Transformace listových disků tabáku bakteriemi Agrobacterium tumefaciens. Transformation of leaf-discs of tobacco with Agrobacterium tumefaciens

Transkript

1 STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 4. Biologie Transformace listových disků tabáku bakteriemi Agrobacterium tumefaciens Transformation of leaf-discs of tobacco with Agrobacterium tumefaciens Autor: Kateřina Kocábková Škola: Česko-anglické gymnázium, Třebízského 1010, České Budějovice Kraj: Jihočeský Konzultanti: RNDr. Květa Tůmová Ing. Tomáš Kocábek, Ph.D. České Budějovice 2017

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracoval(a) samostatně a použil (a) jsem pouze podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V. dne podpis:

3 Poděkování. Děkuji RNDr. Květě Tůmové a Ing. Tomášovi Kocábkovi, Ph.D. za obětavou pomoc a podnětné připomínky, které mi během práce poskytovali.

4 ANOTACE Ve své práci jsem se zaobírala genetickým modifikováním, konkrétně genetickým modifikováním tabáku bakteriemi Agrobacterium tumefaciens. Tuto metodu jsem si také vyzkoušela v praxi. Transformace proběhla úspěšně, ale pokus se nepodařilo dotáhnout do úplného konce. Klíčová slova: Tabák virginský, Agrobacterium tumefaciens, geneticky modifikované organismy, transgenoze. ANNOTATION In my work, I am focusing on genetic modification, especially genetic modification with bacteria Agrobacterium tumefaciens. I have also tried this method in practise. Transformation was successful, but the attempt was not finished to the very end. Key words: Tobacco, Agrobacterium tumefaciens, genetically modified organisms, transgenosis

5 Obsah Úvod Geneticky modifikované organismy Transgenoze Metody transgenoze Metoda pomocí Agrobacterium tumefaciens Přímé metody transgenoze Výhody GMO Nevýhody GMO Představení organismů Tabák virginský Agrobacterium tumefaciens Disková metoda transformace rostlin Regenerace rostlin z transformovaných buněk Praktická část - pokus Rostlinný materiál Bakterie Agrobacterium tumefaciens Metodika Příprava Transformace Ověření Výsledky Závěr Přílohy

6 Úvod Ve své práci s názvem Transformace listových disků tabáku bakteriemi Agrobacterium tumefaciens se budu zabývat geneticky modifikovanými organismy, konkrétně rostlinami a pokusím se jednu takovou vytvořit. Rozhodla jsem se vypracovat tuto práci ze dvou důvodů. Ten první, a zároveň hlavní, důvod je, že je to náplň práce mého otce. Ten pracuje jako vědec v Biologickém centru Akademie věd ČR a mě vždy zajímala jeho práce. V minulosti jsem ho občas navštěvovala v práci a pomáhala mu s menšími věcmi. Už tehdy jsem si říkala, že by mohlo být zajímavé si něco takového vyzkoušet a nyní mám díky němu k dispozici laboratoř a možnost rozšířit své znalosti. Druhý důvod je aktuálnost tématu. V dnešní době často slýcháme o geneticky modifikovaném jídle a lidé mají na toto téma různorodé názory. Někteří ale toho o geneticky modifikovaných organismech moc neví, a i přesto proti tomu protestují. Když se řekne geneticky modifikovaný organismus, mnoho lidí si vybaví něco umělého a děsivého, ale neví, že k tomu může dojít i přírodní cestou, a že to nemusí být jenom pohroma, ale také pomoc v budoucnosti. Svou práci rozdělím na dvě části. V té první vysvětlím, co geneticky modifikované organismy jsou, jak vznikají, jaké jsou výhody a nevýhody a všechny pojmy použité v mé práci. V druhé části popíšu pokus, při kterém se pokusím vytvořit geneticky modifikovaný tabák, který se dá snadno modifikovat. Tento pokus považuju za hlavní cíl mé práce. 6

