ÚVOD. Úvod ke struktuře nukleových kyselin Struktura DNA Replikace DNA Opravy DNA

Transkript

1 NUKLEVÉ KYSELINY

2 ÚVD Úvod ke struktuře nukleových kyselin Struktura DNA Replikace DNA pravy DNA *

3 Základní pojmy struktury nukleových kyselin Nukleotidy mohou být spojovány do řetězců ve formě ribonukleové kyseliny (RNA) nebo deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Nukleové kyseliny jsou řetězce nukleotidů spojených fosfátovým můstkem mezi polohami 3 a 5 sousedních ribosových jednotek. NK = lineární polymery nukleotidů. Fosfáty polynukleotidů jsou kyselé při fyziologickém ph a nukleové kyseliny jsou polyanionty.

4 Chemická struktura nukleové kyseliny bjasněna na počátku 50. let 19 století Spojení mezi jednotlivými nukleotidy se nazývá fosfodiesterová vazba. Koncový nukleotidový zbytek, jehož C5 není dále již vázán se nazývá 5 konec. Analogicky 3 konec. Sekvence nukleotidů v nukleové kyselině se píše zleva doprava od 5 konce ke 3 konci. 5 konec - - P 5 4 N N CH 2 H H 3 2 H - P NH 2 H N N H 5 1 CH 2 H H - P 3 3 HN 2 A H H 1 N H 6 1 CH 2 H H P 3 CH 3 N 2 H NH 2 N H H HN H 2 N U(T) CH 2 H H H N H C H N N H 1 G 3 konec

5 Centrální dogma molekulární biologie léta 19 století Informační tok při expresi dědičné informace DNA RNA protein

6 Zjednodušené schéma struktury nukleové kyseliny paucg Písmeno p před názven tetranukleotidu reprezentuje fosfát na 5 konci. Vertikální čáry reprezentují ribosy, připojené báze jsou označeny písmenem, diagonální čáry s písmenem p reprezentují fosfodiesterové vazby. Čteme zleva do prava paucg Deoxy ekvivalent se liší pouze absencí 2 -H a záměnou U za T, např. dpatcg. A U C G 2 H 2 H 2 H 2 H H P P P P

7 Báze H P + Báze H P + P + Báze H RNA Báze H P + Báze H P + P + Báze H DNA Řetězec DNA a RNA

8 Stabilita nukleových kyselin RNA je na rozdíl od DNA vysoce citlivá na bazickou hydrolýzu DNA nemá 2 -H na ribose - je chemicky stabilnější

9 Skladba bází deoxyribonukleové kyseliny DNA mají stejné počty adeninů a thyminů (A = T) guaninů a cytosinů (G = C). Tato shoda se nazývá Chargaffovo pravidlo. Experimentálně zjištěné poměry složení bází A : T G : C A : G Člověk 1,00 1,00 1,56

10 Základní charakteristika DNA Charakteristickou vlastností přirozeně se vyskytující DNA je její délka. Je poskládána z velkého množství nukleotidů nese genetickou informaci. Genom E. coli je jedna DNA složená ze dvou řetězců obsahujících 4,6 milionů nukleotidů DNA vyšších organismů je mnohem delší. Lidský genom obsahuje přibližně 3 biliony nukleotidů rozdělených do 24 různých DNA molekul: 22 autosomních a 2 typy pohlavních chromosomů (X a Y).

11 Základní charakteristika DNA Velikost některých molekul DNA

12 Dvojitá šroubovice DNA Další podstatnou vlastností DNA je replikace - tvorba dvou kopií nukleové kyseliny z jedné. To umožňuje párování bází. Problém specifického párování bází byl vyřešen při studiu prostorové (třírozměrné) struktury DNA. Chargaffova pravidla - DNA mají stejné počty adeninů a thyminů (A = T) a stejné počty guaninů a cytosinů (G = C). Maurice Wilkins a Rosalinda Franklin získali rentgenové difrakční snímky vláken DNA a z těchto snímků se vydedukovalo, že DNA je dvoušroubovice!!! James Watson a Francis Crick z těchto a dalších dat sestavili model DNA (1953, Nature, London).

