MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2011 HELENA BŘUSKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Tvorba vektorových konstruktů pro indukci rezistence rostlin vůči hmyzím škůdcům a jejich testování Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Pavel Hanáček, Ph.D. Brno 2011 Vypracovala: Bc. Helena Břusková

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Tvorba vektorových konstruktů pro indukci rezistence rostlin vůči hmyzím škůdcům a jejich testování vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU. dne podpis diplomanta

4 PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala Ing. Michalu Rohreovi za pomoc při zpracování práce, odborné rady, trpělivost a ochotu mi vše vysvětlit a s čímkoliv pomoci, dále pak Ing. Pavlu Hanáčkovi, Ph.D., vedoucímu své diplomové práce.

5 ABSTRAKT Tato práce byla zaměřena na vytvoření vektorového systému Agrobacterium tumefaciens kmene EHA 105 nesoucí plazmid pwell14b a následné ověření transgenoze na listových terčících modelové rostliny tabáku virginském (Nicotiana tabacum). Vytvořený konstrukt je určen k transformaci cílové rostliny hrachu setého. Základem plazmidu pwell14b byl vektorový konstrukt pwell11b, který obsahuje gen pro inhibitor hmyzích serinových proteáz SPI2, k němu připojený gen pro GFP, jenž má schopnost zelené fluorescence pod UV zářením, dále pak reportérový gen GUS a selektovatelný gen bar pro rezistenci k fosfinotricinu. Do plazmidu pwell11b, v restrikčním místě NotI, byl vštěpen fragment, pocházející z plazmidu pwell12a, obsahující mezi regulačními sekvencemi 35S promotorem a CaMV polya terminátorem, fúzní gen s fragmentem genu pro plášťový protein viru PSbMV (virus semenem přenosné mozaiky hrachu) a sekvence kódující rezistenci k PEMV (virus výrůstkové mozaiky hrachu) umístěné v poloze sense/antisense. Výsledkem práce je úspěšné vytvoření plazmidu pwell14b. Správnost transgenoze byla potvrzena provedením GUS testu. Lze tedy usoudit, že vektorový systém pwell14b je funkční a úspěšně jím lze transformovat dvouděložné rostliny. Klíčová slova: SPI2, PSbMV, PEMV, transformace, GMO, Agrobacterium tumefaciens, inhibitor hmyzích proteáz, tabák virginský

6 ABSTRACT This thesis is focused on the creation of vectorial system of Agrobacterium tumefaciens of the EHA 105 trunk wearing the pwell14b plasmid, and the resulting verification of the transformation on the foliar disc of tobacco cheroot model herbage (Nicotiana tabacum). The construct created has been designed to transformation of the final pea plant. Serving as the basis of the pwell14b plasmid, the pwell11b vectorial construct contains the gene for SPI2 insect serine proteases inhibitor, to it appended gene for GFP, which takes a green fluorescence at the UV radiation, further, the GUS reporter gene and selectable bar gene for the resistance to phosphinotricin. The fragment, indigenous to plasmid pwell12a, containing, between regulation sequences of the 35S promoter and CaMV polya terminator, a fusion gene with a fragment gene for coat protein of the PSbMV virus (pea seed-borne mosaic virus) and the sequence encoding the resistance to PEMV (pea enation mosaic virus) placed in the position sense/antisense, was inserted to the pwell11b plasmid in the NotI restriction point. The thesis results in a successful creation of the pwell14b plasmid. The validity of the transformation was confirmed by the fulfilment of the GUS test. It is then possible to come to a conclusion that the pwell14b vectorial system is functional and can transform dicotyledonous plants successfully. Keywords: SPI2, PSbMV, PEMV, transformation, GMO, Agrobacterium tumefaciens, insect protease inhibitor, tobacco plant

7 OBSAH 1 ÚVOD Cíl práce LITERÁRNI PŘEHLED Purifikace, separace a úprava nukleových kyselin Extrakce a purifikace nukleových kyselin Lyze buněk z tkání Přečišťovaní enzymy Purifikace nukleových kyselin chromatografií Centrifugace Elektroforéza nukleových kyselin Enzymy používané k úpravám nukleových kyselin Genové inženýrství a transgenoze Metody transgenoze Nepřímé metody transformace Transformace prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium Transformace virovými vektory Přímé metody transformace Biolistika Elektroporace Aplikace polyetylenglykolu Mikroinjekce Využití lipozómů Rozdíly mezi přímou a nepřímou transformací Bakterie Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid a T-DNA plazmidu Ti A. tumefaciens Přenos T-DNA A. tumefaciens do rostlinného genomu Agrobakteriální vektory Kointegrativní vektory Binární vektory Selektovatelné geny Reportérové geny Rezistence k hmyzím škůdcům Transgen pro δ-endotoxin Bacillus thuringiensis Inhibitory hmyzích proteáz Inhibitory hmyzích amyláz Lektiny Chitinázy a tryptofandekarboxylázy Rezistence k virům Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky Rezistence založená na transgenu pro replikázu Rezistence podmíněná nukleovými kyselinami RNA interference Rizika spojená s transgenními rostlinami Rizika spojená s pěstováním GM plodin tolerantních k herbicidům Rizika spojená s pěstováním GM plodin rezistentních k hmyzím škůdcům Rizika spojená s pěstováním GM plodin rezistentních k virům... 34

8 2.7.4 Zamezení šíření GMR do okolí MATERIÁL A METODIKA ZPRACOVÁNÍ Materiál Rostlinný materiál Bakteriální kultury Kultivační média složení Metodika zpracování Založení pokusu Transformace pomocí A. tumefaciens Kultivace GUS test VÝSLEDKY DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 62

9 1 ÚVOD Celosvětová populace lidí se stále rozrůstá a na zemědělství jsou kladeny stále vyšší nároky, co se týče objemu a kvality produkce. Pěstování hrachu setého (Pisum sativum L.), jenž náleží k plodinám s menší výnosovou stabilitou spojenou se značnou závislostí výnosu na počasí, hlavně ovlivňují a způsobují rizikovost jeho výnosu a kvality škody způsobené hmyzími škůdci a poté následné infekce houbovými, virovými, či bakteriálními patogeny. Mezi hlavní hmyzí škůdce hrachu setého v prvé řadě patří kyjatka hrachová (Acyrthosiphon pisum Harris), která nejenže škodí sáním, ale především je hlavním přenašečem viróz. Dále sem patří třásněnky (Thripidae), které významně snižují výnos sáním v době květu, listopas čárkovaný (Sitona lineatus L.), jehož larvy vyžírají kořenový systém a hlízky, navíc sám škodí v dospělosti žírem na listech, nebo zrnokaz hrachový (Bruchus pisorum L.), který způsobuje tzv. muškovitost semen. Následkem působení těchto hmyzích škůdců jsou, jak již bylo zmíněno, virová onemocnění. Mezi hlavní virové patogeny způsobující velké ztráty na výnosech při pěstování hrachu setého patří výrůstková mozaika hrachu (Pea enation mosaic virus PEMV), která je přenášena právě kyjatkou hrachovou. Druhé nejčastější virové onemocnění u hrachu setého je způsobeno virem semenem přenosné mozaiky hrachu (Pea seed-borne mosaic virus PSbMV), který způsobuje u hrachu symptomy často zaměnitelné za symptomy způsobené nedostatkem živin. PSbMV se přenáší semenem a sekundárně hlavně kyjatkou hrachovou. Ochranu hrachu setého před poškozením hmyzími škůdci, a tak i v důsledku toho vzniklým následným infekcím, lze zajistit pomocí aplikace chemických prostředků nebo využitím nových poznatků z genetiky a molekulární biologie v tvorbě nových transgenních odrůd, hlavně odrůd rezistentních vůči hmyzím škůdcům a virovým onemocněním. Rezistenci lze u rostlin navodit pomocí transgenoze, jednou z metod genového inženýrství, a to vnesením části příslušného genu pro navození rezistence do genomu rostliny. Geny pro indukci rezistence k hmyzím škůdcům mohou být jak živočišného (δ-endotoxin), tak živočišného i rostlinného (inhibitory proteáz) či pouze rostlinného původu (lektiny). Ve všech případech exprese těchto genů způsobuje u hmyzu po požití části transgenní rostliny značné metabolické poruchy, omezený vývoj a nejčastěji smrt. 9

10 Rezistenci k virovým onemocněním lze u rostlin navodit vnesením části genu pro plášťový protein příslušného viru v sense/antisense orientaci. Výsledkem integrace takového segmentu do genomu rostliny by měla být tvorba dvouřetězcové RNA, která spouští v rostlinách mechanismus RNAi, jímž je indukovaná rezistence k virovému patogenu. 1.1 Cíl práce Cílem této práce bylo vytvořit vektorový systém určený k transformaci hrachu setého (Pisum sativum). Systém se skládá z bakterie Agrobacterium tumefaciens Smith a Townsend kmene EHA 105 nesoucí plazmid pwell14b. Plazmid pwell14b byl vytvořen fúzí plazmidů pwell11b a pwell12a. Plazmid pwell11b obsahuje pod trojnásobným 35S promotorem a terminátorem OSC fúzní gen pro SPI2-GFP. SPI2 kóduje hmyzí inhibitor serinových proteáz, k němu připojený gen GFP má schopnost zelené fluorescence pod UV zářením a slouží k lepšímu rozpoznání rostlin s inzertem. Plazmid pwell11b byl použit jako vektor pro fragment plazmidu pwell12a, který mezi regulačními sekvencemi 35S promotorem a CaMV polya terminátorem, obsahuje fúzní gen s fragmentem genu pro plášťový protein viru PSbMV a sekvence kódující rezistenci k PEMV umístěné v poloze sense/antisense. Tento fragment o velikosti 3800 bp byl restrikčně vyštěpen z plazmidu pwell12a pomocí restrikčního enzymu NotI a byl vložen do plazmidu pwell11b v restrikčním místě NotI, které se nachází na plazmidu pwell11b mezi signálním transgenem GUS a genem LacZ. K testování tohoto vektoru byly z důvodů obtížné proveditelnosti transformace hrachu použity listové disky z in vitro pěstovaného tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.), protože tabák slouží jako vhodná modelová rostlina při transformacích A. tumefaciens. 10

