Mikrobiální aspekty tvorby biogenních aminů v mléce a mléčných výrobcích Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a technologie potravin Mikrobiální aspekty tvorby biogenních aminů v mléce a mléčných výrobcích Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Zuzana Němcová Brno 2010

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mikrobiální aspekty tvorby biogenních aminů v mléce a mléčných výrobcích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne: podpis autora:

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji svému vedoucímu práce, panu Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za cenné rady a za uvedení do problematiky týkající se mé bakalářské práce. Děkuji také Ing. Michaele Němcové a Bc. Liboru Dosedělovi za možnost asistovat u jejich pokusů. V neposlední řadě také děkuji svým nejbližším, kteří mě podporovali během studia.

4 ABSTRAKT Biogenní aminy jsou sekundární metabolity mikroorganismů s dekarboxylasovou aktivitou, vznikají z příslušných aminokyselin. Tvoří se převážně ve fermentovaných potravinách. Bakalářská práce je zaměřena na tvorbu biogenních aminů v mléce a mléčných výrobcích, zabývá se mikroorganismy, které se podílejí na tvorbě biogenních aminů, především v sýrech. Práce se dále zabývá faktory ovlivňujícími vznik biogenních aminů, hygienickým a toxigologickým významem, a metodami jejich stanovení. Praktická část je zaměřena na testování dekarboxylasové aktivity 12 kmenů laktobacilů izolovaných ze sýrů. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin: Lys, Arg, Orn, Phe, His, Tyr, Trp. Po 10 dnech inkubace byla prokázána pozitivní reakce u řady testovaných kmenů. Klíčová slova: biogenní aminy, sýr, mléčné výrobky, histamin, tyramin ABSTRACT Biogenic amines are secondary metabolites microorganisms with decarboxylase activity. They result from appropriate amino acids. They are constructed in fermented food. The aim of this bachelor thesis is production of biogenic amines in milk and dairy products. It is concerned with microorganisms, which are involved in production of biogenic amines, especially in cheese, on the creation factors, hygienic and toxicological relevance and methods of its determination. In practical part, 12 strains of lactobacillus were isolated from cheese and were tested for 10 days in the temperature of 37 C on the basis of colour reactions on the decarboxylase activity. Seven amino acids were used: Lys, Arg, Orn, Phe, His, Tyr, Trp. After 10 days of incubation were positive reactions proved. Key words: biogenic amines, cheese, dairy products, histamin, tyramin

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Biogenní aminy Charakteristika biogenních aminů Rozdělení biogenních aminů Vznik biogenních aminů Reakce biogenních aminů Faktory ovlivňující vznik biogenních aminů Význam biogenních aminů v organismu člověka Legislativní limity Faktory ovlivňující růst mikroorganismů Vnitřní vlivy Vnější faktory Významné mikroorganismy podílející se na tvorbě biogenních aminů Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď Staphylococcaceae Čeleď Micrococcaceae Bakterie mléčného kvašení Čeleď Streptococcaceae Čeleď Enterococcaceae Čeleď Lactobacillaceae Rod Bifidobacterium Mikrobiální kultury Výskyt biogenních aminů v potravinách Výskyt biogenních aminů v nefermentovaných mléčných výrobcích Výskyt biogenních aminů ve fermentovaných výrobcích Stanovení biogenních aminů MATERIÁL A METODY Průkaz dekarboxylasové aktivity na základě barevných reakcí Výsledky a diskuse Závěr SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 52

6 1 ÚVOD Biogenní aminy jsou metabolity mikroorganismů, které vykazují dekarboxylasovou aktivitu. Nacházejí se běžně ve fermentovaných výrobcích, jako jsou sýry, salámy, kysané zelí, víno, pivo, ale také v nefermentovaných výrobcích a to především v makrelovitých rybách. Za nejtoxičtější je považován histamin a tyramin. Tyramin zvyšuje krevní tlak s možným důsledkem hypertenzní krize, migrenózních bolestí hlavy, v krajních případech až krvácení do mozku, resp. selhání srdce. Vazba histaminu na příslušné receptory stěny cévní vyvolá dilataci hladké svaloviny periferních krevních cév s důsledkem poklesu krevního tlaku, což u citlivých jedinců může mít za následek zrudnutí obličeje (flushing) a silné bolesti hlavy. Interakce histaminu s receptory střevní stěny vyvolá kontrakce hladké svaloviny střeva s klinickými projevy břišních křečí, průjmů, zvracení. Může se projevit i typická intolerance v podobě alergických reakcí, např. u citlivých jedinců je to kopřivka (urticaria), zrudnutí očí, dechové potíže a svalový třes. Biogenní aminy také mohou být prekurzory karcinogenních N-nitroso sloučenin. Hodnoty biogenních aminů v potravinách je důležité sledovat z důvodu možné intoxifikace při příjmu velkého množství potravin s vysokým obsahem biogenním aminů. Zvýšené riziko intoxifikace není tak vysoké při příjmu jednotlivých potravin obsahujících biogenní aminy, jako při kombinaci těchto potravin. Například konzumace zrajících sýrů s vínem nebo s fermentovanými salámy. U zdravého člověka by konzumace potravin s obsahem biogenních aminů neměla vyvolat žádné negativní účinky, protože biogenní aminy jsou tělu vlastní. V určité míře se tvoří v lidském těle. Jsou stavebními látkami, které se účastní biosyntézy některých hormonů. Lidský organismus má tedy účinné enzymy, především deaminooxidasy, které odbourávají aminy. Zvýšené riziko intoxifikace je u osob, které mají sníženou detoxifikační schopnost. Ta může být snížena inhibitory monoaminooxidasy, jako je alkohol a některé léky. 6

7 2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce s názvem Mikrobiální aspekty tvorby biogenních aminů v mléce a mléčných výrobcích bylo: Zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty poznatky o biogenních aminech a jejich tvorbě v mléce a mléčných výrobcích. Charakterizovat mikroorganismy podílející se na vzniku biogenních aminů. Charakterizovat faktory prostředí ovlivňující mikroorganismy a tvorbu biogenních aminů. 7

8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Biogenní aminy Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy (dále jen BA) jsou nízkomolekulární bazické dusíkaté látky vznikající v potravinových surovinách nejčastěji dekarboxylací aminokyselin působením bakteriálních dekarboxylačních enzymů (Komprda, 2007). Mezi BA dnes řadíme asi 40 sloučenin (Greif et Greifová 1998), ze kterých nejznámější jsou: histamin, kadaverin, tyramin, putrescin, agmatin, fenylethylamin, kadaverin, dopamin, tryptamin a jiné. histamin kadaverin putrescin agmatin fenylethylamin tyramin dopamin tryptamin Obr. 1 Vzorce některých biogenních aminů (Velíšek, 1999) 8

9 3.1.2 Rozdělení biogenních aminů Podle chemické struktury se alimentárně významné BA dělí na: alifatické: putrescin (Put), kadaverin (Cad), spermidin (Spd), spermin (Spm) a agmatin (Agm), aromatické: tyramin (Tyr ), fenylethylamin (Pea), heterocyklické: histamin (His) a tryptamin (Try), spermin (Spm) a spermidin (Spd) řadíme k polyamidům (Komprda, 2005). Zvláštní postavení dnes zaujímají polyaminy spermidin a spermin, včetně diaminu putrescinu. Putrescin je řazen do skupiny polyaminů (na rozdíl od kadaverinu), protože je přímým meziproduktem syntézy spermidinu a sperminu (Komprda, 2005). Spermin a spermidin nevzniká bakteriální činností na rozdíl od ostatních uvedených aminů, ale biochemickou syntézou v živých organismech od bakterií po člověka. Putrescin se tedy vyskytuje v jakési dvojroli. Svým vznikem patří mezi BA, ale tím, že z něj vznikají přirozené polyaminy spermin a spermidin, se řadí i mezi polyaminy (Kalač et Křížek, 2005) Vznik biogenních aminů BA vznikají z aminokyselin působením karboxylas (dekarboxylas obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát) nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transaminas. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxygenasy a methyltransferasy (Velíšek, 1999). BA jsou tvořené i pomocí dekarboxylas mikroflóry střev lidí. U anaerobní střevní mikroflóry a u koliformních bakterií, které jsou součástí střevní mikroflóry, byla prokázána např. histidin a tyrozin-dekarboxylasa. Tyto aminy mohou být resorbované, vstupují do portálního krevného oběhu, což je určitým zkreslením při sledování BA v krevním oběhu po požití kontaminovaných potravin. Mikroflóru střev je tedy potřebné akceptovat jako nezanedbatelný zdroj BA ( Greif et al., 1998). Z histidinu vzniká jako produkt dekarboxylace histidindekarboxylasou histamin. Z lysinu vzniká působením lysindekarboxylasy kadaverin (1,5-diaminopentan). Dekarboxylací argininu arginindekarboxylasou vzniká agmatin a dále putrescin (1,4-diaminobutan). Ten vzniká také přímo dekarboxylací ornithinu ornithindekarboxylasou (ornithin vzniká z argininu působením arginasy). Z putrescinu vzniká methylací S-adenosylmethioninem spermidin a dále spermin. Dekarboxylací 9

10 fenylalaninu fenylalanindekarboxylasou vzniká 2-fenylethylamin, z tyrosinu činností tyrosindekarboxylasy tyramin a jeho oxidací oktopamin. Z DOPA (3,4dihydroxyfenylalanin) vzniká dopamin (působením dihydroxyfenylalanindekarboxylasy), oxidací dopaminu hormon dřeně nadledvinek noradrenalin (norepinefrin) a jeho reakcí s S-adenosylmethionenem další hormon nadledvinek adrenalin (epinefrin). Z dopaminu vzniká reakcí s acetaldehydem salsalinol, hlavní metabolit v banánech. Oxidací dopaminu přes dopachrom vznikají melaninové pigmenty. Dekarboxylací tryptofanu tryptofandekarboxylasou vzniká tryptamin, ze kterého se tvoří hormon serotonin, serotonin-n-acetyltransferasou vzniká ze serotoninu N-acetylserotonin a z něj působením hydroxyindol-o-methyltransferasy hormon melatonin (Velíšek, 1999). BA mohou vznikat také při technologicky potřebných fermentacích potravin, a to v sýrech, salámech ale i při fermentaci potravin rostlinného původu, při alkoholovém kvašení a při kysání zelí, a to i v malém množství. BA se dávají do souvislosti s nežádoucími účinky piva a vína, pokud jsou konzumované ve větším množství spolu s tvrdými sýry nebo salámy. Toxicita BA se významně zvyšuje při současné konzumaci alkoholu a některých antibiotik, tuberkulostatik a psychofarmatik, což jsou inhibitory monoaminooxidas. Tyto inhibitory brzdí detoxifikační procesy ve střevech a způsobují zvýšenou resorpci biogenních aminů i při malém obsahu v konzumované potravině (Görner et Valík, 2004). Výraznou schopnost dekarboxylovat aminokyseliny na příslušné aminy mají enterokoky serologické skupiny D. Ty jsou běžnou složkou mikroflóry sýrů a zrajících salámů. Slabými producenty jsou také bakterie rodu Propionibacterium a některé laktobacily (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. plantarum apod.) (Görner et Valík, 2004). R-CH-COOH R-CH 2 + CO 2 NH 2 NH 2 Obr.2 Schéma vzniku biogenních aminů z aminokyselin (Kalač et Křížek, 2002) 10

