Využití a význam inseminace v chovu koní

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Využití a význam inseminace v chovu koní Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: Ing. Martin Hošek, Ph.D. Vypracovala: Hana Drábková Brno 2012

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Využití a význam inseminace v chovu koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkanem AF MZLU v Brně. V..dne Podpis bakaláře..

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi Ph.D., za odborné vedení a poskytnuté konzultace při zpracování bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat za cenné konzultace Ing. Marii Vágenknechtové a Ing. Markétě Píšové. Poděkování patří i mým rodičům, kteří mi umožňují studium na Mendelově univerzitě v Brně.

4 ABSTRAKT Tato práce je zaměřena na reprodukci a inseminaci koní. V práci je popsána historie vzniku inseminace. Dále popisuje pohlavní orgány hřebců a klisen, jejich plodnost, vhodnou dobu pro zařazení do plemenitby a výběr hřebců pro inseminaci. Podrobnější je popis pohlavních reflexů u hřebců a jejich využití při odběru ejakulátu, odběrem a zpracováním ejakulátu. U klisen se zaměřuje na detekce říje (pomocí zkoušky hřebcem, vaginoskopie, rektálního a sonografického vyšetření), pohlavní cyklus, ovlivnění nástupu říje a ovulace, samotné provedení inseminace dle konzervace inseminační dávky. V návrhu metodiky je nastíněno budoucí zaměření diplomové práce na využití inseminace v chovu haflingů. Klíčová slova: inseminace, plemenitba, hřebec, klisna, ejakulát, pohlavní orgány, pohlavní cyklus ABSTRACT This thesis is focused on reproduction and insemination of horses. There is described the genesis of insemination. There is further described reproduction organs of stallions and mares, their fertility, right time for inclusion in breeding and selection of stallions for breeding. More details is given to sexual reflexes by stallions and their use in the ejaculate collection, collection and ejaculate processing. In mares is focused on oestrus detection (tests with stallion, vaginoscopy, rectal and ultrasound examinations), sexual cycle, influencing the onset of oestrus and ovulation, the actual implementation of insemination, according to conversation of insemination doses. There is outlined future direction of diploma thesis for use insemination in breeding Haflinger in proposal ofmethodology. Key words: insemination, breeding, stallion, mare, ejaculate, genital organs, sexual cycle

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED... Chyba! Záložka není definována. 3.1 Historie inseminace Základ pro úspěšnou inseminaci = kvalitní hřebec Plodnost hřebce: Výběr hřebce pro inseminaci Vhodná doba zařazení hřebce do plemenitby: Samčí pohlavní orgány: Pohlavní žlázy: Vývodné cesty: Přidatné pohlavní žlázy: Pářící orgán: Pohlavní reflexy u hřebců a jejich význam při odběru spermatu Nepodmíněné reflexy: Podmíněné pohlavní reflexy: Odběr ejakulátu Typy umělých vagín: Příprava umělé vaginy: Vlastní odběr ejakulátu: Frekvence odběru ejakulátu: Vlastnosti ejakulátu hřebce: Zpracování hřebčího spermatu: Čerstvé sperma: Krátkodobá konzervace spermatu: Dlouhodobá konzervace spermatu: Zařazení klisny do plemenitby: Plodnost klisny: Pohlavní orgány klisny: Pohlavní cyklus klisny: Fáze pohlavního cyklu: Detekce říje a ovulace: Zevní příznaky říje a říjové chování klisny: Detekce říje na základě znalosti délky říjového cyklu klisen: Zkouška hřebcem: Detekce říje u klisny po porodu: Detekce říje mikroskopickým vyšetřením cervikálního hlenu: Vaginoskopie: Rektální vyšetření: Sonografické vyšetření: Ovlivnění nástupu říje: Ovlivnění nástupu ovulace: Inseminace klisny: Přeprava semene a rozmrazení inseminační dávky:... 32

6 Velikost inseminační dávky: Hygiena připouštění: Postup při inseminaci: Inseminace čerstvým spermatem: Insemince chlazeným spermatem: Inseminace mraženým spermatem: Speciální metoda pro sexované semeno: Hysteroskopická metoda Transrektálně vedená inseminace Význam umělé inseminace u koní: Negativa umělé inseminace u koní: NÁVRH METODIKY ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 40

7 1 ÚVOD Spojení mezi člověkem a koněm trvá již 6000 let. V dřívějších dobách se koně využívali převážně na práci, ať již pro tah, či přepravu osob. V současné době používáme koně výhradně pro sportovní účely, relaxaci, agroturistiku či k hyporehabilitaci. Chov koní se stává módní záležitostí a stavy koní se v ČR stále zvyšují, tím narůstají i nároky na jejich reprodukci. Kromě přirozené plemenitby mají chovatelé možnost zajistit reprodukci koní i biotechnologikými metodami. Mezi nejvyužívanější metodu patří inseminace. Umělá inseminace koní je výhodná nejen z hlediska zdravotního a ekonomického, ale napomáhá nám k urychlení genetického pokroku. 7

8 2 CÍL PRÁCE Práce je zaměřená na popis a použití inseminace v chovu koní a cílem bakalářské práce bylo poukázat na kladné stránky této metody. Tato práce je souhrnem anatomických a fyziologických vlastností a potřeb zvířat, dále technologických postupů ať při výrobě inseminačních dávek či technologických postupů při inseminaci klisen. 8

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie inseminace Mezi první průkopníky patřili Arabové, kteří již kolem roku pomocí mořských hub, které vložili do pochvy klisny, zachytili semeno cenných hřebců a mohli tak osemenit více klisen. Vývoj umělé inseminace závisel především na poznatcích vlastností semene a jeho funkcí. K rozvoji přispěl holandský přírodovědec Anton van Leewenhoek ( ), který vynalezl mikroskop a tak jako první viděl spermie, které považoval za předchůdce života a nazval je jako semenná zvířátka (KLIMENT a kol., 1989). O století později italský fyziolog Lazzaro Spallanzani objevil úlohu spermie v oplození. Ve svých pokusech dokázal, že umělým osemeněním lze dosáhnout zabřeznutí a poté narození potomka. Jako první tehdy mluvil o velké budoucnosti inseminace (JEŽKOVÁ, 2009). Na konci 19. století se inseminace zkoušela jak v USA, tak i v Evropě. Angličan W. Help roku 1897 uvedl, že inseminaci jako poměrně jednoduchou metodu lze využívat pro psy, králíky a koně, a že jejich výsledky jsou srovnatelné s přirozeným pářením (JEŽKOVÁ, 2009). Jako první navrhl používat termín umělá inseminace (insemination arteficialis) do této doby se nesprávně hovořilo o umělém oplození. V roce 1902 se v Dánsku prováděli odběry spermatu hřebců do kondomů zhotovených z močových měchýřů prasat. Získaný ejakulát rozdělili na několik dávek a pomocí stříkačky vpravovali semeno do dělohy říjících se klisen. V té době však inseminace koní nenalezla příliš velké uplatnění, neboť hřebci byli ve vlastnictví chovatelů, kteří nepreferovali zájem o osemenění cizích klisen. V roce 1905 se němec Hofmann zaměřil na tlumení neplodnosti a zmetání a doporučil ředit sperma čerstvým mlékem (KLIMENT a kol., 1989). Za průkopníka v používání umělé inseminace se považuje ruský I. Ivanov, který dosáhl dobrých výsledků zabřezávání u klisen, krav a ovcí. Inseminaci využíval hlavně u koní v ruských hřebčínech ( ), kde vybudoval laboratoře a stanici v Askanii. Inseminace koní v této době byla velice důležitá v souvislosti využití koní v armádě. Zajímal se o spermiogenezi, transport spermatu, mikrobiologii spermií a hybridizací zvířat. 9