13 Dvojitá šroubovice DNA (B-DNA) Dva helikální polynukleotidové řetězce se otáčí kolem společné osy. Řetězce se vinou antiparalelně. Vazby sacharidu s fosfáty jsou na vnější straně šroubovice Purinové a pyrimidinové báze leží uvnitř šroubovice. Báze jsou kolmé na osu šroubovice. Sousední báze jsou od sebe vzdáleny 3,4 Å. Helikální struktura se opakuje každých 34 Å, což je 10 bází (= 34 Å na závit / 3,4 Å na bázi). Rotace 36 o na bázi (360 o na celý závit). Průměr helixu je 20 Å. Komplementární párování bazí (vodíkové můstky)

14 Struktura DNA

15 Watson-Crickův model dvojité helix DNA

16 Watson-Crickův model dvojité helix DNA sový pohled na DNA. Páry bází leží jeden na druhém.

17 Pomocný diagram k určení pravotočivé a levotočivé DNA

18 Různé strukturní formy DNA Helix B Watson-Crickova Typ helixu A B Z Tvar: nejširší střední nejužší Stoupání na pár bazí: 2.3 Å 3.4 Å 3.8 Å Průměr helixu: 25.5 Å 23.7 Å 18.4 Å Smysl otáčení: pravotočivá pravotočivá levotočivá Glykosidová vazba: anti anti střídavě anti a syn Počet párů bází na jeden závit helixu: Výška jednoho závitu helixu: dklon páru bází od kolmice na osu helixu: Å 35.4 Å 45.6 Å 19º 1º 9º Velký žlábek: úzký a velmi hluboký široký a celkem hluboký plochý Malý žlábek: velmi široký a mělký úzký a celkem hluboký velmi úzký a hluboký

19 Tři typy DNA

20 Tři typy DNA A-DNA, B-DNA a Z-DNA Jsou uznávány za biologicky činné dvoušroubovicové struktury. B-DNA Je nejčastější druh dvoušroubovice DNA, který za normálních podmínek v buňkách zcela převažuje. Blíží se tradičnímu Watson-Crickovskému modelu dvoušroubovice. Z-DNA Je jedna z dvoušroubovicových struktur DNA. Jedná se o levotočivý útvar, ve kterém se šroubovice stáčí vlevo (na rozdíl od běžnější B-DNA, jejíž šroubovice se stáčí doprava) Biologický význam Z-DNA nebyl přesně stanoven, usuzuje se, že jejím účelem je zajišťovat podporu transkripce DNA.

21 A-DNA Tři typy DNA Jedna z možných dvoušroubovicových struktur nukleových kyselin. Pravotočivé uspořádání. Minimálně dvouvláknová RNA a také hybridní DNA/RNA helix zaujímají A-formu dvoušroubovice, které je velmi podobná A-DNA. V této konformaci existuje většina oligonukleotidů o délce menší než 10 párů bází. Uvnitř dvoušroubovice vzniká poměrně výrazná axiální dutina. B-DNA A-DNA

22 Velký a malý žlábek na DNA Na povrchu dvojité šroubovice jsou dva žlábky: velký a malý. Důvodem je, že glykosidové vazby párů bází nejsou úplně stejné. Malý žlábek a velký žlábek Velký žlábek Malý žlábek

23 Malý a velký žlábek ve struktuře DNA Strana velkého žlábku Strana velkého žlábku H N H N H CH 3 H N H H N H N Glykosidová vazba N A N H N T N H Glykosidová vazba N Glykosidová vazba G N N N H H H N C N H Glykosidová vazba Strana malého žlábku Adenin-Thymin Strana malého žlábku Guanin-Cytosin

24 Párování bází DNA H Watson a Crick objevili, že guanin může být párován s cytosinem a adenin s thyminem. N N N H H N N E. Chargaff to publikoval již v roce 1950, ale Watson s Crickem to nevěděli. N Guanin N H H H N Cytosin Stabilita dvojité helix DNA je dána: A) vodíkovými vazbami, B) Van der Walsovými silami C) hydrofobní interakce N N N H N N H N N CH 3 Adenin Thymin

25 A T Párování bází v DNA G C

26 Replikace DNA

27 Replikace DNA Replikace DNA - proces tvorby kopií molekuly deoxyribonukleové kyseliny (DNA) Přenos z jedné molekuly DNA (templát, matrice) do jiné molekuly stejného typu (tzv. replika). Celý proces je semikonzervativní, tzn. každá nově vzniklá molekula DNA má jeden řetězec z původní molekuly a jeden nový, syntetizovaný. Výsledkem je nakonec kompletní DNA daného organizmu, v podstatě identická kopie původní DNA.