11 Arginin -CO2 Agmatin (aminokyselina) (biogenní amin) Ornitin -CO2 Putrescin (aminokyselina) Spermidin Spermin Obr. 3 Schéma vzniku polyaminů (Kalač et Křížek, 2005) Reakce biogenních aminů BA jsou reaktivní látky. Kromě enzymových reakcí, které vedou k derivátům BA a dalším sloučeninám, mohou oxidativní deaminací poskytovat aldehydy. Dlouhodobým skladováním nebo za zvýšené teploty reagují s triacylglyceroly za vzniku amidů mastných kyselin. Vstupují stejně jako další aminosloučeniny do reakcí neenzymového hnědnutí, kde vznikají jako primární reakční produkty příslušné iminy. Ty se tvoří také oxidací aminů, např. peroxidem vodíku nebo hydroperoxidy lipidů. Sekundární aminy mohou reakcí s oxidy dusíku tvořit karcinogenní nitrosaminy. S bílkovinami reagují BA jako je fenylethylamin, putrescin, histamin, spermidin, a tyramin za vzniku β-n-substituovaných derivátů diaminopropionové kyseliny. Pravděpodobným mechanismem tvorby těchto derivátů aminokyselin je β-eliminace zbytků cysteinu a následná adice aminu na dvojnou vazbu dehydroalaninu vznikajícího stejně jako při tvorbě lysinoalaninu. S methanalem (formaldehydem) vzniká 1,2,3,4-tetrahydro-βkarbolin, s ethanalem 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-karbolin. Analogické produkty vznikají z tryptaminu i tryptofanu v Maillardově reakci (Velíšek, 1999). Většina aminů včetně histidinu je tepelně stálá. Některé dekarboxylasy si uchovávají aktivitu i po pasteraci, takže obsah BA může vzrůstat i během skladování potravin. (Brink et al.,1990) 11

12 Obr. 4 Hlavní reakce biogenních aminů (Velíšek, 1999) Faktory ovlivňující vznik biogenních aminů Pro tvorbu významnějšího množství BA jsou nutné tři podmínky: dostupnost volných aminokyselin, výskyt bakterií vybavených dekarboxylasami aminokyselin podmínky umožňující růst bakterií, biosyntézu dekarboxylas a jejich aktivitu (Křížek et Kalač, 1998) Významným předpokladem tvorby BA je proteolýza, ať již autolytická, či bakteriální (Křížek et Kalač, 1998). Dekarboxylace je děj, kdy se odbourává karboxylová skupina COOH a vytváří se oxid uhličitý. Účinný enzym se nazývá dekarboxylasa (Křížek et Křížek, 2002). Bakterie způsobující dekarboxylaci aminokyselin patří do mnoha rodů, zejména Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella a Shigella, ale vyskytují se i v mléčných bakteriích rodů Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus (Kalač et Křížek, 2005). Ve fermentovaných potravinách živočišného původu se nejčastěji na produkci BA podílejí bakterie: ve zrajících sýrech Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, Streptococcus faecuim, Bacillus macerans a Propionibacterium spp. (Komprda 2005). Některé bakterie jsou naopak schopny vytvořené BA rozkládat: Pseudomonas ssp., Serratia mercesns, Sarcina lutea (Komprda, 2007). Je třeba zdůraznit, že stanovovaná množství BA v potravinách často nekolerují se zjištěnými počty skupin, rodů, resp. druhů příslušných výše uvedených mikroorganismů, neboť jednotlivé kmeny v rámci daného druhu se mohou zásadně lišit svou dekarboxylasovou aktivitou (Komprda, 2005), v některých případech až o tři řády 12

13 (Kalač et Křížek, 2005). To pak způsobuje, že obsahy jednotlivých aminů v určitém druhu potraviny kolísají v širokém rozpětí nejen mezi jednotlivými výrobci, ale i mezi šaržemi stejného výrobce (Kalač et Křížek, 2002). Odstranit alespoň část vytvořených BA z potravin je komplikované, proto je rozhodující omezit jejich vznik (Kalač et Křížek, 2005). Obsah aminů obsažených v potravinách lze snížit několika způsoby. přídavkem enzymu DAO (diaminooxydasy) oxidovat BA za přítomnosti kyslíku na aldehydy, přídavkem sacharidů umožnit reakci s aminy vedoucí k neenzymovému hnědnutí, vyluhovat část aminů do varné lázně pokud se nekonzumuje. Tyto úpravy však mají jen omezené použití. Rozhodující opatření spočívá v prevenci vzniku BA (Křížek et Kalač, 1998). Jedním z důležitých faktorů, které ovlivňují aktivitu mikrobiálních dekarboxylačních enzymů, je dostupnost substrátu. Význam má nejen přítomnost volných aminokyselin, ale také přítomnost využitelných cukrů. Jako optimální je v této souvislosti uváděna koncentrace glukózy 0,5-2 % (Komprda, 2005). Dalším významným faktorem je teplota. Např. histamin se při 5 C tvoří řádově méně než při 20 C (Komprda, 2005). Optimální teploty tvorby tyraminu produkované Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis jsou různé podle různých autorů, kteří tuto skutečnost sledovali: C, C, 37 C, 40 C, ale chybějí hraniční hodnoty. Pokud jde o ph, optimum pro většinu dekarboxylačních mikroorganismů je 4,0-5,5 (Komprda, 2005). Například specifická růstová rychlost pro Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis je nejvyšší při vstupní hodnotě ph 7. Při této hodnotě ph je nejvyšší i specifická rychlost nárůstu tyraminu. Při vyšších a nižších hodnotách ph specifická růstová rychlost klesá. K zastavení tvorby tyraminu těmito mikroorganismy nedochází v žádné hodnotě ph v rozmezí 4,5-9 (Greifová et al., 2003). Přítomnost soli obecně inhibuje tvorbu BA, ale na druhé straně histamin nebo tyramin působí na některé bakterie osmoprotektivně a jeho syntéza je tedy v přítomnosti NaCl v některých případech zvýšena. Greifová et al.(2003) sledovali vliv na produkci BA mlékárensky významnými enteroky, a zjistili, že Enterococcus faecalis produkuje tyramin ve všech jimi zvolených koncentracích NaCl, a to 0,6-6 % NaCl. Nejvyšší koncentraci tyraminu naměřili při 1,1 % NaCl (1345µg/cm 3 ). Specifická rychlost 13

14 produkce tyraminu byla nejvyšší při koncentraci 1,2 % NaCl, se zvyšující se koncentrací NaCl postupně klesala.. Enterococcus faecium produkoval tyramin také ve všech zvolených koncentracích NaCl, a to od 1,3 do 7,0 % NaCl. Maximální koncentrace tyraminu (660,4 µg/cm 3 ) byla zjištěna při 5,9 % NaCl. a nejnižší při 7,7 % NaCl (365,9 µg/cm 3 ). Vzhledem k tomu, že se enterokoky mohou vyskytovat v potravinách rostlinného, ale především živočišného původu s obsahem NaCl do 3 %, kde se vyskytuje buď jako kontaminant nebo jako startovací kultura, je potřeba brát v úvahu jeho pomnožení a tvorbu významných množství tyraminu (Greif et al., 2006). Jiným faktorem, který ne zcela ovlivňuje dekarboxylační aktivitu příslušných mikroorganismů, je přístupnost kyslíku: na tvorbě BA se mohou podílet mikroorganismy aerobní, anaerobní i fakultativně anaerobní (Komprda, 2005). Tvorbu BA ovlivňuje i doba zrání. S rostoucí dobou zrání a skladování se zvyšuje obsah BA ve zrajících sýrech, resp. fermentovaných tepelně neopracovaných masných výrobcích. Zcela zásadním faktorem omezujícím obsah BA ve finálním výrobku je přísná aplikace hygienických zásad při získávání surovin i při jejich následném zpracování. Významnou měrou se na tvorbě BA mohou podílet startovací kultury. Proto při výrobě fermentovaných potraviny je vhodné testovat startovací kultury na dekarboxylasovou aktivitu a vybírat v této souvislosti pouze mikroorganismy v uvedeném znaku negativní (Komprda, 2005). 14

15 Tab.1 Shrnutí faktorů ovlivňující tvorbu biogenních aminů (Kohajdová, 2008) Faktory ph Obsah glukózy Teplota Přítomnost NaCl Vliv na dekarboxylasovou aktivitu dekarbaxylasová aktivita je silnější v kyselém prostředí (ph 4 až 5,5) 0,5 až 2 % optimální pro růst mikroorganizmů vybavených dekarbaxylasami, 3 % inhibují syntézu dekarboxylas 20 až 37 C je optimální pro růst většiny mikroorganismů NaCl aktivuje tyrozindekarboxylasu, inhibuje histidindekarboxylasu Přítomnost NaNO 2 aktivuje tyrozindekarboxylasu je potřebný pro růst mikroorganizmů vybavených Přítomnost O 2 dekarboxylasami Množství přítomných aminů histamin, agmatin a putrescin inhibuje histidindekarboxylasu Význam biogenních aminů v organismu člověka Fyziologické účinky BA jsou skupinou alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází odvozených od aminokyselin, které vykazují různé biologické účinky. Některé BA mají samy významné biologické vlastnosti, neboť jsou např. tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenylethylamin), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin (Velíšek, 1999). Obecně mohou být BA zdrojem dusíku v různých biochemických reakcích, případně mohou sloužit jako prekurzory některých hormonů, nukleových kyselin nebo proteinů. Speciálně histamin má významnou funkci při alergické odezvě organismu. Svou strukturou patří mezi BA také katecholaminy adrenalin a noradrenalin. Noradrenalin je mediátorem v rámci sympatického nervového systému. Adrenalin je důležitým hormonem dřeně nadledvinek s účinkem na hladkou svalovinu krevních cév. V kosterní svalovině vyvolává adrenalin vazodilataci arteriol, naopak jeho vazba na příslušné receptory arteriol kůže a vnitřností, především střev, vyvolává konstrikci. Celkově převládá účinek vazodilatační, u noradrenalinu vazokonstrikční. Důsledkem účinku 15

16 adrenalinu je zvýšení srdeční funkce, v metabolické rovině zvýšení hladiny krevní glukózy (Komprda, 2005). Některé BA mají v lidském (obecně savčím) organismu důležité fyziologické funkce, jsou to látky tělu vlastní. Je tedy zřejmé, že organismus člověka i jiných savců musí mít k dispozici účinné detoxifikační mechanismy. Rozhodující cestou odbourávání BA v organismu člověka je oxidace. Příslušné enzymy lze zjednodušeně rozdělit na monoaminooxidasy (MAO), diaminooxidasy (DAO) a polyaminooxidasy (PAO). MAO odbourávají především aromatické monoaminy, a to oxidační deaminací na příslušný aldehyd, čpavek a peroxid vodíku: R-CH 2 -NH 2 +H 2 O+O 2 RCHO+NH 3 +H 2 O 2. MAO jsou mitochondriální enzymy exprimované v játrech, slezině, ledvinách, mozku, plících a především ve střevě. DAO oxidativně deaminují diaminy (Put, Cad), nejvyšší aktivitu vykazují v tenkém střevě, ledvinách a placentě. PAO využívají jako substrát především polyamidy spermin a spermidin, mohou však odbourávat mono i diaminy. Výše uvedené detoxifikační mechanismy jsou ovšem nedostatečné v následujících případech: s účinkem inhibitorů MAO, resp. při příliš vysokém přijmu BA v potravě (Komprda, 2005). Aktivitu nejúčinnějšího enzymu MAO snižuje alkohol, především však některé léky nejčastěji ze skupiny psychofarmak (např. Aurorix, Jumex, Niar, Selegin, Sepatrem). Pro pacienty přijímající tyto léky představují aminy, především tyramin, riziko, které může ve velmi vzácných případech vést až k ohrožení života při výrazném zvýšení krevního tlaku. Aktivitu enzymu DAO snižují např. léky Ambroxol a Acetylcystein, používané jako expektorans a mukolytikum, tj. pro odkašlávání a uvolňování hlenů (Kalač et Křížek, 2002) Biologická role spermidinu a sperminu Spermin a spermidin se podílejí na množství základních dějů v živých organismech, především na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Proto je jejich obsah vyšší v mladých, metabolicky aktivních rostlinných pletivech a živočišných tkáních, mj. i ve tkáních nádorových. To vyvolalo velmi obsáhlý, stále pokračující výzkum vztahů mezi obsahem polyaminů a růstem nádorů. Je však třeba zdůraznit, že polyaminy nejsou karcinogeny, nejsou tedy iniciátory nádorového bujení. Lidský organismus využívá polyaminy ze třech zdrojů: vytvářené vlastní biosyntézou z aminokyselin, produkované střevními bakteriemi a přijímané potravou. Proto se jako jedna z cest zastavení, či 16