11 2 LITERÁRNI PŘEHLED 2.1 Purifikace, separace a úprava nukleových kyselin Extrakce a purifikace nukleových kyselin Cílem purifikačních procesů je získat nukleovou kyselinu v nativním stavu v dostatečném množství a čistotě. Metody izolozace nukleových kyselin využívají rozdílné rozpustnosti biologických molekul, adsorpce na pevný podklad nebo ultracentrifugace v gradientních roztocích. Výběr metody purifikace DNA nebo RNA závisí na způsobu její následné analýzy (Šmarda et al., 2010) Lyze buněk z tkání Existuje mnoho různých metod purifikace nukleových kyselin, ale jejich základní rysy jsou společné. Vstupním materiálem mohou být např. kultury bakterií nebo eukaryotických buněk, které je třeba oddělit od růstového média (obvykle centrifugací) nebo komplexnější vzorky tkání a pletiv, které musí být před lyzí homogenizovány (př. rostlinná pletiva tekutým dusíkem). Pokud je to možné, měl by být vstupní materiál čerstvý, zamražený nebo lyofilizovaný, aby se zabránilo degradaci nukleových kyselin enzymy v buněčném extraktu. K uvolnění vnitřního obsahu buněk je nutné vyvolat lyzi buněčné stěny. Stěny bakteriálních buněk se obvykle rozrušují lysozomem. Současně s lysozomem se používají detergenty pro solubilizaci cytoplazmatické membrány (např. laurylsíran sodný) a chelatační činidla (např. EDTA), která jednak vážou dvojmocné kationty a tím destabilizují vnější bakteriální membránu, jednak inhibují deoxyribonukleázy (DNázy). Po rozrušení buněčné stěny a plazmatické membrány se v roztoku objeví jejich degradační produkty spolu s nitrobuněčnými složkami a vzniká komplexní směs DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů nízkomolekulárních látek a uhlovodíků (Šmarda et al., 2010). 11

12 Přečišťovaní enzymy Z purifikované DNA lze odstranit RNA působením ribonukleázy (RNázy). Tento enzym je stabilní i při vysoké teplotě a proto je možné jej zahřáním na teplotu 65 C zbavit stop nežádoucích deoxyribonukleáz, které by mohly DNA poškodit. Pro odstranění proteinů z buněčných lyzátů se používají protézy, např. proteináza K nebo pronáza E. Odstranění proteinů je při purifikaci nukleových kyselin velmi důležité, protože buňky obsahuje jednak řadu enzymů, které nukleové kyseliny degraduji, ale také proteiny, které se na DNA vážou a tak mohou omezovat účinnost následujících experimentů (Šmarda et al., 2010) Purifikace nukleových kyselin chromatografií Při purifikaci nukleových kyselin na chromatografických kyselinách, které jsou často vsazeny do centrifugačních mikrozkumavek a kombinují tak chromatografii s centrifugací ( spin columns ) se používají dva hlavní přístupy. Při gelové chromatografii se vzorek nanáší na kolonu, jejíž náplň je tvořena malými poréznímy zrnky nosiče. Malé molekuly, jako soli, volné nukleotidy, atd. prostupují do porézní matrice a tím zpomalují svůj pohyb kolonou, zatímco velké molekuly nukleových kyselin zrnky matrice neprostupují a procházejí proto kolonou rychleji. Při afinitní chromatografii je zajištěna interakce mezi makromolekulami vzorku a náplní kolony. Může se jednat o interakci elektrické povahy, založené na afinitě kladně nabitých chemických skupin nosiče k negativně nabitým zbytkům kyseliny fosforečné v molekule DNA (iontoměničová chromatografie) nebo o více specifickou interakci např. mezi sekvencemi oligo-dt vázanými na zrnka nosiče a sekvencemi poly-a, které jsou přítomny na koncích molekul eukaryotických mrna. V obou případech se využije imobilizace nukleových kyselin na nosiči a odmytí nežádoucích molekul, které kolonou volně procházejí. Následně, použitím jiného pufru se molekuly nukleových kyselin z nosiče uvolní. Nukleové kyseliny izolované prostřednictvím chromatografických technik mají vysoký stupeň čistoty (Šmarda et al., 2010). 12

13 2.1.2 Centrifugace Centrifugace patří k separačním metodám, které se používají k izolaci, purifikaci a charakterizaci biomakromolekul a buněčných struktur. Základním principem separace je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy. Rychlost, s jakou částice sedimentují, závisí na jejich velikosti, tvaru a hustotě a je ovlivněna rovněž vlastnostmi prostředí a podmínkami, při nichž centrifugace probíhá. Veličina, kterou lze rychlost částic při centrifugaci charakterizovat, se označuje jako sedimentační koeficient nebo též hodnota S. Rychlost sedimentace částic při centrifugaci lze vyjádřit obecným vztahem: dr/dt = S.a = s.ω 2 r, kde r je vzdálenost částic od osy otáčení, t je doba centrifugace, a je odstředivé zrychlení, S je sedimentační koeficient, ω je úhlová rychlost rotoru při otáčení (Šmarda et al., 2010). Způsoby centrifugace: diferenciální centrifugace - základem pro dělení jsou rozdíly v sedimentačních rychlostech částic, zonální centrifugace zde je homogenní roztok v centrifugační zkumavce nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky stoupá, izopyknická centrifugace - při tomto postupu se dosahuje rozdělení směsi částic na základě rovnovážné centrifugace (Vávrová, 2009) Elektroforéza nukleových kyselin Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějším separačním technikám při izolaci a analýze nukleových kyselin a bílkovin. Je to metoda, která využívá schopnosti pohybu nabitých částic v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, že rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly, různě velké a různě nabité molekuly se budou pohybovat odlišnou rychlostí (biochemie.sweb.cz). 13

14 Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, a proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují k opačně nabité elektrodě - anodě. Typy elektroforéz: Gelová elektroforéza elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny polyakrylamidem nebo agarózou. Agarózové gely jsou vhodné pro separaci molekul nukleových kyselin o velikosti od 100 bp až po 50 kb, polyakrylamidové gely se používají pro separaci menších molekul (10 až 1000 bp). Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) při této elektroforéze je gel vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem ( ) v časových intervalech periodicky mění. Aby se molekuly DNA mohly pohybovat ve směru změněného elektrického pole, musí nejdříve změnit svou orientaci. Tento proces se nazývá reorientace a doba nutná k jejímu uskutečnění se označuje jako neorientační čas. Větší molekuly DNA spotřebují na svou reorientaci více času než molekuly menší a jejich výsledný přímočarý pohyb je proto pomalejší. Denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) využívá rozdílné elektroforetické mobility u částečně denaturované DNA a DNA v nedenaturovaném stavu. Využívá se k detekci rozdílů v sekvenci (např. bodové mutace) v krátkých molekulách DNA o stejné délce. Elektroforéza nukleových kyselin pro stanovení jejich sekvence používají se gely s vysokou koncentrací denaturujících látek (např. močovina) a elektroforéza se provádí při teplotě C. Zabraňuje se tak denaturaci jednořetězcových oligonukleotidů o délce několika desítek až stovek bází, které jsou výsledkem reakcí používaných při sekvencování DNA (Šmarda et al., 2010) Enzymy používané k úpravám nukleových kyselin Enzymy se dělí podle substrátové specifity na: enzymy, jejichž substrátem je DNA, enzymy, jejichž substrátem je RNA. 14

15 Podle typu reakcí, které katalyzují, lze enzymy obou výše uvedených skupin dále dělit na: enzymy syntetizující nukleové kyseliny (polymerázy), enzymy modifikující nukleové kyseliny (fosfatázy, metylázy, kinázy), enzymy spojující nukleové řetězce (ligázy), enzymy odbourávající nukleové kyseliny (nukleázy) (Šmarda et al., 2010). 15

16 2.2 Genové inženýrství a transgenoze V průběhu posledních dvou desetiletí byly konvenční metody šlechtění, jako je výběr, hybridizace, polyploidizace či indukovaná mutageneze, rozšířeny o techniky genového inženýrství (Bednář, 2005). Snahou genového inženýrství je modifikace genetického materiálu organismu tak, aby získal novou vlastnost. Genetické manipulace, za které považujeme všechny nekonvenční techniky prováděné in vitro vedoucí k modifikaci genomu organismů, lze z hlediska používaných metod rozdělit do dvou hlavních směrů: buněčné inženýrství zahrnující modifikaci genetické informace recipientního organismu prostřednictvím přenosu celých buněk (parasexuální hybridizace) nebo izolovaných organel, vlastní genové inženýrství - transgenoze, genetická transformace (Vyskot, 1998). Prudký rozvoj tohoto odvětví byl především spojen s objevem dvou typů enzymů - restrikčních endonukleáz, jejichž prostřednictvím lze získat požadovaný fragment DNA a ligázy, která umožňuje vložení fragmentu do takové molekuly DNA, která je schopna replikace ve zvoleném typu buněk (Rumlová et al., 2003). Jednou z metod genového inženýrství je transgenoze. Tato metoda je založena na vnášení jednotlivých klonovaných genů do rostlinného genomu. Jde o přenos přesně definovaných sekvencí DNA, tzv. transgenů, které se exprimují v pořadí aminokyselin v konečném translačním produktu (protein) s definovanou úlohou v biosyntetických drahách. Jedná se tedy o předem plánovanou změnu jednoho znaku rostliny (Bednář, 2005). Metody transgenoze odstartovalo v roce 1977 jednoznačné prokázání, že půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens vnáší svou DNA do rostlinného genomu (Ondřej a Drobník, 2002). Jako transgenní rostliny (GMR) jsou tedy označovány všechny rostliny, do jejichž dědičného základu byl vnesen jeden nebo několik klonovaných genů, tedy genů získaných metodami genového inženýrství. Tyto geny mohou pocházet z dědičného základu samotné rostliny nebo z libovolně systematicky vzdáleného organismu, např. přenos eukaryotického genu do bakterií (Bednář, 2005). 16

17 2.3 Metody transgenoze Nepřímé metody transformace Nepřímé metody transformace rostlin patří mezi starší postup přenosu genetické informace. Jsou to takové metody, které využívají jako přenašeče cizorodé DNA, takzvaný vektor. Vektorem bývají obvykle specifické bakteriální plazmidy, některé typy retrovirů, transpozónů či lipozómů (Vejl, 2007). Vhodné vektory by měly mít snadný vstup do rostlinné buňky, široký okruh hostitelských rostlinných druhů, schopnost včlenění do rostlinných chromozomů, schopnost přenosu do semenného potomstva a neměly by negativně ovlivňovat fenotyp rostlin (Vyskot, 1998). Klonovaný gen se vloží do vektoru a spolu s ním se replikuje v hostitelské buňce. Na plazmid nebo virový vektor je klonovaný fragment DNA inzertován ligací na homologních volných koncích, které vznikly rozštěpením určitou restriktázou. Plazmid obohacený DNA fragmentem je pak vpraven do bakteriální hostitelské buňky, kde se namnoží. Plazmidové vektory se množí nezávisle na replikaci bakteriálního chromozomu, čímž se v buňce nahromadí i několik set kopií tohoto plazmidu (Bednář, 2005) Transformace prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium Nejrozšířenějším vektorem k přenosu cizorodé DNA do dvouděložných a nahosemenných rostlin jsou agrobakteriální plazmidy, zejména plazmidy gramnegativních půdních bakterií Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes Conn. Při transformaci A. tumefaciens se využívá jeho přirozené schopnosti vnášet své určité geny z takzvaného Ti-plazmidu do genomu rostliny. Ti-plazmid nese kromě genů virulescence i oblast T-DNA, která se dá různými metodami molekulární biologie upravovat, a vnášet tak do rostlin různé geny. Z úseků T-DNA lze odstranit původní geny a nahradit je novými, námi potřebnými. Pro získání úseku T-DNA je zapotřebí rozštěpit celý Ti-plazmid restrikční endonukleázou. Takto získané fragmenty lze klonovat do malých plazmidových vektorů a různě spojovat dle potřeby (Ondřej a Drobník, 2002). Sekvence T-DNA, která se 17

