Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií

Transkript

1 Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií Iuri Marinov, ÚHKT, Praha Motolský minikurz - Praha, 2015

2 Přežití (%) Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH)- vzácné onemocnění s život ohrožujícími komplikacemi 100 Přežití po stanovení diagnózy (1) 2-6 případů/milion/ročně (3) Úmrtnost do 5 let: 35% (1) Výskyt u všech věkových skupin (med=30 let) (4,5) Kontrolní skupina (věk / pohlaví) Nízká kvalita života (1,6) 20 Nemocní s PNH Progrese onemocnění (1,2) Roky (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Parker C et al. Blood 2005;106(12): ; (3) Hill A et al. Blood 2006;108:985; (4) Moyo VM et al. BJH 2004;126:133-38; (5) Nishimura J et al. Med 2004;83: ; (6) Socié G et al. Lancet 1996;348:573-7; (7) Peffault de Latour R et al. Blood 2008;112(8):

3 PNH- patofyziologie Somatická mutace v genu pig-a, který kóduje protein nezbytný pro iniciální fázi syntézy GPI-kotvy 1,2 Částečný nebo kompletní deficit GPI-kotvených proteinů CD59 GPI kotva CD55 1. McKeage K. Drugs. 2011;71(17): Adapté de : Johnson RJ et al. J Clin Pathol: Mol Pathol. 2002;55: Brodsky R. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. dans : Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. R Hoffman; EJ Benz; S Shattil et al. eds. Philadelphie, PA: Elsevier Churchill Livingstone; 2005;

4 PNH- patogeneze Absence povrchových antigenů CD55 a CD59 vede k deficitu inhibičních systémů aktivovaného komplementu

5 Expanze PNH klonu 1 1 etapa Somatická mutace v genu PIG-A 2 etapa Imunitní ataka proti GPI kotveným proteinům 3 etapa Selekce, růst, expanze PNH klonu 1. Adaptováno od Inoue N et al. Int J Hematol. 2003;77:

6 Chronická hemolýza hlavní příčina klinických komplikací a úmrtnosti Trombóza Renální insuficience Plicní hypertenze Vliv na celkové přežití Aktivace komplementu Mezenteriální trombóza Dyspnoe Dysfagie Volný hemoglobin/anémie NO (oxid dusnatý) Únava Hemoglobinurie Nevýkonnost Vliv na kvalitu života 1. International PNH Interest Group. Blood. 2005;106: Brodsky R. Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. 2005; Rother RP et al. JAMA. 2005;293: Socie G et al. Lancet. 1996;348: Hill A et al. Br J Haematol. 2007;137: Lee JW et al. Hematologica. 2010;95(s2): Abstract #505 and Hill A et al. Br J Haematol. 2010; May;149(3): Hillmen P et al. Am J Hematol. 2010;85:

7 Proč provádět PNH screening 35% pacientů umírá v rámci 5 let i přes podpůrnou terapii Časný záchyt ovlivňuje terapeutickou strategii a úspěšnost léčby u PNH s aplazií kostní dřeně Přítomnost PNH klonů u PNH s aplazií KD předpovídá odpověď na imunosupresivní terapii Může dojit k nárůstu malých PNH klonů V současné době existuje efektivní terapie (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Sugimori C et al. Blood 2006;107:

8 Průtoková cytometrie - časová osa Od r implementace FCM Od r metoda volby pro stanovení PNH klonů Od r ICCS guidelines Od r Practical guidelines: podklad pro standardizaci Od r Harmonizace a Standardizace Od r Nové techniky

9 Validace PNH vyšetření Pre-analytické požadavky - požadavky na vzorek (odběr, skladování, doprava ) - požadavky na reagencie (selekce klonů, titrace MoAb, výběr vhodných kontrol) Analytické požadavky - linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence - rozlišení slabě positivních populací - reprodukovatelnost výsledků měření - reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi (harmonizace, standardizace) Post-analytické požadavky - přesnost: porovnávání k očekávaným výsledkům - specifičnost: série měření ve vztahu k referenční metodě - citlivost: schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - opakovatelnost (v sérii) mezilehlá preciznost (mezi sériemi) - odhad nejistoty výsledků měření (alespoň formou mezilehlé preciznosti)