10 Po první světové válce v roce 1919 byla zřízena centrální stanice pro výzkumné práce v plemenitbě hospodářských zvířat, vše se provádělo pod vedením Ivanova. Během 2. světové války se pozastavil vývoj umělé inseminace (KLIMENT a kol., 1989). V roce 1939 byl objeven ochranný vliv vaječného žloutku na spermie. Velký význam inseminace nastal po 2. světové válce (JEŽKOVÁ, 2009). Velice důležité bylo v roce 1949 zjištění úlohy glycerinu při hlubokém zamražení a díky tomuto poznatku se začalo semeno zmražovat do ampulek (Van DIETEN 1951), pejet (JONDET ) a pipet (NAGASE, GRAHAM, NIVA 1963) (KLIMENT a kol., 1989). V roce 1964 byly zveřejněny nové postupy při hlubokém zchlazování semene a to při použití tekutého dusíku (KLIMENT a kol., 1989). V Československu byla poprvé využita inseminace v roce pro řešení sterility klisen vrchním správcem hřebčína v Kladrubech prof. J. Sigmundem. Poté až po 2. světové válce při tlumení hřebčí nákazy (JEŽKOVÁ, 2009). Hlavní a základní rozvoj pro umělou inseminaci se stalo usnesení vlády ze dne a vyhláška ministerstva zemědělství č. 472 ze dne o umělé inseminaci (KLIMENT a kol., 1989). 10

11 3.2 Základ pro úspěšnou inseminaci = kvalitní hřebec Plodnost hřebce: LOUDA (2001) uvádí, že dobrá plodnost u hřebce je pojem, který zahrnuje jeho dobrou kvalitu ejakulátu a dobré libido sexualis (pohlavní aktivitu). DUŠEK (1999) posuzuje plodnost hřebce dle zapuštěných a gravidních klisen a uvádí ji v procentech. Dle MÁCHALA (2011) je plodnost plemeníků dána kvalitou a kvantitou ejakulátu (objemem ejakulátu, aktivitou, koncentrací, přežitelnosti spermii apod.) Plodnost hřebce je ovlivněna mnoha činiteli (výživa, stáří, plemenná příslušnost, roční období, klima, ošetřování) Výběr hřebce pro inseminaci Pro inseminaci vybíráme hřebce, kteří splňují následující požadavky: - Základním hlediskem je exteriér a výkonnost hřebce, která musí splňovat chovatelské aspekty a požadavky. - Dalším hlediskem je zdraví hřebce, které je podloženo klinickými i laboratorními vyšetřeními. - Pohlavní orgány hřebce musí být dobře vyvinuté, bez vrozených ani získaných změn zejména na varlatech, šourku, penisu a předkožce. - Hřebec musí vykazovat dobré sexuální libido a po nácviku odběru na umělou vaginu musí mít standardní průběh pohlavních reflexů. - Ejakulát hřebce musí splňovat dobrou kvalitu jak po odběru, tak i při naředění a konzervaci pro krátkodobé i dlouhodobé uchování. - Hřebec nesmí být agresivní a musí být dobře ovladatelný (NOVOHRADSKÁ, 2009) Vhodná doba zařazení hřebce do plemenitby: Pohlavní dospělost u hřebce nastupuje v období, kdy hřebec začne produkovat oplození schopné samčí pohlavní buňky. Pohlavní pudy u hřebců jsou pozorovatelné již kolem 1 roku, avšak schopnost oplození přichází v 1,5 roce (MACEČKOVÁ, 2010). LOUDA a kol. (2001) uvádí, že hřebcům ve věku týdnů průkazně stoupá hladina testosteronu v krevní plazmě. Ve věku okolo 83 týdnů by měl obsahovat ejakulát alespoň 50 miliónů spermii s aktivitou vyšší než 10%. 11

12 Do plemenitby se zařazují hřebci v chovatelské dospělosti a vždy po absolvování výkonnostních zkoušek nebo po zhodnocení výsledků na dráze. Chladnokrevná plemena dosahují chovatelské dospělosti ve věku 3 let, teplokrevná až ve věku 4 let (LOUDA a kol., 2001) Samčí pohlavní orgány: Pohlavní orgány samce se skládají z: pohlavních žláz uložených v kožním vaku vývodných cest přidatných pohlavních žláz pařícího orgánu Pohlavní ústrojí samce zajišťuje funkci produkční, transportní a kopulační. Dále zajišťuje sekreci a syntézu pohlavních hormonů (MÁCHAL, 2011) Pohlavní žlázy: Varlata jsou párovým orgánem samců. Produkují samčí pohlavní buňky, jejichž tvorba probíhá v tubulárním aparátu a specifické pohlavní hormony, které jsou produkovány interticiálními buňkami. Tvar varlat je vejčitý a ze stran mírně zploštělý. Délka varlat u hřebce je mm, šířka 60-70, a hmotnost g. Povrch varlat je pokryt serózní blánou. Poloha varlat u hřebce směřuje horizontálně s hlavovým koncem kraniálně a volným okrajem ventrálně (MÁCHAL, 2011) Vývodné cesty: Počátek vývodných cest je již ve varleti. Vývodné pohlavní cesty tvoří přímé kanálky, varletní a odvodné kanálky varlete, vývod nadvarlete, chámovod a močová trubice. Funkce vývodných cest spočívá v odvodu spermií a výměšků pohlavních žláz a uložení spermii. Nadvarle je párový orgán uložený podél varlete (MÁCHAL, 2011). Je to orgán kýjovitého tvaru, který se rozděluje na tři části: hlava, tělo a ocas. Dochází zde ke shromažďování a funkčnímu dozrávání spermii (MARVAN, 1992). Důležitým krycím termoregulačním orgánem, ve kterém jsou uložena varlata s nadvarlaty je šourek. Elastická vlákna v hladkosvalové vrstvě reagují na okolní teploty. Při snížení teploty dochází k jejich smrštění, naopak při navýšení teploty se prodlouží. 12