17 alespoň zpomalení růstu nádorů ověřuje snížení příjmu či využitelnosti potravních polyaminů (Kalač et Křížek, 2005). Polyaminy obsažené v potravě však mohou být i žádoucí pro intenzivnější tvorbu či regeneraci tkání, např. v období pooperační rekonvalescence nebo při léčbě poranění. U zdravého člověka je nadbytečný příjem polyaminů odstraněn střevními enzymy polyaminooxidasou (PAO) a diaminooxidasy (DAO). Spermin a spermidin proto nejsou pokládány za zdravotně rizikové. Zatím však není stanovena výše jejich potřeby (Kalač et Křížek, 2005). Spermin je schopný regenerovat tokoferol (používaný jako antioxidant) z tokoferoxylového radikálu prostřednictvím vodíkového donora z aminoskupiny. Sperminový radikál potom váže lipid, resp. peroxidové radikály do komplexů. Dopamin, noradrenalin a tyramin jsou schopné zneškodňovat reaktivní kyslíkové druhy, také jako např. superoxidový a hydroxylový radikál (Kohajdová et al., 2008) Hygienický a toxikologický význam Z hygienického hlediska mohou sloužit BA jako indikátory stupně kažení potravin. V této souvislosti byl zaveden index biogenních aminů (BAI), který využívá skutečnosti, že obsah kvantitativně významných BA histaminu, putrescinu a kadaverinu se v průběhu skladování daného produktu zvyšuje, na druhé straně se však obsah polyaminů spermidinu a sperminu nemění nebo dokonce snižuje. Spd a Spm totiž primárně nevznikají činností mikrobiálních dekarboxylas v potravině, ale vstupují do ní jako preformované látky již z příslušné suroviny (mléko, maso). Index BA se vypočte jako BAI = His + Put + Cad/(1 + Spd + Spm), obsahy všech BA uvedených v této rovnici jsou v mg/kg dané potraviny (Komprda, 2005). Pokud jde o toxikologický význam, mohou být BA prekurzory karcinogenních N-nitroso sloučenin. Podstatně nebezpečnější jsou v této souvislosti sekundární aminy (R 1 -NH-R 2 ), které vytvářejí stabilní produkty, na rozdíl od těkavých produktů reakcí s účastí primárních aminů (NH 2 -R) (Komprda, 2005). BA jsou pro člověka nepostradatelné, ve vysokých koncentracích se ale mohou projevit jako látky psychoaktivní a vazoaktivní (Silla-Santos, 1996). Nejtoxičtější z BA jsou uváděny histamin a tyramin. Nejvýznamnějším vazoaktivním BA je tyramin, který zvyšuje krevní tlak s možným důsledkem 17

18 hypertenzní krize, migrenózních bolestí hlavy, v krajních případech až krvácení do mozku, resp. selhání srdce. Toxická dávka je asi mg/g (Komprda 2005). Negativní účinky histaminu na organismus člověka jsou poměrně různorodé. Toxická dávka histaminu je asi mg/kg potraviny. Toxický účinek histaminu závisí na přijatém množství, přítomnosti jiných BA (potenciace účinku), aktivitě aminooxidas a celkovém stavu fyziologie střeva (Komprda, 2005). Vazba histaminu na příslušné receptory stěny cévní vyvolá dilataci hladké svaloviny periferních krevních cév s důsledkem poklesu krevního tlaku, což u citlivých jedinců může mít za následek zrudnutí obličeje (flushing) a silné bolesti hlavy. Naopak interakce histaminu s receptory střevní stěny vyvolá kontrakce hladké svaloviny střeva s klinickými projevy břišních křečí, průjmů, resp. zvracení. Kromě toxického účinku ve vlastním smyslu slova mají význam jednak reakce imunologické (alergie), jednak negativní reakce probíhající na jiném než imunologickém podkladě intolerance. K typickým alergickým reakcím, např. po požití vyšších dávek histaminu v některých potravinách, patří u citlivých jedinců kopřivka (urticaria), zrudnutí očí, dechové potíže a svalový třes (Komprda, 2005). Obsah histaminu 100 mg/kg vzorku může způsobit intoxikaci histaminem, mg/kg tyraminu tzv. reakci na sýr (6mg, pokud pacient užívá léky s účinkem MAO). Suma histamin + tyramin + putrescin + kadaverin by pro sýr neměla překročit hodnotu 900 mg/kg (Standarová et al., 2008). Toxické dávky BA je obtížné stanovit. Velmi záleží na individuálních rozdílech mezi lidmi, zastoupení jednotlivých BA v potravině, množství konzumované potraviny a přítomnosti jiných potencujících složek, jakými jsou například alkohol nebo léky (Standarová et al., 2008). V řadě zemí je předepsáno nejvyšší povolené množství histaminu a tyraminu. Znalosti o toxicitě ostatních BA jsou nedostatečné. Pro fenylethylamin, který způsobuje migrénu, se uvádějí hodnoty 30 mg/kg (Velíšek, 1999) Legislativní limity Nejvyšší přípustné množství histaminu udávala vyhláška č. 53/2002 Sb., zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích. Stanovovala nejvyšší přípustné množství histaminu v rybách a rybích výrobcích na 200,0 mg/kg a přípustné množství histaminu v pivu a vínu 20,0 mg/kg. Přípustné množství tyraminu ve vínu bylo 18

19 (vyhláška č. 298/1997 Sb.) 50,0 mg/kg, v sýrech 200,0 mg/kg a v potravinách všeobecně 100,0 mg/kg (Velíšek, 1999). Dnes udává nejvyšší přípustné množství Nařízením EP a Rady (ES) 2073 O mikrobiologických kritériích pro potraviny (2005), a vyhláška 305/2004. Obě stanovují nejvyšší přípustné množství jen pro histamin, a to u produktů rybolovu z druhů ryb spojovaných s vysokým množstvím histidinu (ryby čeledi Engraulidae, Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatoidae a Scombresosidae) a u produktů rybolovu, které byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku a byly vyrobeny z těchto druhů ryb. U ryb při odběru 9-ti vzorků musí být u sedmi z nich dodržen limit 100 mg/kg, dva vzorky mohou obsahovat 200 mg/kg histaminu. Tyto limity platí pro výše uvedené produkty uvedené na trh během celé doby údržnosti (Cwiková, 2009) 3.2 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů Mikroorganismy pro svůj růst a metabolismus potřebují dostatek přístupných živin, vhodnou aktivitu vody a E h, přístup a nebo nepřístup kyslíku a samozřejmě teplotu a čas. V praxi jsou zavedeny tyto následné faktory: vnitřní faktory jsou charakteristické díky fyzikálním vlastnostem, chemickému složení a některým biologickým znakům dané potraviny, kvalitativní a kvantitativní změny složení mikrobiálních společenstvech mikroorganismů na a nebo v potravině způsobené technologickými procesy jejich opracováním a zpracováním (záhřev, chemikálie, záření apod.). Čím méně mikroorganismů potravina obsahuje na počátku skladování a čím jsou mikroorganismy méně aktivní, tím je při daných vnitřních a vnějších podmínkách potřebný čas delší, aby se potravina senzoricky změnila. vnější faktory jako teplota, vlhkost a parciální tlak kyslíku v prostředí uchovávané potraviny, faktory vzniklé vzájemným synergickým a nebo antagonistickým působením výše uvedených parametrů, které mají na zúčastněné mikroorganismy sekundární vliv (Görner et Valík, 2004) 19

20 3.2.1 Vnitřní vlivy složení potravin aktivita vody, a w koncentrace vodíkových iontů, ph redoxní potenciál, E h textura (tuhost) (Görner et Valík, 2004) Složení potravin Druh a míru změn potravin způsobených biochemickou činností mikroorganismů určují ve významné míře jejich složky. Nízkomolekulární látky se mění velmi rychle, protože mikroorganismy je mohou metabolizovat přímo bez předchozího štěpení. Potraviny s vyšším obsahem nízkomolekulárních složek se proto mění (kazí, fermentují) rychleji než ty, které obsahují převážně polymerní látky. Bílkoviny a vysokomolekulární sacharidy, jako škrob, pektin nebo celulóza se musí mikrobiálními exoenzymy nejprve rozštěpit na nízkomolekulární a až potom endoenzymy metabolizovat (Görner et Valík, 2004). Potraviny s vysokým obsahem bílkovin,což je také mlékoa sýry, se mikrobiálně kazí nebo zrají tím rychleji, čím více nízkomolekulárních látek bílkovin obsahují. Jsou to nízkomolekulární peptidy, aminokyseliny, rozpustné organické dusíkaté látky. Aminokyseliny uvolněné štěpením bílkovin přecházejí přímo do buňky a jsou v ní metabolizované pomocí dekarboxylasy, deaminasy nebo transaminasy. Při intenzivním rozkladu bílkovin vzniká mnoho hnilobných produktů jako sirovodík, amoniak, aminy, organické kyseliny a jiné (Görner et Valík, 2004). Dekarboxylací aminokyselin dekarboxylasami vzniká oxid uhličitý a některé toxické, nepříjemné chuti primární aminy (Görner et Valík, 2004) Aktivita vody, a w Hodnota a w je definovaná jako poměr parciálního tlaku vodních par nad potravinou (p) ku parciálnímu tlaku vodních par nad čistou vodou (p 0 ) při stejné teplotě: a = w p p O 20