28 Diagram semikonzervativní replikace

29 Mechanismus replikace DNA Načasování DNA replikace - odlišné u prokaryot a eukaryot. U bakterií a archeí (souhrnně prokaryota) nedochází k replikaci ve speciální fázi buněčného cyklu a nemusí vůbec souviset s buněčným dělením. U eukaryot se obvykle replikace odehrává pouze v tzv. S fázi ( S podle slova syntéza ) buněčného cyklu. Mimo S-fázi se tedy syntéza DNA omezuje na drobné opravné mechanismy. Mitosa (M) probíhá vždy až po syntéze DNA (S). Další dva stupně G1 a G2 oba proces oddělují.

30 Mechanismus replikace DNA Enzymy: DNA polymerasa, DNA ligasa, helikasa a topoizomerasa. Podle vzoru (původní DNA) vytvářena nová DNA, která je k původnímu řetězci komplementární. Replikace je v základních rysech stejná u všech organizmů becně je možné průběh replikace rozdělit do tří základních kroků: 1. Iniciace rozpletení dvoušroubovice DNA, vznik replikační vidlice a navázání enzymatického komplexu 2. Elongace přidávání nukleotidů a postup replikační vidlice 3. Terminace ukončení replikace

31 Iniciace dvoušroubovice DNA Replikační počátek Replikační vidlička Replikační vidlička Směr replikace Směr replikace Začátek replikace

32 Iniciace

33 Iniciace Replikační počátek místo, kde začíná replikace (je přesně určeno) Eukaryota těchto počátků mají několik tisíc Jednodušším organizmům s menším genomem stačí někdy jeden replikační počátek.

34 Iniciační body místa kdy začíná replikace Iniciace Helikasy účastní se vzniku replikační vidlice - enzymy schopné oddálit obě molekuly dvoušroubovice a vytvořit charakteristickou strukturu ve tvaru písmene Y, aby mezi nimi vznikl prostor pro syntézu DNA. Proteiny SSB pomáhají udržet rozdělená vlákna Topoizomerasy enzym ze skupiny izomeráz, umožňuje měnit terciární strukturu DNA bez vlivu na sekundární a primární strukturu. Účastní replikace DNA, podílí se na despiralizaci stočené DNA. Původní DNA Iniciační body Replikační vidlice

35 Elongace Templát je sekvence DNA nebo RNA, na které probíhá syntéza komplementární sekvence. Nový řetězec DNA se tvoří přímo na již existujícím DNA templátě. Každé z vláken původní dvoušroubovice je replikováno odlišným způsobem (molekula DNA tzv. antiparalelní) DNA polymerasa katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi deoxynukleotidy (poprvé izolován v roce 1958) DNA polymerasa dokáže pracovat pouze v jednom směru, přidává k jednomu z řetězců nukleotidy ve směru 5 3. Tomuto řetězci se říká vedoucí řetězec

36 Elongace DNA-polymerasa má ještě jedno omezení: může přidávat nové nukleotidy pouze k již existujícímu řetězci. Při replikaci tedy musí být nějak zařízena syntéza několika prvních nukleotidů (primer) Primer - krátká molekula RNA o délce nukleotidů, je počáteční segment polymeru, který je prodlužován Tuto sekvenci vytváří speciální enzym označovaný jako primasa. Primer slouží jen jednorázově, později se odstraní a nahradí DNA, hraje významnou roli v iniciaci replikace.