18 včleňuje společně s nově vkládaným genem, by neměla obsahovat geny pro syntézu auxinů a cytokininů, které vyvolávají diferenciační změny rostlin, a měla by obsahovat selektovatelný gen, který umožňuje detekci a selekci transformovaných pletiv. Obdobný postup je u A. rhizogenes a jeho Ri-plazmidu. Tato bakterie vyvolává na místě poranění rostlin tvorbu větvených kořenových struktur, tzv. hairy roots (Vyskot, 1998) Transformace virovými vektory Výhodou použití DNA a RNA-rostlinných virů jako vektorů pro přenos genetické informace je schopnost systematického šíření v rostlinách po infekci jejich částí a velký výběr virů s vhodným hostitelským rozmezím. Naopak velkou nevýhodou je jejich omezená klonovací schopnost, autonomní replikace a skutečnost, že se obvykle nepřenášejí do semenného potomstva. Prvním použitý virový konstrukt k přenosu cizího genu do rostlin byl získán z DNA-viru, a to z viru mozaiky květáku, CaMV. S RNA-viry jsou manipulace jako s vektory složitější, neboť nejsou k dispozici techniky přímé konstrukce rekombinantních molekul RNA in vitro. Při integraci genů do RNA-virových genomů je proto nutné připravit zpětnou transkripcí cdna kopii viru. Transformaci rostlin lze potom provést buď infekcí rekombinantní cdna nebo jejími transkripty syntetizovanými in vitro. Tento postup byl poprvé experimentálně ověřen u jednoděložných rostlin pomocí RNA-viru mozaiky sveřepu, BMV. Zvláštní metodou, která umožňuje vnášení virových genomů do rostlin ve fytopatologickém výzkumu, je agroinfekce. Virový genom je klonován v několika tandemových opakováních do T-DNA A. tumefaciens a vnesen do rostlin, kde rekombinací mezi kopiemi virové DNA dochází k jejich uvolnění a následnému vzniku infekčních virových částic (Vyskot, 1998) Přímé metody transformace Přímé metody transformace jsou založeny na mechanickém, chemickém a elektro-fyzikálním principu přímého přenosu cizorodého DNA do jádra akceptorového organismu. Pro integraci DNA přímo vnášené do organismu je charakteristické, že probíhá s využitím enzymů akceptorového organismu. Jedná se 18

19 o replikační a reparační enzymy. Integrace cizorodé DNA je obvykle spojena s častými duplikacemi a přestavbami, které mohou narušit balancovanou sestavu genů organismu (Vejl, 2007) Biolistika Nejčastějším způsobem přímé transformace rostlin je biolistika, jejíž princip je založen na navázání DNA na mikročástice vzácného kovu (zlato, platina, wolfram) a jejich následné inkorporaci do rostlinných pletiv. Pro vnesení DNA se využívá biolistické dělo, které pracuje na principu stlačeného hélia, jenž dodává mikročásticím potřebnou energii pro překonání buněčné stěny a pro zasažení chromozomů. Výhodou této metody je možnost vnášení DNA nejen do dediferencovaných rostlinných buněk, ale i do embryí, pylu nebo meristému. Tato metoda byla rovněž s úspěchem použita při tvorbě GM jednoděložných rostlin, kde využití Ti plazmidu bakterií rodu Agrobacterium ja značně problematické (Vejl, 2007) Elektroporace Tato metoda je využívána při transformaci protoplastů, aby došlo k endocytóze exogenní DNA z roztoku. Působením pulzů elektrického pole vznikají v plazmalemě dočasné póry, kterými dovnitř protoplastů vniká tlumivý roztok obsahující exogenní DNA (Ondřej a Drobník, 2002). Tato metoda, vyvinutá původně pro fúzi buněk, je často používaná pro svou jednoduchost a pro možnost přesně definovat okamžik, kdy cizorodá DNA byla do protoplastů vpravena (Ondřej, 1992) Aplikace polyetylenglykolu Dalším způsobem transformace protoplastů, které jsou inkubovány v pufru obsahujícím cizorodou DNA, je přidání polyetylenglykolu (PEG). PEG může navozovat změny plazmalemy, které vedou jednak k fúzi protoplastů, jednak k endocytóze cizorodé DNA (Ondřej a Drobník, 2002). 19

20 Mikroinjekce Tato transformace je založená na aplikaci cizorodé DNA pomocí mikromanipulátorů a mikroinjektorů nejen do jader protoplastů, ale i do buněk rostlinných embryí, případně do celých pletiv. Nevýhodou metody je, že během jednoho pokusu je možno ovlivnit jen omezené množství (desítky) protoplastů (Ondřej a Drobník, 2002) Využití lipozómů V tomto případě se využívá uměle vytvořených lipidových mikroskopických až submikroskopických kapének, které v sobě uzavírají roztok DNA. Hlavní výhodou lipozómů je příbuznost jejich struktury se strukturou střední, hydrofobní lamely plazmalemy rostlinných buněk a z toho vyplývající vysoké schopnosti přenosu cizorodé DNA přes plazmalemu (Ondřej, 1992) Rozdíly mezi přímou a nepřímou transformací Zatímco bakterie Agrobacterium umožňují včleňovat do rostlinného genomu velké úseky DNA (až 150 kb), při přímé transformaci se zpravidla včleňují jen fragmenty plazmidu zřídka delší než jeden gen. Pro využití systému transformace je však zapotřebí do určitého místa rostlinného genomu vložit nejméně geny dva. Jeden selektovatelný a druhý námi sledovaný gen. U přímé transformace dochází často ke kotransformaci, kdy jsou oba geny integrovány do téhož místa chromozomu. Další rozdíl přímé transformace spočívá v tom, že do rostlinných buněk je často přenášeno mnoho tandemových kopií v témže místě genomu nebo i na různých místech genomu, což se při transformaci bakterií Agrobacterum děje v menší míře. U rostlin s tandemovými kopiemi transgenů je nebezpečí nízké exprese genů, proto jsou nevýhodné a je zapotřebí je vyloučit při výběru pro další experimentální práci. Souhrnně lze konstatovat, že transformace pomocí bakterií Agrobacterum je mnohem výhodnější než transformace přímá. Transformace přímá je sice účinná obecně, ale její účinnost bývá obvykle nízká (Ondřej a Drobník, 2002). 20

21 2.4 Bakterie Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium teumefaciens je tyčinkovitá gramnegativní půdní bakterie z čeledi Rhizobiaceae, která vyvolává tvorbu nádorů typu crown-gall na poraněných místech především dvouděložných a nahosemenných rostlin. Její infekčnost je podmíněná přítomností velkého plazmidu Ti, na kterém se nachází tzv. oblast T-DNA (transferred DNA) a geny odpovědné za virulescenci (Vyskot, 1998) Ti plazmid a T-DNA plazmidu Ti A. tumefaciens Plazmidy Ti jsou funkční, tedy schopné indukovat rostlinné nádory pouze v buňkách Agrobacterium a Rhizobium. Chromozomální mapy Agrobacterium a Rhizobium jsou velmi podobné. Aby docházelo k indukci nádorů u rostlin, musí být geny plazmidu Ti v interakci s chromozomálními lokusy. Plazmid Ti má dva úseky nepostradatelné k indukci nádorů: T-DNA, která do rostlinných buněk vstupuje, ale sama nemá žádné geny pro vlastní integraci, úsek virulescence, který obsahuje geny nutné pro funkce podmiňující přenos T-DNA do rostlinných buněk a její integraci v rostlinném genomu (Ondřej, 1992). Plazmid Ti má délku obvykle v rozmezí kb, což představuje asi 3 % délky chromozomu A. tumefaciens. Délka jeho T-DNA činí asi 15 kb (Ondřej a Drobník, 2002). T-DNA obohacuje rostlinný genom a dva základní typy genů: geny pro syntézu rostlinných hormonů, auxinů a cytokyninů. Ty působí dediferenciaci rostlinných buněk. Transformovaná rostlinná pletiva pak rostou jako nediferencované nádory, geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů či agrocinopinů. Opiny slouží pro bakterii jako zdroj uhlíku, dusíku a energie. Agrocinopiny jako zdroj fosforu, uhlíku a energie. Jsou vylučovány do okolních netransformovaných pletiv a do půdy. 21

22 Existují dva typy Ti plazmidu, oktopinový a nopalinový. Zatímco nopalinový typ je kompaktní, T-DNA oktopinových plazmidů Ti je rozdělena na dva úseky: levý (T L ) a pravý (T R ). K integraci T L a T R dochází často současně, ale T L i T R se mohou integrovat také nezávisle na sobě. Geny pro dediferenciaci a nádorový růst jsou lokalizovány v T L, proto se u nádorů vyskytuje buď T L i T R, nebo jen T L -DNA. Bakterie tedy do rostlinných buněk vkládají genetickou informaci pro syntézu látek, které samy spotřebovávají (Ondřej, 1992). Dělení buněk s touto přidanou genetickou informací T-DNA, ke které vede zvýšená koncentrace rostlinných hormonů, podmiňuje syntézu velkého množství opinů jako substrátu pro výživu tohoto kmene bakterií Agrobacterium. Opiny i agrocinopiny současně také indukují přenos plazmidu Ti do dalších buněk Agrobacterium (Ondřej a Drobník, 2002) Přenos T-DNA A. tumefaciens do rostlinného genomu Přenosové funkce jsou v A. tumefaciens kódovány plazmidovými i chromozomálními virulentními geny. V průběhu procesu hojení dochází v poraněných rostlinných buňkách k syntéze ligninu z fenolických prekurzorů, které slouží jako chemoatraktant pro bakterie A. tumefaciens a následnou indukci Ti plazmidových virulentních (vir) genů. Bakteriální chromozomální virulentrní geny (chva a chvb) jsou exprimovány konstitutivně a zprostředkují zejména přichycení bakterií k rostlinné buňce prostřednictvím celulózových vláken. Virulentní geny lokalizované na Ti plazmidu potom řídí a zprostředkují speciální reakce rozpoznávání rostlinné buňky a následné procesy vedoucí k přenosu T-DNA. Tyto geny jsou lokalizovány v jeho velkém regulonu v osmi operonech (vira až virh). Geny vira a virg svými produkty pozitivně řídí transkripci ostatních vir-genů: aminoterminální část vira-proteinu slouží jako senzorová doména integrující přímo s rostlinnými signálními molekulami a předává signál virg-proteinu, který aktivuje ostatní vir-geny. V transformačním procesu hrají rozhodující úlohu hranice segmentu T-DNA, které jsou tvořeny přímým opakováním ne zcela shodných 25 kb úseků DNA. Jakákoliv DNA lokalizovaná mezi těmito hranicemi může být transponována a integrována do rostlinného chromozomu, přičemž rozhodující úlohu hraje pravá hraniční sekvence (right boundary), od které přenos T-DNA začíná. 22