21 Čistá voda (p=p 0 ) má proto hodnotu a w =1,0. Optimální hodnota a w je pro většinu mikroorganismů a w >0,98. Při snížení hodnoty a w odnímáním vody (sušením, uzením), přídavkem soli, cukru a také mražením se koncentrace vody využitelné mikroorganismy snižuje a jejich růst je částečně nebo úplně inhibovaný. Mikroorganismy náročné na využitelnou vodu jsou bakterie rodu Pseudomonas a Acinetobacter. Proto se vyskytují v potravinách s vysokým obsahem vody, jako je také mléko. Odolnost vůči nízké aktivitě je všeobecně největší u plísní, menší u kvasinek a ještě menší u bakterií grampozitivních a nejmenší i gramnegativních (Görner et Valík, 2004). Minimální hodnoty a w jsou ovlivněny hodnotami ph, teplotou a nebo parciálním tlakem kyslíku (Görner et Valík, 2004). Voda, která je nezbytnou složkou buněčné hmoty, představuje 75% až 90% hmotnosti mikrobních těl. Veškeré chemické reakce v živé buňce probíhají pouze ve vodném prostředí, a proto voda musí být přítomna v dostatečném množství v kapalném stavu (Šilhánková, 2002). Mikroorganismy potřebují vodu tedy pro svoji látkovou přeměnu (Görner et Valík, 2004). Nedisociované molekuly vody mohou volně difundovat cytoplazmatickou membránou mikroorganismů, proto musí být obsaženo dostatečné množství vody ve vnějším prostředí (Šilhánková, 2002). Snižování obsahu vody v buňce způsobuje zpomalení růstu mikroorganismů. Za nepřítomnosti vody se látková přeměna mikroorganismů zastaví. Citlivé mikroorganismy za těchto podmínek odumírají. Některé složky potravin, jako sůl, cukr, bílkoviny mohou vázat vodu natolik, že ji nemohou mikroorganismy využít pro svůj metabolismus. Úměrně se stoupajícím obsahem těchto látek vážících vodu z prostředí, klesá parciální tlak vodních par nad potravinou. Z této skutečnosti je možné odvodit, že parciální tlak vodních par nad potravinou je úměrný koncentraci vody, která je k dispozici pro metabolické pochody přítomných mikroorganismů (, kterou mohou mikroorganismy využít) (Görner et Valík, 2004) Koncentrace vodíkových iontů, ph Růst mikroorganismů i jejich biochemická činnost jsou silně ovlivněny koncentrací vodíkových iontů v prostředí. Každý mikrobní druh se může rozmnožovat pouze v určitém rozmezí ph. Většina bakterií roste v neutrálním ph nebo slabě alkalickém prostředí. Extrémní ph prostředí přežívají bakterie nacházející se v trávicím traktu, neboť musí překonat nízké ph žaludečních šťáv i alkalické ph žluči. Kyselé prostředí 21

22 také přežívají druhy tvořící kyseliny jako hlavní produkty metabolismu. ph prostředí také ovlivňuje odolnost buněk ke zvýšeným teplotám (Šilhánková, 2002). Při stejné hodnotě ph mají větší inhibiční účinek na růst a metabolismus bakterií slabé organické kyseliny (kyselina mléčná, kyselina octová) než silné disociované kyseliny, např. kyselina chlorovodíková. Inhibiční účinek kyseliny mléčné, octové (všeobecně nižších mastných kyselin) spočívá v okyselení obsahu bakteriální buňky a v inhibici procesů látkové přeměny a transportu živin. Na dosažení určité hodnoty ph je však zapotřebí větší množství slabé organické kyseliny než silné (Görner et Valík, 2004). Minimální hodnota ph pro většinu bakterií (mnohé bakterie z čeledi Enterobacteriaceae, druhy rodu Bacillus a jiné), které se účastní kažení potravin, je 4,4 až 4,6. Odolnost mikroorganismů vůči nízkým hodnotám ph v potravinách závisí i na jiných vlivech, které ji mohou zvyšovat či snižovat. Jde o vliv samotných složek potravin, snížení nebo zvýšení aktivity vody, nepříznivé nebo vyhovující zásobování kyslíkem, vliv procesů přípravy, výroby a skladování potravin (Görner et Valík, 2004). Tepelně neopracované mléko má hodnotu ph mezi 6,5 až 6,7. Patří proto mezi potraviny s mírně kyselou reakcí. Vlivem bakterií mléčného kvašení, které jsou přítomné v nadojeném mléku a pro obsah ne lehko fermentovaného disacharidu laktózy, se při teplotě 28 až 30 C sníží jeho hodnota ph na 4,0 a nižší za 16 až 20h. (Görner et Valík, 2004) Tab. 2 Hodnoty ph u některých mléčných výrobků (Görner et Valík, 2004) Interval ph Potravina Hodnota ph Neutrální ph 7,0-6,5 mléko 6,7-6,5 povrch zrajících sýrů pod mazem 7,0-6,8 Slabě kyselé ph 6,5-5,3 zralé sýry 5,9-5,5 Středně kyselé ph 6,3-4,3 mladé sýry 5,3-4,7 Kyselé ph 4,5-3,7 kysané mléko, jogurt 4,2-3,8 majonézy 4,1-3, Oxidoredukční potenciál, E h Hodnota E h je poměrná a je mírou schopnosti látky odevzdávat elektrony. (Görner et Valík, 2004) 22

23 Každé prostředí vykazuje určitý redukční potenciál, který je dán přítomností oxidačních nebo redukčních činidel (Šilhánková, 2002). Pro tuto hodnotu jsou rozhodující oxidačně-redukční pochody v potravině. Oxidační proces je definovaný odevzdáním elektronů a redukční proces jejich příjmem (Görner et Valík, 2004) Vnější faktory teplota prostředí relativní vlhkost vzduchu, % RV složení atmosféry v obale a ve skladovaném prostředí čas Teplota prostředí Teplota vnějšího prostředí je jedním z hlavních faktorů, které ovlivňují rychlost rozmnožování mikroorganismů i možnost jejich života. U každého mikroorganismu rozeznáváme tři základní body teploty: minimální teplou, tj. nejnižší teplotu, při níž se daný druh rozmnožuje ještě zjistitelnou rychlostí, optimální teplotu, při níž se rozmnožuje největší rychlostí, maximální teplotu, tj. nejvyšší teplotu, při které je chopen se ještě rozmnožovat (Görner et Valík, 2004). Stanovení minimální teploty je poměrně obtížné, neboť s klesající teplotou klesá postupně i rychlost rozmnožování. Teplotní mez úplného zastavení růstu je proto zjistitelná velmi obtížně (Görner et Valík, 2004). Všechny základní teplotní body jsou do určité míry ovlivněny dalšími vnějšími faktory, např. ph a osmotickým tlakem prostředí (Šilhánková, 2002). Podle optimální růstové teploty mikroorganismů se dělí do 4 skupin: psychrofilní, prochrotrofní, mezofilní a termofilní (Görner et Valík, 2004). 23

24 Tab. 3 Teplotní rozmezí pro jednotlivé skupiny mikroorganismů (Görner et Valík, 2004) Teplota [ C] Skupina minimální optimální maximální Psychrofilní bakterie -5 až +5 C 12 až 15 C 15 až 20 C Psychrotrofní bakterie -5 až +5 C 25 až 30 C 30 až 35 C Mezofilní bakterie Termofilní bakterie +5 až 15 C 30 až 40 C 35 až 47 C 40 až 45 C 55 až 75 C 60 až 90 C Teplota hraje důležitou roli během skladování potravin. BA zde slouží jako indikátory stupně kažení potravin: při teplotě 0 C nastanou negativní senzorické změny dříve, než hodnoty obsahu BA dosáhnou toxických dávek, při teplotě 10 C je tomu dříve, něž hodnoty BA dosáhnou toxických dávek (Komprda, 2005) Rozdělení mikroorganismů podle vztahu k teplotě Psychrotrofní mikroorganismy Z hlediska skladovatelnosti potravin při nízkých teplotách (chladírenské teploty blízké 4 C) mají významnou úlohu psychrotrofní bakterie. Ty mají růstové optimum v oblasti mezofilní (25 C až 30 C), ale jsou schopné růstu i při chladírenských teplotách až po 0 C. (Görner et Valík, 2004). Psychrofilní mikroorganismy Psychrofilní mikroorganismy se adaptovaly na nízké teploty, při vyšších nerostou (> 20 C). Kažení potravin se zúčastňují jen zřídka. Příčinou je skutečnost, že v přírodě je jen velmi málo pravých psychrofilních bakterií. Psychrofilní mikroorganismy mají optimální teplotu nižší než 20 C a rostou ještě poměrně intenzivně při teplotě 0 C až 5 C. Do této skupiny patří zejména příslušníci rodů Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium, Enterococcus, Serratia (Šilhánková, 2002). 24

25 Mezofilní mikroorganismy Většina mikroorganismů patří do skupiny mezofilních mikroorganismů(görner et Valík, 2004). Tyto mikroorganismy mají minimální teplotu vyšší než 5 C a optimální teplotu nižší něž 45 C. Představují většinu všech mikroorganismů. U bakterií se optimální teplota pohybuje nejčastěji kolem 37 C (, u kvasinek a plísní kolem 30 C) (Šilhánková, 2002). Do této skupiny řadíme např. mikroorganismy rodu Micrococcus, a bakterie mléčného kvašení. (Görner et Valík, 2004). Termofilní mikroorganismy Mikroorganismy v této skupině mají minimální teplotu růstu 45 C nebo vyšší. Pro většinu z nich je optimální teplota 50 až 60 C, pro některé dokonce ještě vyšší. Řada termofilních mikroorganismů se nerozmnožuje při teplotách 28 až 30 C, dokonce ani při teplotách nižších něž 40 C, kdežto jiné se při teplotách kolem 30 C rozmnožují ještě zjistitelnou rychlostí. (Šilhánková, 2002). 3.3 Významné mikroorganismy podílející se na tvorbě biogenních aminů Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď zahrnuje 44 druhů. Jedná se o G rovné tyčinky, nepohyblivé nebo pohyblivé peritrichálními bičíky, netvoří endospory ani cysty. Jsou fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní, mají respiratorní i fermentatorní typ metabolismu. Většina druhů roste dobře při 37 C, některé druhy rostou lépe při nižších teplotě (a jsou při této nižší teplotě i více metaboliticky aktivní), generační doba je velice krátká. Okyselují glukosu (někdy s produkcí plynu) i řadu jiných cukrů a cukerných alkoholů, většinou oxidasa negativní (výjimkou je rod Plesiomonas) a většinou i katalasa pozitivní, převážně také redukují nitráty (Sedláček, 2007). Nacházejí se v půdě, vodě, ovoci, zelenině, rostlinách. Mnoho druhů primárně napadá intestinální trakt a způsobuje průjmová onemocnění (Sedláček, 2007). Na vzniku BA se podílejí tyto rody: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Leclercia, Morganella, Pantoea, Plesiomonas, Proteus, Serratia, způsobují kažení potravin (Sedláček, 2007). 25

26 Rod Citrobacter G tyčinky, vyskytující se jednotlivě nebo po dvou. Obvykle jsou pohyblivé, fakultativně anaerobní, optimální růstová teplota je 37 C. Okyselují glukosu a další sacharidy i s tvorbou plynu. Nedekarboxylují lysin, acetoin negativní, řada druhů H 2 S pozitivní. Zástupce: Citrobacter freundii Rod Enterobacter G tyčinky, pohyblivé většinou peritrichálními bičíky, fakultativně anaerobní. Optimální teplota je 30 až 37 C. Neprodukují H 2 S, DNasu ani lipasu. Zástupci: E. cloaceae, E. aerogenes, E. sakazakii (Sedláček, 2007) Rod Hafnia G tyčinky, pohyblivé většinou peritrichálními bičíky, vyskytují se i nepohyblivé, fakultativně anaerobní. Optimální teplota je 30 až 37 C. Jsou oportunně patogenní pro člověka. Zástupce: H. alvei (Sedláček, 2007) Rod Klebsiella G tyčinky, vyskytují se jednotlivě nebo po dvou nebo v krátkých řetízcích, buňky jsou opouzdřené a nepohyblivé. Optimální teplota pro růst je 37 C, nerostou při 10 C. K růstu nevyžadují žádné speciální růstové faktory. Jsou acetoin pozitivní, obvykle dekarboxylují lysin, ale ne ornitin, některé druhy hydrolyzují močovinu. Většina zástupců využívá citrát a glukosu jako výhradní zdroj uhlíku, ale nevyužívá L-sorbosu. Jsou oportunně patogenní. Zástupci: K. pneumoniae ssp. pneumoniae, K. pneumoniae ssp. ozeanae, K. oxytoca (Sedláček, 2007) Rod Leclercia G tyčinky, pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků, optimální teplota je 37 C. Jsou indol a ornitin dekarboxylasa pozitivní, negativní arginin. Zástupce: L. adecarboxylata (Sedláček, 2007) 26