37 Elongace Replikace po malých částech, tzv. kazakiho fragmentech o délce asi nukleotidů (ale asi 10krát delší jsou tyto fragmenty u prokaryot). Na začátku každého kazakiho fragmentu se musí pokaždé vytvořit nový RNA primer, ten je později vystřihnut DNA ligasa spojuje kazakiho fragmenty do souvislého vlákna, Replikace označuje jako semidiskontinuální. DNA polymerasy přisednou na rozvinutou DNA, umí připojit nové nukleotidy pouze na 3' uhlík deoxyribózy. Svorkové proteiny (tvořící posuvnou svorku, DNA clamp) udržují přichycenou DNA polymerasu

38 Elongace

39 Elongace kazakiho fragmenty - úseky nově replikované DNA na řetězci 5-3 templátu DNA s využitím primerů Vzniká tzv. opožděný řetězec

40 syntéza vždy ve směru 5 3 Elongace 3. Terminace 2. Elongace 1. Iniciace

41 Elongace

42 Elongace DNA polymerasa u prokaryot napojuje 500 nukleotidů za vteřinu u člověka je to jen 50 nukleotidů za vteřinu

43 Elongace

44 Elongace

45 Terminace Replikace končí po zhotovení kopie celé DNA. U bakterií se sejdou obě replikační vidlice a splynou spolu U eukaryot splývají replikační vidlice tehdy, když dosyntetizují svou část genomu. Protože jsou však eukaryotické chromozomy lineární, DNA polymerasy nejsou schopné replikovat jejich koncové části, tzv. telomery, a tak je replikovaná DNA nepatrně kratší, než původní. Po určitém počtu buněčných dělení by to začalo vadit (Hayflickův limit) Během meiózy se velikost telomer obnovuje pomocí enzymů telomeras.

46 Průběh replikace DNA polymerasa III nebo d DNA helikasa DNA polymerasa III nebo a(primasa) kazakiho fragmenty DNA gyrasa/ topoizomerasai Proteiny vázané na řetězci Pohyb replikační vidlice DNA polymerasa I nebo d/rnasa DNA ligasa Replikace je semikonzervativní

47 Rozdíly v průběhu replikace U prokaryot (menší genom) představují snadnější model, mají kruhovou molekulu DNA, tzv. nukleoid. Bakterie Escherichia coli má jediný replikační počátek Z tohoto místa se pohybují oběma směry replikační vidlice, v nichž dochází k syntéze DNA podle vzoru. DNA polymeráza III hlavní u prokaryot Terminační (ukončovací) oblast o délce 23 párů bází. Tyto sekvence rozeznává protein tus, schopný ukončit replikaci v momentu, kdy se replikační vidlice dostane k terminačním sekvencím. Replikace mitochondriální DNA a plastidové DNA vykazuje značnou podobnost s replikací DNA u prokaryot.

48 Replikační vidlička E. coli Žlutě zabarvené enzymy katalyzují iniciaci, elongaci a spojení (ligaci). Primasa tvoří RNA primer začátek nového (leading) řetězce.

49 Rozdíly v průběhu replikace U eukaryot - genomy jsou obecně větší než prokaryotické Více replikačních počátků. V replikaci eukaryotického genomu hraje roli větší množství různých proteinů. SSB proteiny: u bakterií jsou tyto stabilizátory jednovláknové DNA složené z jediné podjednotky, u eukaryot se skládají ze tří podjednotek. Počet DNA polymeras. U eukaryot jich bylo nalezeno nejméně 15. DNA polymerasa α funguje jako primasa schopná vytvořit na začátku každého kazakiho fragmentu RNA primer, k němu přidá několik DNA nukleotidů. Poté předá místo na 3' konci prodlužujícího se řetězce DNA polymeráze δ.

50 U eukaryot je syntéza DNA složitější Mechanicky je podobná replikaci prokaryot. Rozdíly: Velikost: E. coli replikuje 4,8 milionů párů bází; lidská diploidní buňka replikuje 6 bilionů párů bází. Genetická informace E. coli obsahuje 1 chromosom; lidská 23 párů chromosomů. Tvar: chromosom E. coli je kruhový; lidské jsou lineární. Lineární chromosomy jsou po každé replikaci kráceny!!! Nelze plně replikovat DNA konce, protože polymerasy působí pouze ve směru 5 3. Zpožděné (lagging) vlákno má nekompletní 5 konec po odštěpení RNA primeru. Chromosomy mají na konci řetězce telomery (z řečtiny telos = konec). Mnohonásobné hexanukleotidové sekvence. Sekvence bohaté na G lidská je AGGGTT!! Nenesou žádnou informaci!!!