10 Pre-analytické požadavky- požadavky na vzorek Materiál Antikoagulační činidlo Množství Stabilita vzorku Skladování Periferní krev EDTA nebo heparin 1-3 ml 7 dní pro Ery, 48 h pro Leuko 4 o C po 24 h Lyzační činidlo Ery - neprovádí Komerční lyzační roztok, NH4Cl Cílové populace Ery Granulocty Monocyty pro konfirmaci Lymfocyty nevyšetřujeme 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B; Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B; Marinov et al.;cytometry 2013;84B; Sutherland et al. Cytometry 2014:. 5. Marinov et al.;ijlh:2014 accepted

11 Doporučené reagencie pro analýzu PNH Ery 2 barevný test: CD235a-FITC / CD59-PE CD235a optimální pro gate na Ery CD235a způsobuje agregaci Ery (nutná titrace) FITC je preferovaný fluorochrom CD59 vykazuje lepší signal:noise poměr PE je preferovaný fluorochrom pro CD59 CD55 se nedoporučuje - slabá intenzita signálu (nízká epitopová denzita) - špatné rozlišení PNH Erytrocytů typu II a III 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B; Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;

12 Doporučené reagencie pro analýzu PNH Leuko Reagencie Buňky barevný G FLAER CD24 CD15 CD45 4 barevný M FLAER CD14 CD64 (33) CD45 4 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD33 5 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 5 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD64/33 5 barevný G+M FLAER CD157 CD15 CD45 CD64 6 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 CD64 6 barevný G+M FLAER CD24 CD14 CD15 CD45 CD33 GPI- reagencie Reagencie na gate 1. Borowitz et al.;cytometry 2010;178B; Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;

13 Doporučené klony pro PNH Leuko Cílová populace Ery Leuko MP / Fluorochrom (BD/BC) Význam Becton Dickinson Beckman Coulter CD59 (PE/PE) GPI-kotvený MEM-43 OV9A2 CD235a (FITC/FITC) CD15 (APC/PC5) CD15 (efluor450) Gate na Ery KC16 JC159 MEM-43 OV9A2 KC16 JC159 Gate na Gr H198 80H5 Gate na Gr MMA MMA FLAER GPI-kotvený NA NA CD24 (PE/PE) GPI-kotvený SN3 ML5 CD64 (APC/PC5) SN3 ALB9 Gate na Mo CD14 (PE/PE) GPI-kotvený 61D3 MφP9 61D3 RMO52 CD157 (PE/PE) GPI-kotvený SY11B5 SY11B5 CD45 (PerCP- Cy5.5/PC7 Vyloučení debris 2D1 J33 Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:

14 Pre-analytické požadavky- požadavky na reagencie Titrace monoklonálních protilátek Snížení množství Sériové ředění

15 Analytické požadavky Linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence Rozlišení slabě positivních populací Reprodukovatelnost výsledků měření Reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi

16 Analytické požadavky Plně automatizovaný proces pro digitální přístroje: Baseline setting (1-2 krát do roka, kdykoliv po údržbě): min - kontrola linearity - kontrola citlivosti - nastavení PMT voltage - nastavení optického pozadí - optimalizace elektronického šumu - nastavení cílových hodnot fluorescenční intenzity pro optimální rozlišení - nastavení časové prodlevy laserů (BD přístroje) Performance check (denně): 5 min - stanovuje a koriguje odchylky od základního (baseline) nastavení

17 Analytické požadavky Nastavení pro specifickou aplikaci (application setting): - area scaling (korekce hodnot pro FS-area a FS-height ) - optimalizace PMT signálů - digitální korekce spektrálního přísvitu PNH- kontrola nastavení cytometru na lymfocytech B-ly PNH Ly Ba T-ly

18 Post analytické požadavky Přesnost - shoda mezi průměrnými hodnotami získanými z velkého počtu měření a příslušnou referenční hodnotou - není aplikovatelná pro FCM testy (chybí referenční materiál) Specifičnost - analytická specifičnost (MP) - klinická specifičnost: testování série vzorků a hodnocení abnormality ve srovnání s příslušnou referenční metodou (série měření ve vztahu k referenční metodě) Citlivost - schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - diluční testy 1. Barnett et al.; Cytometry 2013; 84B; Wood et al.;cytometry 2013;84B;