7 1 Geneticky modifikované organismy Geneticky modifikované organismy (GMO) jsou organismy s cíleně změněným genetickým materiálem (DNA) technikami umožňujícími přenos DNA i do nepříbuzného organismu. 1 Využívají se hlavně v genetickém inženýrství za účelem vylepšení vlastností organismů. Nejběžnějšími typy GMO jsou geneticky modifikované odrůdy různých plodin, jako je kukuřice, sója, řepka olejka a bavlna. Tyto odrůdy byly geneticky modifikovány většinou proto, aby se zajistila jejich odolnost vůči některým hmyzím škůdcům a tolerance ke konkrétním herbicidům. Některé druhy ovoce byly geneticky modifikovány proto, aby se u nich prodloužila doba zrání. Některé ryby, například losos, byly geneticky modifikovány proto, aby se staly odolnějšími vůči chladu. Geneticky modifikované mikroorganismy se rovněž používají při výrobě řady vitaminů. V celosvětovém měřítku jsou GM plodiny významnou složkou zemědělské výroby. Podíl ploch v Evropské unii je však ve srovnání s ostatními částmi světa zanedbatelný. Celková plocha GM plodin ve světě v roce 2015 dosáhla 179,7 milionů ha, což je např. plocha větší než dvojnásobek rozlohy Velké Británie Transgenoze Transgenoze je vnášení jednotlivých genů do rostlinného dědičného základu (genomu) metodami genového inženýrství. Jde o přenos přesně definovaných sekvencí DNA (transgenů), které se exprimují v pořadí aminokyselin v konečném translačním produktu (proteinu) s definovanou úlohou v různých biosyntetických drahách. Prakticky to znamená cílenou, předem plánovanou změnu jediného znaku vlastnosti rostliny. 3 1 Geneticky modifikovaný organismus. Wikipedia: the free encyclopedia [online]. [cit ]. Dostupné z: 2 Plochy s GM plodinami ve světě poprvé poklesly BIOTRIN. Biotechnologie a GMO BIOTRIN [online]. Copyright 2013 [cit ]. Dostupné z: 3 Michal Rohrer. Testování vektorů pro rezistenci k virovým onemocněním u rostlin: Bakalářská práce [online] Brno: MZLU, 2007 [cit ]. Dostupné z: 7

8 1.2 Metody transgenoze U rostlin se ke změně DNA používají dvě hlavní metody. První je pomocí bakterií rodu Agrobacterium. Druhá je přímá metoda Metoda pomocí Agrobacterium tumefaciens Tato půdní bakterie je parazitem dvouděložných rostlin, u kterých způsobuje nemoc zvanou crown gall. Charakteristickým znakem bakterií rodu Agrobacterium je přítomnost menší kruhové molekuly DNA, zvané Ti-plazmid (viz obrázek 1). Když se bakterie dostane do rostliny, z jejího Ti plazmidu se vyštěpí onkogenní T-DNA (z anglického transferred DNA), která je následně včleněna do genomu napadené rostlinné buňky. Bakterie skrze své geny přinutí rostlinu k nadměrné tvorbě rostlinných hormonů ze skupiny auxinů (indolyl-3-octová kyselina) a cytokininů (isopentenyl-amp), kvůli kterým se na rostlině vytvoří nádor. Kromě těchto genů obsahuje T-DNA agrobakterií geny kódující vznik enzymů zapojených do výroby opinů, které jsou vylučovány z transformovaných buněk a poté konzumovány bakteriemi. V laboratoři jsou agrobakterie upravené, proto nádor nevzniká (viz kapitola 1.5.2). 4 Obrázek 1: Schéma bakterie Agrobacterium tumefaciens. Kromě bakteriálního chromozómu obsahuje tato bakterie Ti-plazmid, který nese geny, které jsou přenášeny do napadené rostliny (T- DNA) a geny, které jsou za tento přenos zodpovědné (vir geny). 4 Barbora Říhová. Praktické využití geneticky modifikovaných rostlin: Bakalářská práce [online] Praha: Univerzita Karlova, 2010 [cit ]. Dostupné z: 8

