nebyly nepouţívány. Poté jamky se vzorkem i prázdné jamky byly doplněny 1x koncentrovaným elektrodovým pufrem. Tento pufr byl nalit i do prostoru mezi skly aţ po horní okraj a zbytek tohoto pufru do elektroforetické vany. Takto sestavená elektroforetická aparatura byla přiklopena víkem a připojena ke zdroji stejnosměrného napětí. Pro separaci proteinů v zaostřovacím gelu bylo nastaveno konstantní napětí 100 V (separace trvala cca minut). Pro dělení proteinů v separačním gelu bylo napětí zvýšeno na 200 V. Elektroforéza byla ukončena v okamţiku, kdy zóna bromfenolové modři doputovala ke spodnímu okraji gelu. Po skončení elektroforézy byla skla vyndána ze stojanu a rozevřena pomocí plastového klínku. Polyakrylamidový gel byl oříznutý od spacerů a byla odstraněna i vrstva zaostřovacího gelu. 6.4 Western blotting (WB) Western blotting - přenos proteinů z elektroforetického gelu na membránu Oříznutý a ze skel vyjmutý gel byl umístěn do nádoby s blotovacím anodovým pufrem II, kde se nechal 5-15 minut namáčet. Prvním krokem WB je převedení proteinů z elektroforetického gelu na nitrocelulózovou membránu. K tomuto účelu bylo dle rozměru gelu nastříháno devět tenkých filtračních papírů a nitrocelulózová membrána, které byly umístěny do nádob s blotovacími pufry. 3 tenké filtrační papíry do anodového pufru I 3 tenké filtrační papíry do anodového pufru II 3 tenké filtrační papíry do katodového pufru gel i nitrocelulózová membrána do anodového pufru II (máčení 5-10 minut) Dle následujícího schématu byly namočené filtrační papíry, nitrocelulózová membrána a gel navrstveny na sebe do kazety blotovacího přístroje. Přenos proteinů z gelu na membránu trval 30 minut při konstantním napětí 10 V. Po procesu následovala kontrola přenosu proteinů z gelu na membránu (viz kap ; 6.4.3) a blokace membrány (viz kap ) 46

52 Obrázek 7: Schéma "sendviče" pro western blotting Barvení gelu pomocí Comassie Blue Barvení bylo provedeno po ukončení procesu přenosu proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu. Gel byl barven z důvodu kontroly elektroforetické proteinové separace. Pomocí tohoto barvení bylo také moţné naznačit tuţkou na nitrocelulózovou membránu, dle obarvených proteinových prouţků na gelu, jednotlivé prouţky separovaného molekulového standardu, coţ v závěru umoţnilo stanovení molekulových hmotností detekovaných proteinů ve vzorcích. K barvení bylo pouţito 0,25% Comassie Blue. Gel byl ponořen do barvy a ponechán v ní 15 minut při 60 C nebo 2 hodiny při pokojové teplotě. Následně byl gel odbarvován v 10% kyselině octové Barvení membrány pomocí Ponceau S Barvení bylo provedeno po ukončení procesu přenosu proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu. Barvení bylo prováděno z důvodu kontroly přenosu separovaných proteinů z gelu na membránu. Pomocí tohoto barvení bylo také moţné naznačit tuţkou na nitrocelulózovou membránu, dle obarvených proteinových prouţků, jednotlivé prouţky separovaného molekulového standardu, coţ v závěru umoţnilo stanovení molekulových hmotností detekovaných proteinů ve vzorcích. K obarvení membrány byl pouţitý 0,1% roztok Ponceau S, ve kterém byla membrána krátce ponechána. Následně byla membrána odbarvována 10% kyselinou octovou a na závěr opláchnuta PBS-T pufrem. Následoval krok blokace membrány (viz kap ). 47

53 6.4.4 Blokace membrány Na membránu byl nalit 5% blokovací pufr ze sušeného mléka. Membrána byla blokována 1,5 hodiny na kývačce. Po blokaci byl blokovací pufr slit a membrána byla dvakrát promyta PBS-T pufrem. Následovala aplikace protilátek (viz kap ) Aplikace protilátek Králičí primární protilátka proti histidinové značce K přípravě roztoku primární protilátky byl pouţit 3% roztok sušeného mléka v PBS-T pufru. Koncentrace protilátky byla připravena dle návodu výrobce v poměru 1:1000. Poţadovaný objem roztoku protilátky byl 15 ml, tzn. při koncentraci 1:1000 bylo přidáno 15 µl králičí primární protilátky proti histidinové značce k 15 ml 3% roztoku sušeného mléka v PBS-T Králičí primární protilátka proti FLAG peptidu K přípravě roztoku primární protilátky byl pouţit 3% roztok sušeného mléka v PBS-T pufru. Koncentrace protilátky byla připravena dle návodu výrobce v poměru 1:1000. Poţadovaný objem roztoku protilátky byl 15 ml, tzn. při koncentraci 1:1000 bylo přidáno 15 µl králičí primární králičí protilátky proti FLAG peptidu k 15 ml 3% roztoku sušeného mléka v PBS-T. Připravená primární protilátka byla nalita na membránu a nechala se inkubovat. V případě králičí primární protilátky proti histidinové značce, dle zvyku pracovní skupiny Katedry biochemických věd, Faf UK, přes noc v chladnu na kývačce a v případě králičí primární protilátky proti FLAG peptidu 2 hodiny, dle doporučení výrobce. Poté byl roztok primární protilátky slit a uloţen do mrazáku (lze pouţít opakovaně aţ 3x). Membrána byla 3x krátce opláchnutá PBS-T pufrem a pak 3x pod 10 minutách opět v PBS-T pufru na kývačce (optimální mnoţství pufru 4 ml/cm 2 membrány). Následně byl aplikován roztok sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám. 48