19 Post analytické požadavky Nepřesnost 1,2 - opakovatelnost: > 5 vzorků připravit a 3 krát změřit v jednom pracovním cyklu. CV <10% (<20% pro populace < 0.1%) - mezilehlá preciznost: > 5 vzorků 3 krát připravit a 3 krát změřit v samostatných pracovních cyklech (restart a re-kalibrace přístroje). CV <10% (<20% pro populace < 0.1%) Účast v cyklech EKK a/nebo MLP 3 1. Barnett et al.;cytometry 2013; 84B; Wood et al.;cytometry 2013;84B; , 3. Marinov et al.;cytometry 2013;84B;

20 Post analytické požadavky Hlášení výsledků - velikost PNH klonů v Ery, Gr a Mo populacích - vždy uvádět aktuální citlivost vyšetření (LOD) - používat správnou terminologii > 1% PNH clone 0.1-1% Minor PNH clone 0.1% Rare cells with GPI deficiency

21 PNH Ery: 2 barevný test Periferní krev (EDTA) vždy ředit 1: µl výchozího ředění na test Přidáváme příslušné množství titrovaných CD59-PE a CD235a-FITC Inkubujeme ve tmě při pokojové teplotě cca 20 minut Nutno promýt v PBS Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBS) Důkladně protřepat!!! (< 2% agregátů) Akvizice na průtokovém cytometru

22 PNH Ery- ruční nastavení cytometru Nastavení Light scatter and PMT Optimalizace FS a SS neznačených Ery v Log : Log scatter plotu Gate na singlety Vynulovat kompenzační nastavení Nastavit PMT pro FL-1 a FL-2 pro optimální zobrazení Ery

23 PNH Ery- ruční nastavení cytometru Akvizice CD59 značených Ery a nastavit FL1 Fl2 kompenzace Akvizice CD235 značených Ery a nastavit FL2 FL1 kompenzace

24 PNH Ery- ruční nastavení cytometru Akvizice CD235a a CD59 značených Ery a stanovit umístění normálních Ery ( typ I) Akvizice vyšetřovaného vzorku

25 PNH Ery- automatické nastavení cytometru Korekce signálů pro FS-area a FS-height Nastavení PMT (> 2,5 rsd z baseline) Digitální kompenzace spektrálního přísvitu

26 PNH Ery Nefiltrované PBS!!!

27 PNH Ery Poorly stained normal RBC Courtesy of A. Illingworth Hodnocení z dot plot, z histogramu méně přínosné

28 PNH Ery-výkonnostní charakteristiky Clone size PNH clone N* Min. Max. Mean SD CV (%) >20% RBC II+III 3/ / / / / / % RBC II+III 3/ / /3 11.8/ / /5.3 <1% RBC II+ III 3/10 0.4/ / / / /6.1 * Opakovatelnost v sérii / mezilehlá preciznost Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

29 PNH Ery-mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Ery type III (big clone)-precision analysis PNH Ery type III (small clone)-precision analysis PNH Ery type III (minor clone)-precision analysis Ref. center Ref. center Ref. center > 20% Ref. center ,87 47,85 47,71 49,28 49, ,38 48,37 47,70 48,65 48, ,02 48,14 47,38 48,71 47,76 Mean 46,76 48,12 47,60 48,88 48,73 SD 0,27 0,21 0,15 0,28 0,86 CV 0,58 0,44 0,32 0,58 1,76 5%- 20% Ref. center ,10 11,16 10,45 11,48 9, ,96 10,77 10,59 11,72 9, ,24 10,86 10,39 11,45 10,44 Mean 10,10 10,93 10,48 11,55 10,10 SD 0,11 0,17 0,08 0,12 0,24 CV 1,13 1,53 0,80 1,05 0,24 < 1% Ref. center ,44 0,37 0,40 0,48 0, ,39 0,39 0,41 0,49 0, ,42 0,47 0,42 0,44 0,38 Mean 0,42 0,41 0,41 0,47 0,40 SD 0,02 0,04 0,01 0,02 0,02 CV 4,93 10,54 1,99 4,60 4,08 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