9 1.2.2 Přímé metody transgenoze Agrobakterie ale většinou nejdou použít u jednoděložných rostlin. U těch se používá biolistická metoda, která umožňuje vstřelení určitého genu do rostliny pomocí přístroje gene gun (Christou, 1992). Tento přístroj vstřeluje DNA přímo do buněk rostliny pomocí nosičů (např: kuličky zlata) Výhody GMO Oproti klasickému křížení má GMO několik výhod. První z nich je variabilita. Při přenášení genů se totiž nemusíme omezovat na druh organismu, a tak se dají zkombinovat například DNA ryby s DNA rostliny. Další z výhod je, že u GMO máme přenos genu pod kontrolou. Můžeme zajistit, aby organismus získal námi požadovanou vlastnost, zatímco u křížení se často spoléháme na náhodu. Další výhodou je možnost využití v budoucnu. Na naší planetě v současnosti žije přes 7 miliard lidí a toto číslo se každým rokem zvyšuje. Organizace spojených národů odhaduje, že do roku 2050 přesáhne celkový počet lidí na světě 9,7 miliardy, z toho v extrémní chudobě žije přes 1,2 miliardy lidí. 6 Je zde tedy oprávněná obava, zda je zemědělství stačí uživit. To znamená, že se musí zvýšit výnos současných plodin. Ten sice vzrostl díky používání průmyslových hnojiv a vyšlechtění nových odrůd, ale to již dosáhlo svého vrcholu. Navíc se objevují požadavky na nové vlastnosti rostlin. U rostlin by se mohla zlepšit odolnost vůči škůdcům a také kvalita. Příkladem může být zlatá rýže, která je obohacena o vitamín A a využívá se v rozvojových zemích k posílení zraku Nevýhody GMO Existují i nevýhody GMO, na jejichž výzkumu vědci intenzivně pracují. Například u Bt kukuřice v USA se vyskytla komplikace. Tato kukuřice je díky genu 5 Gene gun - Wikipedia. [online]. [cit ] Dostupné z: 6 OSN: V roce 2050 bude žít na planetě 9,7 miliardy lidí «. [online]. [cit ]. Dostupné z: 7 Geneticky upravená zlatá rýže zabrání hladu, zachrání zrak. Ale aktivisté jsou proti Reflex.cz. Reflex.cz - Komentáře, zprávy, výrazné autorské fotografie [online]. Copyright 2001 [cit ]. Dostupné z: 9

10 z bakterie Bacillus thuringiensis toxická pro škůdce. Nicméně Bt-toxin z kukuřice začal hubit i larvy ohroženého motýla monarchy stěhovavého. 8 Navíc je známo, že každý insekticid dříve či později vede ke vzniku odolných jedinců, a i Bt kukuřici dříve či později čeká podobný osud. Proto vědci již pracují na náhradních řešeních. 1.5 Představení organismů Tabák virginský Jako modelový organismus jsem si vybrala tabák virginský (odrůdu Samsun). Tato rostlina pochází z Jižní a Střední Ameriky, může dorůstat až do výšky 2 metrů a kvůli své citlivosti na klima a složení půdy je obtížná na pěstování. Díky obsahu alkaloidu nikotinu se dříve tabák využíval v medicíně, dnes je ale používán hlavně k výrobě tabáku a cigaret. 9 Tabák je často používán jako modelová rostlina pro genetické manipulace, neboť dobře reaguje na bakteriální infekci a má dobrou schopnost regenerace v tkáňových kulturách. Pro transformaci používáme tu část rostliny, ze které spolehlivě umíme získat v podmínkách in vitro dostatečný počet regenerantů, v případě tabáku se jedná o listy Agrobacterium tumefaciens Transformaci tabáku provedu pomocí agrobakterií rodu Agrobacteium tumefaciens. V laboratořích se ale pracuje s upravenými bakteriemi. Pro potřeby genového inženýrství se geny pro syntézu rostlinných hormonů a opinů z Ti-plazmidu odstraňují a na jejich místo se vkládají geny, kterými chceme rostlinu transformovat. Uměle vytvořená část DNA, která se umisťuje mezi hraniční sekvence T-DNA a je dále přenášena do rostlinných buněk se nazývá konstrukt chimérického genu (Ondřej a Drobník, 2002). Chimérický proto, že složen z částí DNA pocházejících z různých genomů. Konstrukt se obvykle skládá z vkládaného genu, který by měl rostlině dodat 8 :: OSEL.CZ :: - Na co vymřou monarchové. :: OSEL.CZ :: [online]. [cit ]. Dostupné z: 9 Tabák virginský Wikipedie. [online]. [cit ]. Dostupné z: 10

