Oddělení neurochirurgie, Neurocentrum Krajské nemocnice Liberec

Transkript

1 KMENOVÉ BUŇKY: SOUČASNÝ STAV LABORATORNÍHO VÝZKUMU A PERSPEKTIVY LÉČBY MÍŠNÍHO PORANĚNÍ MUDr. Tomáš Soukup 1, MUDr. Jana Karbanová 1, doc. MUDr. Jaroslav Mokrý, Ph.D. 1, MUDr. Petr Suchomel, Ph.D. 2 1 Ústav histologie a embryologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové 2 Oddělení neurochirurgie, Neurocentrum Krajské nemocnice Liberec Terapeutická transplantace pomocí kmenových buněk (KB) představuje perspektivní a nový léčebný přístup. Jak dokládají experimentální studie, KB (ať už embryonální KB, neurální KB, KB kostní dřeně nebo KB z pupečníkové krve), případně jejich buněčné potomstvo lze využít při terapii míšních lézí a podpoře regenerace přerušených periferních nervů. Způsoby provedení vlastní buněčné transplantace i dosažené výsledky jednotlivých studií se do jisté míry liší úkolem současného výzkumu je nalezení optimálních postupů ke spolehlivému dosažení žádaného terapeutického účinku. Klíčová slova: míšní poranění, kmenové buňky, regenerace, transplantace, buněčná terapie. MUDr. Tomáš Soukup Ústav histologie a embryologie, UK v Praze, LF v Hradci Králové, Šimkova 870, Hradec Králové soukupto@lfhk.cuni.cz Úvod Základní výzkum a hledání nových metod léčby míšní léze neodmyslitelně patří k novodobé historii a současnosti péče o pacienta s míšním poraněním. Je to již více než 65 let, co chirurgie, antibiotická terapie a pokroky v rehabilitaci, umožnily pacientům s míšním poraněním přežít. Moderní věda koncem 20. století mimo jiné objevem neurálních kmenových buněk (NKB) definitivně vyvrátila dogma o nemožnosti regenerace nervové tkáně. Otevřela se tak cesta od terapie symptomatické směrem k terapii kauzální k regeneraci poraněné míchy. Na samém počátku úvah o experimentální terapii míšní léze je ovšem nutné si uvědomit dvě základní fakta: a) klasický terapeutický přístup s cílem omezit tzv. sekundární poranění, které následuje samotné míšní trauma, je mnohem snazší, než samotná regenerace míchy b) v současné době věda dosud nedospěla k takovým úspěchům např. stran užití kmenových buněk v experimentu, aby bylo etické dávat falešnou naději našim nemocným. Cílem tohoto sdělení je shrnout současný stav laboratorního výzkumu míšního poranění. Zaměříme se zejména na roli terapeutické transplantace kmenových buněk (KB), její perspektivy a etické aspekty. Experimentální terapeutické přístupy: Toto poměrně nehomogenní téma lze schematicky rozdělit do tří skupin: 1. přístupy modulující regeneraci axonů 2. aplikace přírodních či syntetických štěpů 3. buněčná terapie. 1. Regenerace axonů Iniciální studie reparace poraněného míšního parenchymu využívaly transplantovaných buněk či periferních nervů jako přemostění, či jakéhosi vedoucího substrátu pro růst nových axonů (4). Byl to pokrokový přístup, avšak nepočítal s inhibičním působením dospělé míšní tkáně na prorůstání axonů v distální části míchy. Další reparační strategie je zaměřena na proces remyelinizace, protože axony v místě poraněné míchy typicky ztrácejí svůj myelinový obal. Tento terapeutický přístup rozvíjí řada pracovišť, z nichž některá posunula své experimenty do klinických studií fáze I. Využívá se nejen transplantace kmenových či progenitorových neurálních buněk a jejich schopnosti diferenciace v oligodendrocyty, ale také stimulace endogenních kmenových buněk lidské míchy s cílem podpořit je k dělení a