54 Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám K přípravě roztoku sekundární protilátky byl pouţit 3% roztok sušeného mléka v PBS-T pufru. Koncentrace protilátky byla připravena dle návodu výrobce v poměru 1:1000 a to při obou variantách primární protilátky (králičí protilátka proti histidinové značce i králičí protilátka proti FLAG peptidu). Poţadovaný objem roztoku protilátky byl 15 ml, tzn. při koncentraci 1:1000 bylo přidáno 15 µl protilátky prasečí protilátky proti králičím protilátkám k 15 ml 3% roztoku sušeného mléka v PBS-T. Připravený roztok protilátky byl nalit na membránu a nechal se 1 hodinu, dle výrobce, inkubovat na kývačce při laboratorní teplotě. Po uplynutí doby inkubace byl roztok primární protilátky slit a uloţen do mrazáku (moţno 3x pouţít). Membrána se opláchla stejným postupem jako v případě primární protilátky, tzn. 3x krátce a 3x po 10 minutách PBS-T pufrem. Následovala vizualizace Vizualizace a vyhodnocení Vizualizace byla prováděna v temné komoře. Po slití PBS-T pufru byl na membránu aplikován detekční systém (Amersham TM ECL TM Prime Western blotting Detection Reagent), kompatibilní ke zvolené sekundární protilátce konjugované s HRP (Horseradish peroxidase křenová peroxidasa), který byl připraven smísením roztoku A a B v poměru 1:1, dle návodu výrobce kitu. Poţadovaný celkový objem byl takový, aby na 1 cm 2 bylo naneseno 0,05 ml tohoto roztoku. Připraveným roztokem byla pokryta celá membrána. Roztok se nechal působit cca 5 minut. Poté byla membrána vyjmuta pomocí pinzety z detekčního systému a vloţena mezi dvě fólie. Důleţité bylo, aby v prostoru mezi membránou a fólií nevznikly vzduchové bubliny. Takto připravená membrána byla vloţena do vyvolávací kazety, na ni byl poloţen fotopapír a kazeta byla zavřena. Doba expozice trvala přibliţně od jedné minuty do 4 minut, dle poţadované výraznosti prouţků proteinů. Po uplynuté doby expozice byl fotopapír vyjmut z kazety a ponořen do vývojky, pak do destilované vody, následně do ustalovače a nakonec byl opět opláchnut destilovanou vodou a nechal sušit ve svislé poloze na vzduchu. Po oschnutí fotopapíru se pomocí standardu molekulových hmotností, který byl při krocích barvení gelu pomocí 5% Commasie blue (viz kap ) a barvení membrány pomocí Ponceau S (viz kap ) překreslen na nitrocelulózovou membránu, určila molekulová hmotnost jednotlivých zobrazených prouţků proteinů. 49

55 6.5 Dot blot Metoda Dot blot byla vyuţita k optimalizaci koncentrace pouţívaných protilátek. Vzorky proteinů byly aplikovány pipetou přímo na nitrocelulózovou membránu. Nitrocelulózová membrána byla nastříhaná na poţadovaný počet obdélníků (dle počtu testovaných koncentrací). Rozměr obdélníku byl cca 1,5 x 2,5 cm Optimalizace koncentrace protilátek pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Na jednu polovinu membrány byl nanesen supernatant získaný po rozbití buněk E. coli nesoucích plasmid s kódovou sekvencí pro CBR1 značenou histidinovou značkou a na druhou polovinu kontrolní vzorek purifikované CBR1. Obrázek 8: Nákres membrány s vyznačenými místy aplikace vzorku pro Dot blot králičí protilátky proti histidinové značce. Supernatant i kontrolní vzorek CBR1 značený histidinovou značkou byl na membránu nanášen pomocí pipety po kapkách a to v následujících mnoţstvích: Supernatant Poţadované mnoţství proteinu na membráně bylo 10 µg. Pomocí známé hodnoty koncentrace proteinu v supernatantu byl jeho pipetovaný objem stanoven na 5,4 µl. Vzorek byl pipetován přímo, nebyla provedena ţádná úprava. Kontrolní vzorek purifikované CBR1 Poţadované mnoţství proteinu CBR1 na membráně bylo 1 µg. Pomocí známé hodnoty koncentrace proteinu v supernatantu byl jeho pipetovaný objem stanoven na 0,63 µl. Vzorek byl pipetován přímo, nebyla provedena ţádná úprava. Po zaschnutí nanesených vzorků byly membrány blokovány v 5% blokovacím pufru z mléka 1,5 hodiny na kývačce. Následovala aplikace protilátek. 50

56 Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce Primární králičí protilátka proti histidinové značce byla naředěna 3% roztokem sušeného mléka v PBS-T na objem 1,5 ml dle poměrů:1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10 000, 1: Jednotlivé membrány se vzorky byly umístěny do kádinek o objemu 25 ml a byla na ně aplikovaná protilátka v jednotlivých ředěních. Inkubace byla provedena přes noc na kývačce v chladnu. Ráno byly jednotlivé protilátky slity a membrány byly opláchnuty 3x krátce a 3x po 10 minutách na kývačce PBS-T pufrem. Následovala aplikace sekundární protilátky naředěné v poměru 1:1000 (dle výrobce). Inkubace trvala 1 hodinu při laboratorní teplotě. Následovalo promývání membrán v PBS-T pufru 3x krátce a 3x pod 10 minutách na kývačce a vizualizace (viz kap ) Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám Byl proveden stejný postup jako při optimalizaci primární králičí protilátky proti histidinové značce (viz kap ). Na membrány byla nejprve aplikovaná primární králičí protilátka proti histidinové značce ředěná v poměru 1:1000 (dle návodu výrobce). Inkubace probíhala přes noc v chladnu na kývačce. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám byla naředěna 3% roztokem sušeného mléka v PBS-T na objem 1,5 ml dle těchto poměrů:1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10 000, 1: Inkubace trvala 1 hodinu. Následovalo promývání membrán v PBS-T pufru 3x krátce a 3x pod 10 minutách na kývačce a vizualizace (viz kap ) Optimalizace koncentrace protilátek pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Na jednu polovinu membrány byl nanesen náhodně zvolený vzorek č.1 (DHRS7) a na druhou polovinu náhodně zvolený vzorek č. 2 (DHRS3). Objem nanášených vzorků byl 2 µl. Ze známé koncentrace proteinů v těchto vzorcích vyplývá, ţe hmotnost proteinů nanesených na membránu ve vzorku č.1 byla 28 µg a ve vzorku č µg. 51

57 Obrázek 9: Nákres membrány s vyznačenými místy aplikace vzorku pro Dot blot králičí protilátky proti FLAG peptidu Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu Primární králičí protilátka proti FLAG peptidu byla naředěna 3% roztokem sušeného mléka v PBS-T na objem 1,5 ml dle těchto poměrů: 1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:12000, 1:14000, 1: Inkubace trvala 2 hodiny. Dále následoval stejný postup jak při optimalizaci koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce (viz kap ) Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám Na membrány byla nejprve aplikovaná primární králičí protilátka proti FLAG peptidu ředěná v poměru 1:1000 (dle návodu výrobce). Inkubace probíhala přes noc v chladnu na kývačce. Následovalo promývání v PBS-T pufru 3x krátce a 3x po 10 minutách na kývačce a aplikace sekundární protilátky. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám byla naředěna 3% roztokem sušeného mléka v PBS-T na objem 1,5 ml dle těchto poměrů:1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:12000, 1:14000, 1:16000 Inkubace trvala 1 hodinu. Po uplynutí doby inkubace sekundární protilátky byla tato protilátky z membrán slita a následovalo promývání v PBS-T pufru 3x krátce a 3x pod 10 minutách na kývačce a vizualizace (viz kap.6.4.6). 52