11 novou vlastnost, ale také selekčního a reportérového genu umožňujícího rozpoznání transformovaných buněk. 10 Selekční geny Spolu s vkládaným genem jsou přenášeny do rostliny také selekční geny za účelem udělení selekční výhody nemnohým transformovaným buňkám. Selekční geny obyčejně kódují rezistenci k antibiotikům (např. ke kanamycinu gen nptii, hygromycinu gen hpt aj.) nebo herbicidům (glufosinát - geny bar, pat). Reportérové geny Reportérové (signální) transgeny jsou transgeny, jejichž projev lze snadno detekovat a měřit. Mezi nejpoužívanější reportérové geny patří: transgen pro β-glukoronidázu (GUS) mění snadno dostupné substráty na snadno rozpoznatelné látky. Pro detekci se používá fluorescenční nebo histochemická metoda. transgen pro zeleně fluoreskující protein (GFP z anglického Green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria vysílá zelené nebo modré světlo při ozáření UVzářením. (Ondřej a Drobník, 2002) Disková metoda transformace rostlin Disková metoda transformace rostlin byla poprvé popsána Horschem et al. (1985). Tato metoda umožňuje snadnou a rychlou selekci regenerovaných transformantů. Nyní je díky modifikacím v laboratořích použitelná na jakoukoli část rostliny (kořen, stonkové segmenty atd). Metoda je jednoduchá a vyžaduje pouze sterilní podmínky. V případě stonků, řapíků nebo kořenů rozstříháme rostlinu na asi 1 cm dlouhé segmenty, u listů na terčíky o průměru 5 mm, které následně zcela ponoříme do bakteriální suspenze tak, aby 10 Vojtěch Hudzieczek. Testování vektorů pro rezistenci k virovým onemocněním u rostlin: Bakalářská práce [online]. Brno: MZLU, 2008 [cit ]. Dostupné z: ce=1;lang=cz 11 Jitka Blažíčková. Rostlinné explantátové kultury a jejich využití pro studium biologie telomer: Bakalářská práce [online]. Brno: Masarykova univerzita, 2007 [cit ] Dostupné z: 11

12 všechny řezné plochy přišly s bakteriemi do styku. Poté se transformované segmenty přenesou na médium, které díky antibiotikům eliminuje růst bakterií a umožňuje růst jen transformovaným buňkám. 1.7 Regenerace rostlin z transformovaných buněk Po transformaci rostlin může z jedné transformované buňky vzniknout celá rostlina. Toto je možné díky schopnosti zvané totipotence. Každá rostlinná buňka totiž obsahuje kompletní genetickou informaci pro celý organismus. Takto může zregenerovat celá rostlina např: z buňky z listu. Tomu napomáhají fytohormony. 12 Fytohormony neboli rostlinné hormony jsou signální látky, které mají zásadní roli ve vývoji rostliny. Každý podporuje růst určitého orgánu a jednotlivé fytohormony spolupracují. Mezi fytohormony řadíme auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselinu abscisovou a etylen Totipotence Wikipedie. [online]. [cit ] Dostupné z: 13 Fytohormon Wikipedie. [online]. [cit ] Dostupné z: 12