diferenciaci v oligodendrocyty (1, 20). Některá pracoviště se snaží převodní blok vzniklý procesem demyelinizace překlenout pomocí farmak blokujících sodíkové a draslíkové kanály, tyto studie jsou již ve fázi III. klinického testování ( Další velmi aktivní přístupy k regeneraci axonů se snaží o potlačení inhibičních molekul vyskytujících se v místě míšního poranění a jeho blízkém okolí. Tyto inhibiční molekuly rozdělujeme do dvou kategorií: a) inhibiční proteiny jako např. Nogo (7), které odklánějí rostoucí axony od jejich optimální trasy b) molekuly vyskytující se ve vznikající jizvě (např. chondroitin sulfát), které zcela blokují cestu rostoucím axonům (6). Další experimentální práce prokázaly, že pro úspěšnou regeneraci axonů nestačí jen eliminovat nově formovanou bazální laminu (kolagen typ IV a laminin) a fibrilární kolagen typu III, ale je potřeba komplexně zasáhnout do procesu formace a vyzrávání gliové jizvy (19). Posledním z této kategorie experimentálních přístupů k léčbě míšního poranění je využití růstových faktorů vedoucích nově tvořené axony k překlenutí mezery napříč lézí. Poměrné zastoupení jak inhibičních, tak stimulačních molekul se v průběhu vývoje jedince mění od převahy stimulačních faktorů v průběhu vývoje, po převahu inhibičních faktorů v dospělosti. Jakmile započneme regeneraci axonů stimulací růstovými faktory (viz dále) je z patofyziologického pohledu esenciální poskytnout axonům také příslušné vodící molekuly, které zabezpečí vedení axonu po optimální trase směrem k cílové struktuře. 2. Aplikace přírodních či syntetických štěpů Cílem těchto semichirurgických metodik a sofistikované technologie tkáňového inženýrství je vytvoření přemostění či lešení podporujícího růst regenerujících axonů správným směrem. Za tímto účelem se používají nejrůznější přírodní (autologní a alogenní štěpy periferních nervů) a syntetické materiály (např. biopolymery algináty, poly-β-hydroxybutyrát, polyetylenglykol a hydrogely), které mohou být navíc in vitro napuštěny nejrůznějšími trofickými faktory, či osídleny NKB či jinými buněčnými typy (10, 22). 3. Buněčná terapie Obecně se jedná o experimentální terapii, kdy se do těla pacienta transplantují buňky 64 / NEUROLOGIE PRO PRAXI 2 / 2005

2 s cílem obnovit funkci postižených tkání. Do skupiny buněčné terapie míšního poranění řadíme strategie léčby založené nejen na nahrazení ztracených buněk buňkami schopnými diferenciace ve všechny poškozené či zničené buněčné typy (neurony, glie). Navíc tyto transplantované elementy produkují velké množství chemických látek a signálů včetně neurotrofických faktorů, uplatňujících se v regeneračním procesu. Jedná se o terapii: 1. diferencovanými buněčnými typy (Schwannovy buňky, gliové buňky CNS, hybridomové buňky produkce blokujících protilátek geneticky modifikované (GM) buňky), které se uplatňují zejména v procesu remyelinizace 2. fetálními a embryonálními buňkami (neurální buňky, O-2A progenitory) 3. buňkami kmenovými. Kmenové buňky (KB) se ve vznikajícím organizmu zakládají jako jedny z prvních buněčných populací. Jejich hlavní úlohou je produkce specializovaných buněčných typů při současném zachování populace KB až do dospělosti. Z tohoto důvodu jsou KB obdařeny vlastnostmi, které je odlišují od všech ostatních buněk v tkáních (např. primitivním fenotypem, vysokou proliferační schopností, širokým diferenciačním potenciálem, schopností sebeobnovy). KB hrají naprosto klíčovou