58 6.6 Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů značených histidinovou značkou za optimalizovaných podmínek Tento postup byl vyuţitý ke stanovení detekčního limitu, coţ znamená nejmenšího moţného mnoţství proteinu značeného histidinovou značkou, které je ještě moţné detekovat pomocí metody Western blotting v případě, kdy je protilátka proti histidinové značce ředěná v poměru 1: Jako testovaný vzorek byl zvolen purifikovaný protein CBR1 značený histidinovou značkou. Prvním krokem byla standardní SDS elektroforéza (viz kap. 6.3), kdy do jednotlivých jamek byl pipetován takový objem vzorku, aby odpovídal poţadovanému mnoţství proteinu CBR1 v jamkách. Byla zvolena tato řada testovaných hmotností proteinu CBR1: 5 µg, 3 µg, 1 µg, 0,5 µg, 0,25 µg, 0,1 µg, 0,05 µg, 0,025 µg. Jednotlivé vzorky testovaných hmotností proteinu CBR1 byly připravovány v mikrozkumavkách Eppendorf. Objemy vzorků byly doplněny 0,1M sodno-fosfátovým pufrem na objem 10 µl a dále smíseny se vzorkovým pufrem (s 2-merkaptoethanolem) v poměru 4:1. Takto připravené vzorky byly zahřívány na teplotu 95 C pomocí termomixéru po dobu 3 minut. Po ukončení elektroforézy následovala metoda Western blotting (viz kap. 6.4). Primární králičí protilátka pro histidinové značce byla ředěna v poměru 1: % roztokem sušeného mléka v PBS-T. Doba inkubace byla 1 hodina. Stejným způsobem byla ředěna i sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám. Doba inkubace byla 1 hodina. Následovala vizualizace a vyhodnocení (viz kap ). 53

59 Absorbance E. VÝSLEDKY 7 Stanovení koncentrace proteinu ve vzorcích Koncentrace proteinu CBR1 byla stanovena ve vzorku supernatantu po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru a purifikované CBR1 Bicinchoniovou metodou (BCA). Naměřené hodnoty kalibračních vzorků v kvadrupletu byly zprůměrovány a byla sestavena kalibrační křivka a rovnice regrese, pomocí které byla vypočtena hodnota koncentrace (viz Obrázek 10). Koncentrace proteinu ve vzorku supernatantu po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru byla 1837 µg/ml a ve vzorku purifikované CBR µg/ml (viz kap. 6.2) U vzorků peleta E.coli před indukcí, peleta E. coli po indukci IPTG a peleta E. coli po rozbití Bug Busterem nebyly koncentrace proteinu CBR1, vzhledem k jejich povaze, stanovovány. Hodnoty koncentrací proteinů ve vzorcích DHRS12, HSD11β1, RODH4, RODH4 (II), DHRS3, DHRS7, DHRS7 (II), DHRS8 byly poskytnuty Mgr. Hanou Štambergovou (viz kap. 5.6). 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0006x + 0,0212 R² = 0, Koncentrace kalibračních vzorků µg/ml Obrázek 10: Kalibrační přímka pro stanovení koncentrace proteinu ve vzorku supernatantu po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru a purifikované CBR1. 54

60 8 Optimalizace detekce proteinů značených histidinovou značkou 8.1 Detekce proteinů značených histidinovou značkou dle doporučení výrobce protilátek V první fázi optimalizace metody detekce proteinů značených histidiny bylo postupováno dle doporučení uváděných v návodu výrobce protilátek. Pouţitými testovacími vzorky byly: peleta E. coli před indukcí, peleta E. coli po indukci IPTG, peleta po rozbití E. coli Bug Busterem, supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru, purifikovaný protein CBR1. Mnoţství vzorku je uvedeno pod obrázkem č. 11. Příprava vzorků viz kap Separace proteinů ve vzorcích byla provedena pomocí SDS elektroforézy (viz kap. 6.3) a následovala metoda Western blotting (viz kap. 6.4). K detekci byla pouţita primární králičí protilátka proti histidinové značce ředěná v poměru 1:1000 (dle doporučení výrobce), inkubace trvala přes noc. Jako sekundární protilátka byla pouţita prasečí protilátka proti králičím protilátkám v poměru 1:1000 (dle výrobce), 1 hodinová inkubace (příprava protilátek viz kap ). Proteiny byly detekovány v temné komoře pomocí detekčního kitu a zviditelněny na fotopapír (viz kap ). Doba působení detekčního systému byla 5 minut. Expozice 1 minutu. Obrázek 11: Detekce proteinů značených histidinovou značkou dle doporučení výrobce protilátek. Separace pomocí SDS-PAGE, podmínky: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. Detekce metodou Western blotting při vyuţití primární králičí protilátky proti histidinové značce (ředění 1:1000, inkubace přes noc) a sekundární prasečí protilátce proti králičím protilátkám (ředění 1:1000, inkubace 1 hodina). Expozice 1 minuta. Legenda: 1- peleta E. coli před indukcí (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 2- peleta E. coli po indukci IPTG (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 3- peleta po rozbití E. coli Bug Busterem (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 4- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (2,8 µg CBR1), 5- purifikovaný protein CBR1(2,6 µg CBR1), 6- standard molekulových hmotností (5 µl). 55

