Možnosti cytogenetického vyšetření potracených plodů

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta Možnosti cytogenetického vyšetření potracených plodů Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Renata Gaillyová, Ph.D. Autor: Markéta Španielová Brno, duben 2011

2 Jméno a příjmení autora: Markéta Španielová Název bakalářské práce: Možnosti cytogenetického vyšetření potracených plodů Pracoviště: Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Černopolní 9, PDM Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Renata Gaillyová, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2011 Souhrn: Tato práce se zabývá vyšetřením karyotypu z materiálu potracených plodů. Práce je rozdělena do dvou částí. Teoretická část podává souhrn dostupných informací o cytogenetických metodách. Praktická část se zabývá popisem provedení celého vyšetření tkání z potracených plodů a dále statistickým zhodnocením výsledků vyšetření - patologické nálezy a kultivační neúspěchy za období let 2007 až Klíčová slova: cytogenetika, chromosomy, karyotyp, potracený plod Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením prim. MUDr. Renaty Gaillyové, Ph.D, a odborného konzultanta RNDr. Evy Makaturové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne......

4 Ráda bych poděkovala vedoucí práce paní prim. MUDr. Renatě Gaillyové Ph.D. za odborné vedení, ochotu a poskytnutí rad a připomínek při vypracování mé bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat odbornému konzultantovi paní RNDr. Evě Makaturové za čas, který mi věnovala, trpělivost a zapůjčení literatury a paní Jaroslavě Križanové za názorné ukázky v laboratoři a pomoc s nafocením praktické části.

5 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AFP AMC CGH CVS DNA FISH hcg MA mfish MS NT NTD OLG PCR PHA QF-PCR RNA SA ue3 UPT UZ UUT α-fetoprotein amniocentéza comparative genomic hybridization komparativní genomová hybridizace chorion villi sampling odběr choriových klků deoxyribonukleová kyselina fluorescenční in situ hybridizace human chorio gonado tropin lidský choriový gonadotropin missed abort zmlklý potrat mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace mateřské sérum nuchální translucence neural tube defects defekty nervové trubice Oddělení lékařské genetiky polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce fytohemaglutinin kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce ribonukleová kyselina spontaneous abort spontánní samovolný potrat nekonjugovaný estriol umělé přerušení těhotenství ultrazvuk umělé ukončení těhotenství

6 OBSAH: TEORETICKÁ ČÁST ÚVOD CÍLE PRÁCE CYTOGENETIKA HISTORIE CYTOGENETIKY CHROMOSOMY STRUKTURA CHROMOSOMŮ Struktura chromatinu MORFOLOGIE CHROMOSOMŮ PRUHOVÁNÍ CHROMOSOMŮ Přehled základní metod METODY KLINICKÉ GENETIKY KLASICKÁ CYTOGENETIKA Stanovení karyotypu Příprava preparátu Hodnocení preparátů Zápis karyotypu Indikace ke stanovení karyotypu MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKA Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Komparativní genomová hybridizace (CGH) Metoda mnohobarevné FISH (multicolour FISH, mfish) MOLEKULÁRNÍ GENETIKA QF-PCR PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKA METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY Neinvazivní metody Invazivní metody Amniocentéza (AMC) Odběr choriových klků (CVS) Kordocentéza Fetoskopie Indikace k invazivnímu prenatálnímu vyšetření GENETICKÉ PORADENSTVÍ TERATOGENY TERATOGENY BIOLOGICKÉ POVAHY TERATOGENY CHEMICKÉ POVAHY TERATOGENY FYZIKÁLNÍ POVAHY POTRATY DEFINICE INCIDENCE...27

7 7.3 SPONTÁNNÍ POTRATY INDUKOVANÉ POTRATY Umělé přerušení, ukončení těhotenství (UPT,UUT) Miniinterrupce Mimoděložní těhotenství...29 PRAKTICKÁ ČÁST METODIKA ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ Z POTRACENÝCH PLODŮ ODBĚR MATERIÁLU EVIDENCE MATERIÁLU KULTIVACE VLASTNÍ ZPRACOVÁNÍ PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ PRUHOVÁNÍ G-PRUHY STATISTICKÁ KAPITOLA CHARAKTERISTIKA SOUBORU SBĚR DAT METODIKA ZÁVĚR LITERATURA SEZNAM PŘÍLOH...47

8 TEORETICKÁ ČÁST 1 ÚVOD Přibližně 15 % všech klinicky uznaných těhotenství končí potratem. Potrat může být způsoben mnoha faktory, ale dle odhadů jsou asi z 50 % příčinou chromosomové abnormality plodu. Mezi nejčastější abnormality patří trisomie, které mohou souviset s vyšším věkem matky, dále monosomie a polyploidie. Nejčastěji se jedná o početní abnormality chromosomů 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y. Genetická pracoviště se zabývají genetickým poradenstvím určeným pro jednotlivce a rodiny postižené genetickým onemocněním. Geneticky riziková rodina nebo jedinec postižený těžkými vrozenými vývojovými vadami či chorobami geneticky podmíněnými nebo s jejich genetickou dispozicí získává prostřednictvím genetického poradenství možnost využít všech nejnovějších metod genetické prevence a klinické léčby. Cytogenetická analýza tkáně potraceného plodu poskytuje cennou informaci o příčině potratu. Získání výsledku je však často znemožněno neúspěšnou kultivací, maternální kontaminací nebo nedostatečnou kvalitou chromosomového preparátu. Pro genetické poradenství je zásadní informace o karyotypu obou partnerů a jeho stanovení se obvykle doporučuje v případě opakovaného samovolného potratu. Cytogenetické stanovení výbavy potraceného plodu je doporučované už u prvního potratu, neboť identifikace možného důvodu snižuje dlouhodobou psychickou zátěž ženy a umožňuje cílenou genetickou konzultaci s párem před plánováním dalšího těhotenství. Cytogenetika je obor genetiky a její klasickou metodou je karyotypování - analýza všech chromosomů, strukturních a početních abnormalit. 1.1 CÍLE PRÁCE Cílem této práce je seznámit se s metodami užívanými pro cytogenetické vyšetření potracených plodů, vyhodnotit patologické nálezy a úspěšnost kultivace na OLG FN Brno a porovnat stanovení chromosomových abnormalit klasickými cytogenetickými metodami se stanovením pomocí metod molekulárně genetických. 8

9 2 CYTOGENETIKA Cytogenetika studuje mikroskopickou anatomii buněčného genetického aparátu. Zabývá se studiem chromosomů jejich počtem, morfologií, poruchami, segregací za normálních i patologických podmínek a studuje korelaci těchto nálezů s fenotypem. (Kuglík, 2000) Cytogenetické vyšetření slouží k určení karyotypu u nemocných s vrozenými vývojovými vadami, v prenatální diagnostice k určení chromosomové výbavy plodu, ke zpřesnění diagnózy a k určení prognózy některých nádorových onemocnění. 2.1 HISTORIE CYTOGENETIKY Počátky lidské cytogenetiky jsou obecně přičítány Walthru Flemmingovi, který publikoval první ilustrace lidských chromosomů již v roce Roku 1951 Hsu omylem použil hypotonický roztok (0,075M KCl) při oplachování buněk ve tkáňové kultuře. Hypotonický roztok způsobil přestup vody do buňky, jádro zvětšilo svůj objem a chromosomy v něm se od sebe separovaly. Tato nehoda byla klíčem k odemknutí budoucnosti lidské cytogenetiky. V roce 1956 ve Švédsku Tjio a Levan z kultivace fibroblastů lidských embryonálních plic stanovili přesný počet lidských chromosomů. Jejich nález potvrdili ve Velké Británii i Ford a Hamerton. Zanedlouho poté byl popsán první patologický karyotyp. V roce 1959 Lejeune studoval chromosomy fibroblastů v kulturách od pacientů s Downovým syndromem a popsal trisomii chromosomu 21. V roce 1960 Nowell zjistil, že výtažek z fazolí fytohemaglutinin (PHA) je tzv. mitogen, protože stimuluje lymfocyty z periferní krve k dělení. Tento objev odstranil nutnost aspirace kostní dřeně, která byla do té doby nejlepším způsobem, jak získat dostatečný počet spontánně se dělících buněk. Podle Denverské nomenklatury (1960) byly poprvé rozděleny chromosomy podle tvaru a velikosti. V letech Caspersson objevil a zavedl pruhovací techniky barvení chromosomů. Tento objev vedl k přesné identifikaci každého chromosomu v karyotypu podle střídání silně a slabě se barvících pruhů a jejich šíře na krátkých a dlouhých ramenech. Následovala kaskáda definovaných chromosomových abnormalit a syndromů, aneuploidií, delecí, mikrodelecí, translokací, inverzí, inzercí atd. S vývojem nových metod a technik barvení se ISCN (International system of cytogenetic nomenclature) stále doplňuje a poslední závazná mezinárodní nomenklatura lidských chromosomů byla vydaná v r [4;11]. 9