23 Produkt vird1-genu působí jako specifická nukleáza, která vyštěpí pravděpodobně jedno vlákno T-DNA, jež je potom s pomocí vird2-proteinu transponováno do rostlinné buňky. Finálně je T-DNA integrována do rostlinného chromozomu procesem náhodné (ilegitimní) rekombinace, což zajišťuje její mitotickou i meiotickou stabilitu (Vyskot, 1998) Agrobakteriální vektory Původně vypracované postupy přenosu klonovaných genů do Ti plazmidů byly poměrně složité. Zahrnovaly několikanásobné konstrukce plazmidových vektorů obsahujících žádný gen, signální gen pro selekci příslušných plazmidů v Escherichia coli T. Escherich a fragmenty T-DNA v promiskuitních plazmidech, které byly vnášeny do A. tumefaciens, kde dvojitou homologní rekombinací docházelo k integraci do Ti plazmidu. T-DNA však obsahuje onkogeny (iaam, iaah a ipt), které odpovídají za nadprodukci auxinu a cytokininu a brání v regeneraci rostlin z transformovaných buněk. Proto bylo nutné tyto geny eliminovat buď mutací, nebo delecí. To vedlo ke konstrukci vektorových Ti plazmidů, kde velká část T-DNA je nahrazena úsekem malého plazmidu z E. coli, což také umožnilo snadnou introdukci žádaných genů klonovaných v tomto pomocném plazmidu jednoduchou rekombinací (Vyskot, 1998) Kointegrativní vektory Kointegrativní vektory jsou tvořeny Ti plazmidem, jehož T-DNA je modifikována tím, že do ní byl včleněn kointegrativní vektor (Ondřej a Drobník, 2002). T-DNA je zbavena onkogenů (onc) kódující tvorbu auxinů a cytokyninů a transgeny se do ní začleňují homologní rekombinací (Říha, 1997) Binární vektory Binární vektory jsou takové vektory, u nichž byl Ti plazmid rozdělen na dva plazmidy, z nichž jeden nese úsek virulescence a druhý T-DNA. Jsou to relativně malé plazmidy nesoucí upravenou T-DNA, do které jsou transgeny klonovány v E. coli a poté je celý plazmid přenesen do vhodného agrobakteriálního kmene, jenž obsahuje 23

24 Ti plazmid s upravenou nebo úplně deletovanou T-DNA. Tyto vektory se používají častěji pro svou snadnější manipulovatelnost a větší univerzálnost (Říha, 1997) Selektovatelné geny Selektovatelné geny jsou takové geny, které se vkládají do vektoru spolu s vkládaným genem. Tyto geny nesou rezistenci k látce, jež může být přidána do agarového média, nebo ji mohou být rostliny postřikovány a jež se využívají k selekci transgenních buněk a pletiv. Nejčastěji se využívá transgen pro rezistenci k antibiotiku kanamycinu (nptii), transgen pro rezistenci k antibiotiku hygromycinu (aphiv), či transgen pro rezistenci k herbicidu fosfinotricinu (bar) (Ondřej a Drobník, 2002) Reportérové geny Reportérové geny jsou takové geny, jejichž biochemický produkt je možné snadno zjišťovat a kvantitativně stanovovat. Slouží jako měřítko stupně exprese transgenů s různými promotory, s různou strukturou, v různých genotypech, různých pletivech a za různých podmínek. Jsou vždy chimérické (skládají se z různých DNA úseků pocházejících z různých genotypů) obsahují regulační sekvence pro projev v rostlinném genomu, ale kódující sekvence bývá bakteriální nebo živočišná. Mezi nejpoužívanější reportérové geny patří: transgen pro β-glukuronidázu (GUS) mění snadno dostupné substráty na modře zbarvené nebo fluoreskující látky. Pro detekci slouží fluorescenční a histochemická metoda, transgen pro zeleně fluoreskující protein (GFP) GFP izolovaný z medúzy Aequorea victoria má schopnost emitovat zelené světlo při ozáření UV zářením při nm nebo modré světlo při nm. Je to jediný známý protein, který fluoreskuje bez dodávání substrátu nebo kofaktorů, transgen pro luciferázu využívá se cdna genu pro luciferázu světlušky (Photinus pyralis L.) nebo kódující sekvence bakterie Vibrio Harci Baumann. Po dodání substrátu k rostlinnému proteinovému extraktu transgenních rostlin nebo do kultivačního média dochází k emisi viditelného záření, které je možno 24

25 měřit luminimetrem, scintilačním počítačem nebo zachytit na fotografický materiál (Ondřej a Drobník, 2002). 25

26 2.5 Rezistence k hmyzím škůdcům Transgen pro δ-endotoxin Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis Berliner byl poprvé objeven v Japonsku roku 1909 v podniku, kde se choval bourec morušový. Bakterie tam působila úhyn motýlů. Pak byl znovu izolován z populace moučných červů v Durynsku biologem Berlinerem v roce Je to grampozitivní bakterie, která za nepříznivých podmínek tvoří spory a přitom syntetizuje krystalickou bílkovinu, která je při větší konzumaci jedovatá pro hmyz. Existuje mnoho kmenů této bakterie a každý vytváří poněkud odlišný sporulační protein. Takovýchto protoxinů neboli δ-endotoxinů bylo již charakterizováno přes 150 a každý z nich měl poměrně úzké spektrum insekticidní účinnosti. Některé jsou toxické pro motýly, jiné pro dvoukřídlý hmyz nebo brouky (Ondřej, 2003). Analýza a porovnání sekvencí genů vedly ke klasifikaci založené na strukturních homologiích a specificitě toxinů. Geny byly sloučeny do pěti hlavních tříd, značených CryI CryV, a v rámci těchto tříd rozděleny na podtřídy (Ondřej a Drobník, 2002). Aby δ-endotoxiny získaly patogenní aktivitu pro hmyz, musí být rozpuštěny v prostředí střeva hmyzu a aktivovány trávicími enzymy, typickými pro určitý hmyz. Aktivovaná forma bílkoviny se váže na specifické receptory na povrchu buněk střeva a proděraví je. Následkem toho hmyz hyne. Právě to, že k účinku je nutná vazba na zcela specifické povrchové struktury ve hmyzím střevě, je příčinou selektivního účinku. Pro hmyz a další organismy, které tyto struktury na střevních buňkách nemají, je bílkovina neškodná. Transgenní rostliny, u kterých dochází k expresi genu pro δ-endotoxin, se také nazývají rostlinné pesticidy, protože snižují náklady na ochranu porostu (Ondřej, 2002). Ve světě je v současné době z takto upravených rostlin nejvíce rozšířeno pěstování kukuřice, bavlníku, brambor a rajčat (Bednář, 2005) Inhibitory hmyzích proteáz Inhibitory proteáz (PI) jsou malé proteolytické enzymy, které katalyzují štěpení molekuly bílkoviny na menší řetězce a posléze až na jednotlivé aminokyseliny. 26

27 V rostlinách zastávají různé funkce, např. v zásobních orgánech či při regulaci proteolytické aktivity. Podílejí se také na regulaci mnoha vývojových procesů včetně programované buněčné smrti a v neposlední řadě tvoří významnou složku obranných mechanizmů rostlin vůči hmyzím škůdcům. V rostlinách se vyskytují v překvapivě vysokých koncentracích a syntetizovány jsou buď konstitutivně, zvláště v často napadaných pletivech, nebo jako odpověď na právě vzniklé poškození, či probíhající napadení (Hraška et al., 2006). Inhibitory hmyzích proteáz je možno rozdělit na čtyři hlavní skupiny: Inhibitory serinových proteáz, serinové proteázy obsahují ve svém aktivním centru aminokyselinu serin. Inhibují trypsin a chymotrypsin. Hojně se vyskytují u semen a v zásobních orgánech rostlin (Ondřej a Drobník, 2002). Optimální aktivita PI serinových proteáz je ph 9-11, což koresponduje s obvyklým ph střevního traktu řady zástupců motýlů. Inhibitory cysteinových proteáz, cysteinové proteázy obsahují ve svém aktivním centru cystein. Aktivita cysteinových proteáz je v neutrální až mírně kyselé oblasti (ph 5-7). Byly popsány v celé řadě rostlinných druhů, např. u brambor, vigny, avokáda či papáji. Nejvíce prostudovaný je PI pocházející z rýže, tzv. oryzacystatin. Inhibitory aspartátových proteáz, aspartátové proteázy mají ve svém aktivním centru začleněn zbytek kyseliny asparágové. Aspartátové proteázy byly nalezeny spolu s cysteinovými u šesti zástupců skupiny ploštic Hemiptera. Nízké ph střevního prostředí zástupců brouků Coleoptera a Hemiptera představuje mnohem vhodnější podmínky pro aspartátové proteázy než vysoké ph (8-11) střev většiny ostatních druhů. V silně zásaditém prostředí ztrácejí svou aktivitu. Inhibitory metaloproteáz, metaloproteázy obsahují ve svém aktivním centru kovové ionty Zn 2+, Ca 2+ či Mn 2+. U rostlin byly doposud charakterizovány dvě skupiny PI metaloproteáz, rodina PI metalo-karboxypeatidas z bramboru a rajčat a skupina cathepsin D PI brambor. Mechanismus toxického působení PI na hmyz je stále předmětem intenzivního výzkumu. Obecně lze konstatovat, že PI inhibují proteázovou aktivitu trávicích enzymů a snižují tak množství proteinu, které může být stráveno, a zároveň vedou k nadprodukci trávicích enzymů, což má za následek vyčerpání rezerv sirných aminokyselin vedoucích k oslabení hmyzu, jeho omezenému vývoji či smrti. 27

28 Způsob, jakým se váží PI na cílové trávicí enzymy, se zdá být pro všechny čtyři skupiny stejný. Inhibitor se naváže na aktivní centrum enzymu a vytvoří komplex o velmi malé disociační konstantě (10 7 až M). Tím velmi efektivně blokuje aktivní centrum. Jedná se o kompetitivní inhibici. PI kromě střevních proteáz dále ovlivňují mnoho dalších enzymů, vodní rovnováhu, a některé další fyziologické pochody (Hraška et al., 2006). Je však známo, že hmyz se může přizpůsobit inhibitorům proteáz v prostředí. Lepidoptera a Coleoptera mohou nadprodukovat proteázy nebo produkovat nové typy proteáz necitlivých k inhibitorům. Hmyz obsahuje různé typy proteáz, proto je třeba u transgenních rostlin využít více typů PI současně, popřípadě využít upravené geny inhibitory proteáz se zvýšenou afinitou k hmyzím proteázam (Ondřej a Drobník, 2002) Inhibitory hmyzích amyláz Stejně jako inhibitory hmyzích proteáz, inhibují inhibitory amyláz řadu trávicích enzymů v hmyzím traktu, a tím působí jejich oslabení nebo úhyn. Základní úlohu v ochraně rostlin před hmyzími škůdci má inhibitor α-amylázy. Tento inhibitor byl izolován ze semene fazolu. Exprese tohoto genu v hrachu způsobuje rezistenci k brouku Callosobruchus maculatus Fabricius a Bruchus pisorum L., ne však k některým jiným škůdcům řádu Coleoptera (Ondřej a Drobník, 2002) Lektiny Lektiny jsou proteiny, které vážou sacharidy. Je o nich známo, že jsou toxické pro savce a ptáky. Většina z nich má antinutriční vliv, např. WGA (wheat germ agglutinin) ze zrn pšenice. Transgenní tabák s lektiny hrachu byl toxický pro motýla Heliotus virescene Fabriciusa s genem pro lektin sněženky GNA (Galanthus nivalis agglutinin) pro motýla Lacanobia oleracea L. Většina experimentů s lektiny se soustředí na získání rostlin s rezistencí ke mšicím. Projev genu GNA v tabáku vedl k částečné ochraně proti mšicím Myzus persicae Sulzer a Aulacorthum solani Keltenbach avšak současně bylo zjištěno, že tyto mšice živící se transgenními rostlinami, jsou částečně toxické pro své predátory, slunéčka Adalia bipunctata L. (Ondřej a Drobník, 2002). 28