61 Na obrázku č. 11 je vidět, ţe u vzorků č. 2 (peleta E. coli po indukci IPTG) a vzorku č. 3 (peleta po rozbití E. coli Bug Busterem), coţ jsou velmi komplexní vzorky, byly výrazné nespecifické vazby. U vzorku č. 3 byl dokonce v oblasti vyšších molekulových hmotností svislý souvislý pruh. Tento pruh mohl vzniknout zřejmě z toho důvodu, ţe proteiny ve vzorku nebyly dostatečně denaturované, coţ zhoršilo jejich pohyblivost v gelu, a proto byla příprava vzorku upravena (viz kap. 8.2). U ostatních vzorků, č. 1 (peleta E. coli před indukcí), č. 4 (supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru) jsou nespecifické vazby vidět jen velmi nepatrně a v oblasti vzorku č. 5 (purifikovaný protein CBR1) nespecifické vazby nejsou patrné vůbec. V dráze standardu molekulových hmotností (č. 6), je také patrné velké mnoţství nespecifických vazeb. U všech vzorků jsou vidět výrazné prouţky v oblasti blízko pod hodnotou 37 kda, coţ odpovídá hodnotě molekulové hmotnosti proteinu CBR1 značeného histidinovou značkou (6x His). 8.2 Detekce proteinů značených histidinovou značkou - optimalizace úpravy vzorků Vzorky byly připraveny stejným způsobem jako při detekci proteinů značených histidinovou značkou dle doporučení výrobce (viz kap. 8.1), ale z důvodu dosaţení vyššího stupně denaturace a rozvolnění proteinů bylo ke vzorkovému pufru přidáno 3x více 2-merkaptoethanolu neţ obvykle, coţ znamenalo, ţe místo standardně přidávaných 10 µl (50 µl na 1 ml vzorkového pufru) bylo přidáno 30 µl 2-merkaptoethanolu (150 µl na 1 ml vzorkového pufru). K dělení proteinů byla pouţita standardní SDS elektroforéza (viz kap. 6.3) a pak následovala metoda Western blotting (viz kap. 6.4). Koncentrace obou protilátek byla stejná jako kapitole 8.1, tedy 1:1000 a doba inkubace byla také nezměněna. Doba expozice 1 minuta. 56

62 Obrázek 12: Detekce proteinů značených histidinovou značkou - optimalizace úpravy vzorků. Separace proteinů pomocí SDS-PAGE, podmínky separace: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. Detekce pomocí metody Western blotting při vyuţití primární králičí protilátky proti histidinové značce (ředění 1:1000, doba inkubace přes noc v chladnu) a sekundární prasečí protilátce proti králičím protilátkám (ředění 1:1000, doba inkubace 1 hodina). Doba expozice 1 minuta. Legenda: 1- peleta E. coli před indukcí (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1 v jamce), 2- peleta E. coli po indukci IPTG (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1 v jamce), 3- peleta po rozbití E. coli Bug Busterem (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1v jamce), 4- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (2,8 µg CBR1 v jamce), 5- purifikovaný protein CBR1 (2,6 µg CBR1 v jamce), 6- standard molekulových hmotností (5 µl v jamce). Výsledek (Obrázek 12) ukazuje, ţe přídavek 2-merkaptoethanolu měl pozitivní vliv na úpravu vzorků. V porovnání s předchozím obrázkem č. 11 výrazně ubylo nespecifických vazeb u vzorku č. 3 (peleta po rozbití E. coli Bug Busterem), u těch co zůstaly, jsou prouţky méně výrazné a to i s ohledem na stejnou dobu expozice (1 minuta). Souvislý pruh, který se v předchozím obrázku (Obrázek 11) vyskytoval u vzorku č. 2 (peleta E. coli po indukci IPTG) není v tomto výsledku jiţ vidět, výrazné nespecifické vazby jsou ale stále přítomny. Standard molekulových hmotností je zobrazen stejně jako na předchozím obrázku (Obrázek 11). 8.3 Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Optimalizace byla provedena pomocí Dot blot metody (viz kap. 6.5) za pouţití vzorků supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (vzorek č. 1) a purifikovaný protein CBR1 (vzorek č. 2). Na membránu bylo nanášeno v případě vzorku supernatantu 10 µg proteinu a v případě purifikovaného proteinu CBR1 2 µg proteinu. 57

63 K testování byla zvolena tato ředící řada králičí protilátky proti histidinové značce: 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1: Inkubace probíhala přes noc v chladnu. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám byla pouţita v koncentraci 1:1000 (dle doporučení výrobce). Doba inkubace byla 1 hodinu. Příprava protilátek je uvedena v kapitole Výsledek byl zhotoven v temné komoře na fotopapír (viz kap ). Působení detekčního systému trvalo 5 minut a doba expozice byla 2 minuty. Obrázek 13: Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce pro detekci proteinů značených histidinovou značkou pomocí metody Dot blot. Primární králičí protilátka proti histidinové značce pouţita v ředění 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1:12000, doba inkubace přes noc. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v ředění 1:1000, doba inkubace 1 hodina. Expozice trvala 2 minuty. Legenda: 1- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (10 µg CBR1 v kolečku), 2-purifikovaný protein CBR1 (2 µg CBR1 v kolečku), 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1: poměr pouţitého ředění králičí protilátky proti histidinové značce u jednotlivých dvojic vzorků. Na obrázku č. 13 je patrné, ţe při ředění 1:2000 jsou proteiny značené histidinovou značkou obsaţené ve vzorcích č. 1 a č. 2 detekovány dobře a stejně je tomu tak i při zvyšujícím se ředění. I nejvyšší testované ředění primární králičí protilátky proti histidinové značce v poměru 1:12000, bylo dostačující pro jejich detekci. 8.4 Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených histidinovou značkou Pro stanovení optimální koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám byl zvolen stejný postup jako při optimalizaci koncentrace primární králičí protilátky proti histidinové značce (viz kap. 8.3). Testovanými vzorky byly supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (nanášeno v mnoţství 10 µg) a purifikovaný 58

64 protein CBR1 (nanášeno v mnoţství 2 µg). Ředění primární králičí protilátky proti histidinové značce bylo dodrţeno dle pokynů výrobce 1:1000. Inkubace probíhala přes noc v chladnu. Pro testování sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám byla zvolena následující ředící řada: 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1: Doba inkubace byla 1 hodinu. Přítomnost proteinů značených histidinovou značkou byla zjištěna pomocí detekčního kitu v temné komoře a vizualizována na fotopapír (viz kap ). Reagencie detekčního kitu působily na nitrocelulozovou membránu s proteiny po dobu 5 minut. Doba expozice byla 2 minuty. Obrázek 14: Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených histidinovou značkou pomocí metody Dot blot. Pouţitými protilátkami byly: primární králičí protilátka proti histidinové značce ředěna v poměru 1:1000 a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v poměru 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000 a 1: Legenda: 1- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (10 µg CBR1 v kolečku), 2-purifikovaný protein CBR1 (2 µg CBR1 v kolečku), 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1: poměr ředění králičí protilátky proti histidinové značce u jednotlivé dvojce vzorků. Z výsledku (Obrázek 14) je patrné, ţe u všech testovaných koncentrací sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám jsou proteiny značené histidinovou značkou dobře detekovány. I nejvyšší testovaná koncentrace 1:12000 je stále dostačující pro kvalitní detekci. 59