10 3 CHROMOSOMY 3.1 STRUKTURA CHROMOSOMŮ Každý chromosom se skládá z velmi dlouhé molekuly DNA asociované s proteiny a RNA, a tyto tři složky vytvářejí hmotu zvanou chromatin. Materiál chromosomů je během interfáze buněčného cyklu rozptýlen uvnitř jádra, ale během mitózy nebo meiózy se mění v kompaktní struktury. V jaderné hmotě rozlišujeme euchromatin tvořící slabě zbarvené oblasti a silně zbarvený heterochromatin. [15] Eukaryotický chromosom je rozdělen centromerou na dvě raménka (krátké a dlouhé). Konce ramének se nazývají telomery. Vlákno tvořící chromosom nazýváme chromatida. [8] Struktura chromatinu Ve všech chromosomech je řetězec DNA dvakrát omotán kolem osmi molekul proteinů zvaných histony. Tyto útvary připomínají korálky na niti a nazývají se nukleosomy. Proteinové jádro nukleosomového tělíska je tvořeno histony H2A, H2B, H3 a H4. Šňůrka s nukleosomovými korálky se dále stáčí do spirálového vinutí neboli solenoidu. Během mitózy a meiózy se chromosomy dále kondenzují, a tím dochází až k jejich stonásobnému zkrácení. Předpokládá se, že chromatinové vlákno je uspořádáno do velkého počtu smyček, které vyčnívají z centrálního skeletu tvořeného nehistonovými chromosomálními proteiny, označovanými NHC. Při buněčném dělení se vlákno se smyčkami dále svinuje, čímž se vytváří plně kondenzovaný heterochromatin. [15] Obrázek 3.1 Struktura nukleohistonového komplexu při různém zvětšení [15] 10

11 3.2 MORFOLOGIE CHROMOSOMŮ Označení ramen chromosomů: Krátké raménko = p (petit) Dlouhé raménko = q (queue) Podle polohy centromery jsou chromosomy děleny na: a) Metacentrické p a q raménka jsou přibližně stejně dlouhá b) Submetacentrické q raménko je nápadně delší než p raménko c) Akrocentrické q raménko je výrazně delší než p raménko, které je redukováno pouze na malý úsek nad centromerou, raménko pokračuje stopkou zakončenou satelitem d) Telocentrické obsahují pouze q raménka, p raménka zcela chybí [8] V současné době se měření relativní délky chromosomů prakticky nevyužívá, protože přesná identifikace je možná na základě rozložení pruhů. [11] 3.3 PRUHOVÁNÍ CHROMOSOMŮ Pruhy na chromosomech se získávají různými technikami barvení a na přesné analýze pruhování karyotypu je postavena i současná cytogenetická nomenklatura a standardizace. Pruhování na chromosomech je jasně viditelné jen po jejich určité kondenzaci, a tím i typický sled pruhů je v přímém vztahu se stupněm kondenzace. [11] Podle Kuglíka (2000) je pruh definován jako ta část chromosomu, která je jasně odlišitelná od sousední části tím, že je tmavší nebo světlejší. Pruhy se barví některými metodikami tmavě, jinými světle. Chromosom je tak tvořen ze sekvence světlých a tmavých pruhů, nejsou mezistupně. [9] Přehled základní metod Q-pruhování Metoda založená na barvení roztokem chinakrinu nebo příbuzných sloučenin a hodnocení preparátů pod fluorescenčním mikroskopem. Na chromosomech lze rozeznat (vzhledem ke 11

12 tmavému podkladu) průhledné a neprůhledné pruhy (Q-pruhy). Průhledné pruhy jsou téměř totožné s tmavými G-pruhy. [12] Výhodou Q - pruhovacích technik je šetrný postup, který neovlivňuje morfologii chromosomů. Nevýhodou je nutnost práce s fluorescenčním mikroskopem a rychle se snižující intenzita fluorescence. [9] G-pruhování Nejčastěji používaná metoda v cytogenetických laboratořích. Chromosomy jsou nejprve vystaveny účinku trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomální proteiny, a následně obarveny Giemsovým barvivem. [12] Výsledkem je sled tmavých (G pozitivních) a světlých (G negativních) euchromatinových pruhů charakteristických pro každý lidský chromosomový pár. Výhodou u této metody je zhotovení trvalého a neměnného preparátu, který lze hodnotit pomocí světelného mikroskopu. [9] Obrázek 3.2 Grafické znázornění rozložení G-pruhů na chromosomech v metafázi podle Pařížské nomenklatury [11] 12

13 R-pruhování Metoda založená na působení vysoké teploty (inkubace preparátů v horkých roztocích pufrů při 87 C) a následném barvení akridinovou oranží nebo Giemsovým barvivem. Výsledné pruhy R-pruhy představují reverzní pruhy v porovnání s pruhováním dosaženého Q- nebo G-pruhovací technikou. Výhodou metody je výrazné tmavé barvení koncových oblastí chromosomů. [1;12] C-pruhování Metoda určená ke specifické vizualizaci centromerické oblasti každého chromosomu a dalších částí obsahujících konstitutivní heterochromatin. C-pruhy jsou nejvíce viditelné v oblasti centromery na chromosomech 1, 9, 15, 16 a na q-raménku chromosomu Y. [9;12] Barvení stříbrem (NOR barvení) Po aplikaci dusičnanu stříbrného (AgNO 3 ) dojde k jeho vysrážení v místě organizátoru jadérka (NOR oblast nucleolar organizer regions) na satelitních stopkách akrocentrických chromosomů. [9;15] Metoda HRT technika vysoké rozlišovací schopnosti (high resolution technique) Technika založená na profázickém pruhování, která umožňuje zachytit i nepatrné delece či duplikace DNA. Barvení se provádí v časné fázi mitózy (profázi nebo prometafázi), kdy se chromosomy nacházejí v relativně málo kondenzovaném stavu. G-pruhy se při této metodě rozdělí na další jemnější podpruhy. V lidském karyotypu se tak dá touto metodou rozlišit 850 až 1256 pruhů na rozdíl od 350 až 400 pruhů rozlišitelných klasickým G-pruhováním. [9;12] 13

14 4 METODY KLINICKÉ GENETIKY 4.1 KLASICKÁ CYTOGENETIKA Stanovení karyotypu Příprava preparátu Karyotyp je soubor chromosomů jedince nebo buňky s označením jejich počtu, druhu pohlavních chromosomů a případných aberací. Jako materiál ke stanovení se používají intenzivně proliferující buňky, ve kterých můžeme zachytit největší počet dělení jader. Tomu nejvíce vyhovují a zároveň se nejsnadněji získávají T-lymfocyty periferní krve. Vedle tohoto materiálu lze však kultivovat a použít pro stanovení karyotypu také buňky vazivové fibroblasty (např. kůže potraceného plodu), epiteliální buňky kostní dřeně, buňky plodové vody amniocyty nebo buňky nádorové tkáně ze solidních tumorů. [9;12] Pěstování buněk in vitro vyžaduje sterilní odběr materiálu, vhodné kultivační médium, zachování optimální teploty, ph a dalších podmínek. Podle charakteru použitého materiálu můžou být tkáňové kultury krátkodobé, při kterých kultivace trvá několik hodin (buňky kostní dřeně), případně několik dní (buňky periferní krve), anebo dlouhodobé - vyžadující pěstování buněk několik týdnů (fibroblasty). K přípravě krátkodobé kultury se nejčastěji odebírá periferní krev do heparinu kvůli zabránění srážení. [12;17] T-lymfocyty mají malou spontánní mitotickou aktivitu, a proto se k jejich stimulaci přidává do média extrakt fazole (Phaseolus vulgaris) fytohemaglutinin (PHA). PHA stimuluje přechod lymfocytů z klidové fáze G 0 do fáze G 1. [1;17] Po získání dostatečného počtu mitotických buněk je jejich dělení zastaveno v metafázi pomocí inhibitoru dělícího vřeténka kolchicinu, ten blokuje anafázní rozestup, a tak udržuje chromosomy permanentně v metafázi. Kolchicin ve vyšších koncentracích přispívá i ke kondenzaci, tedy větší spiralizaci, chromosomů. Buňky jsou poté odděleny a převedeny do hypotonického roztoku (0,075 M KCl), dochází k uvolnění chromosomů a k jejich vhodnému prostorovému rozložení v jedné rovině. [9;11;17] Následuje fixace použitím metanolu a kyseliny octové v poměru 3:1. Fixační prostředek se musí připravovat čerstvý před použitím, protože snadno absorbuje vodu z atmosféry, což nepříznivě ovlivňuje kvalitu a barvení chromosomů. 14