29 2.5.5 Chitinázy a tryptofandekarboxylázy Chitin, je kromě exoskeletonu, také obsažen v peritrofické membráně hmyzu. Aktivita chitináz tedy může rovněž narušovat trávení hmyzu. Výsledky s transgenozí jsou zatím nejednoznačné. Alkaloidy jsou antinutriční faktory u mnoha druhů hmyzu. Exprese genu pro tryptofandekarboxylázu z rostliny Catharanthus roseus L. umožňuje syntézu tryptaminových alkaloidů založených na tryptaminu u tabáku. Produkce tryptaminu u tabáku vede ke zvýšení úhynu molic (Ondřej a Drobník, 2002). 29

30 2.6 Rezistence k virům Existují dvě základní skupiny mechanismu působení transgenu, které podmiňují rezistenci vůči rostlinným virům: A. Mechanismy, které vyžadují proteosyntézu B. Mechanismy založené na interakcích RNA-RNA a RNA-DNA Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein Rezistence může být širokospektrá i úzkospektrá. Úzkospektrá je u plášťového proteinu viru tabákové mozaiky (TMV) nebo bramborového viru Y (potato virus Y, PVY). Širokospektrá je u genu pro plášťový protein některých kmenů viru mozaiky sóji (soybean mosaic virus, SMV), vnáší rezistenci do tabáku také proti PVY a viru leptavosti tabáku (tabacco ech virus, TEV) (Ondřej a Drobník, 2002). Nejčastějším mechanismem je vnesení genu pro virový plášťový protein do genomu rostliny. Jeho expresí vzniká v rostlině imunita pro infekci příslušným virem. Záleží však na místě integrace genu v genetické mapě. Při této metodě je nutné uvažovat riziko tranjkapsidace, tj. zabalení nukleové kyseliny jiného viru, než toho, pro který se vytvořil obalový protein. Jiným rizikem je, že nechtěně dodáme funkční obalový protein defektnímu viru, který se neprojevoval, protože jeho plášťový protein byl mutovaný ( Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky Virový protein pro přenos viru z buňky do buňky (movement protein, MP) zprostředkovává i systémový pohyb v rostlině. Hodně MP se hromadí v plazmodermách. Viry, jejichž genetickou složkou je DNA, jako geminiviry, se replikují v jádře a viry, jejichž genetickou složkou je RNA, se replikují v cytoplazmě. Geminivirová DNA se replikuje v jádře a k jejímu transportu do cytoplazmy je znám jeden protein. Druhý protein transportuje virovou DNA přes plazmodermy. MP v transgenních rostlinách může umožnit kmenům TMV (virus tabákové mozaiky) s mutací v genu MP, aby se přemísťovaly do sousedních buněk. Předpokládá se naopak, 30

31 že defektní mutace transgenu pro MP budou omezovat pohyb viru po rostlině (Ondřej a Drobník, 2002) Rezistence založená na transgenu pro replikázu Rezistence tohoto typu je omezena na kmen, z něhož traansgen pochází. Rezistence k TMV byla poprvé zjištěna při použití transgenu pro fragment proteinu o molekulové hmotnosti 54 kda. U některých případů je asi rezistence záležitostí RNA, u jiných je záležitostí proteinu. Mechanizmus zatím není znám. Předpokládá se, že produkt trensgenu inhibuje aktivitu virové replikázy (Ondřej a Drobník, 2002) Rezistence podmíněná nukleovými kyselinami Je možné použít tzv. protismyslovou (antisense) konstrukci, tedy DNA, jejíž transkripcí vzniká RNA komplementární k původnímu typu. Ta vede obvykle k inaktivaci původní RNA, protože dvouvláknová RNA nemůže být překládána a je zpravidla brzy odbourána nukleázami specifickými pro dvouvláknovou RNA.Využití antisense RNA dává různé výsledky. V některých případech nebyla replikace viru ovlivněna, v jiných docházelo k silné inhibici virové infekce. Rezistence založená na antisense RNA však funguje jen proti úzkému spektru virů (Ondřej a Drobník, 2002) RNA interference Další, poměrně novou, metodou je využití RNA interference (RNAi). Základním principem RNAi je štěpení dvouvláknové RNA (dsrna) na krátké nepřekrývající se úseky, které rozpoznávají homologní mrna a indukují utlumení jejich exprese. RNAi může být realizována dvěma způsoby, a to prostřednictvím tzv. small interfering RNA (sirna) indukující degradaci cílových mrna nebo pomocí microrna (mirna), které ve většině případů inhibují proces translace. Používají se expresní vektory obsahující oligonukleotid kódující tzv. krátkou vlásenkovou RNA (short hairpin RNA, shrna), která je složena ze dvou inverzních repetic (sense/antisense) oddělených několika (obvykle 3 9) nukleotidy. Po transfekci vektoru do buňky dojde in vivo transkripcí k přepisu shrna, z které po štěpení enzymem Dicer vzniká funkční sirna molekula (Kontrová et al., 2009). V dalším 31

32 kroku se pak sirna vážou na nukleázový komplex označovaný jako RISC (RNAinduced silencing komplex). Jeho součástí je helikáza, která pravděpodobně oba řetězce duplexu sirna odvíjí a jeden z nich protismyslový řetězec sirna (antisense) navádí aktivovaný komplex RISC ke komplementární cílové mrna, která je následně rozštěpena (Šmarda et al., 2010). Většina shrna expresních vektorů je řízena promotorem pro RNA polymerasu III (např. lidské promotory U6, H1), některé obsahují promotor pro RNA polymerasu II (např. virové promotory SV40, CMV). Příprava expresních vektorů je poměrně časově náročná, avšak jejich výhody pro potřeby dlouhodobých studií jsou nesporné - exprese cílového genu je snížena po dobu několik týdnů, někdy i déle. Velkou výhodou je možnost vnesení selekčního markeru, který slouží k obohacení kultury o úspěšně transferované buňky nesoucí příslušný vektor, což velice zvyšuje úspěšnost tlumení exprese genů u těžko transfekovatelných buněk (Kontrová et al., 2009). Hlavní nevýhodou RNAi je, že není zcela specifická pro určitý gen, ale může ovlivnit i expresi genů příbuzných (Šmarda et al., 2010). 32

33 2.7 Rizika spojená s transgenními rostlinami Doposud získané výsledky kultivace transgenních odrůd neprokázaly žádné nebezpečí jejich velkoplošného uvolňování do přírody. Byly však získány transgenní rostliny, které nejsou zamýšleny k využití jako kulturní odrůdy a jejichž proteiny mohou být toxické. Proto je nutné, aby jednotlivé typy transgenních rostlin byly v počáteční fázi výzkumu izolovány od vnějšího prostředí a jen postupně zaváděny do vnějšího prostředí za současného monitorování. Mezi rizika spojená s nekontrolovaným únikem GMO do prostředí patří: přenos genů hybridizací, necílové vlivy na neškodné organismy, genové interakce mezi různými konstrukcemi transgenů, interakce mezi transgeny a původními geny genomu v různých prostředích, změny virulescence škůdců a patogenů v odpovědi na využití genů rezistence, perzistence transgenních rostlin a jejich potomstvech v zemědělské výrobě (Ondřej a Drobník, 2002) Rizika spojená s pěstováním GM plodin tolerantních k herbicidům Plodiny s tolerancí k herbicidům mají schopnost odolávat neselektivním herbicidům (glyphosate a glufosinate-ammonium) z důvodu získané schopnosti detoxikovat účinnou látku herbicidu, případně produkovat terčový enzym herbicidního účinku v nadměrném množství. Rizikem pěstování těchto GM plodin může být přenos transgenů do populací planě rostoucích rostlin mezidruhovým křížením s příbuznými plevely, dále dlouhodobé používání stejných účinných látek vede k posuvu ve prospěch odolnějších plevelných druhů a může vést i k selekci rezistentních biotopů, podobně jako u klasických herbicidů. Nejvýznamnějším rizikem je však perzistence transgenních zaplevelujících rostlin ze sklizňových ztrát, mezi kterými může docházet ke vzájemnému křížení a vzniku několikanásobné tolerance, což může komplikovat jejich hubení (Kocourek, 2005). 33

34 2.7.2 Rizika spojená s pěstováním GM plodin rezistentních k hmyzím škůdcům Pěstování takto geneticky modifikovaných rostlin může mít vliv na necílové organismy, přirozené nepřátele škůdců a diverzitu členovců. Bylo potvrzeno možné riziko akumulace Bt-toxinů v tělech skupiny hmyzu sajících z mezofylu a tím tak nepřímého vlivu této skupiny herbivorů na organismy ve vyšších trofických úrovních (na predátory a parazitoidy) citlivých k Bt-toxinu (Kocourek, 2005). Další problém může nastat u včel a transgenních rostlin obsahujících gen pro chitinázu, protože savé ústrojí včely je z části tvořeno chitinem. Zatím však pokusy prováděné s GM řepkou nepotvrdily, že by se transgen pro chitinázu vyskytoval v pylu, tudíž by tyto rostliny neměly mít pro včely škodlivý účinek (Ondřej a Drobník, 2002) Rizika spojená s pěstováním GM plodin rezistentních k virům Při využití transgenních rostlin s geny pro virové plášťové proteiny vyvolávají málo odůvodněné obavy dva jevy: transenkapsidace a rekombinace. Transenkapsidace znamená, že virus může využít obalový protein, který je v rostlině přítomen v důsledku exprese transgenu, pro zabalení své RNA. Jestliže byla zabalena virová RNA viru odlišného od toho, z něhož pochází gen pro plášťový protein, potom může vzniknout virus s novými vlastnostmi, který může přenášet na hostitele, z něhož pochází, gen pro plášťový protein, jinou RNA, pro kterou daný druh není hostitelem. V následujícím cyklu si ovšem proteinová RNA vytvoří sobě odpovídající plášťový protein. Nebezpečí rekombinace spočívá v tom, že mrna genu pro plášťový protein, transkribována v důsledku aktivity transgenu, a virový genom mohou spolu rekombinovat, čímž může dojít k vzniku nového, rekombinovaného genomu. Totéž se však stává i při směsné infekci dvěma viry současně (Ondřej a Drobník, 2002) Zamezení šíření GMR do okolí Nejdůležitější ochranu před nekontrolovatelným šířením transgenních rostlin představuje zábrana šíření semen a pylu. Šíření semen lze omezit na minimum vhodnou agrotechnikou, způsobem transportu a způsobem nakládání s GMO materiálem. Šíření 34