30 PNH Ery-mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Ery type III (big clone)- reproducibility 60 PNH Ery type III (minor clone)-reproducibility Ref. center Ref. center > 20% Ref ,12 48,56 49,06 51,34 48, ,64 47,96 48,58 50,71 48, ,10 48,61 47,66 49,98 49, ,58 47,93 46,95 50,65 48, ,73 47,76 46,86 50,42 49,27 Mean 47,23 48,16 47,82 50,62 49,11 SD 0,71 0,35 0,87 0,44 0,24 CV 1,51 0,73 1,83 0,87 0,48 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; %- 20% Ref ,27 11,59 11,01 10,97 10, ,69 11,27 10,88 12,49 10, ,67 11,07 10,83 11,50 10, ,11 11,34 10,97 11,44 10, ,97 11,12 10,49 11,30 10,86 Mean 10,34 11,28 10,84 11,54 10,81 SD 0,29 0,18 0,18 0,51 0,13 CV 2,82 1,63 1,70 4,41 1,23 < 1% Ref ,45 0,42 0,44 0,47 0, ,42 0,44 0,44 0,44 0, ,48 0,42 0,45 0,50 0, ,44 0,44 0,45 0,48 0, ,39 0,38 0,41 0,43 0,36 Mean 0,44 0,42 0,44 0,46 0,42 SD 0,03 0,02 0,01 0,03 0,04 CV 6,90 5,22 3,36 5,55 9,04

31 PNH Ery- lineární regrese Ref. center vs center 1 (RBC) y = 1,0227x R² = 0, Pearson r: Pearson r: Ref. center vs center 3 (RBC) y = 1,0387x R² = 0, Pearson r: Pearson r: Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; Ref. center vs center 2 (RBC) y = 1,0092x R² = Ref. center vs center 4 (RBC) y = 1,0157x R² =

32 PNH Ery- Bland Altmann Wilcoxon rank test: P= 0,08 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,06 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,053 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,15 (> 0.05) Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

33 PNH Leuko µl periferní krev (EDTA) Příslušné množství titrovaných MP Inkubace ve tmě a pokojové teplotě 30 minut Lyzace erytrocytů (Immunoprep, Optilyse, FACS Lyse, NH4Cl..) 1 promytí v PBA Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBA) Akvizice na průtokovém cytometru

34 PNH Leuko 4 barevný protokol Beckman Coulter Gr FLAER-Alexa Fluor 488 CD24-PE (SN3,ALB9) CD15-PC5 (80H5) CD45-PC7 (J33) Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD14-PE (61D3,RMO52) CD64-PC5 (22) CD45-PC7 (J33) Becton Dickinson Gr FLAER-Alexa Fluor 488 CD24-PE (SN3,ML5) CD15-APC (H198) CD45-PerCP-C5.5 (2D1) Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD14-PE (61D3,MφP9) CD64-APC (10.1) CD45-PerCP-C5.5 (2D1) Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:

35 PNH Leuko - manuální nastavení Nastavení PMT signálů 1. Gr + GPI + MP na gate: umístění normálních Gr cytometru (4 barevný test) 2. Gr + MP na gate: umístění PNH Gr 3. Akvizice vyšetřovacího vzorku

36 PNH Leuko-nastavení cytometru ( 5 barev) Application settings Korekce hodnot pro FS-Area a FS-Height (area scaling)

37 PNH Leuko analýza - nastavení cytometru ( 5 colors) Nastavení optimálních PMT signálů (>2,5 rsd z nastavení baseline)

38 PNH Leuko analýza - nastavení cytometru ( 5 colors) Digitální kompenzace spektrálního přísvitu

39 Zobrazení PNH Granulocytů

40 Zobrazení PNH Monocytů

41 PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (4 barevný test) Clone size PNH clone Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) > 20% 1-20% Gr Mo Gr Mo < 1% Gr 4-color 3/ / / / / /0.3 5-color 3/ / / / / /0.1 6-color 3/ / / / / /0.1 4-color 3/ / / / / /0.1 5-color 3/ / / / / /0.1 6-color 3/ / / /99 0.3/ /0.2 4-color 3/ / / / / /3.6 5-color 3/ / / / / /1.7 6-color 3/ / / /12 0.1/ /1.5 4-color 3/10 9.9/ / / /.1 2.6/3.1 5-color 3/10 9.6/ / / / / color 3/ / /2 10.2/ / / color 3/10 0.5/ / / / /3.1 5-color 3/10 0.5/ / /0.5 0/0.02 1/2.9 6-color 3/10 0.5/ / /0.5 0/ /2.9 Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