27 Rod Marganella G tyčinky, pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků, fakultativně anaerobní, optimální teplota je 37 C. Indol, ureáza a fenylalanin pozitivní, neprodukující H 2 S. Je to oportunní původce druhotných infekcí. Zástupce: M. morganii ssp. morganii (Sedláček, 2007) Rod Pantoea G tyčinky, pohyblivé většinou peritrichálními bičíky, většinou produkující žlutý pigment. Optimální růstová teplota je 30 C. Netvoří plyn, indol negativní. Oportunní patogen člověka, některé jsou fytopatogenní. Zástupce: P. aglomerans (Sedláček, 2007) Rod Plesiomonas G tyčinky, pohyblivé pomocí polárních bičíků, optimální teplota je 37 C, netvoří plyn, oxidasa i katalasa pozitivní, produkují indol, dekarboxylují lysin a ornitin. U člověka způsobuje průjmová onemocnění a příležitostně oportunní infekce. Rod obsahuje pouze jeden druh: P. schigeloides (Sedláček, 2007) Rod Proteus G tyčinky, pohyblivé většinou peritrichálními bičíky, optimální teplota pro růst je 37 C, oxidativně deaminují fenylalanin a tryptofan, hydrolyzují močovinu, většinou produkují H 2 S. Jsou patogenní pro člověka. Zástupci: P. vulgaris, P. mirabilis (Sedláček, 2007) Rod Serratia G tyčinky, pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků, optimální teplota je 30 až 37 C, některé druhy tvoří červený pigment. Jsou arginin a ureasa negativní, většinou hydrolyzují DNA. S. marcescens je významný oportunní patogen. Způsobují mastitidy u krav a různé infekce zvířat. Zástupce: S. marcescens (Sedláček, 2007) 27

28 3.3.2 Čeleď Staphylococcaceae Jedná se o novou čeleď navrženou v roce 2001 na základě srovnání genetické informace grampozitivních koků. V současnosti je v této čeledi 5 rodů a jsou to bakterie vyskytující se jak v prostředí, tak i v klinickém materiálu. Rody: Staphylococcus, Gemella, Jeotgalicoccus, Macrococcus a Salinococcus (Sedláček, 2007) Rod Staphylococcus Jedná se o G + koky, nepohyblivé, nesporolující, fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní, metabolismus jak respirativní, tak i fermentatorní. Kolonie jsou obvykle neprůhledné a mohou být bílé nebo krémové, někdy žluté až žlutooranžové. Katalasa pozitivní a oxidasa negativní, nitráty jsou redukovány na nitrity. Rostou v přítomnosti 10 % NaCl. Optimální růstová teplota je 30 až 37 C. Patří mezi všudypřítomné bakterie. Některé druhy jsou oportunně patogenní až patogenní pro člověka i zvířata nebo produkují extracelulární toxiny, případně jsou patogenní jen pro zvířata. Z potravinářského hlediska jsou významné dva druhy koagulasa negativních stafylokoků S. carnosus a S. xylosus. Tyto mikroorganismy jsou součástí startovacích kultur pro výrobu fermentovaných masných výrobků (Sedláček, 2007) Čeleď Micrococcaceae G + koky i pravidelné nesporulující tyčinky, katalasa pozitivní, aerobní, chemoorganotrofní s respirativním metabolismem. Řadíme do této čeledí rody: Arthrococcus, Citrococcus, Kocuria, Micrococcus, Nesterenkovia, Ranibacterium, Rothia. (Sedláček, 2007) Rod Micrococcus Nepohyblivé koky, mohou produkovat karotenoidní pigmenty (žlutý, světle oranžový). Katalasa a oxidasa pozitivní, mírně halotolerantí rostou při 5 % NaCl, rezistentní k lysostafinu. Jsou mezofilní, optimální růstová teplota 25 až 35 C. Obecně jsou považovány za nepatogenní. Zástupce: M. luteus, M. lylae (Sedláček, 2007) 28

29 Rod Kocuria Katalasa pozitivní, mezofilní, rostou v rozmezí teplot 22 až 37 C. Kolonie jsou růžové či žluté, exopigmenty neprodukují. Charakteristický zástupce je Kocuria rosea (Sedláček, 2007) Bakterie mléčného kvašení Do této skupiny řadíme 13 rodů G + bakterií: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera. Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella (Jay et al., 2005) a podle Görnera et Valíka, (2004) k této skupině řadíme také bakterie rodu Bifidobacterium. Pravé bakterie mléčného kvašení tvoří velkou přirozenou skupinu nepohyblivých, nesporulujících grampozitivních koků a tyčinek, které fermentují sacharidy za fakultativně anaerobních (mikroaerofilních) podmínek a tvoří přitom hlavně kyselinu mléčnou. Bakterie mléčného kvašení se vyskytují nejen v mléce a fermentovaných mléčných produktech, ale i ve střevech lidí a zvířat a na jejich sliznicích (Görner et Valík, 2004). Bakterie mléčného kvašení jsou důležitou složkou společenstvech technologicky významných mikroorganismů, které se používají jako výrobní prostředky při fermentačních procesech v technologii kysaných a kvašených potravin a pochutin živočišného a rostlinného původu (čisté bakteriální kultury, zákysy, startéry). Zde splňují svoji hlavní úlohu, požadované kysání příslušných potravin, tj. fermentaci sacharidů na kyselinu mléčnou a octovou, a vedlejší metabolity přispívají k tvorbě typické chuti a arómatu příslušného fermentovaného výrobku. Bakterie mléčného kvašení nemají výrazné proteolytické a lipolytické vlastnosti, ale přesto ve svém metabolismu tvoří také z bílkovin štěpné produkty, peptidy a aminokyseliny, které slouží jako živiny náročným bakteriím mléčného kvašení jako lehko využitelný zdroj dusíku (Görner et Valík, 2004). Bakterie mléčného kvašení stále soutěží s ostatními skupinami bakterií vyskytujících se v potravinách. Jejich fermentační metabolismus produkuje látky a vytváří takové podmínky, které jsou pro jiné (obyčejně nežádoucí) bakterie zpravidla škodlivé. Konzervační vlastnosti bakterií mléčného kvašení a jejich fermentačních produktů se využívají pro prodloužení trvanlivosti potravin živočišného i rostlinného původu. 29

30 Hlavním produktem je kyselina. mléčná. Dalším významným selekčním faktorem bakterií mléčného kvašení je rychlá změna ph prostředí na hodnoty ph 4 a nižší. Mnohé nežádoucí bakterie nesnášejí takto nízké hodnoty ph, ani kyselinu mléčnou nebo octovou, která se může vytvořit za anaerobních podmínek z kyseliny mléčné. Některé kmeny Lactococcuc lactis produkují bakteriocin nizin a jiné přesně necharakterizované bakteriociny. Selekčním faktorem produktů kyseliny mléčné je také jimi tvořený nízký redox potenciál E h (Görner et Valík, 2004). Bakterie mléčného kvašení fermentují sacharidy v závislosti na jejich druhu a rodu a podle různých metabolických drah, které jsou: a) homofermentativní: z metabolitů tvoří kyselinu mléčnou, min. 90%, b) heterofermentativní: z metabolitů tvoří kyselinu mléčnou, min. 50% (Görner et Valík, 2004) Čeleď Leuconostocaceae Jedná se o G + nepohyblivé a nesporulující koky i tyčinky, fakultativně anaerobní, katalasa a oxidasa negativní, chemoorganotrofní. Tato čeleď zahrnuje 3 rody bakterií mléčného kvašení: Leuconostoc, Oenococcus a Weissella. (Dva poslední rody vznikly vydělením z leukonostoků) (Sedláček, 2007). Rod Leuconostoc Buňky jsou kulovité v párech a v řetízcích, nejsou proteolytické, nehomolyzují, neredukují dusičnan ani dusitan. Optimální teploty jsou v rozmezí 20 až 30 C, některé rostou i při 5 C. Pro svůj růst potřebují aminokyseliny a vitaminy skupiny B. Růst je podmíněn přítomností fermentovatelného sacharidu, růst je ovšem pomalý. Tvoří kyselinu mléčnou, CO 2 a ethanol. Některé druhy snášejí v prostředí vysoké hodnoty sacharosy (55 až 60%). Některé kmeny leukonostoků tvoří dextranový sliz a mají tudíž ve své buněčné stěně obsažen enzym dextran-sacharasu. L. mesenteroides ssp. cremoris netvoří sliz ze sacharosy. Používá se jako složka do smetanových kultur. L. mesenteroides ssp. dextracium se používá jako složka smetanového zákysu pro produkci aromatické látky diacetylu. Tvoří sliz. 30

31 L. lactis fermentuje rychleji laktózu než jiné druhy, okyseluje a sráží i neobohacené mléko. Je termorezistentnější než ostatní druhy, snáší záhřev 60 C po 30 min (Görner et Valík, 2004). Rod Oenococcus Koky vyskytující se obvykle po dvou a v řetízcích, acidofilní, rostou při ph 3,5 až 4,8, v přítomnosti 10 % ethanolu, optimální růstová teplota je 22 C. Zástupce: pouze jediný druh: O. oeni (Sedláček, 2007). Rod Weissella Krátké tyčinky, vyskytují se jednotlivě, po dvou nebo v krátkých řetízcích, acidodurické (schopné přežívat za kyselých podmínek), rostou při 15 C, při 45 C už ne. Zástupce: W. viridescens (Sedláček, 2007) Čeleď Streptococcaceae G + koky, ovoidního nebo kulovitého tvaru, nepohyblivé a netvoří endospory. Jsou chemoorganotrofní, metabolismus je fermentatorní, z cukrů tvoří kyselinu. mléčnou, octovou, ethanol a CO 2. Fakultativně anaerobní, katalasa negativní, mohou být nutričně náročné a vyžadují komplexní médium. Jsou patogenní, saprofytické i biotechnologicky využívané druhy (Sedláček, 2007). Rod Streptococcus Pokud rostou v tekutém médiu, jsou uspořádané v párech, krátkých nebo delších řetízcích. Optimální teplota pro růst je okolo 37 C a nižší, s vyjímkou termofilního druhu Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Z potravinářského hlediska je významná přítomnost saprofytických streptokoků ( rod Lactococcus a rod Enterococcus Streptococcus salivarius ssp. thermophilus) v mléku a mléčných produktech, na rostlinách a plodech, v půdě a ve fekálně kontaminované vodě (enterokoky). Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou, ale netvoří významné množství plynu. S jejich fermentací souvisí rychlý pokles ph až na inhibiční teploty. Některé druhy fermentují i organické kyseliny a aminokyseliny. Neredukují dusičnan a dusitan (Görner et Valík, 2004). 31