13 Tento mechanizmus udržuje teplotu uvnitř šourku o 3-5 C nižší oproti teplotě tělesné. Snížení teploty v šourku oproti tělesné teplotě je důležité pro dobrý průběh spermiogeneze (MÁCHAL, 2011). Chámovod tvoří spojovací část mezi vývodem nadvarlete a močovou trubicí. U koně se rozšiřuje v ampuli chámovodu, kam jsou posouvány spermii při pohlavním vzrušení (MÁCHAL, 2011) Přidatné pohlavní žlázy: U hřebce jsou přidatné pohlavní žlázy tři: měchýřkovitá žláza, předstojná žláza a bolbouretální žláza. Sekrety těchto žláz jsou vylučované do močové trubice a tvoří přirozené ředidlo pro spermie. Dále obsahují látky, které slouží jako výživa spermii, a konečně upravují spermiím prostředí při jejich průchodu močovou trubicí a pohlavním aparátem samic (MARVAN, 1992). Sekret přidatných pohlavních žláz je semenná plazma, která tvoří % objemu z celkového ejakulátu hřebce (MÁCHAL, 2011) Pářící orgán: Pyj slouží k přepravě spermatu do samičích pohlavních orgánů. Je válcovitého tvaru a skládá se kořene pyje (fixovaná část) a z těla pyje (volná část) (MARVAN, 1992). Tato stavba umožňuje při pohlavním dráždění napřímení a zpevnění pyje. Celou délkou pyje probíhá na ventrální straně močová trubice, na straně dorzální se nachází cévy a nervy. Konec pyje je uložen v předkožce, což je kožní duplikatura (MÁCHAL, 2011). MARVAN (1992) uvádí, že délka pyje u hřebce je cm a šířka 5-6 cm. Žalud hřebce je mohutný a má tvar kloboučku s vyvýšeným válem na obvodu a s centrální jamkou (MARVAN,1992). Vyvýšený obvodový vál působí v pochvě klisny jako píst (MÁCHAL, 2011) Pohlavní reflexy u hřebců a jejich význam při odběru spermatu Pohlavní reflexy se dělí na reflexy podmíněné a nepodmíněné Nepodmíněné reflexy: Nepodmíněné reflexy jsou reflexy vrozené. Realizují se samostatně a nezávisle na vůli jedince, nejčastěji na podráždění smyslovými vjemy, které přichází z vnějšího prostředí. 13

14 Před i během páření probíhá řetěz pohlavních reflexů, a to : - distančních, - kontaktních, - kopulačních. Distanční pohlavní reflexy: Distanční reflexy jsou vyvolány reakcemi na vzdálené stimuly. Tyto reflexy jsou označovány jako sexuální předehra. Distanční reflexy se dělí na reflex lokomoční, což je reflex sbližování, dále reflex erekční, reflex vysunutí pyje a reflex kremastorový. Lokomoční reflex se u hřebce projevuje tak, že vyhledává říjící se klisnu pomocí čichových, sluchových a zrakových vjemů (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1976). Erekční reflex je reflexem pohlavní přitažlivosti a působením podněty ze strany říjící se klisny. U hřebců je tento reflex vyvolaný především pachovými a zrakovými vjemy. Vlivem těchto vjemů vedou nervové vzruchy z kůry velkého mozku k erekčnímu centru v křížové části míchy. Odtud přechází nervové vzruchy nervovými cestami k pohlavním orgánům, hlavně k cévám a pomocným svalům pohlavního údu. Artérie pohlavního vzruchu se v důsledku podráždění rozšíří a tím se zvýší přítok krve do topořivých těles. Zkrácením pohlavního údu pomocí svalů se přitlačí pohlavní úd k sedacím kostem, tím se zabrání odtok krve z topořivých těles a vzniká erekce pohlavního údu. Zvyšuje se tak krevní tlak v těle penisu. Pohlavní úd se zvětší, zvýší se jeho tělesná teplota, tuhost a citlivost. U hřebce má erekce oproti ostatním hospodářským zvířatům pomalejší nástup, proto je důležité dodržovat sexuální předehru (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1976). Dle VĚŽNÍKA a kol. (2008) dochází k reflexu erekce u mladých koní během 3 minut, u starších hřebců je tato doba do 2 minut. Po erekčním reflexu následuje reflex vysunutí pyje, kdy dojde k vysunutí pyje z předkožky. Kremastorový reflex se vyznačuje přitažením šourku k tělu a tím zkrácení vývodných cest pro spermie. Kontaktní pohlavní reflexy: Tyto reflexy vznikají bezprostředně po styku hřebce s klisnou. Patří sem reflex přímého kontaktu, vzeskoku a objímací reflex. 14

15 Kopulační reflexy: Jsou fyziologickým dokončením předcházejících pohlavních reflexů. Umožňují samotný pohlavní akt a přenos spermií do pohlavních orgánů samice, či do umělé vagíny. Představují složitý proces, které se skládají z těchto na sebe navazujících pohlavních reflexů: vyhledávací reflex, reflex zasunutí pyje do samice, frikční neboli třecí, ejakulační a reflex seskoku (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1976). Z hlediska odběru ejakulátu pro inseminaci je pro nás nejdůležitější reflex ejakulační. Ejakulace je vyvrcholením komplexu sexuálních reflexů. U hřebce probíhá ejakulace ve dvou fázích. V první fázi je vypuzován hlenovitý sekret a to díky kontrakcím v oblasti Cowperových žláz a semenných váčků. Poté dojde ke kontrakcím svalů ocasu nadvarlete, uretry a všech pohlavních žláz a je vyměšováno sperma po dobu 8-12 sekund (KLIMENT a kol., 1989). Ejakulované sperma lze u hřebců rozdělit do 4 frakcí: 1. frakce - předspermiová, která obsahuje hlavně sekret Cowperových žláz 2. frakce- je nejbohatší na spermie 3. frakce- převažuje v ní sekret semenných váčků a má želatinózní charakter 4. frakce- je sekret všech přídatných pohlavních žláz a má vodnatý charakter (KLIMENT a kol., 1989). Za normální projev sexuálního libida a pohlavních funkcí se považuje to, když celý pohlavní akt proběhne mezi 2-5 minutami (VĚŽNÍK a kol, 2009) Podmíněné pohlavní reflexy: Kromě reflexů nepodmíněných (vrozených) se u hřebců využívaných na připouštění vytvářejí i reflexy podmíněné (získané). Podmíněné reflexy jsou výsledkem procesu páření a mají důležitou úlohu při odběru do umělých vagin (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1976) Odběr ejakulátu Odběr spermatu se u hřebce provádí většinou pomocí umělých vagín různých typů a konstrukcí, umělého fantomu a nebo říjící se klisně (MÜLLER, 2006). Sperma se odebírá od hřebců, kteří splňují vyhovující zdravotní stav. Při odběru je důležité dodržovat předepsané bezpečnostní předpisy (LOUDA, 2001). 15

16 Aby byl zajištěn co nejnižší počet nepatogenních zárodků, je důležité dbát na správne ošetřování hřebců, odběr spermatu a dále i jeho zpracování. Penis hřebce musí být pravidelně ošetřován a desinfikován. Zahájením připouštěcí sezony se penis pravidelně omývá roztokem mazlavého mýdla při teplotě vody 35 C. Tento roztok napomáhá odstranění usazené soli na penisu a mazu z předkožky (smegma). Po omytí se penis desinfikuje roztokem akriflavinu slabě zelené barvy. Tímto roztokem se penis desinfikuje i 2 hodiny před vlastním odběrem. Tato doba je nutná proto, aby se zamezilo přechodu zbytků desinfekčního prostředku do ejakulátu (LOUDA, 2001) Typy umělých vagín: 1. Typ Missouri, navržený MC Kenzim. Tento typ má zůžený vchod pryžovým prstencem, protože se domníváme, že reflex ejakulace je vyvolán třením u báze pyje (KLIMENT a kol. 1989). 2. Typ Missisipi, navržený Berlinerem. Je založený na principu dráždění repeptorů na žaludu pyje (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). 3. Umělá vagína s jednorázovým sběračem dle Paršutina v modifikaci Peteliková, Müller, Matoušek, (1980). Tento typ je zhotoven z hliníku a pryžové vložky, délka vagíny činní 54 cm a průměr 14 cm. Sběrač se používá jednorázově a je vyroben z PVC folie. Vagína se obaluje molitanem, aby chránil ejakulát před chladovým šokem. Do mezistěny vaginy se nalévá teplá voda v rozmezí 1,5 2 l, teplota umělé vagíny v době odběru musí činit C (KLIMENT a kol, 1989). 4. Krakovský typ, jedná se o tzv. otevřenou umělou vaginu. Slouží k odběru ejakulátu bez výměšků uretrálních žláz. A bez sekretu semenných váčků. Tato vagína je 40 cm dlouhá o průměru 14 cm. Odběrem do této vagíny zamezíme vyšší mikrobiální kontaminaci, dosáhneme vyšší hustoty ejakulátu a lepší hygieně odběru. Tento typ vagíny nejlépe odpovídá fyziologickým potřebám hřebců. Sperma se zachycuje do tepelně izolované, předehřáté a sterilní nádobky opatřené gázou. Při odběru vyčnívá žalud penisu z umělé vagíny, při frikčních pohybech penisu a ejakulaci se vystřikovaný ejakulát zachycuje nálevkou do nádobky (LOUDA, 2001). 16