65 8.5 Detekce proteinů značených histidinovou značkou s aplikací výsledků získaných pomocí metody Dot blot Získané poznatky z Dot blot metody (viz kap. 8.3, 8.4) byly aplikovány do kompletního procesu detekce rekombinantních proteinů značených histidinovou značkou. Byl zvolen stejný postup úpravy vzorků jako v kapitole 8.2. Rozdílem bylo pouze, ţe ke vzorku peleta po rozbití E. coli Bug Busterem bylo navíc přidáno 2,5 µl 2-merkaptoethanolu a oproti ostatním vzorkům byl zahříván na teplotu 95 C o 1,5 minuty déle. Tato změna byla zvolena z toho důvodu, ţe při přípravě dle kapitoly 8.2, nebyl tento vzorek zcela homogenní a obsahoval pravděpodobně proteinové agregáty, které obtíţně vstupovaly do gelu. K dělení proteinů byla pouţita standardní SDS elektroforéza (viz kap. 6.3) a poté metoda Western blotting (viz kap. 6.4). Primární králičí protilátka proti histidinové značce byla ředěna v poměru 1: Doba inkubace byla zkrácena na 1 hodinu. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám byla ředěna také v poměru 1:12000 a inkubace trvala 1 hodinu. Vizualizace probíhala v temné komoře na fotopapír, kdy roztok reagencií detekčního systému působil 5 minut a následná doba expozice byla 2 minuty (viz kap ). Obrázek 15: Detekce proteinů značených histidinovou značkou s aplikací výsledků z Dot blot metody. Separace proteinů ve vzorcích provedena pomocí SDS-PAGE, podmínky separace: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. K detekci byla pouţita metoda Western blotting při vyuţití primární králičí protilátky proti histidinové značce (ředění 1:12000, doba inkubace 1 hodina) a sekundární prasečí protilátce proti králičím protilátkám (ředění 1:12000, doba inkubace 1 hodina). Doba expozice 2 minuty. Legenda: 1- peleta E. coli před indukcí (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 2- peleta E. coli po indukci IPTG (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 3- peleta po rozbití E. coli Bug Busterem (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 4- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (2,8 µg CBR1), 5- purifikovaný protein CBR1(2,6 µg CBR1), 6- standard molekulových hmotností (5 µl). 60

66 Výsledek (Obrázek 15) potvrdil, ţe ředění obou protilátek v poměru 1:12000 je stále dostačující pro spolehlivou detekci proteinů značených histidinovou značkou. V oblasti lehce pod 37 kda jsou viditelné výrazné prouţky detekovaných proteinů u všech testovaných forem vzorků odpovídající molekulové hmotnosti proteinu CBR1 značeného histidiny, která je 30,9 kda. Tímto ředěním bylo dosaţeno i výrazného sníţení výskytu nespecifických vazeb. Zkrácení doby inkubace nevykázalo negativní vliv na detekci a tato doba se zdá být dostatečná a optimální. 8.6 Ověření funkčnosti protilátek při opakovaném použití Pro přípravu vzorků byl zvolen stejný postup jako v předchozí kapitole 8.5. K dělení proteinů byla pouţita standardní SDS elektroforéza (viz kap. 6.3) a následovala metoda Western blotting umoţňující detekci (viz kap. 6.4.). Primární králičí protilátka proti histidinové značce a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám byly ředěny 1:12000 a inkubace u obou protilátek trvala 1 hodinu. Tyto protilátky byly jiţ dvakrát pro detekci proteinů značených histidiny pouţity. Doba expozice byla 3 minuty. Obrázek 16: Detekce proteinů značených histidinovou značkou - ověření funkčnosti protilátek při jejich opakovaném použití. Podmínky seperace, mnoţství vzorku, detekce a pouţité protilátky byly stejné jako u předchozího obrázku č. 15. Doba expozice 3 minuty. Legenda: 1- peleta E. coli před indukcí (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 2- peleta E. coli po indukci IPTG (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 3- peleta po rozbití E. coli Bug Busterem (kousek pelety, neznámé mnoţství proteinu CBR1), 4- supernatant po rozbití E. coli pomocí Bug Busteru (2,8 µg CBR1), 5- purifikovaný protein CBR1(2,6 µg CBR1), 6- standard molekulových hmotností (5 µl). 61

67 Z obrázku č. 16 je patrné, ţe i opakované pouţití protilátek ředěných v poměru 1:12000 je moţné a protilátky jsou stále dostatečně funkční k detekci značených proteinů. Ani zkrácená doba inkubace na 1 hodinu neměla negativní vliv na detekci při tomto opakovaném pouţití a zdá se být z hlediska úspory času optimální. Slabší prouţek u vzorku číslo 1 (peleta E. coli před indukcí) je zřejmě z toho důvodu, ţe se jedná právě o vzorek před indukcí IPTG, proto lze předpokládat, ţe je ve vzorku niţší koncentrace exprimovaného proteinu CBR1 značeného histidinovou značkou neţ v ostatních vzorcích. Další opakování jiţ nebylo testováno. 8.7 Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů s histidinovou značkou za podmínek dle doporučení výrobce Ke stanovení detekčního limitu byl pouţit vzorek purifikovaného proteinu CBR1 značeného histidinovou značkou. Byla zvolena tato řada testovaných hmotností proteinu CBR1: 3 µg, 1 µg, 0,5 µg, 0,25 µg, 0,1 µg, 0,05 µg, 0,025 µg. Příprava vzorků byla provedena dle kap Byla provedena SDS elektroforéza (viz kap. 6.3) a Western blotting (viz kap. 6.4). Primární králičí protilátka proti histidinové značce byla ředěna dle doporučení výrobce v poměru 1:1000 a doba inkubace byla přes noc. Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám, byla také dle doporučení výrobce ředěná v poměru 1:1000, délka inkubace byla 1 hodina. Vizualizace označených proteinů probíhala v temné komoře, za pouţití dvousloţkového detekčního systému, jehoţ délka působení byla 5 minut a výsledek byl zviditelněn pomocí fotopapíru (viz kap ). Expozice trvala 4 minuty. 62