32 Podle staršího pojetí se dělí do šesti skupin: pyogenní S. agalactiae, S. cannis, S. pyogenes, orální S. oralis, S. pneumoni, S. salivarius, ostatní S. bovis, S. sacharolyticus, S. thermophilus, anaerobní Peptostreptococcus parvulus enterokoky E. casseliflavus, E. faecalis, E. fecium, mléčné streptokoky Lactococcus lactis ssp. lacstis, L. lasctis ssp. cremoris, (Görner et Valík, 2004) Poslední dvě skupiny jsou dnes vyčleněny do samostatných rodů. Rod Lactococcus Významní zástupci jsou: L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae L. rafinolactis, L. garvieae, L. plantarum. L. lactis ssp. lactis je v mlékárenství snad nejrozšířenější mikroorganismus. V čerstvém, za hygienických podmínek nadojeném mléce se velmi dobře rozmnožuje a působí kysnutí. Je to neodmyslitelná součást používaných čistých mlékařských kultur na výrobu některých kysaných mlék, zakysaných smetan a na výrobu všech druhů sýrů jako jediná kultura a nebo spolu se specifickou kulturou mikroorganismů. L. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis má podobné vlastnosti jako L. lactis ssp. lactis, s vyjímkou tvorby většího množství těkavých látek. Liší se dvěma znaky: za přítomnosti fruktosy vytváří hlavně CO 2 a kyselinu octovou a štěpí kyselinu citrónovou, přičemž se ve značné míře tvoří acetoin. Bývá obsažen v mezofilních čistých mlékařských kulturách, ve kterých se požaduje tvorba aroma (diacetylu) a tvorba CO 2 není chybou. L. lactis ssp. cremoris (smetanový streptokok) má některé charakteristické vlastnosti, kterými se liší od L. lactis ssp. lactis: má nižší optimální teplotu a to kolem 28 C, některé kmeny přežívají 30 min při 60 C, tvoří měřitelné množství CO 2 (jeho tvorba je ovšem proměnlivá) a asi 0,7 % kyseliny mléčné. Tvorba dlouhých řetízků je ale charakteristická jen pro čerstvé kultury pěstované v mléce. U starších kultur se řetízky rozpadají v páry. Některé kmeny tvoří sliz. Je typickým smetanovým, mléčným laktokokem, není však univerzální sýrařský mikroorganismus. Využívá se v mlékařské technologické mikrobiologii jako jedna ze složek mezofilních zákysů. Používá se také 32

33 v norském zakysaném mléce tättemjölk, které se vyznačuje slizovitostí a tahovitostí a tvorbou dlouhých řetízků (Görner et Valík, 2004) Čeleď Enterococcaceae Jsou to G + koky i krátké tyčinky, patřící mezi bakterie mléčného kvašení. Čeleď zahrnuje 5 rodů Atopobacter, Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus a Vagococcus (Sedláček, 2007). Rod Enterococcus Jedná se o velmi odolné bakterie vůči nepříznivým vlivům prostředí, proto jsou rozšířené i v přírodě. Intenzivně fermentují sacharidy podobně jako jiné bakterie mléčného kvašení, a někdy se zúčastní tvorby arómatu a chutnosti potravin. Konečná hodnota ph v glukosovém bujonu je 4,6 až 4,2, příležitostně i nižší. Neredukují dusičnan ani dusitan, nerozkládají celulózu, pektin ani tuky. Významnou proteolýzu vykazuje pouze druh E. faecalis. Připisuje se jim také toxigenita, tvorba BA a to zejména u proteolytických druhů, kde se předpokládá dekarboxylace aminů. Využívají se v mikrobiologii pitné vody jako indikátory recentního fekálního znečištění. Různorodost jejich významu a působení se odůvodňuje vztahem mezi mikroorganismem a jeho vlastnostmi na straně jedné a prostředím, tedy potravinami a vodou a jejich vlastnostmi na straně druhé. Jsou běžnou mikroflórou pasterovaného mléka, neboť jsou termorezistentní a některé kmeny přežívají předepsané pasterizační teploty. Obsah enterokoků se sleduje zejména u sušeného mléka, mohou totiž díky své odolnosti přežívat v sušícím zařízení. Pro odlišení od pravých mléčných streptokoků se používají tzv. Shermenova kritéria, poukazující na jejich vysokou fyziologickou toleranci: růst v bujonu s obsahem soli 6,5 % NaCl, při ph 9,6, 40 % žluči, při teplotě 10 C a 45 C a přežití teploty 60 C po dobu 30 min. Z potravinářského hlediska je z těchto kritérií důležitá zejména značná odolnost některých druhů (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis a E. durans) vůči zvýšené koncentraci soli v potravinách a tím i nízké hodnotě a w, a skutečnost, že mohou přežívat nižší pasterizační a termizační teploty (Görner et Valík, 2004). Enterococcus faecium a Enterococcus faecalis jsou schopné produkovat enzym tyrozindekarboxylasu, v důsledku toho vzniká tyramin (Greifová et al, 2003). 33

34 3.3.7 Čeleď Lactobacillaceae Čeleď G + fakultativně anaerobních, nesporulujících bakterií mléčného kvašení, pravidelné tyčinky nebo koky, nepigmentující, mezofilní, chemoorganotrofní. Obsahuje rody Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus (Sedláček, 2007). Rod Lactobacillus Tento rod zahrnuje tyčinkovité bakterie mléčného kvašení. Jejich hlavním metabolitem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, octová, ethanol a CO 2. Pro svůj růst potřebují dostatek fermentovatelných sacharidů, štěpných produktů bílkovin, nukleových kyselin a vitaminů skupiny B. Upřednostňují mezofilní a mírné termofilní teploty. Jsou acidotolerantní až acidofilní. Při fermentaci sacharidů snižují kyselost prostředí až pod ph 4,0. Jedná se o saprofyty, velmi zřídka jsou patogenní. Nacházejí se ve fermentovatelných rostlinných a živočišných materiálech, méně v trávicím a zažívacím traktu lidí a zvířat. Do mléka se dostávají z prostředí, mléko samo o sobě laktobacily neobsahuje. V nativní kyselé syrovátce se rozmnoží nejprve kyselinotolerantnější L. helveticus, který v ní vytvoří až 3 % kyseliny mléčné. Tento mikrob je stálou složkou tzv. ementálského zákysu ( termofilní zákys) pro výrobu tvrdých sýrů. Dnes se při výrobě sýrů používají i kultury L. delbrueckii ssp. bulgaricus nebo L. delbrueckii ssp. lactis. Ve všech druzích a typech sýrů, které zrají déle než 14 dní, se rozmnožují různé mezofilní laktobacily ( L. plantarum, L. brevis, L. casei a jiné). Na mléko velmi specificky adaptovaný laktobacilus je L. delbrueckii ssp. bulgaricus, který je vedle Streptococcus salivarius ssp. thermophilus složkou mikrobiální kultury pro výrobu kysaného jogurtu L. kefír je heterofermentativní složkou původně kavkazského kysaného nápoje kefír. Tyto dva druhy kysaných mlék jsou jediným známým původním stanovištěm těchto laktobacilů. Laktobacily se dělí do třech skupin: I. skupina - Obligátně homofermentativní Hexosy fermentují výhradně na kyselinu mléčnou (> 90 %), pentosy a glukonáty nefermentují. Do této skupiny patří: L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. lactis, L. helveticus, L. acidophilus, L. salivarius, L. farciminis, L. yamanashiensis. 34

35 II. skupina - Fakultativně heterofermentativní Hexosy fermentují výhradně na kyselinu mléčnou nebo při nedostatku glukosy některé druhy produkují kyselinu octovou, mravenčí a ethanol. Pentosy fermentují pomocí indukovatelné fosfoketolasy. Tato skupina zahrnuje: L. alimentarius (roste při 10 % NaCl, tvoří acetoin), L. sake ( syn. L. sakei), L. casei ssp. casei, L. casei ssp. pseudoplantarum, L. casei ssp. rhamnosus, L. casei ssp. tolerans (přežívá pasteraci 72 C, 40 s), L. curvatus, L. maltaromaticus, L. plantarum. III. skupina - Obligátně heterofermentativní Hexosy fermentují na kyselin. mléčnou, octovou, ethanol a CO 2, pentosy na kyselinu mléčnou a octovou. Do této skupiny patří také: L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. confusus (nově Weisela confusa), L. divergens (nově Carnobacterium divergens), L. kandleri, L. kefir, L. sanfrancisciensis (syn. L. sanfrancisco), L. viridiscens (nově Weisella viridiscens) (Görner et Valík, 2004). Některé aminokyseliny jako glutamová a tyrozin jsou laktobacily dekarboxylované za vzniku aminů, které nejsou dále metabolizovatelné. Některé druhy a kmeny laktobacilů produkují baktericiny. Jsou citlivé na většinu antibiotik působící na G + bakterie. L. delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus se využívají na zjištění přítomnosti inhibičních látek, antibiotik v mléce (Görner et Valík, 2004). Rod Pediococcus Kulovité bakterie, často se nacházejí v párech, všechny druhy rostou při 30 C. Jejich hlavním metabolitem je při fermentaci sacharidů je pravotočivá kyselina mléčná. Některé figurují jako škůdci, některé jsou součástí fermentační mikroflóry. Příležitostně se společně s jinými bakteriemi zúčastňují kažení majonéz (Görner et Valík, 2004) Rod Bifidobacterium Nepravidelné, G + tyčinky, zpravidla striktně anaerobní a katalasa negativní, nesporolují, nepohyblivé a nesnášejí velmi kyselé prostředí. Některé druhy tolerují určitou přítomnost O 2 v prostředí, ale jen za přítomnosti CO 2 a nebo bifidogenních 35

36 faktorů. Optimální teplota pro růst je 37 až 41 C, optimální hodnota ph je 6,5 až 7,0. Ve svém sacharolytickém metabolismu produkují z hexózy kyselinu octovou a L(+)-kyselinu mléčnou. CO 2 netvoří. Jako vedlejší metabolity tvoří velké množství kyseliny mravenčí, ethanolu a kyseliny jantarové. Některé kmeny vykazují v mléce proteolytickou aktivitu. Z fermentovaných sacharidů produkují kyselinu octovou a mléčnou, které inhibují nežádoucí bakterie a stimulují intestiální peristaltiku. Růst bifidobakterií podporují tzv. bifidogenní faktory: laktulosa, N-acetyl-D-glukosamin obsahující sacharidy, transgalaktozylované oligosacharidy a další. Tyto látky spolu s obsahovými látkami a vlastnostmi mateřského mléka stimulují růst bifidobakterií ve střevech. Z těchto důvodů se pro výživu lidí a dojnic vyrábějí kysané mléčné výrobky s obsahem bifidobakterií a to i výživové preparáty podporující jejich růst (Görner et Valík, 2004). 3.4 Mikrobiální kultury Mikrobiální kultury jsou definované a rozmnožování schopné mikroorganismy v jednotlivých nebo smíšených kulturách, a rozdělené podle svých specifických vlastností. Přidávají se do potravin, surovin a nebo do zemědělských produktů za účelem vyrobit nebo alespoň zlepšit (změnit) jejich vzhled, vůni, chuť, konzistenci, trvanlivost a jejich konzumovatelnost (Görner et Valík, 2004). Zvyšují také výrobní jistotu, snižují rozmezí kolísání charakteristických vlastností příslušných potravin a urychlují procesy látkové výměny. Hlavní předností fermentovaných potravin vyrobených s cíleným použitím čistých mikrobiálních kultur je standardnost, výborné organoleptické vlastnosti a lepší trvanlivost (Dědek et al., 1984). Výrobci kultur je dělí na monokultury, složené kultury (více definovaných kmenů a druhů) a směsné (nedefinované kmeny jednoho a nebo i více druhů mikroorganismů). Obyčejně se kombinují nejméně 2 druhy příbuzných mikroorganismů, které jsou ve vzájemném symbiotickém vztahu. Jednotlivé druhy mají typické vlastnosti a tedy i svoji úlohu v příslušné technologické operaci a při tvorbě kvalitativních vlastností produktů vyráběných s jejich pomocí. Jednotlivé kmeny určitého druhy jsou při moderní výrobě mikrobiálních kultur separovaně množené, koncentrované, sušené a až potom v určitých kvantitativních poměrech stejného nebo odlišného druhu kombinované a míchané. Libovolnou kombinací jednotlivých definovaných kmenů je 36