42 Lineární regrese Bland Altmann (Gra) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

43 Lineární regrese Bland Altmann (Mo) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

44 PNH Gr: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Gr (big clone)-precision analysis PNH Gr (small clone)-precision analysis PNH Gr (minor clone)-precision analysis Ref. center Ref. center Ref. center > 20% Ref. center ,66 98,31 99,74 99,73 99, ,64 98,64 99,72 99,65 99, ,65 98,57 99,73 99,71 99,23 Mean 99,65 98,51 99,73 99,70 99,49 SD 0,01 0,14 0,01 0,03 0,18 CV 0,01 0,14 0,01 0,03 0,18 5%- 20% Ref. center ,73 6,56 6,53 6,32 8, ,84 6,67 6,47 6,21 7, ,76 6,85 6,69 6,29 7,79 Mean 6,78 6,69 6,56 6,27 7,95 SD 0,05 0,12 0,09 0,05 0,13 CV 0,69 1,79 1,41 0,74 1,59 < 1% Ref. center ,64 0,53 0,51 0,53 0, ,64 0,51 0,72 0,58 0, ,59 0,50 0,56 0,51 0,26 Mean 0,62 0,51 0,60 0,54 0,25 SD 0,02 0,01 0,09 0,03 0,02 CV 3,78 2,43 15,01 5,45 7,64 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

45 PNH Mo: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Mo (big clone)-precision analysis Ref. center > 20% Ref. center ,65 95,29 99,27 98,95 99, ,66 96,41 99,06 98,18 99, ,70 95,77 99,22 98,35 99,54 Mean 99,67 95,82 99,18 98,49 99,38 SD 0,02 0,46 0,09 0,33 0,11 CV 0,02 0,48 0,09 0,34 0,11 PNH Mo (small clone)-precision analysis Ref. center %- 20% Ref. center ,89 8,42 9,64 8,44 9, ,91 8,72 10,10 8,58 8, ,90 9,32 9,80 8,55 9,01 Mean 8,90 8,82 9,85 8,52 9,25 SD 0,01 0,37 0,19 0,06 0,37 CV 0,09 4,24 1,94 0,71 3,95 PNH Mo (minor clone)-precision analysis Ref. center < 1% Ref. center ,70 0,79 0,88 0,93 1, ,65 0,81 1,01 0,93 1, ,73 0,78 1,24 0,97 1,12 Mean 0,69 0,79 1,04 0,94 1,20 SD 0,03 0, 01 0,15 0,02 0,05 CV 4,76 1, 57 14,27 2,00 4,54 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

46 PNH Gr: mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Gr (big clone)-reproducibility PNH Gr (small clone)-reproducibility PNH Gr (minor clone) - reproducibility Ref. center Ref. center Ref. center > 20% Ref ,67 99,22 99,76 99,63 99, ,71 98,74 99,70 99,25 99, ,72 98,97 99,73 99,45 99, ,74 98,87 99,67 99,34 99, ,76 98,35 99,78 99,54 99,68 Mean 99,72 98,83 99,73 99,44 99,68 SD 0,03 0,29 0,04 0,14 0,02 CV 0,03 0,29 0,04 0,14 0,02 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; %- 20% Ref ,58 6,23 6,23 5,30 7, ,35 6,86 6,28 5,63 7, ,47 6,84 6,29 5,41 8, ,41 6,59 6,17 5,99 8, ,61 6,63 6,71 6,06 8,15 Mean 6,48 6,63 6,34 5,68 8,05 SD 0,10 0,23 0,19 0,53 0,18 CV 1,52 3,43 3,03 5,34 2,20 < 1% Ref ,56 0,46 0,63 0,49 0, ,66 0,54 0,55 0,54 0, ,67 0,44 0,63 0,53 0, ,59 0,48 0,53 0,55 0, ,67 0,49 0,57 0,52 0,25 Mean 0,63 0,48 0,58 0,53 0,23 SD 0,05 0,03 0,04 0,02 0,02 CV 7,31 6,99 7,08 3,91 10,33