51 U virů Rozdíly v průběhu replikace Specifický typ replikace DNA, odvíjející se od jejich parazitického způsobu života. Některé DNA viry obsahují jednovláknovou DNA, a tak po infekci musí nejprve dojít k syntéze komplementárního vlákna, aby vznikla klasická dvoušroubovice. U virů se vyskytuje poměrně velké množství dalších odchylek od běžného schématu DNA replikace. Př. Polyomavir - infikuje eukaryotické buňky, jeho DNA je replikována téměř stejně jako vlastní eukaryotický genom. Využívá hostitelské DNA polymerázy

52 Tok informace z RNA na DNA u retrovirů (HIV-1)

53 DNA polymerasy DNA polymerasy bakterií U bakterií známe sice pět druhů DNA polymeras, z E. coli byly izolovány jen Pol I, II a III DNA polymeráza I - především opravuje DNA DNA polymeráza II - především opravuje DNA DNA polymeráza III - hlavní DNA polymeráza bakterií, umožňuje replikaci DNA DNA polymeráza IV (méně významná) DNA polymeráza V (méně významná) DNA polymerasy eukaryot Nalezeno nejméně 15 různých DNA polymeráz. Ty se účastní nejen v replikaci chromozomů, ale i v opravě DNA, crossing-overu chromozomových ramen a replikaci mitochondriální DNA. DNA polymeráza α vytváří primery DNA polymeráza δ replikuje DNA DNA polymeráza ε replikuje DNA

54 DNA polymerasy DNA polymerasa I Spojuje deoxynukleosidtrifosfáty na matricích DNA Současně dochází ke štěpení PP i difosfatasou Katalysuje serii 20 a více kroků bez uvolnění z matrice Aktivita 1. Polymerasová 2. Exonukleasová ve směru Exonukleasová ve směru 5 3 Exonukleasová aktivita je aktivována nesprávným 3 nukleotidem dštěpuje chybně spárované nukleotidy V místě přerušení vlákna odštěpuje až 10 nukleotidů poškozeného vlákna Vyštěpuje primery RNA

55 DNApolymerasy DNA polymerasa I Rozdílné aktivní místa pro polymerasovou a exonukleasové funkce

56 Helikasa Enzym účastnící se zejména replikace DNA. Je to protein pohybující se přímo podél fosfodiesterových vazeb nukleové kyseliny Rozděluje dvoušroubovici do dvou izolovaných vláken za použití energie z nukleotidové hydrolýzy. Správné rozpletení dvoušroubovice je klíčovým okamžikem v procesech buněčného života zahrnující replikaci, transkripci a opravu poškozené DNA.

57 DNA ligasa Enzym katalyzující spojení dvou polydeoxyribonukleotidových řetězců. Podílí se na replikaci DNA (spojování kazakiho fragmentů) a na opravách poškozené DNA. U eukaryot se štěpí ATP na AMP a PPi. U bakterií NAD + na AMP a nikotinamidmononukleotid (NMN)

58 Mechanismus DNA ligasy

59 Poškození DNA Poškození DNA může být způsobeno např. jednou nebo několika mutacemi nebo modifikací bází - následek poškození genetické informace buňky. Změna jediné báze depurinace (purinová báze se uvolní z fosfáto-cukerné kostry) deaminace (adenin na hypoxantin či cytosin na uracil) alkylace báze inzerce či delece nukleotidu vložení analogu báze, tzn. molekuly strukturně podobné nukleové bázi schopné ji nahradit při replikaci Změna dvou bází vznik thyminového dimeru dimerizace sousedních bází vlivem alkylačních činidel

60 Poškození DNA Poruchy na úrovni celých řetězců poruchy vlivem ionizujícího záření poruchy fosfáto-cukerné složky vlivem radioaktivity vznik volných radikálů vlivem oxidace Chybný vznik vazeb mezi dvěma bázemi na stejném řetězci nebo napříč řetězcem mezi DNA a okolními proteiny (histony atp.) Replikace DNA je choulostivý proces, při němž je potenciál vzniku chyb v genetickém materiálu. To, že je nakonec tato chybovost pouze jedna chyba na miliardu bází (1/10 9 ) je zásluhou kontrolních mechanismů během replikace i po ní.