35 transgenů pylem lze předejít dodržováním ochranné vzdálenosti a u cizosprašných rostlin zamezit kontaktu s planě rostoucími druhy. 35

36 3 MATERIÁL A METODIKA ZPRACOVÁNÍ 3.1 Materiál Rostlinný materiál Tabák virginský (Nicotina tabacum) kmen SR-1, kultura in vitro Bakteriální kultury K přípravě vektoru pwell14b byly použity bakterie Agrobacterium tumefaciens kmene EHA 105 nesoucí plazmid pwell11b (obrázek 1) a bakterie nesoucí plazmid pwell12a (obrázek 2). Oba tyto plazmidy jsou odvozeny z binárního plazmidu pgreenii. Dále byla použita bakteriální kultura Escherichia coli kmne TOP 10. Bakteriální kultury byly uchovávány dlouhodobě v 10 % roztoku glycerolu v hluboko mrazicím boxu při teplotě -72 C. Obsažené plazmidy pwell11b a pwell12a se obecně skládají z těchto částí: 35S-GUS a lacz Signální gen GUS pro -glukoronidázu s 35S promotorem umístěný spolu s kódujícími sekvencemi do polylinkeru na genu lacz, který kóduje -galaktosidázu. -galaktosidáza způsobuje u bakterií modré zabarvení, je-li však inzert správně ligován do polylinkeru lacz, není tento gen exprimován a testovaná bakteriální kolonie zůstane bez zabarvení. nos-bar Selekční gen bar sloužící pro rezistenci k fosfinotricinu (PPT), který je účinnou látkou některých komerčních herbicidů (BASTA, Liberty, apod.) s nos promotorem z A. tumefaciens. Tyto sekvence jsou vloženy do plazmidu pwell11b a pwell12a mezi pravou a levou hraniční sekvencí T-DNA. Dalšími složkami těchto plazmidů jsou psa ORI, sloužící k rozpoznání počátku replikace A. tumefaciens, gen npti pro bakteriální rezistenci k antibiotiku kanamycinu a ColEl ori pro počátek replikace v E. coli. 36

37 Plazmid pwell11b navíc obsahuje tyto části: CaMV 35S::SPI2:GFP SPI2 je gen pro inhibitor hmyzích serinových proteáz, původně izolovaný ze zavíječe voskového (Galleria mellonella L.), vytvořený na pracovišti Entomologického ústavu AVČR. Gen GFP (green fluorescent protein) izolovaný z medúzy Aequorea victoria Murbach and Shearer má schopnost zelené fluorescence pod UV zářením (Ondřej a Drobník, 2002), čímž slouží k lepšímu rozpoznání buněk či pletiv s inzertem. Do genu SPI2 byl zakódován gen GFP tak, aby čtecí rámec navazoval na 3 konci genu SPI2. Takto připravený fúzní gen kóduje protein o 278 aminokyselinách. Gen je umístěn pod regulačními sekvencemi promotorem triple X, trojnásobný 35S promotor, a terminátorem OCS, polyadenylační sekvencí genu pro oktopinsyntázu z A. tumefaciens sloužící pro signalizaci ukončení transkripce genu ( Obr. 1 Plazmid pwell11b 37

38 Plazmid pwell12a navíc obsahuje tyto části: CaMV 35S::PSbMV:PEMV Tento fúzní gen obsahuje fragment genu pro plášťový protein viru PSbMV (virus semenem přenosné mozaiky hrachu) a sekvence kódující rezistenci k PEMV (výrůstková mozaika hrachu) umístěné v poloze sense/antisense. Sense a antisense sekvence jsou od sebe odděleny intronem, který po transkripci pomáhá vytvořit ihprna (intron intterupted hairpin RNA), což je vlásenka, která spouští mechanismus RNAi (Wesley et al., 2003). Regulační sekvence tvoří 35S promotor a CaMV polya terminátor, oba pocházející z genomu viru žilkové mozaiky květáku. LB KpnI ApaI XhoI SalI ClaI HindIII EcoRV RB SacI SacII NotI lacz Fragment 477 bp pwell12b bp 35s-GUS 2501 bp XbaI EcoRI XhoI EcoRI HindIII KpnI ClaI HindIII EcoRI XbaI EcoRV EcoRI PstI SmaI BamHI SpeI XbaI NotI HindIII ClaI pwell12a KpnI HindIII EcoRI XhoI Obr. 2 Plazmid pwell12a 38

39 Kultivační média složení Kultivační média pro Escherichia coli 1) Pevné LB médium s kanamycinem (1 l) 10 g trypton 5 g kvasničný extrakt 5 g NaCl 1 ml 1 N NaOH 50 μl/ml kanamycin 15 g agar sterilizace 30 minut při 120 ºC 2) LB médium (1 l) 10 g trypton 5 g kvasničný extrakt 5 g NaCl 1 ml 1 N NaOH sterilizace 30 min při 120 ºC. Médium pro elektroporované kompetentní buňky Escherichia coli 1) SOB (na 1 l) 20 g trypton 5 g kvasničný extrakt 0,5 g NaCl 0,186 g KCl sterilizováno autoklávováním 30 minut při 120 ºC 2) SOC (na 1 l) K SOB médiu přidat: 5 ml 2M MgCl 2 1M glukózy (Ausubela et al., 1992) Kultivační média pro transformaci listových disků 1) MS 0.1/1 médium kokultivační (1 l) MS 0/0 obsahující: 39

40 6 g Phytoagar (Duchefa) 1,0 mg BA (1 ml zás. roztoku 1mg/ml v KOH) 0,1 mg NAA (100 μl zás roztoku 1 mg/ml v 70% ethanolu) ph upravit na 5,7 (pomocí KOH) autokláv 2) MS 0.1/1 médium selekční (1 l) MS 0.1/1 médium kokultivační (vyautoklávované) obsahující: 300 mg augmentinu (rozpuštěn ve vodě) 2 mg/l PPT (rozpuštěn ve vodě) 3) MS 0/0 médium (1 l) 4,3 g Murashige and Skoog micro and macro elements (Duchefa) 30 g sacharosa 2 ml 5x B 1 -inositol 3,0 ml Miller`s I 4) Miller`s I (50 ml) 3 g Kh 2 PO 4 rozpustit ve vodě skladovat při laboratorní teplotě 5) 5x B 1 -inositol (50 ml) 0,025 g thiamine 2,5 g myo-inositol 50 μl 0.5M EDTA zmrazit -20 ºC 6) LB médium (1 l) 10 g trypton 5 g kvasničný extrakt 5 g NaCl 1 ml 1 N NaOH sterilizace 30 min při 120 C (Dombrowski et al., 1994) 40

41 Zásobní roztoky na přípravu histochemického GUS testu 1) Roztok pro histochemický GUS test 100 mm Na 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 10 mm Na 2 EDTA 5 mm K 4 [Fe II (CN) 6 ] 5 mm K 3 [Fe III (CN) 6 ] 0,1% Triton X-100 0,3% X-Gluc ph 7 8 2) Zásobní roztoky pro přípravu roztoku pro histochemický GUS test 1M Na 2 HPO 4 /KH 2 PO 4, ph 7,0 6,4% objem 1M Na 2 HPO 4 3,6% objem KH 2 PO 4 90% objem H 2 O ph upraveno na 7,0 uchováno při -20 C 50 mm K 4 [Fe II (CN) 6 ] 0,211 g K 4 [Fe II (CN) 6 ] rozpustit v 10 ml vody přefiltrováno přes sterilní filtr uchováno při -20 C 50 mm K 3 [Fe III (CN) 6 ] 0,165 g K 3 [Fe III (CN) 6 ] rozpustit v 10 ml vody přefiltrovat přes sterilní filtr uchováno při -20 C 10% Triton 100 vodný roztok (Castle and Morris, 1994) 41

42 3.2 Metodika zpracování Namnožení kultury bakterií nesoucí plazmid pwell11b Kličkou byla odebrána část bakterií nesoucí plazmid pwell11b. Kultura bakterií byla rozetřena na jedné Petriho misce s LB mediem s kanamycinem. Po jednom dni namnožení byla vybrána jedna kolonie a předána do zkumavky s tekutým LB médiem s antibiotikem kanamycin. Poté následoval den kultivace při 37 ºC za mírného třepání Založení pokusu Izolace plazmidové DNA pwell11b pomocí GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) Izolace byla provedena z 1-5 ml tekuté LB kultury bakterií. Narostlá kultura byla přenesena do 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf, centrifugována cca 2 minuty při x g a kultivační médium odstraněno odsátím pomocí pipety. 1) Do zkumavky bylo aplikováno 250 µl Resuspension Solution a pelet bakterií dokonale resuspendován pomocí vortexu. 2) Dále bylo aplikováno 250 µl Lysis Solution a promícháno 4-6 krát převracením zkumavky. Roztok se vyčistí a stane se viskózním. 3) Následně bylo použito 350 µl Neutralization Solution a ihned promícháno 4-6 x převracením zkumavky. 4) Centrifugace 5 minut při x g. 5) Kapalná frakce byla přenesena do GeneJET spin kolony. 6) Kolona v zásobní zkumavce byla centrifugována 1 minutu při x g, poté byla odstraněna kapalná frakce ze zásobní zkumavky a kolonu vrácená do zásobní zkumavky. 7) Poté bylo aplikováno 500 µl Wash Solution na kolonu. Kolona v zásobní zkumavce byla centrifugována 1 minutu při x g, kapalná frakce ze zásobní zkumavky odstraněna a kolona poté vrácená zpět do zásobní zkumavky. 8) Krok 7) byl znovu opakován s užitím dalších 500 µl Wash Solution. 42