15 Fixované buňky ze suspenze jsou kapány na podložní skla pro následné barvení a analýzu. Dobrý preparát má dostatečný počet mitóz, které jsou dobře rozprostřené s minimálním překrytím chromosomů. [4] Skla s chromosomy se následně barví některou z cytogenetických technik, jejíž výběr závisí na konkrétním diagnostickém postupu. [12] Metody, které produkují specifické střídání pruhů po celé délce chromosomů, vytváří unikátní vzor pro každý chromosomový pár. To umožní identifikaci jednotlivých chromosomů a charakterizaci případné strukturní abnormality Hodnocení preparátů Základní metodou hodnocení chromosomů je jejich studium v mikroskopu. Nejprve se při malém zvětšení (suchý objektiv) vyhledá vhodná mitóza, která se následně analyzuje pomocí imerzního objektivu. Je nutné zaznamenat souřadnice každé mitózy, rozloženou mitózu můžeme nakreslit a chromosomy označit čísly nebo různými barvami. Všímáme si rozložení pruhů, velikosti a intenzity zbarvení, zaznamenáváme případné odchylky. Počet sledovaných mitóz se liší podle typu vyšetření a požadavků klinického genetika nebo lékaře, který vyšetření požaduje. Sledujeme nejméně 15 mitóz, nejčastěji však 20 mitóz, ale podle závažnosti nálezu se počet sledovaných mitóz zvyšuje. [11] Dříve se při mikroskopickém hodnocení jednotlivé mitózy fotografovaly a ze získaných fotografií se následně vystřihovaly jednotlivé chromosomy. Ty se poté řadili podle velikosti a tvaru do jednotlivých skupin A až G, přičemž pohlavní chromosomy se hodnotí odděleně. [15] V moderní praxi se k vyšetření používá digitální snímání a počítačová analýza mikroskopického obrazu. Počítačové programy automaticky určují základní osu chromosomů, poměry dlouhých a krátkých ramen a jejich orientaci. Karyotypování je možné provést automaticky nebo manuálně přetažením jednotlivých chromosomů pomocí myši. Výhodou počítačového zpracování je možnost zvětšení jednotlivých chromosomů, velmi rychlé karyotypování a digitální archivace a dokumentace výsledků. [11] 15

16 Obrázek 4.1 Příklad karyotypovacího softwaru [4] Zápis karyotypu Normální karyotyp mitotické buňky tvoří 46 chromosomů, tj. 22 párů autozomů, které se u obou pohlaví neodlišují a označují se čísly 1 22, a z jednoho páru pohlavních chromosomů (gonosomů), který je u ženy tvořen dvěma chromosomy X a u muže z chromosomu X a Y. Normální karyotyp se zapisuje u muže 46, XY, u ženy 46, XX. [17] Obrázek 4.2 Normální mužský karyotyp [19] 16

17 Indikace ke stanovení karyotypu Cytogenetické vyšetření lze doporučit v následujících situacích: Předpokládaná chromosomová abnormalita Mnohočetné vrozené anomálie nebo vývojová retardace Poruchy funkce gonád Neobjasněná mentální retardace Sterilita nebo opakované aborty Narození mrtvého plodu nebo úmrtí novorozence [15] 4.2 MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKA Molekulární cytogenetika využívá metod klasické cytogenetiky ve spojení s molekulární genetikou. Umožňuje detailnější analýzu submikroskopických změn chromosomů Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Techniky FISH slouží ke zjištění přítomnosti či absence určitých sekvencí DNA nebo ke studiu počtu, případně uspořádání chromosomů nebo chromosomových oblastí. [11] Výraz in situ ( na místě ) znamená, že hybridizace probíhá přímo v biologickém materiálu, a nikoliv na izolované DNA. [8] Metody hybridizace in situ jsou založeny na schopnosti vazby jednořetězcové DNA s komplementárními úseky cílové DNA. V minulosti byly sondy pro hybridizaci in situ značeny radioaktivně a jejich detekce se prováděla autoradiograficky. V současné době se nejvíce používají neradioaktivně značené sondy a průkaz navázání sondy se provádí přímou nebo nepřímou fluorescencí ve fluorescenčním mikroskopu. [7] Hybridizaci provádíme tak, že vyšetřovanou DNA a sondu vystavíme působení vysoké teploty (denaturace). Po oddělení řetězců směs ochladíme. Pokud je sonda v dostatečně vysoké koncentraci, váže se ke komplementárním sekvencím ve vyšetřované DNA dříve než původní řetězec a dochází k hybridizaci (spojení dvou nestejných molekul DNA). Přítomnost hledané sekvence se projeví jako fluorescenční signál. Výskyt signálu je důkazem přítomnosti hledané sekvence. Absence jednoho signálu znamená, že chromosom popř. jeho určitý úsek není přítomen (je deletován). Tři signály místo dvou naopak znamenají zmnožení 17

18 (amplifikace) jednotlivých genů, popřípadě celých chromosomů. Metoda může být použita i pro detekci translokací. [8] Velkou výhodou této metody je možnost použití nedělících se (interfázních) buněk, čímž odpadá nutnost kultivace buněk a celý proces se časově zkrátí. [17] Obrázek 4.3 Metoda FISH - jádro lymfocytu obarvené DAPI, centromery chromosomů 13 (zelená) a chromosomů 21(červená) [28] Komparativní genomová hybridizace (CGH) CGH představuje variantu techniky FISH, která umožňuje provádět srovnávací analýzu chromosomových změn v celém genomu. U této metody je izolována a označena hapteny celková genomová DNA vyšetřovaného vzorku, která je použita jako sonda pro in situ hybridizaci s normálními metafázními chromosomy. Simultánně je označena a hybridizována i kontrolní (normální) DNA. Pro označení vyšetřované i kontrolní DNA se používají spektrálně odlišné fluorochromy (např. červená a zelená) rozlišitelné pomocí selektivních filtrů. Po sestavení karyotypu se počítačově vyhodnotí intenzity signálů. Pokud vyšetřovaná DNA neobsahuje žádné změny, všechny chromosomy mají jednotné zbarvení. V případě, že vzorek obsahuje nadbytečný matriál (trisomie, amplifikace), objeví se úseky s převážně zelenou fluorescencí. Úseky, které svítí červeně, znamenají ztrátu genetického materiálu (delece). Poměr intenzit signálů je analyzován nejméně u 10 mitóz. Metodou nelze odhalit chromosomové abnormality, u kterých je množství DNA zachováno (inverze, balancované translokace). [7;9] 18

19 Obrázek 4.4 Příklad výsledku vyšetření metodou CGH [20] Metoda mnohobarevné FISH (multicolour FISH, mfish) Tato metoda je další variantou metody FISH, při níž jsou pěti fluorochromy kombinatoriálním způsobem označeny jednotlivé páry všech chromosomů. Fluorochromy jsou snímány odděleně pomocí pěti filtrů. Počítačový program přiřadí každému chromosomovému páru tzv. pseudobarvu (klasifikační barvu), a tím se získají různé barvy pro všechny homologní páry. [7;11] Obrázek 4.5 Karyotyp zpracovaný metodou mfish [26] 19

20 4.3 MOLEKULÁRNÍ GENETIKA Molekulární genetika je oblast lékařské genetiky zabývající se analýzou DNA. Mezi její metody patří i vyšetření, které umožňuje rychlou detekci aneuploidií vybraných chromosomů QF-PCR QF-PCR neboli kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce. Metoda zahrnuje amplifikaci, detekci a analýzu STR (short tandem repeats), což jsou krátké, několikrát se opakující sekvence v genomu. Pro amplifikaci se používají fluorescenčně značené primery. Primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromosomech neboli markery. Počet kopií každého markeru je úměrný signálu. Vzniklý PCR produkt je separován a analyzován na automatickém genetickém analyzátoru a každý fluorescenční produkt se zobrazí jako peak. [25] Tato metoda umožňuje potvrdit nebo vyloučit numerické odchylky vybraných chromosomů, a to ve velmi krátkém časovém období maximálně dvou dnů. Nejčastěji jde o chromosomy, jejichž numerické abnormality tvoří většinu chromosomových aberací: 13, 18, 21, X a Y. Oproti vyšetření klasického karyotypu však tato metoda nedokáže detekovat numerické abnormality jiných chromosomů, než které jsou součástí příslušného QF-PCR kitu. [22] 20