68 Obrázek 17: Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro králičí protilátku proti histidinové značce a prasečí protilátku proti králičím protilátkám, dle doporučení výrobce. Separace proteinů byla provedena metodou SDS-PAGE, podmínky separace: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. K detekci byla vyuţita metoda Western blotting a pouţitými protilátkami byly primární králičí protilátka proti histidinové značce a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám ředěny v poměru 1:1000. Doba expozice 4 minuty. Legenda: čísla uvedená pod jednotlivými vzorky udávají mnoţství proteinu CBR1 v µg obsaţeného v jamce. Na obrázku č. 17 jsou vidět postupně se zesvětlující prouţky proteinů CBR1 značených histidiny v oblasti pod 37 kda. Nejvýraznější a nejširší prouţek je vidět u vzorku, který obsahuje největší mnoţství proteinu CBR1 a to 3 µg. Se sniţujícím se mnoţstvím proteinů dochází k zesvětlování a zuţování prouţků. Poslední viditelný prouţek je u vzorku obsahujícího 0,05 µg proteinu CBR1 značeného histidinovou značkou. Z toho vyplývá, ţe detekční limit metody Western blotting pro králičí protilátku proti histidinové značce a prasečí protilátku proti králičím protilátkám, ředěné dle doporučení výrobce 1:1000 je ng proteinu v prouţku. Na obrázku se vyskytuje řada nespecifických vazeb. 8.8 Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro detekci proteinů s histidinovou značkou za optimalizovaných podmínek Stanovení probíhalo stejným způsobem jako v předchozím experimentu (viz kap. 8.7). Jedinou odlišností bylo, ţe primární králičí protilátka proti histidinové značce byla ředěna na základě optimalizace v poměru 1:12000 a inkubace trvala 1 hodinu. Stejným způsobem byla ředěna i sekundární prasečí protilátka proti králičím 63

69 protilátkám, a délka inkubace byla také stejná (1 hodina). Vizualizace výsledku viz kap Expozice trvala 4 minuty. Obrázek 18: Stanovení detekčního limitu metody Western blotting pro králičí protilátku proti histidinové značce a prasečí protilátku proti králičím protilátkám, ředěné v poměru 1: Separace proteinů byla provedena metodou SDS-PAGE,podmínky separace: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. K detekci byla vyuţita metoda Western blotting a pouţitými protilátkami byly primární králičí protilátka proti histidinové značce a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám ředěny v poměru 1: Doba expozice 4 minuty. Legenda: čísla uvedená pod jednotlivými vzorky udávají mnoţství proteinu CBR1 v µg obsaţeného v jamce. Na obrázku č. 18, stejně jako v předchozím případě (Obrázek č. 17) jsou vidět postupně se zesvětlující prouţky proteinů CBR1 značených histidiny v oblasti pod 37 kda. Nejvyššímu mnoţství proteinu CBR1 (5 µg) odpovídá nejvýraznější prouţek a s klesajícím mnoţstvím proteinu je vidět postupné zesvětlování a zuţování prouţků. Poslední detekovatelné mnoţství proteinu CBR1 značeného histidinovou značkou v prouţku 0,1 µg. Z tohoto výsledku vyplývá, ţe detekční limit metody Western blotting pro králičí protilátku proti histidinové značce a prasečí protilátku proti králičím protilátkám, ředěné v poměru 1:12000 je ng proteinu v prouţku. V porovnání s předchozím obrázkem č. 17 výrazně ubylo nespecifických vazeb. 64

70 9 Optimalizace detekce proteinů značených FLAG peptidem 9.1 Detekce proteinů značených FLAG peptidem dle doporučení výrobce protilátek V první fázi optimalizace metody detekce proteinů značených FLAG peptidem bylo postupováno dle doporučení uvedených v návodu výrobce protilátek. Všechny pouţívané vzorky (DHRS12, HSD11β1, RODH4, RODH4 (II), DHRS3, DHRS8, DHRS7) byly 5x naředěny 0,1 M Na-fosfátovým pufrem, ph 7,4 do mikrozkumavek. Další postup přípravy vzorků viz kapitola Separace proteinů ve vzorcích byla provedena pomocí SDS elektroforézy (viz kap. 6.3). Následovala metoda Western blotting (viz kap. 6.4). K detekci byla pouţita primární králičí protilátka proti FLAG peptidu ředěná v poměru 1:1000 (dle doporučení výrobce), kdy doba inkubace byla 2 hodiny dle doporučení výrobce. Jako sekundární protilátka byla pouţita prasečí protilátka proti králičím protilátkám ředěna v poměru 1:1000 (dle výrobce), 1 hodinová inkubace. Příprava protilátek Vizualizace byla provedena v temné komoře a výsledek zviditelněn na fotopapír (viz kap ). Doba působení detekčního systému byla 5 minut a expozice trvala 1 minutu. Obrázek 19: Detekce proteinů značených FLAG peptidem - dle doporučení výrobce. Separace proteinů probíhala pomocí metody SDS-PAGE za podmínek: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. K detekci byla pouţita metoda Western blotting kdy primární králičí protilátka proti FLAG peptidu byla ředěna v poměru 1:1000 (dle doporučení výrobce) a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v také poměru 1:1000 (dle výrobce). Výsledek byl zhotoven v temné komoře pomocí detekčního kitu (5 minut působení) na fotopapír. Expozice trvala 1 minutu. Legenda: 1- standard molekulových hmotností, 2- DHRS12 (24 µg v jamce), 3- HSD11β1 (31,6 µg v jamce), RODH4 (34 µg v jamce), 5- RODH4 (II) (38 µg v jamce), 6- DHRS3 (31,4 µg v jamce), 7- DHRS8 (28 µg v jamce), 8- DHRS7 (28 µg v jamce). 65

71 Na obrázku č. 19 je vidět velké mnoţství nespecifických vazeb, přes které není moţné ani identifikovat proteiny obsahující FLAG peptid. U některých vzorků (vzorek č. 2, 3, 4, 6, 7) zřejmě nedošlo k dostatečné denaturaci proteinů, čímţ zřejmě vznikly souvislé vertikální pruhy ve vyšších oblastech molekulových hmotností. Z tohoto výsledku vyplývá, ţe pro kvalitní detekci je nutná optimalizace podmínek metody. 9.2 Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Pro nalezení optimálního ředění primární protilátky byla zvolena metoda Dot blot. Vzorky byly přímo aplikovány na membránu bez předchozí úpravy. Jednalo se o náhodně zvolené vzorky rekombinantně připravených enzymů DHRS12 a DHRS8 obsahujících FLAG peptid. Nanášený objem vzorků byl v obou případech 2µl, coţ odpovídalo mnoţství 24 µg proteinu u vzorku DHRS12 a 28 µg u vzorku DHRS8. Testována byla tato ředící řada primární králičí protilátky proti FLAG peptidu: 1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:12000, 1:14000, 1: Doba inkubace byla 2 hodiny. Koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám byla zvolena dle doporučení výrobce 1:1000 a inkubace trvala 1 hodinu. Příprava protilátek viz kapitola Vizualizace výsledku byla provedena v temné komoře na fotopapír za pouţití detekčního kitu (5 minutové působení). Expozice trvala 3 minuty. Obrázek 20: Optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu pro detekci proteinů značených FLAG peptidem pomocí metody Dot blot. Byla pouţita Dot blot metoda kdy primární králičí protilátka proti FLAG peptidu byla v ředění 1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:8000, 1:12000, 1:14000, 1:16000, doba inkubace 2 hodiny (dle výrobce). Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v ředění 1:1000, doba inkubace 1 hodina (dle výrobce). Expozice trvala 2 minuty. Legenda: 1- DHRS12 (24 µg v kolečku), 2- DHRS8 (28 µg v kolečku) 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1:14000, 1: poměr ředění králičí protilátky proti histidinové značce 66