17 Obr. 2 Schematické znázornění umělá vagíny (MOREL, 2003) Příprava umělé vaginy: Aby se vytvářely podněty kvalitativně shodné s fyziologickými podněty v pochvě plemenice, musí umělá vagina splňovat patřičnou teplotu, tlak a kluzkost (KLIMENT a kol, 1989). Teplota vaginy při odběru by měla mít C, potřebný tlak zajistíme dofouknutím mezistěn vaginy a měl by činit přibližně 530 kpa. Kluzkosti dosáhneme vymazáním vaginy pomocí skleněné tyčinky sterilní vazelínou (LOUDA 2001) Vlastní odběr ejakulátu: Vlastní odběr ejakulátu se uskutečňuje z pravého boku klisny, při sklonu umělé pochvy v úhlu C. Po vzeskoku hřebce na klisnu odběratel stojící na levé straně a odtlačí pyj hřebce na pravou stranu. Po vniknutí pyje do umělé vaginy po několika frikčních pohybech následuje ejakulace. Ejakulaci lze na hřebci zpozorovat jeho uklidněním a vlnovitými pohyby kořene ocasu. V tomto okamžiku je vhodné sklonit umělou vaginu směrem dolů, aby ejakulát nebyl delší dobu ve styku s penisem, gumou, a nevytékal z vaginy (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). Dle LOUDY (2001) je zapotřebí k odběru ejakulátu od hřebce do umělých vagin více pokusů (2 až 3) Frekvence odběru ejakulátu: Frekvence odběrů u hřebců zařazených do inseminace je 1x za den. Nácvik trvá jeden týden a objem ejakulátu se postupně zvyšuje. Jestliže dochází ke zhoršení kvality odebíraného ejakulátu, je třeba prodloužit sexuální pauzu (LOUDA, 2001). 17

18 Vlastnosti ejakulátu hřebce: Objem ejakulátu: Objem je závislý na hmotnosti a plemenné příslušnosti hřebce. Průměrně kolísá od cm 3. Chladnokrevná plemena produkují 150 cm 3, teplokrevná 60 cm 3 a lehká 45 cm 3 (LOUDA, 2001). Pro účely inseminace nelze použít sperma s objemem nižším jak 20 ml (MAMICA a MÁCHAL, 2008). Barva ejakulátu: Je závislá na koncentraci spermii a je bílá až šedavě bílá. Konzistence: je vodnatá. Viskozita kolísá od 1,4 do 3,3 (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). ph ejakulátu: se pohybuje v rozmezí 6,7 do 7,8. Koncentrace spermii je dána podílem semenné plazmy a pohybuje se v rozmezí v 1 mm 3 (MISAŘ, JISKROVÁ 2001). Aktivita spermii: Je uváděna jako procentický podíl spermii s přímočarým pohybem vpřed za hlavičkou. Aktivita spermii je od 60-80%. Tato hodnota klesá dolů v mimosezonním období (LOUDA, 2001). Průměrná přežitelnou spermii: MISAŘ, JISKROVÁ (2001) uvádí, že průměrná přežitelnou spermii v pohlavním aparátu klisny je 38 hodin. Patologické spermie: Ejakulát hřebce nesmí obsahovat více jak 30-35% patologických spermii, z toho primárních změn na spermii vzniklých při spermiogenezi jen do 10% (LOUDA, 2001). 18

19 Spermie hřebce: obr.2 (MOREL, 2003) Zpracování hřebčího spermatu: Cílem konzervace ejakulátu je uchovat dobrou oplozovací schopnost a zachovat životaschopnost spermií. Dále pak odpovídajícím ředěním vyrobit maximální počet inseminačních dávek, které odpovídají biologickým požadavkům pro zajištění úspěšné koncepce (oplození) (LOUDA a kol., 2001) Čerstvé sperma: Čerstvé sperma je získané pomocí umělé vagíny, je neředěné a používá se ihned k inseminaci klisny (MÜLLER, 2006) Krátkodobá konzervace spermatu: Krátkodobě konzervované sperma je sperma ředěné a zchlazené zpravidla na teplotu asi 4 C (MÜLLER 2006). LOUDA a kol., (2001) uvádí, že při příliš rychlém zchlazování může semeno utrpět chladový šok, při kterém dochází k nevratným změnám na membráně spermie a ztrátě progresivního pohybu. K inseminaci se využívá většinou hodin po jeho odběru, doba je závislá na zvoleném použití ředidla a technologie zpracování. Pro krátkodobé uchování spermatu in vitro se používají ředidla na žloutkové a mléčné bázi, která chrání především povrchové membrány spermii. 19

20 Ředidla obsahují energetické a pufrovací látky (MÜLLER, 2006). Konzervací se snižuje aktivita intracelulárního vápníku ve spermiích, tím dochází k porušení buněčné homeostáze (LOUDA a kol, 2001). Příklad složení ředidla pro krátkodobou konzervaci: - Glukóza 30g - Laktóza 20g - Vinan sodnodraselný 10g - Redestilovaná voda 1000g - Vaječný žloutek 200g - PAB 10% (kyselin paraaminobenzoová) 60g Semeno se ředí v poměru 1:1. Poměr ředění se volí tak, aby v 1 cm 3 ředěného spermatu dosáhlo min. 20 milionů spermií s progresivním pohybem vpřed (LOUDA kol, 2001) Dlouhodobá konzervace spermatu: Dlouhodobě konzervované sperma je konzervované převážně zmražením a uchovává se v tekutém dusíku. Ředidlo pro zmrazení spermatu je na rozdíl od ředidla pro krátkodobou inseminaci obohaceno o kryoprotektivní látky. Tyto látky chrání spermie v procesu zmrazení a rozmrazení. Jako kryoprotektivum je téměř výhradně při zmrazení využívá glycerin. Po ředění se sperma ochladí a poté se zamrazuje většinou v pejetách o obsahu 0,5 až 4 ml nebo v hliníkových tubách o obsahu 7-15 ml. Rychlost poklesu teploty při zmrazování hraje důležitou roli. Proto se využívá programovatelných automatických zmrazovačů. Po zmrazení se uchovává inseminační dávka spermatu v kontejnerech s kapalným dusíkem při teplotě mínus 196 C. Takto zakonzervované sperma si uchovává svoji oplozovací schopnost po desítky let (MÜLLER, 2006). Příklad ředidla pro dlouhodobé uchování spermatu: A - odstředěné mléko čerstvé - glukoza 5 g - citrát sodný 0,05 g - laktóza 0,2 g 20