21 5 PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKA Prenatální diagnostika a screening zahrnuje veškerá vyšetření, testy a kontroly, které žena absolvuje v průběhu těhotenství. Slouží k odhalení některých vrozených vývojových vad (VVV) nebo geneticky podmíněných chorob u plodu. Počátky prenatální diagnostiky spadají do roku 1966, kdy Steele a Breg dokázali, že karyotyp plodu lze určit kultivací buněk z plodové vody. [12] Česká republika patřila v roce 1971 k prvním zemím v Evropě, kde po experimentálním ověření základních metod byla prenatální genetická diagnostika zavedena do klinické praxe. [5] Hlavním úkolem prenatální diagnostiky není pouze prevence narození dětí s těžkými poruchami duševního a tělesného vývoje, ale především umožnit narození dětí, které by se pro zvýšené genetické riziko bez prenatální diagnostiky nikdy nenarodily. (Hájek, 2000) Ke stanovení diagnóz a k odhadu rizika pro genetické poradenství zahrnuje prenatální diagnostika nezbytnou spolupráci více lékařských oborů: gynekologie a porodnictví, ultrasonografie, specializovaných biochemických laboratoří a klinické genetiky. [12] 5.1 METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY V současnosti užívané metody rozdělujeme do dvou skupin: Neinvazivní metody Ultrasonografie ultrazvukové vyšetření (UZ) umožňuje v reálném čase určení stáří, morfologie plodu, identifikaci vícečetných těhotenství a potvrzení životaschopnosti plodu. Toto screeeningové vyšetření je většinou časováno do tří stupňů v , 20-22, a mezi 30 a 34. t.g. Mezi běžné UZ nálezy, které jsou podmíněné chromosomovou aberací, patří ventrikulomegalie, cysty choroidního plexu, hygroma coli cysticum, nuchální edém nebo vady srdce a ledvin. [12;16] o Nuchální translucence (NT) je UZ marker, který slouží pro hodnocení rizika aneuploidie. Jeho měření spočívá v kvantifikaci podkožního projasnění mezi kůží a měkkými tkáněmi překrývajícími krční páteř. Tento screeningový test dokáže odhalit až 80% těhotenství s Downovým syndromem. [12] 21

22 o Nosní kůstka (NB) je další UZ marker asociovaný s chromosomovými změnami. Přibližně u 70 % plodů s trisomií 21 není v týdnu gestace tato kůstka přítomna. [2] Biochemický screening mateřské sérum (MS) obsahuje cenné indikátory, které mají souvislost s VVV plodu. Mezi parametry stanovované v prvním trimestru patří volná podjednotka β-hcg a těhotenský plazmatický protein PAPP-A. Následující biochemické markery se stanovují v tzv. triple testu, který ženy podstupují mezi 15. a 20. týdnem těhotenství. [12; 30] o Alfa-fetoprotein (AFP) je glykoprotein syntetizovaný fetálními játry a žloutkovým váčkem. Jeho syntéza je prokazatelná už od 29. dne po početí. Hladina AFP v MS u gravidních žen je charakterizována pozvolným vzestupem do týdne. Jeho zvýšení může značit poruchy uzávěru nervové trubice u plodu. Nízké hodnoty signalizují možnost chromosomové aberace typu trisomie u plodu. o Lidský choriový gonadotropin (hcg) je glykoprotein složený ze dvou podjednotek alfa a beta. hcg je syntetizován v buňkách syncytiotrofoblastu. Jeho hladina stoupá do 11. týdne, poté prudce klesá o 80 % a na této úrovni zůstává do konce gravidity. Hlavní funkcí hcg je udržování syntézy progesteronu v corpus luteum. Určování hladin hcg, především jeho volné beta-podjednotky, patří k nejdůležitějším vyšetřením nejenom při screeningu chromosomálně podmíněných vad, ale i jiných závažných poruch vývoje gravidity jako je např. mola hydatidosa. Snížené hladiny f-β-hcg svědčí pro riziko vývoje ektopické gravidity či potratu. o Nekonjugovaný estriol (ue3) je jediným markerem abnormálního vývoje plodu, který odráží metabolickou aktivitu fetoplacentární jednotky (Hájek, 2000). Jeho snížení provází gravidity s vývojem plodů postižených Downovým syndromem, s hypofunkcí nadledvin a s anencefalií. [5;16] 22

23 5.1.2 Invazivní metody Amniocentéza (AMC) AMC je ambulantní výkon, při němž je pod UZ kontrolou transabdominálně jehlou odebráno asi 20 ml plodové vody. Provádí se obvykle v období týdne gravidity. Plodová voda obsahuje buňky plodu, které se dají využít ke kultivaci pro diagnostické účely. Kromě vyšetření karyotypu plodu slouží AMC i ke stanovení koncentrace AFP za účelem detekce zvýšeného rizika NTD u plodu. Obecné riziko komplikací, z nichž nejzávažnější je SA po AMC, ve druhém trimestru je 0,5 1 %. [5;12] Obrázek 5.1 Amniocentéza [20] Odběr choriových klků (CVS) CVS zahrnuje transcervikální nebo transabdominální biopsii tkáně vilózní oblasti choria. Choriová tkáň představuje rychle rostoucí kulturu buněk pro cytogenetické vyšetření s možností krátkodobé kultivace. Provádí se mezi 10. a 12. týdnem těhotenství. Množství odebrané tkáně je cca 20 mg. [5;12] Provedení CVS v 9. týdnu je spojeno s třikrát větším výskytem abortů a dalších komplikací než v graviditě nad 10. týden. Množství fetálních ztrát se zvyšuje s počtem opakovaných vpichů jehlou. Riziko komplikací včetně SA u transabdominální CVS je 0,5 1,0 %. U transcervikální CVS je riziko 2,0 4,0 %, a proto se od této metody již ustoupilo. [5] 23

24 Kordocentéza Zákrok, při němž je přímo z pupečníku odebrán vzorek krve plodu. Doporučuje se provádět po 20. týdnu gestace, kdy je pupečník při UZ vyšetření zřetelně viditelný a v. umilicalis je širší. Kordocentéza je indikovaná obvykle až jako následné vyšetření, pokud UZ vyšetření ukázalo nějakou abnormalitu, v časové tísni, nebo při selhání kultivace amniocytů. Vždy je nutné stanovit fetální hemoglobin pro vyloučení kontaminace mateřskou krví. Karyotyp z lymfocytů fetální krve lze předběžně stanovit během 5 dnů. Riziko SA po tomto zákroku je 0,8 1 %. Vzhledem k současným možnostem využití metod molekulární genetiky a molekulární cytogenetiky, se kordocentéza provádí již velmi zřídka. [5;12] Fetoskopie Metoda, umožňující zavedení jehlového fetoskopu s optikou do amniální dutiny. Uplatňuje se ve II. trimestru mezi 17. a 20. týdnem gravidity a slouží k vizualizaci plodu a odběru fetálních vzorků (krev z pupečníku, biopsie svalů, kůže, jater). Metoda je zatížena vysokým rizikem - kolem 6 %. Při současných možnostech UZ a genetické diagnostiky se fetoskopie již prakticky nevyužívá. [5;16] Indikace k invazivnímu prenatálnímu vyšetření Vyšší věk matky v době porodu v kombinaci s další indikací Patologický biochemický screening Patologický UZ nález Chromosomální abnormality de novo u předchozího dítěte Přítomnost již zjištěné chromosomální aberace v rodině Výskyt zjistitelné genetické poruchy v rodině Výskyt X-vázané choroby v rodině Příbuzenství rodičů v rodinách s výskytem recesivní choroby Medikace matky nebo její expozice účinkům teratogenů Abnormální objem amniové tekutiny Prokázané přenašečství určitých chorob u rodičů [15;16] 24

25 5.2 GENETICKÉ PORADENSTVÍ Genetické poradenství, základní činnost v lékařské genetice, se zabývá nejen informováním pacienta a rodiny, ale také poskytuje psychologicky zaměřené poradenství, aby jednotlivcům pomohlo přizpůsobit se vlivu a důsledkům choroby v rodině (Nussbaum, et. al., 2004). Při genetické konzultaci je nutné, aby osoba poskytující genetické poradenství znala anamnézu rodiny, sdělila pacientům charakteristiku dědičného onemocnění, jejich genetické riziko, nabídla diagnostické genetické vyšetření a nastínila různé možnosti léčby nebo prevence ke snížení rizika opakování v rodině a vzniku choroby. Toto nedirektivní poradenství pacientům neříká, jak se mají rozhodnout nebo postupovat, ale místo toho jsou jim poskytnuty informace a podpora. U genetické konzultace před zvažovaným prenatálním vyšetřením je nutné, aby byl pár obeznámen s možností diagnostické metody, možnostmi výsledku a možností obtížně interpretovatelného výsledku nebo nutností dalšího vyšetření. Dále je nutné s rodiči probrat případné možnosti dalšího postupu v případě patologických výsledků. Úkolem prenatální diagnostiky je zjistit, zda je plod postižen daným onemocněním, a rodičům tak může stanovení diagnózy pomoci rozhodnout se pro ukončení gravidity nebo se připravit na případnou péči o postiženého novorozence. [12] 25