47 PNH Mo: mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Mo (big clone)- reproducibility PNH Mo (small clone) - reproducibility PNH Mo (minor clone) - reproducibility Ref. center Ref. center Ref. center > 20% Ref ,58 96,31 99,09 98,86 99, ,64 95,23 99,36 98,12 99, ,55 96,35 99,16 98,28 99, ,50 95,61 99,34 98,39 99, ,64 96,05 99,00 98,28 99,68 Mean 99,58 95,91 99,19 98,39 99,56 SD 0,05 0,43 0,14 0,25 0,07 CV 0,05 0,45 0,14 0,25 0,07 Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; %- 20% Ref ,75 9,29 9,97 8,84 9, ,10 8,04 10,42 8,22 9, ,10 8,49 9,85 8,59 8, ,45 9,09 10,39 8,01 8, ,86 9,08 9,95 7,96 8,65 Mean 8,45 8,80 10,12 8,32 8,80 SD 0,49 0,46 0,24 0,34 0,26 CV 5,80 5,27 2,37 4,09 2,90 < 1% Ref ,79 0,83 1,05 0,93 1, ,85 0,80 0,74 1,15 1, ,82 1,02 0,97 0,93 1, ,89 0,57 0,93 0,96 1, ,92 0,79 0,80 0,84 1,11 Mean 0,85 0,8 0,90 0,96 1,23 SD 0,05 0,14 0,11 0,10 0,19 CV 5,47 17,83 12,59 10,63 15,40

48 NH Leuko- mezilaboratorní lineární regrese Ref. center vs center 1 (WBC) y = 0,9755x R² = 0, Ref. center vs center 2 (WBC) y = 0,9984x R² = 0, Pearson r: Pearson r: Ref. center vs center 3 (WBC) y = 0,9933x R² = 0, Pearson r: Pearson r: Ref. center vs center 4 (WBC) y = 0,9975x R² = 0, Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

49 PNH Leuko-Bland Altmann Wilcoxon rank test: P= 0,56 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,56 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 0,21 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P= 1,0 (> 0.05) Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B;

50 PNH Leuko 6 barevný test Beckman Coulter platform v průběhu validace Becton Dickinson platform Gr+ Mo FLAER- Alexa 488 CD24-PE (SN3) CD15-APC (H198) CD14-PerCP-C5.5 (61D3) CD64-PC7 (10.10 CD45-APC-H7 (2D1) Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

51 PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (6 barevný test) Clone size PNH clone Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) > 20% 1-20% Gr Mo Gr Mo < 1% Gr 4-color 3/ / / / / /0.3 5-color 3/ / / / / /0.1 6-color 3/ / / / / /0.1 4-color 3/ / / / / /0.1 5-color 3/ / / / / /0.1 6-color 3/ / / /99 0.3/ /0.2 4-color 3/ / / / / /3.6 5-color 3/ / / / / /1.7 6-color 3/ / / /12 0.1/ /1.5 4-color 3/10 9.9/ / / /.1 2.6/3.1 5-color 3/10 9.6/ / / / / color 3/ / /2 10.2/ / / color 3/10 0.5/ / / / /3.1 5-color 3/10 0.5/ / /0.5 0/0.02 1/2.9 6-color 3/10 0.5/ / /0.5 0/ /2.9 Marinov et al.;clin HemLab Med, 2013; 51: Marinov et al.;clinlab, 2014;60:;

52 PNH Leuko 6 barevný protokol

53 PNH Leuko 5 barevný protokol (CD157) Beckman Coulter platform Gr+ Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD157-PE (SY11B5) CD15-PC5 (80H5) CD64-ECD (22) CD45 PC7 (J33) Becton Dickinson platform Gr+ Mo FLAER-Alexa Fluor 488 CD157-PE (SY11B5) CD15-APC (H198) CD64-PC7 (10.1) CD45 PerCP-C5.5 (2D1) Sutherland et al.:cytometry; 2013 Marinov et al.;ijlh, 2014