43 9) Kapalná frakce ze zásobní zkumavky opět odstraněna a kolona vrácena do zásobní zkumavky. Pro odstranění reziduí Wash Solution centrifugováno ještě jednou 1 minutu při x g. 10) Kolona přemístěna do nové mikrozkumavky Eppendorf 1,5 ml. Na střed kolony aplikováno 50 µl Elution Buffer, ponecháno 2 minuty inkubovat a poté centrifugováno 2 minuty při x g. 11) Na konec byla kolona odstraněna a purifikovaná plazmidová DNA uchována při -20 ºC. Restrikční štěpení DNA Pro restrikční štěpení plazmidu pwell11b a pro vyštěpení inzertu operonu CaMV 35S::PSbMV:PEMV z plazmidu pwell12a byl použit restrikční enzym NotI. Tento restrikční enzym patří do podskupiny restrikčních endonukleáz II. typu, které štěpí obráceně opakované sekvence, takže vznikají fragmenty s tzv. lepivými konci (Raclavský, 2003). K restrikci byly připraveny dvě reakce s následujícím obsahem: 13µl H 2 O 1µl NotI 10 2µl Pufr H 4µl plazmidové DNA (pwell11b nebo pwell12a) Defosforylace Po restrikčním štěpení byly vzorky inkubovány v termocycleru po dobu 1h a 45min, v průběhu které po uplynutí 1h, byla provedena defosforylace vektoru (vzorku s plazmidovou DNA pwell11b) a to přidáním: 0,5 µl fosfatázy a 2,3 µl pufru. Dále pak termoinkubace pokračovala do konce při teplotě 37 C. Elektroforéza DNA fragmenty byly poté rozděleny na 1 % agarózovém gelu elektroforézou a vizualizovány ethidium bromidem. Izolace plazmidové DNA z gelu K izolaci DNA byla použita Invisorb Fragment Clean Up sada pro izolaci DNA a postupovalo následně: 43

44 1) Požadovaný fragment DNA byl vyříznut z agarového gelu a ponechán ve zkumavce s 500 µl Gel Solubilizer S při 50 C po dobu 10 min. 2) Po 10 minutách bylo ke vzorku přidáno 250 µl Binding Enhancer, vzorek zvortexován. 3) Následně byl vzorek přelit do kolony a centrifugován 1 min při x g. 4) Po centrifugaci bylo přidáno k vzorku 500 µl Wash Bufer a následovala centrifugace 30 s při x g. Krok 4) byl proveden 2x po sobě. 5) Poté byla provedena centrifugace na sucho po dobu 4 min při x g a po centrifugaci byla kolona předána do zkumavky Eppendorf. 6) Následovala extrakce destilovanou vodou a inkubace 10 min při pokojové teplotě. 7) Na závěr byl vzorek centrifugován 1 min při x g, kolona poté odstraněna, zkumavka se vzorkem vortexována. Měření koncentrace Koncentrace byla měřena na spektrofotometru Picodrop v laboratorních podmínkách. Na základě koncentračních hodnot byl proveden výpočet poměru koncentrací vektrou a inzertu pro následnou ligaci. Ligace T4 DNA-ligáza se používá k vzájemnému spojení dvou molekul DNA zakončených komplementárními konci. K ligaci bylo použito: 2µl pufru 1µl DNA-ligázy 4,3µl plazmidové DNA pwell11b (vektor) 12,7µl operon CaMV 35S::PSbMV:PEMV plazmidové DNA pwell12a (inzert) Purifikace Purifikace slouží k čištění DNA. To znamená odstranění všech látek, které absorbují ultrafialové záření, což mohou být volné nukleotidy, RNA nebo proteiny. Purifikace byla provedena následujícím způsobem: 1) K ligační směsi (v našem případě k nově vzniklému plazmidu pwell14b) bylo přidáno 250 µl Binding Buffer. 2) Směs byla zvortexována a přelita do kolony. 44

45 3) Následovala centrifugace 3 min při x g. 4) Vzorek byl poté eluován 30 µl destilovanou vodou po dobu 1 minuty. 5) Na závěr centrifugován 1 min při x g. Elektroporace kompetentních buněk Escherichia coli K rozmraženým elektrokompetentním buňkám Escherichia coli kmene TOP 10 bylo přidáno 10 µl purifikované ligační směsi (předpokládaného nově vzniklého plazmidu pwell14b). Směs byla minutu ponechána na ledu, poté byl vzorek přenesen do elektroporační kyvety (2 mm) a elektroporován elektroporátorem (Easyject, Equibio) při 12,5 Kv/cm, 25 µf, 400 Ω. Ke vzorku bylo přidán 900 µl připraveného SOC média. Poté byl vzorek přenesen pomoci pipety do 15 ml sterilní zkumavky s víčkem a kultivován 30 minut na orbitální třepačce při 60 rpm a 37 ºC. Desetina objemu média (100 µl) byla odebrána a rozetřena skleněnou tyčinkou na Petriho misku s pevným LB médiem s kanamycinem. Zbytek média byl slit na přibližně stejný objem (100 µl) a taktéž rozetřen na misku s pevným LB médiem s antibiotiky. Kultivace probíhala při 37 ºC minimálně 18 hodin. Namnožení kultury E. coli nesoucí rekombinantní plazmid Z narostlých kultur byly odebrány ve sterilním prostředí pomocí sterilních párátek vzorky a předány do zkumavek s 50 µl 50 mmtris/50 nm MgCl 2. Následně byla provedena amplifikace v PCR (tabulka 1). Průběh PCR: Denaturace 7min při 94 C 31 cyklů PCR E. coli denaturace 30s při 94 C anealing 30s při 57 C elongace 30s při 72 C anealing 3 min při 72 C chlazení při 4 C 45

46 Tab. 1 Komponenty k PCR 1x 8x Vzorek 25ml 18,2µl 145,6µl destilovaná H 2 O 5µl 40µl pufr 0,2µl 1,6µl dntps 0,2µl 1,6µl primer GUSint 1 0,2µl 1,6µl primer GUSint 2 0,2µl 1,6µl polymeráza 1µl 8µl pwell14b Vybrané vzorky byly dále použity ke kultivaci v (1,7ml) tekutém LB médiu s kanamycinem. Po jednodenní kultivaci byla z narostlých vzorků izolovaná plazmidová DNA a pro kontrolu provedena restrikční analýza s restrikčními enzymy NotI a ClaI a elektroforéza. K restrikci bylo použito: 15 µl destilovaná H 2 O 2 µl pufr 1 µl NotI nebo ClaI 2 µl pwell14b Založení kultury A. tumefaciens nesoucí plazmid pwell14b Byly použity elektrokompetentní buňky Agrobacterium tumefaciens kmene EHA 105, ke kterým bylo přidáno 1 µl plazmidu pwell14b a 1 µl vektoru psoup. Vektor psoup je součástí binárního systému pgreenii. nese důležité oblasti pro replikaci v A. tumefaciens. Dále elektroporace probíhala stejným způsobem jako u E. coli. Elektroporované buňky byly 30 minut kultivovány v 15 ml tekutém SOC médiu a poté rozetřeny třecí kličkou na Petriho misku s pevným LB médiu s antibiotiky kanamycin (50 µl/ml) a rifampicin (30 µl/ml). Takto založená bakteriální kultura byla kultivována 3 dny při 28 C. Z narostlých bakterií byla očkem odebrána část kultury do 1,7 ml tekutého LB média a kanamycinem, pro množení na izolaci plazmidu pro kontrolní restrikční analýzu. Dále byla odebrána část bakteriální kultury do 5 ml tekutého LB média bez antibiotik pro transformaci listových disků tabáku virginského. 46

47 3.2.2 Transformace pomocí A. tumefaciens Transformace byla prováděna na modelové rostlině tabáku virginském (Nicotiana tabacum L.) metodou transformace listových disků. Pro transformaci listových disků tabáku bylo použito 5 ml tekuté kultury (tekuté LB médium bez antibiotik) Agrobacterium tumefaciens nesoucí plazmidový vektor pwell14b. Tato kultura byla kultivovaná přes noc při teplotě 28 C. Práce probíhala ve sterilním prostředí flowboxu, za výhradně sterilních podmínek a se sterilními nástroji. Byly použity ploché listy tabáku virginského, kultivovaného in vitro. Z míst, kudy neprocházela hrubá nervatura, bylo sterilním korkovrtem vyraženo na navlhčeném filtračním papíře 38 listových disků, cca 1 cm velkých. Takto získané listové disky byly přeneseny do suspenze A. tumefaciens (OD 600 > 0,7) v Petriho misce na dobu 1 minuty. Poté vyjmuty, osušeny na sterilním papíře a přeneseny vrchní stranou dolů do 2 Petriho misek s MS 0,1/1 kokultivačním médiem Kultivace Listové disky byly ponechány na kokultivačním médiu MS 0,1/1 2 3 dny při rozptýleném světle a teplotě 28 C, poté přemístěny na světlo plné. Na médium MS 0,1/1 obsahující augmentin (300 mg/l), antibiotikum zamezující dalšímu růstu bakterii A. tumefaciens, byly listové disky přeneseny po třech dnech po transformaci. Při tomto pasážování bylo z každé Petriho misky odebráno po třech listových discích k provedení histochemického GUS testu. Tento test sloužil k ověření, zda byly pro transformaci optimální podmínky GUS test Histochemický GUS test slouží k ověření správnosti transformace a rozlišení transformovaných rostlin od netransformovaných. GUS gen kóduje enzym β-glukuronidázu. Po přidání směsi pro histochemický GUS test k transgennímu rostlinnému pletivu odštěpuje tento enzym ze substrátu X-gluc glukunorid při inkubaci v 37 C po dobu 24h a v přítomnosti katalyzátoru tak vzniká tmavě modrá sloučenina. 47

48 Pro lepší pozorování modrého zabarvení u transformovaných rostlin se zelená barva listů odbarvovala v 70 % etanolu po dobu několika dní. 48

49 4 VÝSLEDKY Podařilo se nám namnožit bakteriální kulturu nesoucí plazmid pwell11b a posléze úspěšně tento plazmid izolovat. Plazmid pwell11b, spolu s již dříve izolovaným plazminem pwell12a, byli podrobeni restrikčnímu štěpení. Pro restrikční štěpení byl použit enzym NotI, dále pak pro ověření byl na restrikci pwell11b použit restrikční enzym ClaI. Ve všech případech bylo použito 1 µl restrikčního enzymu. Restrikční směs byla následně zvortexována a na 1h a 45 min ponechána v termocycleru při 37 C, přičemž po 1h byla provedena u restrikční směsi s enzymem NotI defosforylace plazmidu pwell11b. Po termoinkubaci byly vzorky dány, spolu s neštěpenými vzorky pro ověření a velikostním standardem, na gelovou elektroforézu (obrázek 3) v následném množství a pořadí (čísla znázorňují pořadí jamek): 1-1k bp Ladder 2 - pwell11b ClaI 3 - pwell11b Neštěpeny 5 - pwell11b NotI 7 - pwell12a Neštěpeny 9 - pwell12a NotI 5 µl 20 µl + 2 µl loading buffr 4 µl + 1 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 4 µl + 1 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr Obr. 3 Výsledek elektroforézy po restrikci enzymy NotI a ClaI 49