37 možné připravit optimální složení mikrobiálních kultur pro požadované technologické procesy a operace (Görner et Valík, 2004). Podle vnějších vlastností a způsobu používání se mikrobiální kultury dělí na: tekuté, sušené výmrazem a mrazené. Ty mohou mít podobnou koncentraci buněk jako původní mikrobiální kultury, nebo zvýšenou (odstřeďováním, ultrafiltrací), což jsou koncentráty kultur. (Görner et Valík, 2004) V mlékařském průmyslu se využívají mikrobiální kultury při výrobě: kysaných mléčných výrobků (kysané mléko, acidofilní mléko, probiotická mléka, kefír, jogurty, kysaná smetana a jiné), sýrů a tvarohů (zrajících převážně anaerobně a aerobně za pomoci bakterií mléčného kvašení, propionových bakterií, proteolytických bakterií, plísní a kvasinek), másla z kysané smetany (bakterie mléčného kvašení, kvasinky) (Görner et Valík, 2004). 37

38 Tab.4 Aplikace čistých mlékařských kultur v mléčných výrobcích (Dědek et al., 1984 ) Mikroorganismus Výrobek Používaný mikroorganismus Bakterie mléčného kvašení tvrdé lisované sýry 1, 2, 3, 4, 5 (čedar, cheshire, gouda, eidam) Mezofilní 1. Streptococcus lactis polotvrdé sýry (lancashire) 1, 2, 3, 4 2. S. lactis subsp. diacetylactis měkké sýry (tvaroh, feta, cottage, smetanový) 1, 2, 3, 4 3. S. cremoris 4. Leuconostoc cremoris Termofilní 5. S. feacium sýry s plísní na povrchu 1, 2, 3, 4, 13, 14, 15 (camembert, de Brie) 6. S. thermophilus sýry s plísní v těstě 1, 2, 3, 4, 16 (rokfór, stilton, gorgonzola) 7. Lactobacillus bulgaricus 8. Lactobacillus lactis 9. Lactobacillus helveticus 10. Lactobacillus casei vysokodohřívané sýry 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 (parmezán, romano grana) 11.Lactobacillus acidophilus vysokodohřívané sýry 6, 7, 8, 9, 22 ( ementál, gruyér) 12. Lactobacillus plantarum Plísně a kvasinky sýry s mazem na povrchu 13. Penicillium camemberti (limburský) 1, 2, 3, Penicillium caseicolum zakysaná smetana, máslo ze zakysané 2, 3, 4 smetany, zakysané podmáslí 15. Penicilium candidum jogurt 6, Penicilium roqueforti dietní jogurt, 6, 7, 11, 21 kefír kumys 1,6, 7, 18, 17. Saccharomyces kefir ymer 1, 2, 3, Saccharomyces lactis yakult 10 Candida kefir 19. Torulopsis kefir filmjolk, laktofil graddfil 1, 2, 3, 4 1, 4, 7, 10, 11, 17, 18, 19 38

39 Ostatní mikroorganismy 20. Brevibacterium linens 21. Bifidobacterium bifidum 22.Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 3.5 Výskyt biogenních aminů v potravinách BA se vyskytují prakticky ve všech potravinách jako běžné produkty metabolismu. Ve vyšším množství se nachází ve fermentovaných výrobcích sýrech, kde vznikají mikrobiální činností. Vysoké koncentrace BA se vyskytují u potravin v pokročilém stupni kažení. Při zrání sýrů dochází k výrazné tvorbě BA jen v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry jen poměrně malá množství BA(Velíšek,1999). Tab 5 Obsah hlavních biogenních aminů v sýrech (upraveno) (Velíšek, 1999) Potravina Obsah v mg/kg (nebo v mg/dm 3 ) Him Cad Put Pea Tyr Try sýry Cheddar Emmental s Gouda Eidam 0-88 s s s-320 Roquefort s s=stopy 39

40 3.5.1 Výskyt biogenních aminů v nefermentovaných mléčných výrobcích Koncentrace BA v mléce je nepatrná (Greifová et al., 2003), v nekontaminovaném mléce obsah BA nepřesahuje 1 mg/kg (Standarová et al., 2007). V čerstvém mléce, mléčných nápojích a výrobcích, které nejsou fermentované, se nacházejí aminy (propylamin, hexylamin, alifatické di- a polyaminy, histamin a tyramin) v malém množství (méně než 1mg/kg). Obsah histaminu v mléce okolo 0,5-0,8 mg/kg. V sušeném mléce koncentrace histaminu 131 mg/kg a tyraminu 42 mg/kg. Kromě toho je možný výskyt také putrescinu, kadaverinu, sperminu a spermidinu (Greifová et al., 2003) Výskyt biogenních aminů ve fermentovaných výrobcích Obsah biogenních aminů v sýrech Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu BA, které vznikají převážně dekarboxylací volných aminokyselin za působení bakteriálních dekarboxylas. Dekarboxylasy aminokyselin se u bakterií příliš nevyskytují, ale schopnost tvořit BA byla popsána pro některé mikroorganismy zejména čeledi Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. a pro bakterie mléčného kvašení (Standarová et al., 2008). Koncentrace volných aminokyselin v původní surovině i v sýru, jsou tak nízké, že působením dekarboxylas by vzniklo netoxické množství BA. Působením proteas a peptidas přítomných v sýru dochází k proteolýze kaseinu a tvorbě volných aminokyselin a následně BA, přičemž každý typ sýra má charakteristický profil aminokyselin a BA, který vyplývá ze specifické degradace a syntézy (Standarová et al., 2008). Podmínkou vzniku toxického množství aminů v sýrech je proteolýza, která je při zrání sýru považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňující kvalitu sýra. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteasy mléka, proteasy kysacích kultur, syřidlové enzymy, proteasy kontaminující mikroflóry ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lasctis, Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus, Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium). Startovací kultury používané při výrobě sýrů při zvýšeném stupni proteolýzy přispívají také k tvorbě BA (Greifová et al., 2003). Častější příčinou výskytu BA v sýrech je sekundární kontaminace mikroorganismů z přidávané startovací kultury. Sýry se srovnatelným mikrobiologickým profilem se 40

41 mohou významně lišit v obsahu BA. Dokonce i různé kmeny jednoho druhu se mohou lišit v produkci BA až o několik řádů. Je proto obtížné najít přesné korelace mezi obsahy BA a počty mikroorganismů (Standarová et al.,2007). K nejdůležitějším faktorům ovlivňujícím obsah BA v sýrech patří hygienické podmínky získávání výchozích surovin, teplota syřidla, startovací kultura, proteolytická činidla, ph, vodní aktivita, obsah soli, obsah tuku, teplota zrání, doba skladování, zrání. Nižší obsahy BA proto mají sýry holandského typu, vyšší sýry poloměkké, švýcarského typu a plísňové. Výrazně vyšší obsahy mají sýry vyrobené z nepasterovaného mléka ( Schneller et al., 1997). Vhodným výběrem startovacích kultur v sýrařské technologii je možné významně snížit koncentraci histaminu, ale i kadaverinu a putrescinu. Nizin produkovaný Lactococcus lactis a Enterococcin EFS 2 a enterocin 4 produkovaný Enterococcus faecalis, výrazně inhibuje růst mikroorganismů produkující histamin v sýrech, jehož producentem je především Lactobacillus buchneri a Lactobacillus brevis (Greifová et al., 2003). Sýry obvykle obsahují jednotky až stovky mg/kg histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, jednotky až desítky mg/kg 2-fenylethylaminu a velmi malá množství tryptaminu. Obsahy BA však mohou výjimečně dosáhnout až gramových množství v 1 kg sýra, což závisí na ošetření výchozí suroviny a technologických faktorech. Výrazně vyšší množství BA bylo zjištěno u sýrů z nepasterovaného mléka (Standarová et al., 2008). Vyšší obsah BA byl také zjištěn v kulatých sýrech ve srovnání s pravoúhlými a také u sýrů zrajících pod fólií než při zrání pod kůrou (3500, resp mg/kg). Pravděpodobnou příčinou je rozdílná aktivita vody v povrchových vrstvách sýra (Komprda, 2005). Nejvyšší obsahy BA jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvarůžky, romadúr) a v sýrech poloměkkých a plísňových. Další skupinou jsou sýry vyráběné z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek (např. brynza). Ve tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny BA nižší (Kalač et Křížek, 2005). Nejnižší koncentrace BA byla zjištěna v eidamských sýrech (58 mg/kg) střední v sýru Romadúr (937 mg/kg), nejvyšší ve vyzrálých sýrech ementálského typu (1820 mg/kg). Obsah BA v tvrdých sýrech je všeobecně nižší než v tavených sýrech. Během skladování obsah BA stoupá, až nakonec (např. u ovčího sýra po 220 dnech) klesá, příp. vymizí. Skladováním při zvýšené teplotě obsah BA roste (při 4 C a 20 C bylo zjištěno 200 a 300 mg/kg histaminu a tyraminu). Proti vzniku BA působí nizin resp. enterocin 4, 41

42 pokud je některými bakteriemi produkován (Lactococcus lactis a Enterococcin EFS 2. resp. Enterococcus faecalis) (Suková, 2006). Jak uvádí Greifová et al. (2003), změnu obsahu BA u ovčího sýra Pecorino pugliese v průběhu skladovaní sledovali Celano, Cafarchia a Tiecco. Putrescin, histamin a tyramin, které byly na počátku skladování ve stopových množstvích, rychle zvyšovaly svoji koncentraci po šedesátém dni skladování. Tento nárůst pokračoval do stodvacátého dne, kdy obsah aminů začal klesat. Po dvěstědvaceti dnech skladování nebyly tyto aminy zaznamenány a nebo se vyskytovaly jen ve stopových koncentracích. Vyjímkou byl kadaverin, který byl přítomný od začátku skladování a maximální koncentrace dosáhl ve čtyřicátém dni. Potom následovala fáze rychlého poklesu až do vymizení ve dvěstědvacátém dni skladování. Vliv teploty během skladování byl sledován u sýrů Talegio a Gorgonzola. Při skladování sýrů při teplotě 4 C došlo k nárůstu koncentrace histaminu a tyraminu na 200 mg/kg. Skladování sýrů při teplotě 20 C zvyšuje obsah tyraminu až nad hranici 300 mg/kg, obsah histaminu je nad 100 mg/kg (Greifová et al., 2003). Fyziologické inaktivace BA lze dosáhnout použitím mikroorganismů, které mají aminooxidasovou aktivitu, patří sem např. Bravibacteruim linens, který snižuje množství tyraminu a histaminu během celé doby zrání sýra (Greif et Greifová, 2006). Vyšší koncentrace NaCl může přispět ke snížení schopnosti mikroorganismů produkovat histamin. Při koncentraci 3,5 % je částečně inhibována schopnost Lactobacillus buchneri (vyskytuje se jako kontaminant sýrů) tvořit histamin a při koncentraci 5 % se tvorba histaminu zastavuje (Greifová et al., 2003). Pro destrukci mléčných proteas a inaktivaci proteolytických bakterií je účinný tepelný záhřev (75-85 C), který má za následek snížení obsahu volných aminokyselin a tím i koncentrace BA (Greifová et al., 2003). Sýry Gouda a Maasdam vyrobené z pasterovaného mléka použitím komerčně dostupných startovacích kultur obsahovaly zanedbatelný obsah BA i po jednom roce skladování. V jiném pokusu zkoumal vliv jiných bakterií na tvorbu BA. Přítomnost gramnegativních mikroorganismů v mléce vedla ke tvorbě BA v sýru, i když byl vyroben z důkladně pasterovaného mléka a byly dodrženy základní hygienické požadavky. Jejich přítomnost zapříčinila vzrůst hlavně kadaverinu a putrescinu. Enterokoky byly zodpovědné za tvorbu tyraminu a fenyletylaminu. Pediokoky nebyly schopny způsobit tvorbu aminů v sýru. Vzrůst koncentrace bakterií rodu Bacterium 42