54 PNH Leuko 5 barevný protokol

55 PNH Leuko-výkonnostní charakteristiky (5 barevný test) Clone size > 20% 1-20% PNH clone Gr Mo Gr Mo Protocol N Min. Max. Mean SD CV (%) 5-color 3/3 51.3/ / / / /0.1 6-color 3/3 51.5/ / / / /0.1 5-color 3/3 73.5/ / / / /0.7 6-color 3/3 74.6/ / / / /0.7 5-color 3/3 7.4/ / / / /0.7 6-color 3/3 6.9/ / /15.1 0/ /1.6 5-color 3/3 18.4/ / / / /2.6 6-color 3/3 18.8/ / /36 0.1/ /1.6 5-color 3/3 0.3/ / /0.2 0/0 3/3.7 < 1% Gr 6-color 3/3 0.3/ / /0.2 0/0 5.8/4 Mo 5-color 3/3 0.8/ / /0.5 0/0 8.1/4.8 6-color 3/3 0.8/ / /0.6 0/0 5.4/3.2 Marinov et al.;ijlh, 2014

56 % p o s it iv e % p o s it iv e % p o s it iv e PNH Leuko- opakovatelnost v sérii (5 barevný test) (a ) (b ) In t r a - a s s a y p r e c is io n - m e d iu m c lo n e (c ) In t r a - a s s a y p r e c is io n - m in o r c lo n e In t r a - a s s a y p r e c is io n - b ig c lo n e G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l VC 5c: 0.88%-0.20% VC 6c: 0.42%-0.72% VC 5c: 2.40%-0.31% VC 6c: 2.29%-0.28% VC 5c: 3.02%-5.83% VC 6c: 8.14%-5.41% Marinov et al.;ijlh, 2014

57 % p o s it iv e % p o s it iv e % p o s it iv e PNH Leuko: mezilehlá preciznost (5 barevný test) (d ) In t e r - a s s a y p r e c is io n - b ig c lo n e (e ) In t e r - a s s a y p r e c is io n - m e d iu m c lo n e (f) 5. 0 In t e r - a s s a y p r e c is io n - m in o r c lo n e G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l 0 G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l G r-5 c G r-6 c M o -5 c M o -6 c P o p u la t io n - p r o t o c o l VC 5c: 0.09%-0.08% VC 6c: 0.49%-0.72% VC 5c: 0.71%-1.63% VC 6c: 2.15%-1.55% VC 5c: 3.71%-4.04% VC 6c: 4.80%-3.19% Marinov et al.;ijlh, 2014

58 PNH Leuko: lineární regrese (5 barevný test) (a) c vs. 6c (Granulocytes) y = x r² = (b) c vs. 6c (Monocytes) y = 0.997x r² = Pearson r: 0.99 Pearson r: 0.99 Marinov et al.;ijlh, 2014

59 D i f f e r e n c e i n r e s u lt s D i f f e r e n c e i n r e s u lt s PNH Leuko: Bland Altmann (5 barevný test) (c ) 5. 0 M e a n b ia s : (d ) 5. 0 M e a n b ia s : M e a n o f r e s u lt s ( 5 c v s. 6 c ) ( G r a n u lo c y t e s ) M e a n o f r e s u lt s ( 5 c v s. 6 c ) ( M o n o c y t e s ) Wilcoxon rank test: P= 0.23 (> 0.05) Wilcoxon rank test: P=0.08 (> 0.05) Marinov et al.;ijlh, 2014

60 CD24-Granulocytes CD24-Granulocytes CD14-Granulocytes CD24-Granulocytes CD24-Granulocytes Monitorování minoritních PNH klonů (AA) Září 2008 Prosinec 2008 Březen 2009 Květen 2009 FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker FLAER-GPI Anchor Marker Gr. klon: 3.8% Gr klon : 7.6% Gr klon : 14.2% Gr klon : 23.3% Ery klon : 0.8% Ery klon : 1.6% Ery klon : 1.8% Ery klon : 2.4% CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein CD59 GPI Anchor Protein 3 months 6 months 9 měsíců Vývoj PNH klonu v průběhu jednoho roku Source- Dahl-Chase Diagnostic Services.