61 Poškození DNA

62 Poškození DNA

63 Poškození DNA Frekvence mutací v 1 lidské buňce za 1 den single strand break (vznik zlomů v jednom řetězci DNA ) depurinací 600 deaminací 2000 oxidačních lézí alkylací 10 double strand breaks (vznik zlomů v obou řetězcích DNA )

64 becný princip oprav DNA 1. Rozeznání a odstranění chybného místa 2. Vyplnění mezery 3. Spojení řetězce DNA Body 2 a 3 téměř stejné u různých typů oprav, v bodu 1 jsou zúčastněny různé enzýmy

65 pravné mechanismy DNA

66 prava DNA během replikace Proofreading ( kontrolní čtení ) DNA polymerasa předtím, než nukleotid přiřadí, zkontroluje, že navázání předchozího nukleotidu odpovídá plně zákonům komplementarity Pokud je tam chyba, polymerasa je schopná opět narušit fosfodiesterovou vazbu a vložit na tomto místě nukleotid správný. Díky speciálním vlastnostem DNA polymerasy je taková chybovost pouze jedna chyba na deset milionů bází (1/10 7 ). Korekce párování bází Po ukončení replikace dané části řetězce následuje ještě jedna korekce správného párování bází. V případě chyby specializovaná skupina enzymů je schopná rozeznat řetězec původní od řetězce právě dosyntetizovaného. Výsledná chybovost pouze 1/10 9.

67 prava DNA mimo období replikace Přímý zvrat poškození Fotolyasa (není u savců), enzym, jenž je schopen opravit chyby způsobené paprsky ultrafialového (UV) záření např. tvorba thyminového dimeru Je aktivována světlem nm Fotolyáza se naváže ve tmě na thyminový dimer a poté ve dne absorbují dojde k aktivaci enzymu a k rozkladu thyminového dimeru.]

68 prava DNA mimo období replikace Vyštěpovací oprava Speciální enzymy (endonukleasy) vyštěpují z molekuly DNA oligonukleotid (jednovláknový řetězec dlouhý několik nukleotidů) obsahující pyrimidinové dimery (cytosinové či thyminové). DNA gykosylasa štěpí glykosidovou vazbu pozměněného nukleotidu Následně jsou (u bakterií zřejmě DNA polymerázou I) syntetizovány předtím odstraněné nukleotidy.

69 prava DNA mimo období replikace Vyštěpovací oprava

70 prava DNA mimo období replikace Rekombinační oprava Pokud DNA polymerasa replikující genom dojde na místo, kde je např. thyminový dimer, přeruší zde polymeraci a toto místo přeskočí. Taková mezera však musí být zacelena, a to nejlépe podle vzoru v podobě druhého rodičovského vlákna, které již mezi tím bylo replikováno. SS odpověď U bakteriálních buněk, různými způsoby silně poškozených, dojde k utlumení dělení Místo toho se posílí opravné mechanismy.

71 Problém nedoreplikovaných konců DNA-polymerasy mohou přidávat nukleotidy pouze k 3 konci Každé kolo replikace se produkují stále kratší a kratší molekuly DNA Problém nenastane u kruhové DNA prokaryot

72 Telomery chromosomální DNA eukaryot má na svých koncích speciální sekvence, telomery telomery neobsahují geny, ale jsou tvořeny krátkými sekvencemi, které se mnohonásobně opakují u lidských telomer se jedná o sekvenci TTAGGG, která je opakována krát po mnoha buněčných cyklech může nastat potřeba obnovit stále se zkracující telomery

73 Telomerasa Telomerasa je zvláštní reverzní transkriptasa nesoucí svůj vlastní RNA templát. Schopna prodlužovat samotné konce eukaryotických chromozomů (tzv. telomery). Je to velký ribonukleoproteinový komplex o molekulové hmotnosti kolem 500 kda složený z enzymu "TERT" (telomerázová reverzní transkriptáza) a telomerázové RNA komponenty. Krátká sekvence uvnitř této RNA slouží jako předloha (templát) pro výrobu DNA. Konkrétně lidská telomeráza vytváří na konci telomer stále se opakující sekvence TTAGGG.

74 Telomerasa Telomerasa není přítomna ve většině buněk mnohobuněčných organismů Telomerasa je přítomna v tzv. germ-line cells, ze kterých vznikají gamety Telomerasa je přítomna rovněž u buněk rakovinných nádorů Je důležitým cílem pro diagnózu i terapii rakoviny

75 Telomerasa