72 Ze získaného výsledku (obr. č. 20) je patrné, ţe k detekci proteinu značeného FLAG peptidem dochází jak při nejniţším testovaném ředění (1:4000) tak i při vyšších ředěních králičí primární protilátky proti FLAG peptidu. Větší rozsah testovaných ředění protilátky, neţ při optimalizaci protilátek pro detekci rekombinantních proteinů značených histidiny, byl vyzkoušen právě s ohledem na získané výsledky při předchozí optimalizaci protilátek pro detekci histidinové značky (viz kap. 8.3; 8.4). I při nejvyšším testovaném ředění protilátky (1:16000) stále dochází ke spolehlivé detekci. Další ředění jiţ testována nebyla. Rozdílná intenzita výsledku obou vzorků můţe být dána rozdílnou koncentrací proteinů nesoucích značení FLAG peptidem. 9.3 Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených FLAG peptidem Optimální koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám byla stanovována stejným postupem a při stejných podmínkách jako optimalizace koncentrace primární králičí protilátky proti FLAG peptidu (viz kap. 9.2). Náhodně zvolenými testovanými vzorky byly rekombinantně připravené enzymy: DHRS7 a DHRS3. Ředění primární králičí protilátky proti FLAG peptidu bylo dodrţeno dle pokynů výrobce 1:1000 a dodrţeno bylo i doporučení výrobce ohledně doby inkubace tedy 2 hodiny. Pro hledání optimální koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám byla zvolena tato ředící řada: 1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:12000, 1:14000, 1:16000, která byla stejná jako při optimalizaci primární králičí protilátky proti FLAG peptidu. Doba inkubace této sekundární protilátky trvala 1 hodinu. Vizualizace výsledku probíhala v temné komoře (viz kap.6.4.6). Byl pouţit detekční kit (působení 5 minut). Doba expozice byla 2 minuty. 67

73 Obrázek 21: Optimalizace koncentrace sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám pro detekci proteinů značených FLAG peptidem pomocí metody Dot blot. Detekce proběhla pomocí Dot blot metody kdy primární králičí protilátka proti FLAG peptidu byla v ředění 1:1000, doba inkubace 2 hodiny (dle výrobce). Sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v ředění 1:4000, 1:8000, 1:10000, 1:8000, 1:12000, 1:14000, 1:16000, doba inkubace 1 hodina (dle výrobce). Výsledek byl zhotoven v temné komoře na fotopapír, doba působení roztoku reagencicí detekčního kitu byla 5 minut. Expozice trvala 2 minuty. Legenda: 1- DHRS7 (28 µg v kolečku), 2- DHRS3 (31,4 µg v kolečku), 1:2000, 1:4000, 1:6000, 1:8000, 1:10000, 1: poměr ředění králičí protilátky proti histidinové značce. Výsledek (Obrázek 21) ukázal, ţe při všech testovaných koncentracích sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám dochází k detekci proteinů značených FLAG peptidem. Při nejvyšším testované ředění 1:16000 jsou sice výsledná kolečka světlejší neţ u předchozích vzorků, ale stále dochází k viditelné detekci. Větší ředění této protilátky jiţ nebyla testována. 9.4 Detekce proteinů značených FLAG peptidem s aplikací výsledků získaných pomocí metody Dot blot Výsledky získané pomocí Dot blot metody ukázaly, ţe i při ředění králičí protilátky proti FLAG peptidu a prasečí protilátky proti králičím protilátkám v poměru 1:16000 dochází k detekci proteinů značených FLAG peptidem. Tyto poznatky byly následně aplikovány do kompletního procesu detekce proteinů zahrnujícího SDS elektroforézu a Western blotting, aby se ověřilo, jestli bude také docházet k detekci. Byl zvolen stejný postup úpravy vzorků jako při detekci dle pokynů výrobce (viz kap. 9.1). Rozdíl byl pouze v tom, ţe ke kaţdému ze vzorků bylo přidáno 68

74 2,5 µl 2-merkaptoethanolu. Tento přídavek byl zvolen z důvodu, aby se docílilo vyššího stupně denaturace proteinů ve vzorcích a zabránilo se tak vzniku souvislých vertikálních prouţků u některých vzorků, které se vyskytly na obrázku č. 18. Obě pouţité protilátky (primární králičí protilátka proti FLAG peptidu i sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám) byly ředěny v poměru 1: Doba inkubace byla u primární protilátky dodrţena dle doporučení výrobce, tedy 2 hodiny. Sekundární protilátky byla inkubována po dobu 1 hodiny, také dle doporučení výrobce. Výsledek experimentu byl zhotoven v temné komoře, kdy k jeho zviditelnění byl pouţit detekční kit (doba působení reagencií 5 minut) a fotopapír (viz kap ). Doba expozice byla 4 minuty. Obrázek 22: Detekce proteinů značených FLAG peptidem s aplikací výsledků z Dot blot metody. Separace proteinů ve vzorcích proběhla pomocí SDS-PAGE, podmínky separace: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. K detekci byla pouţita metoda Western blotting kdy primární králičí protilátka proti FLAG peptidu byla ředěna v poměru 1:16000 (dle výsledků optimalizace, inkubace 2 hodiny) a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám v také poměru 1:16000 (dle výsledků optimalizace, inkubace 1 hodina). Výsledek byl zhotoven v temné komoře pomocí detekčního kitu (5 minut působení) a fotopapíru. Expozice trvala 4 minuty. Legenda: 1- marker (5 µl), 2- DHRS8 (28 µg v jamce), 3- DHRS12 (31,4 µg v jamce), 4- HSD11β1 (31,6 µg v jamce), 5- RODH4 (34 µg v jamce), 6- RODH4 (II) (38 µg v jamce), 7- DHRS3 (28 µg v jamce), 8- DHRS7 (28 µg v jamce). Na zhotoveném obrázku č. 22 je vidět, ţe v oblasti vyšších molekulových hmotností proteinů se vyskytly opět souvislé vertikální pruhy, coţ svědčí zřejmě o špatné úpravě vzorků. Vzorky č. 2 (DHRS8) a č. 4 (HSD11β1) chybí úplně. Jak bylo patrné jiţ při provádění experimentu, tyto vzorky po nanesení do jamek změnily svoji povahu, coţ můţe nasvědčovat tomu, ţe mohlo dojít k agregaci proteinů a ty pak zřejmě při elektroforéze nepronikly do gelu a zůstaly v jamkách, případně se dostaly pouze částečně do separačního gelu (viz pruhy v horní části gelu). Nicméně se ukázalo, ţe 69