21 B - rafinóza 0,3 g - citrát draselný 0,082 g - dionizovná sterilovaná voda 100 cm 3 - sušené odstředěné mléko 9,46 g - glukóza 0,5 g - dionizovaná sterilovaná voda 100 cm 3 Obě části A a B se ředí v poměru 1:1, takto naředěné semeno se po ekvilibraci a zchlazení na 4 C plní do pejet a v párách tekutého dusíku se mrazí (LOUDA a kol, 2001). 21

22 3.3 Zařazení klisny do plemenitby: Pohlavní dospělost klisny nastává v období počátku činnosti pohlavních žláz a produkce zralých pohlavních buněk. Projevuje se probuzením pohlavního pudu, pravidelným opakováním ovariálního cyklu klisny, zpomalením růstu a změnou chování. Doba dosažení pohlavní činnosti je individuální a je závislá na mnoha faktorech. Věk koní při dosažení pohlavní dospělosti je v rozpětí 9-12 měsíců. Chovatelská dospělost je optimální období pro zařazení mladého koně do plemenitby, aniž bychom způsobili negativní dopad na dokončení růstu a vývinu. Důsledky předčasného zařazení do chovu se projevují zpomalením až zastavením růstu, intenzivnějším opotřebením organismu, zvýšením nebezpečí výskytu problémových porodů a poranění porodních cest u klisen. Ovšem pozdější zařazení do chovu má také své nevýhody, ke kterým patří poruchy plodnosti, nepravidelnost pohlavního cyklu, nebezpečí komplikovaných porodů. Věk koní při dosažení chovné dospělosti se liší, u teplokrevných plemen je 3-4 roky, u plemen chladnokrevných 2,5 až 3 roky. Dále u koní rozlišujeme ještě dospělost pracovní a fyzickou (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001) Plodnost klisny: Dle MÁCHALA, (2011) se plodností u samic rozumí pravidelnost v oplození po předchozím páření či inseminaci a pravidelnost v porodech vyvinutých a životaschopných mláďat. DUŠEK (1999) hodnotí plodnost klisen počtem hříbat ve vztahu k délce jejich působení v chovu a vyjadřuje ji v procentech Pohlavní orgány klisny: Pohlavní orgány mají jako hlavní funkci tvorbu pohlavních buněk a hormonů a zajištění páření, speciální funkci pohlavních orgánů samic na rozdíl od samců je poskytnout ochranu a výživu pro vyvíjející se zárodek a plod (MARVAN, 1992). Pohlavní orgány u klisen rozdělujeme na orgány vnitřní, kam řadíme vaječníky, vejcovod, dělohu, pochvu a orgány zevní, kam řadíme poševní předsíň, vulvu a poštěváček. 22

23 Jedině výborná znalost anatomie pohlavních orgánů klisny nám zajistí úspěšnou inseminace bez poranění klisny. Vaječník je párová samičí pohlavní žlázy, ve které se tvoří pohlavní buňky vajíčka a pohlavní hormony, kam patří estrogeny a progesteron. Je uloženy v kaudální části břišní dutiny (MARVAN, 1992). Ovulační plocha na vaječnících klisny je ve srovnání s ostatními druhy hospodářských zvířat podstatně menší. Ovulační plocha je omezena jen na malý okrsek povrchu vaječníku nazvaný ovulační jamka. Celý povrch vaječníku je kromě ovulační jamky pokryt perineem. Značně rozdílná je velikost a tvar vaječníku, a to nejen individuálně, ale i mezi oběma vaječníky jedné klisny (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001). MARVAN, (1992) uvádí, že tvar vaječníku u klisny je fazolovitý, délka 5-8 cm, šířka 2-3 cm a hmotnost g. Změny na vaječnících charakterizované dozráním sekundárního folikulů na terciální, jeho prasknutí, proliferací a zánikem žlutého tělíska se pravidelně opakují v intervalech, které se souhrnně nazývají jako vaječníkové ovariální cykly. Ovariální cyklus se dělí na dvě fáze, folikulární (zahrnuje 18., 19., 20., 21. den předcházejícího pohlavního cyklu a 1. a 2. den nového cyklu, končí ovulací) a fázi luteální, která zahrnuje den pohlavního cyklu klisny. Vejcovod začíná širokou nálevkou v těsné blízkosti vaječníku. Vejcovod slouží k zachycení ovulovaného vajíčka a k jeho přesunutí do dělohy (MARVAN 1992). Při sestupu vajíčka vejcovodem dochází k jeho oplození, nejčastěji v horní třetině vejcovodu (MÁCHAL, 2011). Do děložního rohu se vejcovod na druhém konci otevírá děložním ústím. V průběhu pohlavního cyklu samice za působení vaječníkových hormonů probíhají změny na sliznici vejcovodu, které se označují jako vejcovodé tubulární cykly (MARVAN, 1992). Děloha je dutý silnostěnný orgán, který zajišťuje vývoj nového jedince z oplozeného vajíčka až do narození mláděte. Děloha klisny je dvourohá a skládá se ze tří základních částí: děložní krček, děložní tělo a děložní rohy. Děložní krček spojuje děložní tělo s pochvou (MARVAN 1992). Délka děložního krčku u klisny je 6-7 cm a šířka 4 cm (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001). Děložní tělo je kaudálně navázáno na děložní rohy. U klisny je dlouhé cm (MARVAN, 1992). Dle MISAŘ, JISKROVÁ (2001) je děložní tělo dlouhé cm. Děložní rohy u klisny jsou dlouhé cm a kraniálně se rozbíhají, jejich vrcholy se v mírném oblouku dorzálně zvedají (MARVAN, 1992). Společně se změnami na vaječnících a vejcovodu dochází při 23

24 pohlavním cyklu klisny ke změnám na děložní sliznici. Tyto změny se souhrnně nazývají jako děložní uterinní cykly. Uterinní cyklus se dělí na tři fáze: proliferaci, sekreci a regresi. Během proliferace se zvyšuje epitel děložní sliznice a epitel žláz. Sliznice má rudou barvu, dochází k tomu díky rozšiřování krevních cév. Překrvení sliznice v období říje vrcholí a říje tak může být doprovázena subepitálním krvácením. Dále dochází ke zduření děložní sliznice. Proliferace společně s fází sekrece vytváří příznivé podmínky pro přijetí oplozeného vajíčka. Během fáze sekrece se tvoří děložní uterinní mléko, což je mléčně zkalený sekret vyměšovaný děložními žlázami. Fáze regrese přichází v případě, že nedošlo k oplození vajíčka. Ustává sekrece žláz, překrvení sliznice a sliznice se vrací do původního klidového stavu (MARVAN, 1992). Pochva je pářícím orgánem samice. Vyúsťuje do ní z kraniální strany kanál děložního krčku, kaudálně přechází v poševní předsíň, která je navenek uzavřena stydkou štěrbinou (MARVAN, 1992). MÁCHAL (2011) uvádí, že pochva klisny je dlouhá cm. Poševní předsíň je kaudálním pokračováním pochvy Je nejen orgánem pohlavním, ale slouží i jako vývodná močová cesta (MARVAN, 1992). MÁCHAL (2011) uvádí, že délka poševní předsíně u klisny je cm. Ochod (vulva) tvoří vstup do samičích pohlavních cest. Leží ventrálně od řitě, od níž je oddělena krátkou hrází. Vulva je složena ze dvou stydkých pysků (MÁCHAL, 2011). Tvar vulvy u klisny je na rozdíl jiných hospodářských zvířat specifický tím, že ventrální spojka mezi stydkými pysky je zaokrouhlená a dorzální ostrá (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001). 24