26 6 TERATOGENY Populační teratologie je obor zabývající se výskytem VVV v definované populaci a faktory, které tento výskyt ovlivňují. Teratogen je látka, jejíž působení na embryo nebo plod může zapříčinit jeho abnormální vývoj. Účinek teratogenu závisí na dávce, délce a času působení a genetické výbavě plodu i matky. Teratogenní faktory povahy fyzikální, chemické či biologické mohou těžce a trvale ohrozit prenatální a postnatální vývoj dítěte. 6.1 TERATOGENY BIOLOGICKÉ POVAHY Patří sem zejména různí původci infekčních onemocnění. Například prvok Toxoplasma gondii (toxoplasmosa), Rubivirus (zarděnky), Cytomegalovirus, Herpesviry, Treponema pallidum (syfilis), Parvovirus B-19 aj. Nebezpečná mohou být i chronická onemocnění matky například diabetes mellitus, fenylketonurie aj., která v případě nesprávné kompenzace mohou vést k metabolické dysbalanci a negativně působit na vývoj plodu. 6.2 TERATOGENY CHEMICKÉ POVAHY Do této skupiny patří řada látek užívaných v průmyslu či zemědělství (organická rozpouštědla, polychlorované bifenyly, těžké kovy atd.). Významnou skupinou jsou léčiva a léčivé přípravky. Mezi významné teratogeny patří z léků např. cytostatika, dále některá antibiotika (tetracykliny), antiepileptika (fenytoin, valproát), lithium, warfarin, thalidomid, ACE-inhibitory, látky steroidní povahy, retinoidy atd. Významným teratogenem je rovněž alkohol (jeho abúzus v těhotenství způsobuje fetální alkoholový syndrom) a některé další návykové látky. 6.3 TERATOGENY FYZIKÁLNÍ POVAHY Tato skupina zahrnuje hlavně různé typy ionizujícího záření (RTG záření, gama-záření atd.), dále i vysokou teplotu a mechanické teratogeny. Jako pravidlo "Vše nebo nic" je označována reakce časných stádií embrya (embryogeneze) na působení teratogenů. V tomto období nevznikají vrozené vývojové vady, embryo buď dokáže veškeré poškození zreparovat, nebo zanikne. V následujícím období (organogeneze) již působení teratogenů vývojové vady vyvolává. [27] Vliv teratogenů se může projevit již před těhotenstvím, kdy negativní působení na genetický materiál rodičů může zapříčinit poškození DNA i v gametách, a zvýšit riziko vzniku genových nebo chromosomových mutací u potomků. 26

27 7 POTRATY 7.1 DEFINICE Potrat je definován jako vypuzení plodu z dělohy, který nedosáhl schopnosti extrauterinního života. Světová zdravotnická organizace (WHO) doporučuje, aby byla stanovena hranice hmotnosti pro potrat 500g, která odpovídá přibližně 22. týdnu těhotenství. (Čech, 1999) Podle vyhlášky MZ ČSR 11/1988 Sb. o povinném hlášení ukončení těhotenství, úmrtí dítěte a úmrtí matky se potratem rozumí ukončení těhotenství ženy, při němž buď plod neprojevuje ani jednu ze známek života a jeho porodní hmotnost je nižší než 1000 g a pokud ji nelze zjistit, jestliže je těhotenství kratší než 28 týdnů nebo plod projevuje alespoň jednu ze známek života a má porodní hmotnost nižší než 500 g, ale nepřežije 24 hodin po porodu. Další druh potratu je ten, u něhož bylo z dělohy ženy vyňato plodové vejce bez plodu, anebo těhotenská sliznice. Potratem se též rozumí ukončení mimoděložního těhotenství, anebo umělé přerušení těhotenství provedené podle zvláštních předpisů. [23] 7.2 INCIDENCE Odhaduje se, že spontánním potratem končí % všech klinicky uznaných těhotenství. Skutečný výskyt je zřejmě vyšší, protože více než 40 % koncepcí končí ještě v době před stanovením diagnózy gravidity. Odhaduje se, že chromosomální abnormality jsou příčinou až u 50 % potratů. Drtivá většina těchto chromosomálních abnormalit jsou numerické aberace (~ 86%), včetně trisomií, monosomií a polyploidií. Tyto chromosomové aneuploidie většinou vznikají de novo, přičemž riziko opakování stejné změny je minimální. K většině SA (asi 80%) dochází mezi 7. a 11. týdnem gestace, tedy v prvním trimestru gravidity. Frekvence potratů se snižuje s rostoucím gestačním věkem. Četnost spontánních potratů se dále zvyšuje s věkem matky. Následující graf ukazuje celkový počet potratů v ČR za jednotlivé roky. [6;10;18] 27

28 Graf 7.1 Celkový počet potratů v ČR Rozdělení potratů podle mezinárodní klasifikace nemocí 1) Potrat samovolný, spontánní (abortus spontaneus, SA) 2) Potrat indukovaný, legální, terapeutický (abortus inductus) 7.3 SPONTÁNNÍ POTRATY Nejčastější příčiny SA jsou: - Defektní plodové vejce nejčastěji se jedná o chromosomální trisomie, monosomie, triploidie a teraploidie - Mateřské příčiny o Hormonální příčiny o Malformace dělohy o Záněty a nádory dělohy o Myomy lokalizované submukózně o Onemocnění matky o Infekce o Otravy o Imunologické faktory o Trauma Z klinického hlediska rozdělujeme podle průběhu SA na nekomplikovaný a komplikovaný. Zamlký potrat (missed abortion, MA) je jedním z komplikovaných potratů. Plodové vejce je odumřelé, někdy odloučené, není však dělohou vypuzeno. Žena po určité době amenorey 28

29 začne krvácet, trpí nechutenstvím, únavou, má zvýšené teploty, což jsou projevy intoxikace způsobené částečným vstřebáváním tkání odumřelého plodového vejce. [3] Opakované (habituální) potrácení je charakterizováno 3 a více následnými samovolnými potraty. Postihuje asi 1% žen v reprodukčním věku. [29] 7.4 INDUKOVANÉ POTRATY Umělé přerušení, ukončení těhotenství (UPT,UUT) Lze provést podle zákona 66/1986 do konce 12. týdne těhotenství pouze na žádost těhotné ženy nebo ze zdravotních důvodů. Je-li během těhotenství zjištěno závažné genetické poškození plodu, lze těhotenství přerušit až do 24 týdne těhotenství. Bez omezení lze těhotenství uměle ukončit v případě, kdy samotné těhotenství ohrožuje ženu na životě, nebo bylo-li prokázáno, že plod se již dále nevyvíjí, nebo je-li prokázáno těžké poškození plodu. [24] Miniinterrupce Jedná se o umělé ukončení těhotenství prováděné vakuovou aspirací. Tato metoda je pro ženu šetrnější a lze ji provést v raném stádiu těhotenství tj. do sedmého týdne u prvorodičky a do osmého týdne u druhorodičky Mimoděložní těhotenství Vzniká při uhnízdění oplodněného vajíčka mimo dělohu, většinou ve vejcovodu, popř. též ve vaječníku či dutině břišní. Následující grafy ukazují rozdělení druhů potratů v ČR za jednotlivé roky. 29

30 Graf Rozdělení potratů podle druhu [13] 30

31 PRAKTICKÁ ČÁST 8 METODIKA ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ Z POTRACENÝCH PLODŮ Stanovení karyotypu plodu z kožních fibroblastů se provádí u spontánních potratů či potratů indukovaných při patologickém nálezu. 8.1 ODBĚR MATERIÁLU Výchozím materiálem pro cytogenetické vyšetření potraceného plodu je vzorek kůže bez podkoží (nejčastěji ze zad plodu) o velikosti asi 1 x 1 cm. Kůže je odebírána do sterilní zkumavky s 5 ml transportního média. Obrázek 8.1 Zkumavka s kůží v médiu Označené a zabalené zkumavky jsou doručeny do laboratoře. Odběr provádí gynekologické pracoviště nebo patologicko-anatomický ústav. Jako žádanka slouží papírová indikace k provedení výkonu z OLG nebo od gynekologa. Viz příloha č EVIDENCE MATERIÁLU Odebrané vzorky se přijímají od sanitní služby. Údaje o pacientce se zapíší do knihy pacientů a založí se složka na dokumentaci vyšetření. Viz příloha č

32 8.3 KULTIVACE Zpracování se provádí v laminárním boxu. Obrázek 8.2 Laminární box Jouan třída II Biohazard Vzorek kůže z potraceného plodu se přenese ze zkumavky do plastové Petriho misky a opláchne se několika ml kultivačního média, které se následně odsaje. Obrázek 8.3 Kůže přenesená do Petriho misky 32

33 Pomocí očních nůžek nebo skalpelu se vzorek kůže rozdělí na fragmenty o velikosti asi 1 x 1 mm (obr.č.8.4). Je nutné odstranit tukovou tkáň. Obrázek 8.4 Stříhání kůže Fragmenty se přenesou do dvou kultivačních lahviček (obrázek č. 8.5) s minimálním množstvím kultivačního média (pouze navlhčené dno), označených číslem a jménem pacientky. Obrázek 8.5 Kultivační lahvička 33

34 Obrázek 8.6 Kultivační lahvičky s fragmenty kůže a malým množstvím média Kultivační lahvičky se umístí do termostatu s regulovatelným přívodem CO 2 při 37 C/5% CO 2 a ponechají se v klidu 3 dny. Obrázek 8.7 Kultivační lahvičky v termostatu 34