75 ředění protilátek 1:16000 u vzorků č. 3, 5, 6, 7, 8 je dostačující ke spolehlivé detekci proteinů značených FLAG peptidem. Tímto ředěním byl omezen i výskyt nespecifických vazeb protilátek. Bylo nutné tedy vylepšit přípravu vzorků, protoţe takto komplikované vzorky mikrosomální frakce nesoucí membránové proteiny je obtíţné v dostatečné míře rozvolnit. 9.5 Optimalizace úpravy vzorků Snížení teploty přípravy vzorků na 65 C Vzorky byly připraveny dle postupu (viz kap ). V kaţdé jamce bylo 20 µg proteinu. Následovala SDS elektroforéza a Western blotting (viz kap. 6.3; 6.4) Obě protilátky (králičí protilátka proti FLAG peptidu a prasečí protilátka proti králičím protilátkám) byly ředěny v poměru 1:16000 a byly pouţity potřetí, aby se zároveň ověřilo, zda je moţné protilátky spolehlivě pouţít třikrát i při tomto ředění. Doba inkubace obou protilátek byla zkrácena na 1 hodinu. Vizualizace probíhala v temné komoře za pouţití detekčního kitu a fotopapíru (viz kap ). Doba působení detekčního systému byla 5 minut. Doba expozice 1 minuta. Obrázek 23: Detekce proteinů značených FLAG peptidem - optimalizace úpravy vzorků, změněný faktor - teplota 65 C. K separaci proteinů byla pouţita metoda SDS-PAGE, separační podmínky: 4% zaostřovací polyakrylamidový gel, 100 V, 10 minut; 12,5% separační polyakrylamidový gel, 200 V, 45 minut. Kaţdá jamka obsahovala 20 µg příslušného proteinu. Detekce proběhla za pouţití metody Western blotting s aplikací primární králičí protilátky proti FLAG peptidu a sekundární prasečí protilátky proti králičím protilátkám. Obě protilátky byly ředěny v poměru 1:16000 a doba inkubace byla zkrácena v obou případech na 1 hodinu. Výsledek byl zhotoven na fotopapír, doba expozice 1 minuta. Legenda: 1- marker, 2- DHRS8, 3- DHRS12, 4- HSD11β1, 5- RODH4, 6- RODH4 (II), 7- DHRS3, 8-DHRS7. 70

76 Jak je vidět na obrázku č. 23, sníţení teploty mělo na úpravu těchto komplikovaných vzorků mikrosomálních frakcí pozitivní vliv. V porovnání s výsledkem experimentu, kde jsou vzorky zpracovány klasickým způsobem (Obrázek 19, Obrázek 22), jsou v tomto výsledku vidět hezké prouţky u kaţdého z testovaných vzorků. V drahách jednotlivých vzorků došlo také k potlačení výskytu nespecifických vazeb a souvislých pruhů. Prouţky jednotlivých proteinů (enzymů) se nacházejí v oblasti kolem 37 kda, coţ odpovídá molekulovým hmotnostem stanovovaných enzymů. Detekce proteinů značených FLAG peptidem byla úspěšná u všech testovaných vzorků, a proto ředění protilátek v poměru 1:16000 se zdá být optimální. Zkrácená doba expozice neukázala negativní vliv na detekci a prokázalo se také, ţe protilátky jsou funkční i při třetím pouţití Použití chaotropního činidla K tomuto experimentu byly vzorky připraveny dle metodiky (viz kap ). Do jamek byl pipetován celý objem takto připravených vzorků. Kaţdá jamka pak obsahovala 20 µg příslušného proteinu. Proteiny byly separovány standardní SDS elektroforézou (viz kap. 6.3) a detekovány pomocí metody Western blotting (viz kap. 6.4). Protilátky (primární králičí protilátka proti FLAG peptidu a sekundární prasečí protilátka proti králičím protilátkám) byly naředěny v poměru 1: A stejně jako v předchozím experimentu (viz kap ) byly tyto protilátky pouţity potřetí, aby se ověřilo, zda je moţné dosáhnout spolehlivé detekce i při třetím pouţití. Doba inkubace obou protilátek byla také zkrácena na 1 hodinu. Následná vizualizace výsledku probíhala v temné komoře na fotopapír za pouţití detekčního systému, který se nechal působit 5 minut (viz kap ). Doba expozice byla 4 minuty. 71

77 Obrázek 24: Detekce proteinů značených FLAG peptidem- optimalizace úpravy vzorků, změněný faktor - přídavek 8M močoviny. Podmínky seperace, mnoţství vzorku, detekce a pouţité protilátky byly stejně jako u předchozího obrázku č. 23. Legenda: 1- marker, 2- DHRS8, 3- DHRS12, 4- HSD11β1, 5- RODH4, 6- RODH4 (II), 7- DHRS3, 8- DHRS7 Obrázek č. 24 ukazuje, ţe přídavek 8M močoviny měl pozitivní vliv na úpravu vzorků mikrosomálních frakcí. Tímto krokem bylo dosaţeno velmi podobného výsledku jako v předchozím experimentu, kdy byla sníţena teplota (viz kap ) U jednotlivých vzorků jsou detekovány výrazné prouţky v oblasti kolem 37 kda, odpovídající molekulovým hmotnostem jednotlivých stanovovaných enzymů značených FLAG peptidem. Nevyskytují se zde téměř ţádné nespecifické vazby ani souvislé pruhy, které byly přítomny na Obrázek 19, proto se ředění protilátek v poměru 1:16000 zdá být optimální a byla prokázána (stejně jako v předchozím experimentu, viz kap ) i jejich funkčnost i při třetím pouţití. 72