13 2 Praktická část - pokus 2.1 Rostlinný materiál Jako modelový organismus jsem si vybrala tabák virginský (odrůdu Samsun). Jednalo se o asi měsíc staré rostliny předpěstované ve skleníku. 2.2 Bakterie Agrobacterium tumefaciens Bakterie, se kterými jsem pracovala, patřily do kmenu LBA Dlouhodobě jsou uchovávané v 10% glycerolu při teplotě -80 C. Používala jsem dvě varianty 3771 (s T-DNA) a 4404 (kontrola bez T-DNA). Listové disky s variantou 4404 by měly po určité době působením antibiotika kanamycinu uhynout. Geny, které jsem se pokoušela přenést, se nazývají nptii a gus. Gen nptii, selekční gen, kóduje enzym neomycinfosfotransferasu, který způsobuje rezistenci ke kanamycinu a díky němu můžeme rozlišit transformované buňky od netransformovaných. Gen gus, reportérový gen, kóduje enzym beta-glukuronidasu, který umožňuje určit, jak a kde se přenesený gen projevuje. 2.3 Metodika Veškerá vlastní práce s rostlinami a kulturami bakterií probíhala vždy sterilizovanými nástroji a pomůckami v boxu s laminárním prouděním vzduchu Holten HH72 v laboratoři molekulární genetiky Ústavu molekulární biologie rostlin BC AV ČR Příprava Na začátku jsem připravila tři druhy kultivačních médií. 1) MS (Murashige and Skoog, 1962) médium. To se používá jako výživa pro rostliny. Připravila jsem 1 litr z MS zásobního koncentrátu (Duchefa) 4,14 g, 13

14 sacharózy - 15g, Plant agar (Duchefa) - 8 g a ph jsem pak upravila s použitím 1M hydroxidu draselného na 5,7. Směs jsem podrobila autoklávování v tlakovém hrnci, které probíhá za vysokého tlaku a teploty (120 o C). Po vychladnutí na teplotu cca 60 o C jsem médium rozlila do sterilních Petriho misek (cca 20 ml na misku). 2) MSR médium jsem připravila stejně jako MS médium a k tomu jsem přidala 250 mg antibiotika Timentinu, 100 mg kanamycinu (rozpuštěn ve vodě), 1,0 mg BAP (benzylaminopurin) a 0,1 mg NAA (kyselina α-naftyloctová). Na rozdíl od BAP a NAA, antibiotika by se autoklávováním zničila, takže jsem je přidala ze sterilního 1000x koncentrovaného zásobního roztoku až po autoklávování a vychladnutí na cca 55 o C (teplota, při které bylo možné udržet ruku na lahvi s médiem). 3) Poslední LK médium obsahuje sacharózu - 10g, 8 g tryptonu, 4 g kvasničného extraktu, 0,3g MgSO4.7H2O a 2 g KH2PO4. Poté jsem ph upravila pomocí 1 M NaOH na 6,8 a sterilizovala 30 minut při 120 ºC. LK médium je určeno pro kultivaci bakterií. Poté jsem si připravila bakterie. Ty jsem nabrala na kličku sterilizovanou v plameni, naočkovala do 20 ml tekutého LK média a nechala na třepačce přes noc (16 hodin). V případě varianty s Ti-plazmidem (3771) jsem přidala 50mg kanamycinu. Druhý den jsem bakteriální suspenzi nechala 15 minut při 5000 otáčkách za minutu centrifugovat, abych bakterie oddělila od LK média. Supernatant (tekutou část) jsem pak vylila a k bakteriím jsem přidala 0,1 mm síranu hořečnatého, protože hořčík napomáhá přenosu T-DNA do rostliny Transformace Korkovrtem jsem si do mladých listů tabáku vyřízla disky s průměrem 1 cm. Celkem jsem jich takto připravila 79. Snažila jsem se vyhnout hlavní žilnatině na listu. Disky jsem dále ponořila do Petriho misky s 10% roztokem Sava, aby došlo k jejich sterilizaci, ale zároveň se samy nepoškodily. Po 15 minutách sterilizace za mírného třepání jsem sterilní pipetou odsála roztok Sava a disky jsem propláchla sterilní vodou, aby byly odstraněny zbytky Sava. Toto promytí jsem opakovala 3x. 14