35 Po třech dnech se přidá 1 ml kultivačního média. Po pěti dnech se doplní médium na celkový objem 5 ml. Obrázek 8.8 Výměna kultivačního média Denně se kontroluje růst pod inverzním mikroskopem. Kultivační médium se mění 3x týdně. Po dosažení požadované hustoty nárůstu kultury se přidá do média 0,5 ml 0,025% roztoku kolchicinu v H 2 0 a nechá se inkubovat 4 hodiny při 37 C v termostatu. 8.4 VLASTNÍ ZPRACOVÁNÍ Obsah kultivační lahvičky se slije do předem označených zkumavek. Každá lahvička se opláchne malým množstvím 0,08% roztoku trypsinu ve versenu a obsah se přidá do příslušné zkumavky. Pokud je třeba, použije se k uvolnění buněčných kolonií z kultivační lahvičky buněčná škrabka (obr. č. 8.9). 35

36 Obrázek 8.9 Sklizeň kultury pomocí roztoku trypsinu a buněčné škrabky Zkumavky se odstředí 10 minut při 1000 ot./min a supernatant se odsaje. Do lahvičky se přidá malé množství (1ml) 0,08% roztoku trypsinu ve versenu a inkubuje 10 minut při 37 C. Působení trypsinu se přeruší přidáním 1 ml 37 C teplého hypotonizačního roztoku sestávajícího z média ředěného vodou pro injekce v poměru 3:1. Hypotonizační roztok obsahující nakultivované buňky se přidá do zkumavky se sedimentem ze slitého média. Lahvička se 2x opláchne asi 3 ml hypotonizačního roztoku a obsah se vždy přidá do zkumavky se sedimentem. Inkubuje se 30 min při 37 C. Hypotonizace se zastaví přikápnutím 10 kapek fixačního roztoku (metanol s kyselinou octovou v poměru 3:1), opatrně se promíchá. Zkumavky se odstředí 10 minut při 1000 ot./min a supernatant se odsaje. K sedimentu se přidají po částech 3 Pasteurovy pipety fixačního roztoku, promíchá se a ponechá 10 minut v chladničce. Zkumavky se odstředí 10 minut při 1500 ot./min a supernatant se odsaje. K sedimentu se přidají dvě Pasteurovy pipety fixačního roztoku a ponechá se 20 minut v chladničce. 36

37 Obrázek 8.10 Přidání fixačního roztoku Znovu se odstředí po dobu 10 minut při 1500 ot./min a supernatant se odsaje. Nakonec se k sedimentu přidají dvě Pasteurovy pipety fixačního roztoku se 3-10 kapkami kyseliny octové a zkumavky se nechají do druhého dne v chladničce. 8.5 PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ Suspenze se odstředí 10 minut při 1500 ot./min, dále se resuspenduje ve fixačním roztoku do mléčného zakalení. Poté se suspenze nakape na podložní skla a nechá zvolna usušit. 37

38 Obrázek 8.11 Kapání suspenze na podložní skla 8.6 PRUHOVÁNÍ G-PRUHY Nakapaná skla se předsuší 20 minut při 80 C. Dále se vloží do kyvety s trypsinem (4 ml 2% roztoku trypsinu ve versenu do 70 ml Sörensenova pufru) na několik vteřin. Následuje 2x oplach v Sörensenově pufru. Skla se vloží do kyvety s barvícím roztokem (5 ml Giemsova barviva do 70 ml Sörensenova pufru) na 1 minutu. Obrázek 8.12 Pruhování preparátů 38

39 Skla se opláchnou pod tekoucí vodou, poté destilovanou vodou. Preparáty se prohlédnou v mikroskopu a doba denaturace a barvení se upraví dle stupně denaturace a intenzity barvení. Preparáty se hodnotí přímo v mikroskopu, a to 20 mitos obou paralelních kultur, z toho 5 detailně. Ke každému vyšetření se provede dokumentace pomocí karyotypovacího systému LUCIA. Normální hodnoty normální ženský karyotyp: 46, XX normální mužský karyotyp: 46, XY K popisu cytogenetických nálezů slouží standardizovaný systém nomenklatury ISCN (1985): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelmanf (ed), S. Karger, Basel, Výsledky jsou zadávány do nemocničního informačního systému AMIS a formou papírového protokolu předány do genetické ambulance. V případě kontaminace nebo kultivačního neúspěchu není možné vyšetření zopakovat, protože nelze provést další odběr materiálu. [14] Od roku 2009 je doručený vzorek rozdělen na dvě části a v případě neúspěšné kultivace je tkáň vyšetřena pomocí metody QF-PCR. 39

40 9 STATISTICKÁ KAPITOLA 9.1 CHARAKTERISTIKA SOUBORU Dle údajů publikovaných v ÚZIS došlo v Jihomoravském kraji v období 2007 až 2009 celkově k potratům. Náš soubor tvoří 156 vzorků z potracených plodů, které byly na OLG FN Brno zpracovány v letech 2007 až V roce 2007 je to 66 vzorků, v roce vzorků a v roce vzorků. 9.2 SBĚR DAT Veškerá získaná data jsou uvedena v tabulkách na konci práce jako přílohy č Podrobné údaje o jednotlivých vzorcích za rok 2010 jsem neměla k dispozici, z důvodů neuzavření případů v době zpracování práce, ale v kontextu jsou celková čísla v grafu uvedena pro větší přehlednost a zvýšení statistické významnosti. 9.3 METODIKA U všech vzorků bylo provedeno cytogenetické vyšetření stanovení karyotypu s využitím metody tzv. G-pruhování (viz kap. 8). Graf č.9.1 ukazuje úspěšnost kultivací za jednotlivé roky v absolutních číslech. Graf 9.1 Úspěšnost kultivace za jednotlivé roky V roce 2007 bylo zpracováno 66 vzorků, z toho u 39 byl stanoven karyotyp a ve třech případech byl tento karyotyp patologický (vzorky 3;4;26). V roce 2008 bylo zpracováno 50 vzorků, z toho u 28 byl stanoven karyotyp a ve třech případech byl patologický (vzorky 35; 49; 50). V roce 2009 bylo zpracováno 40 vzorků, u 20 z nich byl stanoven karyotyp, který byl 40

41 ve dvou případech patologický (vzorky 1;24). V celém souboru byl tedy zjištěn patologický karyotyp u 8 vzorků. Data o úspěšnosti kultivace a patologických karyotypech jsou shrnuty v následujících tabulkách. Rok Celkem vzorků Stanoveno Nestanoveno Počet patologických karyotypů Úspěšnost kultivace % % % % Tabulka 9.1Přehled vzorků a úspěšnosti stanovení za jednotlivé roky Karyotyp Počet 47, XY , XX , XY , XYY 2 69, XXY 1 92, XXXX 1 Celkem 8 Tabulka 9.2 Přehled patologických karyotypů za období Z grafu č.9.1 lze vyčíst, že úspěšnost stanovení karyotypu mírně klesá, což může být způsobeno vyšším procentem zmlklých těhotenství z celkového množství potratů, jak ukazuje graf č.9.2. Graf 9.2 Zvyšující se počet MA 41

42 Možným důvodem selhání kultivace je znehodnocená tkáň, která u zmlklých těhotenství a materiálů z revizí dutin děložních rostě hůře nebo vůbec. Velmi záleží na době mezi zmlknutím těhotenství a vlastním abortem. Často se zmlklé těhotenství diagnostikuje až po delší době, a pak je plod značně macerovaný a tkáň je ke kultivaci nepoužitelná. Stupeň macerace je pro kultivaci podstatný. V případě vyšších týdnů u indukovaných abortů mohou růst vzorku inhibovat prostaglandiny, které se používají k urychlení zrání porodních cest. Snižuje se i každoroční počet zpracovaných vzorků, v souvislosti s nízkým počtem indikací k odběru od gynekologů nebo odmítnutím odběru pacientkami. Vzhledem k rozvoji moderních vyšetřovacích metod v lékařské genetice a pro zlepšení úspěšnosti vyšetření, je na OLG FN Brno od roku 2009 doručený vzorek tkáně rozdělen na dvě části. Jedna je použita ke klasickému cytogenetickému vyšetření a druhá odeslána k molekulárně genetickému vyšetření metodou QF-PCR, které se provádí v případě selhání kultivace biologického materiálu. Dostupné výsledky za rok 2009 jsou uvedeny pro srovnání v následující tabulce. Vzorek Cytogenetika QF-PCR 8 nestanoven 47,XY nestanoven 47,XY nestanoven 46,XY 31 nestanoven 46,XY 32 nestanoven 47,XX nestanoven 46, XX 37 nestanoven 46, XX 38 nestanoven 69,XXY 39 nestanoven 46, XX Tabulka 9.3 Srovnání výsledků stanovení karyotupu Z 9 vzorků, u kterých nebyl klasickou cytogenetickou metodou karyotyp stanoven, byl pomocí metody QF-PCR zjištěn 4x patologický karyotyp plodu. Metoda QF-PCR nezahrnuje vyšetření celého karyotypu, ale dokáže rychle a bez nutnosti kultivace životaschopných buněk detekovat trisomie autosomů 13, 18 a 21 případně i 15, 16, 22 a aneuploidie gonosomů X a Y. Tato metoda nedokáže plně nahradit klasické cytogenetické vyšetření karyotypu, neboť nedokáže detekovat všechny typy případných chromosomových abnormalit. Aneuploidie 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y však představují cca 95% patologických karyotypů, které u plodů detekujeme. 42