50 Obr. 4 Velikostní marker 1k bp Ladder Na gelu můžeme vidět v druhé jamce štěpený plazmid pwell11b enzymem ClaI. Toto štěpení se provádělo pro linearizaci plazmidu. Plazmid pwell11b štěpený restrikčním enzymem NotI by měl být stejné velikosti, což se na elektroforéze prokázalo (jamka 5). Dále se nám podařilo vyštěpit z plazmidu pwell12a pomocí restrikčního enzymu NotI potřebnou sekvenci, nesoucí fragmenty fúzního genu PSbMV-PEMV o velikosti 3800 bp (menší fragment na gelu, mezi fragmenty velikostního markeru 4072 bp a 3054 bp, jamka 9). Z výsledků elektroforézy lze usoudit, že restrikce proběhla správně. Pro další postupy v práci byly izolovány z gelu fragmenty pwell11b štěpeného restrikčním enzymem NotI a menší fragment (3800 bp) plazmidu pwell12a. K izolaci plazmidové DNA byla použita GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) sada pro izolaci DNA. Po izolacii z gelu byla u obou plazmidových DNA změřena koncentrace. Naměřené hodnoty byly následující: plazmid pwell11b 8,8 ng/µl plazmid pwell12a 3,8 ng/µl 50

51 Na základě koncentrace plazmidových DNA byl proveden ligační výpočet. Kde vektorem je plazmid pwell11b a inzertem plazmid pwell12a. Dle ligačního výpočtu bylo pro ligaci použito 4,4 µl plazmidu pwell11b a 12,7 µl pwell12a. ݒ ݑݐݎ ݖ ݐݏ ݒ ݒ ݑݎݐ ݒݐݏ ݐ h ݎݐ ݒ :ݐݎ ݖ ݎě í ݎá ݒ ݑݎݐ ݒݐݏ ݒ ݒ ݑݐݎ ݖ ݐݏ ݐ = h Vhodný molární poměr inzert: vektor je 3:1. Výsledkem rovnice je počet ng inzertu potřebných na 1µl vektoru. Pro převedení na µl byla použita následující rovnice: ݒ ݑݐݎ ݖ ݐݏ ݐ h μ ݒ ݑݐݎ ݖ íݒݐݏž =μ / ݒ ݑݐݎ ݖ ݎݐ Po dosazení: 8,8 3,8 8,6 ݑݐݎ ݖ = 11,6 3 11,6 ݑݐݎ ݖ 3μ = 3,8 Z rovnice tedy vyplývá, že na 1 µl vektoru by mělo být použito 3 µl inzertu. V našem případě bylo použito do 20 µl zkumavky 17 µl celkové plazmidové DNA (zbytek do 20 µl činí pufr a DNA-ligáza). Celkový objem použité plazmidové DNA byl podělen součtem molárního poměru inzert:vektor, aby byl zachován poměr 3:1 inzert:vektor v ligační směsi, který je považován za nejvhodnější. Proto bylo použito 4,4 µl plazmidu pwell11b a 12,7 µl pwell12a. Předpokladem ligace inzertu o velikosti 3800 bp do vektoru o 8574 bp v restrikčním místě NotI byl vznik nového plazmidu o velikosti bp, nesoucího jak gen pro inhibici hmyzích serinových proteáz SPI2 fúzovaný s genem pro zelenou fluorescenci GFP umístěných mezi trojnásobným 35S promotorem a OCS terminátorem, tak v poloze sense/antisense mezi 35S promotorem a CaMV polya terminátorem fragment genu pro plášťový protein viru PSbMV spojeného se sekvencemi kódující rezistenci k PEMV. Ligace byla úspěšně provedena a výsledný plazmid byl označen jako pwell14 (obrázek 5). 51

52 KpnI ApaI XhoI SalI ClaI HindIII PstI BamHI SmaI KpnI EcoRV EcoRI PstI RB SacI SacII NotI lacz Fragment 477 bp pwell14a bp XhoI XbaI EcoRI EcoRI HindIII KpnI ClaI HindIII EcoRI XbaI BamHI SpeI XbaI NotI HindIII ClaI pwell14b KpnI HindIII EcoRI XhoI Obr. 5 Plazmid pwell14 52

53 Takto získaný plazmid pwell14 byl následně purifikován. Purifikace slouží k čištění DNA, tzn. odstranění všech nežádoucích látek, které absorbují ultrafialové záření, jako jsou volné nukleotidy, RNA nebo proteiny. Po purifikaci byl plazmid pwell14 elektroporován do elektrokompetentních buněk Escherichia coli. Takto elektroporované buňky byly pomoci třecí kličky rozetřeny do dvou Petriho misek s pevným LB médiem s antibiotikem kanamycin. Na jednu misku bylo naneseno množství o koncentraci 100 a druhou množství o koncentraci 900. Bakterie byly kultivovány den při 37 C. Po denní kultivaci narostli kolonie bakterií pouze na Petriho misce s koncentrací 900, a to v počtu 10 kolonií. Ze 7 kolonií byly odebrány pomocí sterilních párátek v sterilním prostředí vzorky a přeneseny do zkumavek s 50 µl 50 mmtris/50 nm MgCl 2. Z takto odebraných vzorků byl použit 1 µl plazmidové DNA k PCR reakci s primery GUSint1 a 2. Výsledky PCR byly ověřeny elektroforeticky. Na gel (obrázek 6) byly vzorky spolu s kontrolou a velikostním standardem naneseny v následujícím množství a pořadí (čísla znázorňují pořadí jamek): bp Quick load 3 µl 2 - pwell14 vzorek 1 10 µl + 2 µl loading buffr 3-8 pwell14 vzorek µl + 2 µl loading buffr 9 - kontrola 8 µl + 2 µl loading buffr Obr. 6 Výsledky PCR 53

54 Obr. 7 Velikostní marker 100 bp Quick load Primery GUSint1 a 2 nasedají na část fragmentu plazmidu nesoucího signální gen GUS. Výsledkem elektroforézy by měly být fragmenty zhruba o velikosti 300 bp až 400 bp, což bylo elektroforézou prokázáno. Dále z výsledku na gelu můžeme usoudit, že do bakterií obsažených ve vzorku č. 2 a vzorku č. 7 (jamka 3 a 8), se nepodařilo plazmid pwell14 správně elektroporovat. Ze správně elektroporovaných vzorků bylo odpipetováno 5 µl bakteriálního roztoku E. coli do zkumavek s 1,7 ml tekutého LB média s kanamycinem a tyto vzorky byly označeny čísly 1 až 5. Následně byly vzorky jeden den kultivovány při 37 C. Z pěti vzorků založené kultury narostl jen jeden vzorek, a to vzorek č. 1, z kterého byla izolována DNA. Pro ověření správnosti izolace byla provedena následná elektroforéza na agarózovém gelu. Na gel, kromě vzorku byly naneseny i oba velikostní markery v následujícím množství (obrázek 8): 1-1 kb DNA leader 5 µl 3- pwell14 2 µl + 2 µl loading buffr bp Qick load 5 µl 54

55 Obr. 8 Výsledek elektroforézy plazmid pwell14b Z výsledku lze odečíst, že plazmid pwell14 o velikosti bp se nám podařilo správně vyizolovat. Dále byla provedena restrikční analýza s restrikčními enzimy NotI a ClaI. Restrikční enzym ClaI byl použit pro linearizaci kruhové plazmidové DNA. Neštěpená plazmidová DNA byla použita pro kontrolu. Na gel (obrázek 9) byly vzorky spolu s velikostními standardy naneseny v následujícím množství a pořadí (čísla znázorňují pořadí jamek): 1-1 kb DNA leader 5 µl 2 - pwell14 neštěpený 2 µl + 1 µl loading buffr 4 - pwell14 NotI 20 µl + 2 µl loading buffr 6 - pwell14 ClaI 20 µl + 2 µl loading buffr bp Quick load 5 µl 55

56 Obr. 9 Restrikce plazmidu pwell14 restrikčními enzymy NotI a ClaI Výsledkem restrikce plazmidu pwell14 restrikčním enzymem NotI měly být dva fragmenty, jeden o velikosti 8574 bp a druhý o velikosti 3800 bp. Výsledky z elektroforézy tyto předpoklady potvrdily. Mohlo být tedy přistoupeno k elektroporaci buněk bakteriální kultury Agrobacterium tumefaciens tímto plazminem, založení bakteriální kultury A. tumefaciens nesoucí plazmid pwell14 a ověření vektoru pomocí transformace listových disku tabáku virginského. K elektroporaci byla použita bakteriální kultura A. tumefaciens kmene EHA 105 z Po elektroporaci byla založena bakteriální kultura A. tumefaciens nesoucí plazmid pwell14. Pro kultivaci byla použita Petriho miska s pevným LB médiem s antibiotiky kanamycin a rifampicin, na kterou byla kultura rozetřena pomocí třecí kličky. Takto založená kultura byla kultivována 3 dny při 28 C. Z narostlých kolonií byla očkem odebrána část kultury do tekutého LB média bez antibiotik, pro transformaci listových disků a část do tekutého LB média s antibiotikem kanamycin pro následnou izolaci a restrikci plazmidu. K ověření plazmidu pomocí restrikce bylo použito více restrikčních enzymů a pro kontrolu byla provedena i restrikce plazmidu pwell12a a pwell11b. Na gel (obrázek 10) byly výsledky restrikce nanášeny v následujícím množství a pořadí (čísla znázorňují pořadí jamek): 56

57 1-1 kb DNA leader 2 - pwell14 EcoRI+XbaI 3 - pwell12a EcoRV 4 - pwell14 NotI 5 - pwell12a NotI 6 - pwell14 EcoRI+HindIII 7 - pwell11b EcoRI+HindIII 8 - pwell14 NotI+ClaI 9 - pwell14 XbaI 10 - pwell12a NotI+ClaI 11 - pwell12a XbaI 12 - pwell14 EcoRI 13 - pwell14 EcoRV bp Quick load 5 µl 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 20 µl + 2 µl loading buffr 5 µl Obr. 10 Restrikční analýza plazmidů pwell11b, pwell12a a pwell14 Kromě restrikčního štěpení plazmidů pwell12a a pwell14 restrikčními enzymy EcoRI a HindIII (jamkaa 5 a 6), všechna štěpení vyšla podle očekávaných předpokladů. Navíc díky restrikčnímu štěpení pomocí restrikčního enzymu XbaI (jamka 9) se ukázalo, že se jedná o B variantu plazmidu pwell14. Na gelu je možno vidět fragmenty o velikosti zhruba pb a 2500 bp, jenž odpovídají právě B variantě plazmidu pwell14. 57

58 Namnožená bakteriální kultura A. tumefaciens nesoucí plazmid pwell14b v tekutém LB médiu bez antibiotik, byla použita k transformaci 38 listových disků tabáku virginského. Takto připravené listové disky byly rozděleny do 2 Petriho misek a tři dny kultivovány na kokultivačním médiu (obrázek 11). Obr. 11 Listové terčíky tabáku virginského infikované A. tumefaciens nesoucí plazmid pwell14b Po třech dnech byly disky pasážovány na médium s antibiotikem augmentin a byl proveden histochemický GUS test s třemi listovými disky, náhodně vybranými z každé z Petriho misek. Tímto testem se u všech testovaných disků prokázala správnost transformace, došlo tedy k modrému zbarvení okrajových a poškozených částí disků, což prokazuje expresi reportérového genu GUS. Pro ověření správnosti byla použita kontrola z již transgenní rostliny tabáku virginského (obrázek 12). Obr. 12 Histochemický GUS test z listových disků tabáku virginského 58