25 Obr. 3 Pohlavní orgány klisny z bočního pohledu (MOREL, 2003) Pohlavní cyklus klisny: Klisna se řadí mezi sezóně polyestrická zvířata. Pohlavní cykly probíhají jen po určité období, po kterém následuje období pohlavního klidu (JELÍNEK, 2001). U klisny v průběhu roku rozlišujeme 4 období, a to: Fyzilologický zimní anestrus, který je ovlivněn plemennou příslušností a individuální variabilitou klisen. Nejčastěji však nastává v listopadu, prosinci a lednu. Vyznačuje se nízkou hladinou a nedostatečným signálem hypotalamického GnRH k indukci pulzativní sekrece gonadotropních hormonů. Ovariální aktivita u klisen v tomto období je malá nebo žádná, klisny jsou anestrické a velikost folikulů je menší než 30mm. Jarní přechodné období, které se vyznačuje normalizací sekrece GnRH a tím zvýšení produkce gonadotropních hormonů v adenohypofýze. Cyklická ovariální aktivita se probouzí a objeví se typický syndrom multipních folikulů a průměru mm. Folikuly na počátku přechodného období zpravidla nedozrávají, ale atretizují. Dochází ke zvětšování folikulů a vytvoří se dominantní folikul, který při zvýšení LH ovuluje a tím se aktivuje plnohodnotný ovulační cyklus. Říje v přechodné období je často různě dlouhá (až 10 dní), říjové příznaky málo výrazné a klisna je většinou nesvolná k páření. S postupem jara dojde ke zkrácení říje a ke stabilizaci pohlavního cyklu (KUDLÁČ, 2005). Připouštěcí období, které je charakterizováno plnohodnotným pohlavním cyklem. Říje a výraznost vnitřních a vnějších příznaků jsou u klisen značně 25

26 variabilní. Obecně platí, že říje a její příznaky u klisen teplokrevných jsou výraznější než u klisen chladnokrevných. Během stabilizovaného pohlavního cyklu u klisny je hormonální profil následující. Hladina FSH má 2 vrcholy. První je ve shodě s pozdním estrem a pohybuje se okolo 80 ng/ml, 4. den po ovulaci klesá na 4 ng/ml, avšak od 8. dne se opět navyšuje a 12. den cyklu dosahuje znovu 80ng/ml. Hladina LH před říjí je v rozmezí ng/ml. Během říje se hladina navyšuje a k ovulaci dojde po dosažení úrovně ng/ml. Estogeny vykazují v diestru hladinu 17- estradiolu mezi pg/ml. V estru a 1-2 dny před ovulací hladina narůstá na pg/ml. Hladina progesteronu je během říje velmi nízká, prakticky nulová. Avšak 2-3 den po ovulaci jeho hladina v krvi stoupá až na 4 ng/ml, 5-7. den a později až do dne se pohybuje v rozmezí ng/ml. U nezabřezlé klisny vlivem uterinního prostaglandinu dochází k poklesu progesteronu a tím je umožněn nový cyklus a nástup říje. Období doznívání je charakterizováno prodloužením pohlavního cyklu a říje a dochází k zeslabení říjové aktivity u klisen. Folikuly již nedozrávají a nedochází k jejich ovulaci, ale k luteinizaci a artezii. Klisny přecházejí do zimního anestru (KUDLÁČ, 2005). Pohlavní neboli říjový cyklus se u klisny vyjadřuje souborem změn na pohlavních orgánech a v chování. Pohlavní cyklu u samic se dá rozdělit do několika fází, které se od sebe liší změnami na jednotlivých částech pohlavního ústrojí určovaných hormonálními hladinami (JELÍNEK, 2001). 26

27 3.3.4 Fáze pohlavního cyklu: Proestrus Adenohypofýza uvolňuje FSH, pod jehož vlive dochází k růstu a zrání folikulů. Dále díky vlivu prostaglandinu F2α probíhá regrese žlutého tělíska z předchozího cyklu. Ve zracích folikulech se tvoří estrogenní hormon 17β-estradiol, jehož vlivem dochází ke zvýšení přívodu krve do pohlavního ústrojí klisny, tím se zvýší dráždivost svalové vrstvy vývodných pohlavních cest. Dochází k uvolnění tonu hymenálního prstence, otevírá se děložní krček a začíná tvorba cervikálního hlenu. Zvýší se erotizace a neklid samice. Estrus Je charakterizován dozráváním folikulů, proliferační změny na pohlavním ústroji se dokončí. Pohlavní podráždění vrcholí a samice je svolná k páření. Ovulace u klisny se dostavuje ještě před ukončením říje. Metestrus V této fázi zaniká psychické a pohlavní podráždění, endomatózní zduření a uzavře se děložní krček. Na ovariích se vytvoří žluté tělísko, které je tvořeno luteinovými buňkami, tyto buňky vznikly přeměnou folikulárních buněk. Luteinové buňky obsahují barvivo lutein. Diestrus Je charakterizován dokončením vývoje žlutého tělíska. Jeho další osud je závislý na tom, zda došlo k zabřeznutí či nikoli. V případě, že nedojde k oplození a samice nezabřezne, endometriu začíná produkovat prostaglandin, který vyvolá regresi žlutého tělíska. Tím se přeruší produkce progesteronu a tím se umožní u polyestrických zvířat vývoj dalšího pohlavního cyklu (JELÍNEK, 2001). 27

28 3.3.5 Detekce říje a ovulace: Zevní příznaky říje a říjové chování klisny: Změna chování, časté močení, zdvihání ocasu nahoru a do stran, prokrvení pochvy, otevření děložního krčku, výtok čirého hlenu z pochvy naznačuje, že klisna je v říji (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001) Detekce říje na základě znalosti délky říjového cyklu klisen: Individualita délky říjového cyklu u jednotlivých klisen se může lišit až o 18 dní. Pohybuje se v rozmezí od dnů. Proto se nedoporučuje detekovat říji u klisen jen na základě všeobecné znalosti délky říjového cyklu (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001) Zkouška hřebcem: Říji klisny zjišťujeme za přítomnosti hřebce u zkušební stěny 2,5-3 m dlouhé a 1,5 m vysoké. Dle vnějších projevů klisny lze určit 4 stádia říje: 1. Klisna při zkoušce je neklidná, říje nevýrazná 2. Klisna klidně stojí, příznaky říje zřetelné (zvedání ocasu, blýskání) 3. Klisna sama přistupuje k hřebci, říje je výrazná 4. Klisna sama přistupuje k hřebci, odvést ji od hřebce je obtížné, příznaky říje jsou velmi zřetelné. Pro inseminaci klisny jsou důležité projevy říje 3. a 4. stupně. Klisnu osemeňujeme každých hodin, dokud zevní příznaky neustoupí a klisna hřebce neodmítne (LOUDA, 2001) Detekce říje u klisny po porodu: Z důvodu výrazné involuce dělohy se první říje u klisny dostaví již den po porodu. V době říje dochází ke změně složení mléka a tím k průjmu u hříběte (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001) Detekce říje mikroskopickým vyšetřením cervikálního hlenu: Z hlediska náročnosti a ekonomického aspektu není běžně používána. 28