43 10 ZÁVĚR Cílem práce bylo seznámit se s metodami užívanými pro cytogenetické vyšetření potracených plodů. Byla popsána struktura chromosomů, jednotlivé metody klinické genetiky a metody prenatální diagnostiky. Dalším cílem práce bylo vyhodnotit patologické nálezy a úspěšnost kultivace na OLG FN Brno a porovnat stanovení chromosomových abnormalit klasickými cytogenetickými metodami se stanovením pomocí metod molekulárně genetických. V práci byla provedena analýza výsledků vyšetření za období 2007 až Z výsledků vyplývá snižující se úspěšnost kultivace, která může být způsobená vyšším počtem zmlklých těhotenství. Plod je macerovaný a tkáň je díky tomu ke kultivaci a klasickému cytogenetickému vyšetření nepoužitelná. Z celkového zkoumaného souboru byla klasickou metodou karyotypování zjištěna závažná odchylka v karyotypu u 8 vzorků. Karyotyp rodičů v případě patologického nálezu karyotypu u plodu byl buď normální, nebo nebyl na OLG FN Brno stanoven, ale jeho vyšetření se u rodičů vždy doporučuje. Ke zlepšení úspěšnosti byla použita metoda QF-PCR, ze které byl výsledek ve všech devíti případech stanoven, a u čtyř vzorků odhalila patologický karyotyp plodu. Vzhledem k tomu, že vzorky ze spontánních abortů, se testují metodou QF-PCR pouze při selhání kultivace buněk u karyotypování, nelze tyto dvě metody porovnat, ale z výsledků vyplývá, že kombinací použitých metod se zvyšuje záchyt jak normálních, tak patologických karyotypů. Cíle práce byly splněny. Výsledky sledovaného souboru potvrzují nezastupitelnou úlohu stanovení karyotypu plodu, neboť můžou poskytnout cennou informaci o příčině potratu. To umožní snížit negativní vliv na psychiku ženy a zároveň doporučit páru genetickou konzultaci s nabídkou preventivných postupů nebo cílených prenatálních vyšetření pro plánování dalšího těhotenství. 43

44 11 LITERATURA [1] BRYŠOVÁ, V. Základy klinické genetiky : pro studující 4. ročníku lékařské fakulty. Edtion ed. Brno: Masarykova univerzita-lékařská fakulta, s. p. ISBN [2] CICERO, S., CURCIO, P., PAPAGEORGHIOU, A., SONEK, J. AND NICOLAIDES, K. Absence of nasal bone in fetuses with trisomy 21 at weeks of gestation: an observational study. Lancet, Nov 2001, vol. 358, no. 9294, p [3] ČECH, E., HÁJEK, Z. et al. Porodnictví. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, s.isbn [4] GERSEN, S.L. AND KEAGLE, M.B. The principles of clinical cytogenetics. Edtion ed. Totowa, N.J.: Humana Press, xiii, 596 p. p. ISBN [5] HÁJEK, Z., KULOVANÝ, E. AND MACEK, M. Základy prenatální diagnostiky. Edtion ed. Praha: Grada, s., 428 s. obr. příl. p. ISBN X [6] HUDEČEK, Robert - KRAJČOVIČOVÁ, Renata - VENTRUBA, Pavel. Aktuální farmakologické možnosti embryoprotektivní terapie infertilních žen. Klinická farmakologie a farmacie, Solen, Solen. ISSN , 2009, vol. 2009/23, no. 2, s [7] KLENER, P. Vnitřní lékařství. Edtion ed. Praha: Galén Karolinum, s. p. ISBN X (Galén) [8] KOČÁREK, E. Genetika : obecná genetika a cytogenetika, molekulární biologie, biotechnologie, genomika. Edtion ed. Praha: Scientia, s. p. ISBN [9] KUGLÍK, P. Vybrané kapitoly z cytogenetiky. Edtion ed. Brno: Masarykova univerzita, s. p. ISBN [10] MENTEN, B., SWERTS, K., DELLE CHIAIE, B., JANSSENS, S., BUYSSE, K., PHILIPPE, J. AND SPELEMAN, F. Array comparative genomic hybridization and flow cytometry analysis of spontaneous abortions and mors in utero samples. Bmc Medical Genetics, Sep 2009, vol

45 [11] MICHALOVÁ, K. Úvod do lidské cytogenetiky. Edtion ed. V Brně: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, s. p. ISBN [12] NUSSBAUM, R.L., MCINNES, R.R., WILLARD, H.F., THOMPSON, J., THOMPSON, M.W. AND GOETZ, P. Klinická genetika : Thompson & Thompson : 6. vyd. Edtion ed. Praha: Triton, , lix s. p. ISBN [13] Potraty-Praha : Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR, ISSN [14] Pracovní postup OLG: Vyšetření karyotypu z kožních fibroblastů [15] PRITCHARD, D.J. AND KORF, B.R. Základy lékařské genetiky. Edtion ed. Praha: Galén, s. p. ISBN [16] ROZTOČIL, A. Vyšetřovací metody v porodnictví a gynekologii. Edtion ed. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, s. p. ISBN [17] SRŠEŇ, Š. AND SRŠŇOVÁ, K. Základy klinickej genetiky. Edtion ed. Martin: Vydavateľstvo Osveta, s. p. ISBN

46 Internetové zdroje: [18] PUSCHECK, E. Early Pregnancy Loss, URL: [ ] [19] Mužský karyotyp, URL: yotype.png [ ] [20] Comparative Genomic Hybridization, URL: [ ] [21] Amniocentéza, URL: [ ] [22] [ ] [23] Vyhláška ministerstva zdravotnictví ČSR o povinném hlášení ukončení těhotenství, úmrtí dítěte a úmrtí matky, URL: [ ] [24] %C3%A1kon%20o%20specifick%C3%BDch%20zdravotnick%C3%BDch%20slu%C5 %BEb%C3%A1ch.pdf [ ] [25] Analýza časných potratů, URL: [ ] [26] FISH images, URL: [ ] [27] Příčiny vrozených vad a teratogeny, URL: [ ] [28] Fluorescence microscope, URL: [ ] [29] Krajčovičová, R., Hudeček, R., Kalvodová, J., Diferenciální diagnostika a terapie opakovaných těhotenských ztrát, Prakt Gyn 2007;11(4), URL: [ ] [30] [ ] 46

47 12 SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1 Tabulka rok 2007 Příloha 2 Tabulka rok 2008 Příloha 3 Tabulka rok 2009 Příloha 4 Žádanka k vyšetření kožní biopsie Příloha 5 Dokumentace kultivace a hodnocení Příloha 6 Souhlas s genetickým vyšetřením 47

48 Příloha č. 1 Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 1 MA kůže 16 nestanoven 2 MA kůže 18 nestanoven 3 UPT kůže 13 47,XX,16qh+,+18 VVV 4 UPT CVS 13 47,XY,+21 46,XX non MT 46,XY 1x MA v anamnéze 5 UPT kůže 23 nestanoven 6 SA kůže 15 nestanoven 46,XX,21ps+ 46,XY,9qh+ předchozí SA v anamnéze 7 SA kůže 22 46,XX 46,XX non MT 46,XY,15ps+ non MT ruptura amnia a sy amniálních pruhů 8 MA kůže 22 nestanoven gravidita po IVF 9 MA kůže 22 nestanoven gravidita po IVF 10 MA CVS 9 nestanoven 46,XX,15ps+ 46,XY 11 UPT kůže 19 46,XY předčasný odtok PV 12 MA kůže 20 46,XX 13 MA CVS 20 nestanoven 14 UPT kůže 20 nestanoven VVV 15 UPT CVS 20 nestanoven VVV 16 SA kůže 22 nestanoven 17 UPT kůže 23 46,XY pat.uz nález - VCC 18 UPT kůže 21 nestanoven nedostatek hod.mat. 19 UPT kůže 13 46,XX VVV 20 UPT CVS 13 nestanoven VVV 21 MA kůže 9 46,XX 22 UPT kůže 23 46,XX VVV 23 SA kůže 20 46,XX 46,XX 46,XY gravidita po IVF 24 SA kůže 20 46,XX 46,XX 46,XY gravidita po IVF 25 MA pl.vejce 11 46,XX 46,XX non MT 46,XY 1x MA v anamnéze