43 proteolyticum v sýru byl doprovázen nežádoucí chutí a vedl ke slabé tvorbě putrescinu (Greif et al,.1998). 43

44 Tab. 6 Koncentrace biogenních aminů ve vybraných druzích sýrů konzumovaných v České republice podle Standarové et al., 2008 vzorek koncentrace BA mg/kg Try Pea Put Cad Him Tyr Spd Spm Sýry s vysokodohřívanou x 7,7 4,8 29,5 20,8 37,8 206,0 3,5 3,8 sýřeninou (a=32) x min 1,2 ND 1,2 1,1 1,4 3,4 0,8 0,8 x max 31,2 6,2 223,0 233,0 151,0 1123,0 6,7 9,1 Sýry s nízkodohřívanou x 2,0 1,5 37,7 66,9 12,6 70,2 1,0 2,4 sýřeninou (a=21) x min 0,6 0,6 0,7 ND 0,6 3,4 0,4 0,6 x max 8,2 5,8 184,0 432,0 58,0 360,0 2,7 11,3 Sýry s plísní x 2,3 1,8 61,3 51,5 8,2 12,9 5,3 0,9 na povrchu (a=25) x min 0,4 0,3 17,9 0,3 0,6 0,4 0,6 0,1 x max 8,8 9,0 266,0 388,0 116,0 187,0 12,5 29,8 Sýry s plísní x 2,0 5,6 28,5 37,9 8,3 63,0 17,7 1,8 uvnitř hmoty (a=24) x min 0,6 0,3 7,3 ND 0,6 3,4 0,4 0,6 x max 26,0 30,5 123,0 699,0 38,0 444,0 39,7 2,9 Měkké zrající x 3,1 13,0 161,0 200,0 56,1 121,0 8,1 7,2 sýry (a=35) x min 0,5 5,5 4,2 7,8 8,1 28,1 ND 0,8 x max 49,2 53,2 591,1 1110,0 283,0 417,0 26,1 10,8 Kozí sýry (a=10) x 4,2 1,3 22,0 70,2 74,0 109,0 1,2 1,0 x min 1,2 ND 1,4 ND 3,0 3,0 ND ND x max 8,0 2,8 66, ,0 326,0 2,0 2,0 Tavené sýry x 1,2 1,1 12,9 3,4 1,1 7,2 0,6 0,8 přírodní (a=12) x min 0,6 0,4 0,6 0,3 0,6 0,5 0,2 0,3 x max 6,1 2,1 55,8 13,8 6,4 27,8 3,6 1,7 Tavené sýry x 1,0 3,9 86,2 28,2 2,5 38,8 1,3 2,9 ochucené (a=12) x min 0,4 0,3 0,6 0,1 0,6 0,4 0,4 0,5 x max 11,8 34,8 4219,0 242,8 16,7 161,0 5,5 6,8 x průměrné hodnota, x min minimální naměřený hodnota, x max maximální naměřená hodnota, ND nedetekováno 44

45 Výskyt biogenních aminů v tavených sýrech Zrající sýry slouží jako jedna ze základních surovin pro výrobu tavených sýrů. BA vytvořené ve zrajících sýrech tedy přecházejí při výrobě i do tavených sýrů. Obsah tyraminu je průměrně 50, 56 resp. 21 mg/kg (Komprda, 2005). 3.6 Stanovení biogenních aminů Pro stanovení BA bylo vyvinuto několik technik zahrnujících tenkovrstvou chromatografii (TLC), plynovou chromatografii (GC), kapilární elektroforézu (CE) a kapalinovou chromatografii (HPLC), (Smělá et al., 2004) v některých případech je výhodné použít micelární elektrokinetickou kapilární chromatografii (MEKC) (Komprda, 2005). V praxi se nejčastěji používají vysoce citlivé chromatografické metody na reverzních fázích s fluorescenční nebo UV detekcí po dansylaci, benzoylaci nebo derivatizaci reakcí s 9-fluoromethyl chloroformátem, N-hydroxysuccinimidyl-6- chinolylkarbamátem nebo o-ftaldialdehydem (OPA). Iontově párovou RP-HPLC nebo iontově výměnnou chromatografií lze stanovit aminy po postkolonové derivatizaci OPA. V poslední době se jeví jako velmi spolehlivé a vysoce citlivé chromatografické metody s elektrochemickou detekcí nebo detekcí pomocí hmotnostní spektrometrie (LC/MS), zvláště pokud dochází ke koeluci více látek. Příprava vzorků pro chromatografické stanovení aminů po derivatizaci OPA je výrazně jednodušší, vyžaduje podstatně méně času a umožňuje plnou automatizaci při použití inteligentního automatického dávkovače (Smělá et al., 2004). Stanovení BA je poměrně náročné s ohledem na obvykle značné nároky na citlivost a přesnost stanovení a rovněž na nikoli nevýznamný vliv matrice na předseparační kroky (Křížek et Kalač, 1998). Extrakce BA z matrice dané potraviny se provádí nejčastěji kyselinou chloristou nebo kyselinou trichloroctovou. Nevýhodou naprosté většiny analytických postupů pro stanovení BA v potravinách je nutnost hledané analyty před vlastní detekcí derivatizovat, což je možné provádět buď před nástřikem na kolonu, nebo až po jejich výstupu z kolony. Nejčastěji používanými derivatizačními činidly jsou dansylchlorid (5-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid) a o-ftaldialdehyd (Komprda, 2005). Dnes jsou již prakticky opuštěny postupy založené na přímém fotometrickém stanovení aminů v poživatinách, hlavně z důvodu malé selektivity stanovení. Svůj 45

46 význam, si však stále udržuje tenkovrstvá chromatografie. Její hlavní předností je rychlost a cenová nenáročnost. Předseparace a derivatizace je ale i u této metody nutná (Křížek et Kalač, 1998). Nearomatické BA neabsorbují záření v UV/VIS oblasti a bez vhodné derivatizace je není možné detekovat způsoby běžnými v kapalinové chromatografii. Rovněž doprovodné rušivé složky musí být odděleny citlivě volenou předseparací (Křížek et Kalač, 1998). Nejobvyklejším předseparačním krokem je vzhledem k bazicitě aminů jejich extrakce ze vzorku zředěnou kyselinou chloristou či trichloroctovou. Pro mléčné výrobky se rovněž osvědčila jednoduchá extrakce metanolem za zvýšené teploty (60 C). Jiné postupy doporučují extrakci citranu sodného, okyselené extraktu zředěnou kyselinou trichloroctovou a centrifugační oddělení vysrážených bílkovin (Křížek et Kalač, 1998). Po izolaci aminů ze vzorku následuje zpravidla alkalizace alikvotního podílu extraktu a derivatizace aminů vhodným činidlem zpravidla na bázi chloridů aromatických kyselin. (Křížek et Kalač, 1998). Vybrané BA lze v poživatinách stanovit také metodou enzymové imunoanalýzy (Křížek et Kalač, 1998). 46

47 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Průkaz dekarboxylasové aktivity na základě barevných reakcí Princip: při dekarboxylaci aminokyseliny obsažené v diagnostickém médiu odštěpí příslušná dekarboxylasa z karboxylové skupiny aminokyseliny CO 2 za vzniku alkalického aminu. Pozitivní výsledek se pak projeví změnou zbarvení indikátoru způsobené změnou ph. Postup: sterilní zkumavky 80 x 10 mm byly plněny 2 ml diagnostické půdy (Davis, 1995, modifikace CCM), zality 0,5 ml parafinového oleje a sterilizovány 15 min. při 121 C. Do takto připravených zkumavek byla očkovací kličkou inokulována 24 hodinová mikrobiální kultura. Testováno bylo 12 kmenů laktobacilů izolovaných ze sýrů Inkubace zkumavek probíhala při 37 C po dobu 10 dnů v jejichž průběhu byly hodnoceny barevné změny. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin: Lys, Arg, Orn, Phe, His, Tyr, Trp. Tab.7 Testované kmeny mikroorganismů Pořadové číslo: Výsledky identifikace: Původ: 1 Lactobacillus casei/paracasei vysokodohřívaný sýr 2 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus vysokodohřívaný sýr 3 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus vysokodohřívaný sýr 4 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus vysokodohřívaný sýr 5 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus nízkodohřívaný sýr 6 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus nízkodohřívaný sýr 7 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus měkký sýr 8 Lactobacillus curvatus nízkodohřívaný sýr 9 Lactobacillus curvatus sbírkový kmen 10 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus sbírkový kmen 11 neidentifikováno vysokodohřívaný sýr 12 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus měkký sýr 47

48 Obr. 4 Lactobacillus curvatus (Anonym, 2010a) Obr. 5 Lactobacillus casei (Anonym, 2010b) 48

49 4.2 Výsledky a diskuse V průběhu 10 dnů bylo sledováno při teplotě 37 C 12 mikrobiální kmenů izolovaných ze sýrů. Po prvním dni inkubace byla sledována slabě pozitivní reakce u kmene 11 u Arg, stejně tak po 5. dni sledování vzrůstala reakce kmene 11 u Arg. Po 10 dnech inkubace byla prokázána silná pozitivní reakce u kmene 11 u Arg a slabá reakce kmene 2 u Tyr, kmene 5 u Lys a Arg, kmenů 10,12 u Tyr. Optimální růstová teplota laktobacilů je 30 až 40 C (Sedláček, 2007). Význam optimální teploty pro funkci dekarboxylas a tvorbu BA uvádějí ve svých pracích Silla Santos (1998), Bover-Cid et Holzapfel (1999) a Greifová et al., (2003). Mnohé kmeny laktobacilů včetně L. curvatus jsou uváděny jako producenti Tyr (Choudhury et al., 1990, De Llano et al., 1998, Bover-Cid et al., 2001, Pereira et al., 2001). Také některé pozorované kmeny vykázaly pozitivní i když ne příliš silnou reakci na tyramindekarboxylasu. Nejsilnější dekarboxylasová aktivita u testovaných kmenů byla zjištěna jen u Arg. Protichůdné údaje o schopnosti bakterií mléčného kvašení tvořit histamin uvádí Silla Santos (1998) a Bover-Cid et al., (2001) nepozorovali u laktobacilů aktivitu histidindekarboxylasy. Naopak přítomnost tohoto enzymu u mnoha laktobacilů uvádí Bover-Cid et Holzapfel (1999) a Dapkevicius et al.,(2000). Dekarboxylasové aktivity stanovené různými autory u téhož mikrobiálního druhu mohou být rozdílné, protože existují desítky kmenů uvnitř jednotlivých druhů, které se mohou v této vlastnosti výrazně lišit (Kalač et Křížek, 2002). Graf 1 Dekarboxylasová aktivita po 1 dni inkubace 1 1/5 1 4/5 3/5 2/5 1/5 0 Lys Arg Orn Phe His Tyr Trp Graf 2 Dekarboxylasová aktivita po 5 dnech inkubace 49

50 2 1/ /2 1 1/2 0 Lys Arg Orn Phe His Tyr Trp Graf 3 Dekarboxylasová aktivita po 10 dnech inkubace 3 2 2/3 2 1/ /3 1 1/3 1 2/3 1/3 0 Lys Arg Orn Phe His Tyr Trp Obr.4 Barevná reakce (Doseděl, 2009) fialová silná pozitivní reakce, žlutá negativní reakce 50