15 Poté jsem je přidala do bakteriální suspenze, kde jsem je nechala 20 minut na třepačce za mírného třepání. Následně jsem disky vyndala a položila jsem je rubem nahoru na MS médium bez antibiotik. Listy jsem do Petriho misky umisťovala po 7-10 kusech. Takto jsem je nechala jeden den. V této fázi stále ještě bakterie vstupují poraněnou částí do rostliny a může docházet k přenosu T-DNA. Kdybych nechala disky delší dobu v suspenzi, tak se rozmočí. Kdybych nechala disky na miskách bez antibiotik déle, tak se bakterie začnou množit na agaru a disky přerostou. Druhý den jsem disky přendala rubem dolů na MS médium s růstovými látkami a antibiotiky. Listové disky byly ponechány v kultivační místnosti se stálou teplotou 22±1 o C a se stálým světelným režimem 16 hodin světla, 8 hodin tmy. Každé 3 týdny jsem disky přemisťovala na nové Petriho misky s MSR médiem a pozorovala jejich vývoj. 2.4 Ověření To, jestli se mi transformace povedla, jsem si ověřila pomocí histochemického GUS testu podle Jeffersona (1987). Po přidání roztoku X-gluc k listovým diskům se rostlinná pletiva s reportérovým transgenem gus zabarvují modře. Substrát pro histochemickou detekci aktivity GUS X-Gluc (Fluka) - 5mg se rozpustí ve 100uL dimethylformamidu v digestoři. Přidá se 10 ml 100 mm fosfátového pufru ph 7.0. Listové disky s vyrůstajícími výhony jsem namočila do roztoku X-gluc, vložila do exsikátoru, spustila vodní vývěvu a 5 minut nechala infiltrovat, aby substrát pronikl dovnitř pletiv. Po zrušení vakua jsem misku zakryla víčkem a umístila do termostatu (37 o C). Druhý den jsem odsála roztok substrátu a rostlinky zalila 70 % etanolem. V ethanolu se vzorky zbavily chlorofylu, v jehož přítomnosti by detekce modrého zbarvení byla obtížnější. 15

16 2.5 Výsledky Celá experimentální práce probíhala od poloviny listopadu 2016 do února 2017 a zahrnovala transformaci listových disků, kultivaci regenerovaných rostlin na selekčním médiu a testovaní regenerujících rostlin nebo listových disků GUS testem. Pracovala jsem s dvěma variantami bakterií. U listových disků s variantou 4404 bez antibiotik se po pěti dnech začaly objevovat přerůstající kolonie bakterií. Naopak listové disky s variantou 4404 na miskách s kanamycinem začaly po pěti týdnech odumírat. To dokazuje, že gen nptii nebyl v bakteriích přítomný. U listových disků s variantou 3771 se začaly objevovat první známky dělení buněk na jejich obvodu 3 až 5 týdnů od transformace. V této době se jednalo o nediferencované buňky, to znamená, že ještě nebyly patrné stonky či listy. Ty se začaly objevovat až po 8 týdnech od transformace. Stonky byly ztluštělé a dosahovaly délky menší než jeden cm, takže ještě nebyly vhodné k odříznutí a přesazení na nové médium k zakořenění. Výsledky jsem shrnula do tabulky 1. Varianta Kanamycin Počet disků Disky Živé disky Nekrotické s výhony bez výhonů disky 3771 Ano Ano Ne Tabulka 1: Shrnutí výsledků po 87 dnech od transformace Pomocí GUS testu listových disků jsem zjistila, že transformace listových disků s bakteriemi 3771 proběhla úspěšně byla prokázána přítomnost genu gus, ale regenerace neprobíhala podle časového plánu. V ideálním případě by se po šesti týdnech po transformaci měly začít objevovat výhony (prýty). V mém případě se začaly objevovat až po deseti týdnech. Příčinou by mohla být nižší teplota v kultivační místnosti, která byla nastavena na 22 o C, což je teplota, která vyhovuje ostatním rostlinám, které v místnosti byly umístěné. Jakmile prýt dosáhne velikosti 1-2 cm, budou výhony odříznuty a dány na médium bez fytohormonů, kde by měly zakořenit. 16