49 26 UPT kůže 20 47,XY,+18 46,XX 46,XY UZ - VVV Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 27 UPT kůže 16 46,XY pitva - akutní chorioamnionitida 28 SA kůže 22 46,XY 29 SA kůže 18 46,XY 46,XX,21ps+,22ps+ heterozygot 46,XY non MT akutní chorioamnionitida, 2x SA 30 UPT kůže 21 46,XX 46,XX non MT 46,XY VVV, FISH + del22q11 (Di George) 31 UPT kůže 21 46,XY VVV 32 UPT CVS 21 nestanoven VVV 33 UPT CVS 13 nestanoven 46,XX non MT 46,XY non MT gravidita po IVF; Ž - 6% aber.bb. 34 UPT kůže 17 46,XX 35 UPT kůže 17 46,XX hodnoceno pouze početně 36 UPT kůže 20 46,XY předčasný odtok PV 37 SA kůže 15 nestanoven 38 UPT kůže 21 46,XY VVV - ageneze ledvin 39 UPT kůže 12 46,XX 46,XX heterozygot 46,XY,9qh+,21ps+ non MT UPT pro acranius plodu 40 SA kůže 21 46,XY gravidita po IVF 41 MA kůže 15 nestanoven 42 UPT kůže 16 46,XY VVV 43 SA kůže 21 nestanoven 46,XX,9ps+,14ps+ heterozygot pitva - chorioamnitida 44 UPT kůže 17 46,XX abúzus kokainu 45 MA kůže 21 nestanoven 46,XX,22ps+ non MT 46,XY kontaminovaný vzorek 46 SA kůže 21 nestanoven 46,XX[194]/ 45,X[6] heterozygot gravidita po IVF 47 MA kůže 16 nestanoven 46,XX heterozygot 46,XY 1x MA v anamnéze 48 SA kůže 7 46,XX 46,XX non MT 46,XY non MT Ž - Elisa + chlamydie 49 UPT kůže 21 46,XY 46,XX non MT 46,XY non MT VVV 50 UPT kůže 17 nestanoven VVV, diabetická embryopatie 51 SA kůže 16 nestanoven 52 UPT kůže 20 nestanoven VVV CNS

50 53 SA kůže 22 46,XX,22ps+ gravidita po IVF 54 SA kůže 22 46,XX,22ps+ gravidita po IVF Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 55 UPT kůže 20 46,XX 46,XX heterozygot 46,XY,16qh+ heterozygot 56 MA CVS 9 46,XX 46,XX non MT 57 MA kůže 9 46,XX non MT Ig G Toxoplazma + 58 SA kůže 21 46,XY 46,XX,22ps+ non MT 46,XY non MT Ž - 5% aber.bb. 59 UPT kůže 23 46,XX 60 MA kůže 16 nestanoven 1x SA v anamnéze 61 MA CVS 11 46,XX 46,XX 46,XY non MT Ž - 0% aber.bb. 62 SA kůže 20 46,XY 1x SA v anamnéze 63 SA kůže 22 46,XY 64 MA kůže 23 nestanoven Ž - antifosfolip. sy 65 SA kůže 23 46,XX 66 MA kůže 15 nestanoven

51 Příloha č. 2 Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 1 UPT kůže 17 46,XX 2 SA kůže 13 nestanoven infekce kultury 3 SA kůže 17 46,XX 1x SA v anamnéze 4 UPT kůže 19 46,XX,inv(9qh) 5 UPT kůže 21 46,XY získáno jen 5 mitóz 6 UPT kůže 18 46,XY 7 MA kůže 22 nestanoven non MT 8 MA CVS 22 46,XY,22ps+ non MT 9 SA kůže 20 46,XY 46,XX,9qh+,13ps+ předčasný odtok PV 10 SA CVS 20 46,XY předčasný odtok PV 11 UPT kůže 17 46,XX VVV 12 UPT kůže 23 nestanoven VVV 13 UPT kůže 21 nestanoven VVV 14 MA kůže 23 nestanoven 15 UPT kůže 12 nestanoven infikovaný materiál 16 MA kůže 20 nestanoven 17 UPT kůže 23 nestanoven VVV 18 SA kůže 16 nestanoven 19 UPT kůže 20 46,XY patologický UZ nález 20 SA kůže 19 46,XX,22ps+ heterozygot 46,XY,9qh+ 2x SA v anamnéze 21 UPT kůže 19 nestanoven patologický UZ nález 22 MA CVS 12 46,XX 23 MA kůže 16 nestanoven 46,XX heterozygot 46,XY 2x MA v anamnéze 24 SA kůže 23 nestanoven 25 UPT kůže 21 nestanoven 26 MA kůže 16 nestanoven AFP v PV

52 Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 27 UPT kůže 20 46,XX patologický UZ nález VVV 28 UPT kůže 14 46,XX 29 SA kůže 19 46,XX gravidita po IVF 30 SA kůže 19 46,XY gravidita po IVF 31 SA kůže 14 46,XY 32 SA kůže 14 46,XY 33 SA kůže 14 46,XY 34 SA kůže 23 46,XY 92,XXXX [25]/ 35 MA kůže 10 46,XX[11] 36 MA kůže 20 46,XX předchozí SA v anamnéze 37 MA kůže 11 nestanoven 46,XX 46,XY non MT 1x MA v anamnéze 38 MA kůže 18 nestanoven 39 SA kůže 18 46,XY 40 MA kůže 22 nestanoven 46,XX non MT 46,XY non MT pozitivní bch. screening 46,XX[169]/ 41 MA kůže 12 nestanoven 47,XXX[1] heterozygot 46,XY 42 MA CVS 8 nestanoven 2x SA v anamnéze 43 MA kůže 17 nestanoven 44 MA kůže 39 nestanoven 45 UPT kůže 15 nestanoven 46,XX,22ps+ non MT patologický UZ nález 46 MA CVS 8 46,XX,21ps+ 46,XX,21ps+ 46,XY,9qh+ 2x SA v anamnéze 47 SA kůže 14 46,XX 48 UPT kůže 23 46,XY předčastný odtok PV 49 UPT kůže 16 47,XYY 46,XX 46,XY,9qh+ 50 UPT kůže 16 47,XYY 46,XX 46,XY,9qh+

53 Příloha č. 3 Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 1 MA CVS 10 47,XX,+18 46,XX non MT 46,XY,15ps+ v rodině Hunting.chorea 2 MA CVS 8 nestanoven 46,XX,14ps+ non MT 46,XY,9qh+,13ps+ 2x MA v anamnéze 3 SA kůže 16 46,XX 4 UPT kůže 18 46,XX Ž - epileptička 5 UPT kůže 16 nestanoven 46,XX non MT 46,XY VVV 6 SA kůže 17 46,XY gravidita po IVF 7 SA kůže 16 46,XX 8 UPT kůže 22 nestanoven non MT 9 MA kůže 17 46,XX 10 MA kůže 16 46,XX 46,XX non MT 46,XY 11 UPT kůže 21 46,XX 12 SA kůže 21 46,XY 13 UPT kůže 18 nestanoven VVV 14 UPT kůže 19 nestanoven infikovaný materiál 15 UPT CVS 12 46,XX 46,XX[167]/ 45,X[3] heterozygot patologický UZ nález 16 MA kůže 15 nestanoven 17 MA CVS 8 46,XX 46,XX non MT 46,XY non MT 3x MA v anamnéze 18 UPT kůže 19 46,XY 46,XX,13ps+ heterozygot 46,XY 1x SA v anamnéze 19 UPT kůže 14 46,XY VVV 20 MA pl.vejce 10 nestanoven 46,XX[98]/ 45,X[2] 46,XY 3x SA v anamnéze 21 UPT kůže 19 46,XY,22ps+ 22 MA kůže 17 46,XX non MT gravidita po IVF 23 SA kůže 17 46,XX 24 UPT kůže 11 69,XXY VVV 25 MA CVS 8 nestanoven 3x MA v anamnéze 26 MA CVS 9 nestanoven 46,XX non MT 46,XY 2x SA v anamnéze

54 Vzorek Dg. Materiál t.g. Karyotyp plodu Karyotyp matky CFTR matka Karyotyp otce CFTR otec Poznámka 27 MA kůže 12 nestanoven non MT CMV Elisa IgG + 28 UPT CVS 13 nestanoven 46,XX non MT 46,XY non MT 29 MA CVS 17 nestanoven 30 MA kůže 20 nestanoven 31 MA CVS 20 nestanoven 32 MA CVS 15 nestanoven 46,XX,21ps+ 46,XY non MT 33 MA CVS 31 nestanoven 34 SA kůže 18 nestanoven 35 SA kůže 18 46,XY 36 SA kůže 17 46,XX 37 UPT kůže 21 nestanoven 46,XX non MT 38 MA CVS 12 nestanoven 46,XX non MT 46,XY,13ps+ non MT předchozí SA v anamnéze 39 MA CVS 11 nestanoven non MT 47,XXY 40 SA kůže 19 46,XX 46,XX heterozygot 46,XY heterozygot

55 Příloha č. 4

56 Příloha č. 5