29 Vaginoskopie: V dnešní době se k vaginoskopii používají plastiková nebo papírová spekula, která ovšem nabízejí jen omezený pohled do vaginálního kanálu. Vaginoskopie umožňuje odhalit přítomnost čiré tekutiny, moči, hlenu nebo exsudátu, adhezi, relaxovaného krčku a stanovit zánětlivé změny na sliznici (BUCCA, 2011) Rektální vyšetření: Pomocí transrektální palpace se dá posoudit tonus a struktura jednotlivých orgánů. Prověříme krček, tělo a rohy děložní, široký děložní vaz a opatrnou palpací vaječníků určíme stádium pohlavního cyklu, popřípadě abnormality (BUCCA, 2011). Při rektální kontrole vaječníku zjišťujeme v průběhu říje změny, které jsou vyvolané rozvíjením Graafova folikulu. Mimo období říje je vaječník souměrný, ledvinovitého tvaru s tuhoelastickou konzistencí, na dotek nebolestivý. Změny na vaječníku u klisny během říje se dají rozdělit do šesti stupňů. První stupeň: Tento stupeň trvá asi 3 dny, jsou zde první příznaky růstu folikulů a vaječník dosahuje velikosti 5 x 3 x 2 cm. Druhý stupeň: Toto stádium opět trvá 1-3 dny, je charakterizováno zvětšením části vaječníku, který se stává asymetrickým a na pohmat lze zjistit mírnou fluktuaci. Vaječník dosahuje velikosti 6 x 4 x 3 cm. Třetí stupeň: Toto stádium trvá opět v rozmezí 1-3 dnů. Tvar vaječníku se mění na hruškovitý a dosahuje v průměru 6 x 5 x 4 cm. Uložení vaječníku bývá o 2-5 cm posunuté níže než v předešlých stádiích. Při palpaci vaječníku v tomto stádiu, je zvýšená jeho citlivost. Čtvrtý stupeň: Toto stádium může trvat 1-3 dny. Tvar vaječníku je kulovitý, na polovině vaječníku kde se folikul nerozvíjí, tvoří malý výběžek. Vaječník je na pohmat zřetelně citlivý. Folikul je naplněný tekutinou, jejíž tlak je poměrně značný, fluktuace není tak patrná. Toto je příznakem blížící se ovulace. Velikost vaječníku může dosáhnout 7 x 6 x 6 cm. Pátý stupeň: Toto stádium trvá 1-3 hodiny, dochází k ovulaci. Vaječník je na pohmat citlivý a měkké konzistence. Odtokem folikulární tekutiny ztrácí vaječník kulatou formu a rozměry se zmenší na 3 x 2 x 2 cm (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). Folikul před 29

30 ovulací dosahuje velikosti v průměru 4 cm, ale i velikosti 2,5-7 cm jsou možné (TERTTU KATILA, 2011). Šestý stupeň: V místě po prasknutí folikulu se začne tvořit žluté tělísko. LOUDA a kol., (2001) uvádí, že optimální doba pro inseminaci spadá do čtvrtého stádia. V tomto stádiu dochází ke koncepci u 70-80%klisen. Ve třetím stádiu se zabřeznutí pohybuje od 40-50%, ve druhém od 10 do 15%. Při inseminaci ve stádiu prvním, dochází k zabřeznutí jen výjimečně. Inseminace prováděna po ovulaci také snižuje procento zabřeznutí. Nevhodná je inseminace klisny po ovulaci déle jak 6 hodin Sonografické vyšetření: Rektální palpace ovarii je u koní na rozdíl od skotu podstatně obtížnější, je to způsobeno těžší dostupností a omezením pohyblivosti ruky v konečníku. Neposkytuje nám přesné výsledky při sledování růstu folikulů a stanovení cyklických změn na žlutém tělísku. Z těchto důvodů je nepostradatelné vyšetření ovarii za pomocí sonografu. Sonografie nám umožňuje určit nejen velikost a tvar ovarii, ale i detekovat folikuly o velikosti již od 2-3 mm. Dále nám umožňuje sledovat morfologické změny při vývoji žlutého tělíska a další ovariální struktury. Díky sonografii poměrně lehce určíme dobu ovulace. Pět až sedm dní před ovulací lze ultrazvukem sledovat růst preovulačního folikulu. V této době je kulovitého tvaru o průměru asi 2,5 3,5 cm (GRYGAR A KUDLÁČ, 1997). Folikul běžně roste průměrnou rychlostí 3mm za den (KATILA, 2011). Folikuly před ovulací mají v průměru okolo 4,5 cm Ovlivnění nástupu říje: Nástup pohlavní činnosti u klisny po zimním anestru můžeme nastartovat několika způsoby. Jedním z faktorů je umělé prodlužování světelného dne při intenzitě osvětlení hodin denně, při zachování pravidelného střídání světla a tmy. Nástup pohlavních činností rovněž vyvolá i náhlá změna teploty a intenzita krmení (MÜLLER, 2006). K vyvolání říje se nejčastěji používá prostaglandin a jeho syntetické analogy. Podáním prostaglandinu nevyvoláme říji, ale vyvoláme působení luteolýzy žlutého tělíska na vaječníku klisny a přerušení cyklu. Nastupuje nový fyziologický pohlavní cyklus. Jeho podání je účinné pouze v sekreční fázi žlutého tělíska (od 5. do 12. dne po 30

31 ovulaci) (MÜLLER, 2006). Hlavní vliv na interval ovulace má velikost folikulu v době podání PG. Pokud je na vajíčku přítomen folikul o velikosti 4 cm, podání PG je nevhodné, protože klisna neprojde celou říjí a snadno se tak zmešká ideální doba k zapuštění. Po aplikaci prostaglandinu začnou klisny vykazovat příznaky říje za 2-5 dní a ovulují za 8-11 dní. Nejčastěji se používají dva PG preparáty a to dinoprost (PGF 2a) a cloprostenol (Estrumate). Doporučená luteolytická dávka pro dinoprost je 5-10 mg, pro cloprostenol je to ug (KATILA, 2011). Je nutné se před každou aplikací prostaglandinu přesvědčit, zda klisna není březí, protože preparáty negativně působí na březost klisny (MÜLLER, 2006) Ovlivnění nástupu ovulace: Na podporu nástupu ovulace se nejčastěji využívají chorionový humánní gonadotropin (HCG) (MÜLLER, 2006). HCG působí přes LH-receptory, ty jsou umístěny na dominantním preovulačním folikulu. Nejsme schopni určit, zda se LH receptory vyskytují na folikulu, ale folikul s průměrem větším jak 3,5 cm se považuje za dostatečně zralý na to aby LH- receptory obsahoval. Po aplikaci HCG proběhne ovulace během 48 hodin, typicky mezi hodinami. Jestliže k ovulaci u klisny došlo do 36 hodin, znamená to, že aplikace HCG byla pozdě provedena. V případě že nedojde k ovulaci do 48 hodin, musíme aplikaci HCG opakovat a signalizuje to, že v době podání nebyl folikul dostatečně zralý (KATILA, 2006). MÜLLER, (2006) uvadí jako další možný způsob ovlivnění nástupu ovulace použití equinního gonadotropinu (ECG) a přípravků na úrovni gonadotropinů RH na bázi lecirelinu nebo buserelinu Inseminace klisny: Podmínkou úspěšné inseminace je aktivní součinnost chovatele, inseminačního technika, veterinárního lékaře a organizace produkující sperma hřebce (ŘÍHA, 2003). Dle ŘÍHY, (2003) existuje 5 zásad, jejíž realizace nám zajistí úspěch inseminace: plemenice ohlášená k inseminaci musí mít řádně provedenou anamnézu a předvyšetření dodržení hygieny při inseminaci a dalších úkonech 31