17 Závěr Ve své práci jsem si vyzkoušela transformování tabáku bakteriemi Agrobacterium tumefaciens. Podařilo se mi navodit tvorbu výhonů, ale v zadané době se mi nepodařilo dosáhnout kořenících rostlin, pravděpodobně kvůli neideální teplotě v kultivační místnosti. Nakonec jsem si projev reportérového genu ověřila histochemickým GUS testem na teprve se vyvíjejících výhonech. 17

18 Použité zdroje: Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T.: A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: , Christou P. (1992): Genetic transformation of crop plants using microprojectile bombardment. Plant Journal, 2 (3): Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan M. W. (1987): GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO, 6 (13): Langley, R.A., Kado, I.: Studies on Agrobacterium tumefaciens conditions for mutagenesis by N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine and relationships of A. tumefaciens mutants to crowngall tumor induction. Mut. Res. 14: , Murashige T., Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 15: Ondřej, M.; Drobník, J. Transgenoze rostlin. 1. vyd. Praha: Academia, s. ISBN Geneticky modifikovaný organismus. Wikipedia: the free encyclopedia [online]. [cit ]. Dostupné z: Plochy s GM plodinami ve světě poprvé poklesly BIOTRIN. Biotechnologie a GMO BIOTRIN [online]. Copyright 2013 [cit ]. Dostupné z: Michal Rohrer. Testování vektorů pro rezistenci k virovým onemocněním u rostlin: Bakalářská práce [online] Brno: MZLU, 2007 [cit ]. Dostupné z: Barbora Říhová. Praktické využití geneticky modifikovaných rostlin: Bakalářská práce [online] Praha: Univerzita Karlova, 2010 [cit ]. Dostupné z: Gene gun - Wikipedia. [online]. [cit ] Dostupné z: OSN: V roce 2050 bude žít na planetě 9,7 miliardy lidí «. [online]. [cit ]. Dostupné z: Geneticky upravená zlatá rýže zabrání hladu, zachrání zrak. Ale aktivisté jsou proti Reflex.cz. Reflex.cz - Komentáře, zprávy, výrazné autorské fotografie [online]. Copyright 2001 [cit ]. Dostupné z: :: OSEL.CZ :: - Na co vymřou monarchové. :: OSEL.CZ :: [online]. [cit ]. Dostupné z: Tabák virginský Wikipedie. [online]. [cit ]. Dostupné z: Vojtěch Hudzieczek. Testování vektorů pro rezistenci k virovým onemocněním u rostlin: Bakalářská práce [online]. Brno: MZLU, 2008 [cit ]. Dostupné z: load_prace=1;lang=cz Jitka Blažíčková. Rostlinné explantátové kultury a jejich využití pro studium biologie telomer: Bakalářská práce [online]. Brno: Masarykova univerzita, 2007 [cit ] Dostupné z: Totipotence Wikipedie. [online]. [cit ] Dostupné z: Fytohormon Wikipedie. [online]. [cit ] Dostupné z: 18

19 Přílohy Obrázek 2: Rostlina tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.) použitá k pokusu. Obrázek 3: List tabáku po vyříznutí listových disků korkovrtem (vpravo). Obrázek 4: Narostlé bakteriální kultury v LK médiu před transformačním pokusem. Obrázek 5: Listové disky tabáku během dvacetiminutové kokultivace se suspenzí bakterií. 19

20 Obrázek 6: Listové disky tabáku umístěné po ukončení kultivace s agrobacteriem na regenerační MSR médium rubem dolů s cílem navodit regeneraci transgenních rostlin a zničit přežívající agrobakterie. Obrázek 7: Listové disky s variantou 4404 bez antibiotik po 87 dnech. Obrázek 8: Listové disky s variantou 4404 s antibiotiky po 87 dnech. 20

21 Obrázek 9: Listové disky s variantou 3771 po 87 dnech. Obrázek 10: Histochemický test listových disků tabáku po provedení GUS histochemického testu na projev transgenu gus. 21