32 inseminaci provádět v optimální době říje řádné zacházení se spermatem vlastní inseminaci provést bezchybně (zavedení spermatu). Není-li některá z těchto zásad splněna, lze očekávat nižší výsledky úspěchu při inseminaci s vyššími náklady na její provedení Přeprava semene a rozmrazení inseminační dávky: Naředěné semeno se doporučuje použít do 30 minut od jeho získání, z tohoto důvodu se na delší vzdálenosti nepřeváží a do okamžiku použití se nezchlazuje, drží se při teplotě C. Konzervované a zchlazené sperma na teplotu 0 až 4 C, obalí se nádobka se semenem gázou nebo vatou a vloží se do termoláhve. Před vlastním použití konzervovaného semene je potřeba posoudit vitalitu spermii. Vzorek zahříváme na teplotu C. Obnovení pohybu spermii závisí na době, po kterou konzervace trvala. Při šestihodinové konzervaci se pohyb plně obnoví za 2 minuty, zatímco při 48 hodinové konzervaci až za minut. Hluboce zamrazené sperma se převáží v kontejnerech s tekutým dusíkem a rozmrazuje se při teplotě C, těsně před použitím semene k inseminaci (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). Teplota dusíku je mínus 196 C, teplota par tekutého dusíku se pohybuje v hodnotě okolo 150 C. Metabolické pochody jsou pozastaveny při teplotě nižší než mínus 130 C. Proto je nutné pracovat při vyjímání pejet tak, aby se nezvýšila při manipulaci teplota uložených pejet nad mínus 130 C. V polovině hrdla kontejneru je teplota asi mínus 60 C směrem k otvoru se teplota zvyšuje na mínus 30 C (ŘÍHA, 2003) Velikost inseminační dávky: Při použití krátkodobě konzervovaného spermatu by počet aktivních spermií neměl klesnou pod 100 milionů aktivních spermii. Při použití inseminační dávky mražené se doporučuje, aby obsahovala minimálně 250 milionů aktivních spermii. Objem inseminační dávky je doporučován od 10 do 30, výjimečně až 120 cm 3. Vyšší objem inseminační dávky nemá vliv na lepší zabřezávání u klisen (LOUDA a kol, 2001). 32

33 Hygiena připouštění: Nedodržení správné hygieny během připouštění se může negativně projevit na jeho celkovém výsledku. V plnohodnotné říji jsou pohlavní orgány klisny poměrně odolné vůči mikrobiální infekci. U klisen s nižší obranyschopností existuje reálné nebezpečí endometritid, jako následek zavlečení infekce při připouštění. Velmi důležité je před připouštěním opakovaně, důkladně omýt vulvu klisny mýdlem a vhodným desinfekčním prostředkem. Aby byl znemožněn přenos infekce z jedné klisny na druhou, je třeba používat k mytí jednorázových pomůcek. Značné problémy může přivodit umělá inseminace do dělohy klisny mimo období říje nebo v nekvalitní říji, protože v tomto období jsou pohlavní orgány klisny k infekci značně náchylné (MÜLLER, 2006) Postup při inseminaci: Inseminační zákrok se u klisen prování vaginální metodou a to za použití vaginálního zrcadla nebo bez požití vaginálního zrcadla. K inseminaci používáme jen sterilní nástroje. Při použití spekula jej zasuneme do vagíny tak, aby bylo dobře vidět zevní branku děložního krčku. Pod zrakovou kontrolou se pak zavádí do kanálku děložního krčku do hloubky cm. Semeno se tlakem na píst zvolna vstřikuje do dělohy. Tato metoda je hojně využívána v chovech ohrožených nakažlivými nemocemi (GAMČÍK, KOZUMPLÍK 1976). Při inseminační metodě bez spekula si technik navlékne jednorázovou rukavici. Před zasunutím ruky do pochvy zvýší její kluzkost rozetřením sterilního parafinového oleje. Po zasunutí ryky do pochvy se vyšetří otvor děložního krčku. Je-li krček uzavřen, inseminace se neprovádí. Po vyšetření krčku se ruka vysune na okraj pochvy tak, aby dlaň chránila zakončení pipety. Pipeta se pod ochranou ruky přivede až ke krčku, zde se prst zavede do krčku a pipeta se zasune podél prstu asi 10 a 15 cm od zevní branky děložního krčku kam deponujeme semeno (LOUDA a kol, 2001). MÜLLER (2006) uvádí, že po deponaci semene je vhodné přidržet zevní branku krčku a simulovat frikční pohyby hřebce aby došlo k navození děložních kontrakcí. Po inseminaci je vhodné klisnu provádět. 33

34 Obr. 4 Inseminace klisny vaginální metodou (zavedení inseminační sondy pod ochranou ruky a prstů do děložního krčku) (LOUDA, 2001) Inseminace čerstvým spermatem: On site UI neboli inseminace čerstvým spermatem, se provádí, jeli hřebec a klisna na jednom místě a k inseminaci dochází bezprostředně po odběru ejakulátu od hřebce. Tato metoda je nejúspěšnější. Úspěšnost hřebce v prvním pohlavním cyklu u klisen je okolo 70% a v reprodukčním období až okolo 90% s porodností kolem 80% (poměr mezi zapuštěnými a zabřezlými klisnami) (KATILA, 2011). Výhoda oproti přirozené plemenitbě je v možnosti vyšetření spermatu. Vyšetření spermatu nám přináší poznatky o jeho kvalitě, oplozovací schopnosti a veterinární nezávadnosti. Tato metoda nám nabízí ekonomičtější a intenzivnější využití plemeníků zvláště u sportovních koní. Hřebec může být využíván jak v jezdeckém sportu, tak i v reprodukčním procesu (MISAŘ, JISKROVÁ, 2001) Inseminace chlazeným spermatem: Vzhledem k ekonomickým aspektům a k obtížnější dostupnosti semene (omezený počet zaslaných inseminačních dávek)je snaha inseminovat každou klisnu pouze jednou inseminační dávkou. Doporučená dávka je dvojnásobkem dávky normální, to je 1000 x 10 6 progresivně pohyblivých spermii. Kvalita semene po transportu nemusí být příliš vysoká, a proto je důležité provést inseminaci co nejblíže k ovulaci. Pokud dojde k inseminaci zaslaným semenem do 24 hodin před ovulací, bývá 34