roli při vývoji (při zakládání jednotlivých orgánů), při udržení tvaru a velikosti dospělých orgánů i při regeneraci poškozených orgánů. Poněvadž mikroprostředí (tzv. niche), v němž jsou KB uchovávány, se s vyzráváním organizmu mění, mění se do určité míry i vlastnosti KB (dospělé vs embryonální KB). Nové poznatky o chování embryonálních kmenových (ES), primordiálních zárodečných (prvopohlavních) buněk, fetálních a adultních tkáňově specifických KB, jakož i možnosti jejich izolace a separace, aktivace, ex vivo expanze, reprogramování, včetně možností regulace vyzrávání potomstva těchto buněk v přesně vymezené buněčné typy, činí z KB velice perspektivní nástroj pro terapii afekcí postihujících nejrůznější tkáně či orgány, ať již stimulací endogenní reparace nebo transplantací KB. Zvýšený zájem o problematiku KB, a to zejména v posledních pěti letech, si vyžádal uspořádání mnoha monotematicky zaměřených mezinárodních konferencí a postgraduálních kurzů. Na stránkách odborných časopisů se mimo jiné objevily i inzeráty nabízející lidské KB. Informace o výzkumu KB se stále častěji objevují nejen v nejrůznějších odborných časopisech, ale i ve sdělovacích prostředcích a časopisech pro laickou veřejnost. Ačkoli v současné klinické praxi se transplantace KB omezuje především na KB hematopoetické, úspěšné experimenty provedené na zvířecích modelech naznačují, jak široké využití najdou KB v blízké budoucnosti (8, 9). Neurální kmenové buňky Tkáňově specifické neurální kmenové buňky tvoří jedinečnou populaci buněk, která představuje základ pro vývoj CNS v průběhu organogeneze, ale i zdroj buněk pro obnovu nervové tkáně po poranění v dospělosti. Ve fetálním stadiu tyto buňky čile proliferují a jejich potomstvo dává vzniku diferencovanějším progenitorům, které vyzrávají v plně diferencované elementy nervové tkáně neurony, astrocyty a oligodendrocyty. V dospělém mozku jsou NKB přítomny v relativně klidové formě, přičemž velké množství jich je soustředěno do dvou regionů subependymální zóny postranních komor a subgranulózní vrstvy gyrus dentatus hipokampu. V těchto oblastech mozkové tkáně probíhá čilá neurogeneze a odtud lze rovněž izolovat multipotentní NKB. Multipotentní NKB však lze získat z oblasti kolem centrálního kanálku míchy a okolního míšního parenchymu, přesto buňky vzniklé diferenciací z těchto kmenových buněk in vivo vykazují gliový fenotyp. Pokud však tyto NKB vyjmeme a kultivujeme in vitro nebo transplantujeme do neuronogenních oblastí, tyto NKB dají vznik i neuronům. Dospělá mícha totiž představuje non-neuronogenní oblast CNS, kde přítomné astrocyty a extracelulární matrix zabraňuje vzniku nových neuronů z NKB endo- i exogenních. Za určitých okolností však i v míše mohou z exogenních NKB vzniknout neurony v případě, že pro transplantaci použijeme fetální NKB, které díky své nezralosti jsou schopny ignorovat tlumivé vlivy prostředí na vznik neuronů nebo zadané neuronální progenitory, které jsou již vývojově předurčené. Diferenciaci NKB v neurony lze však také podpořit řadou růstových faktorů (NT3 neurotrophin 3, BDNF brain-derived neurotrophic factor, NGF nerve growth factor). Mícha tak představuje poměrně komplikovanou oblast z hlediska možnosti regenerace po poranění; postupným poznáním všech aspektů a zvláštností této oblasti bude možné způsob terapie vhodně přizpůsobit. Přesto terapie pomocí kmenových buněk představuje jeden z nejnadějnějších přístupů v léčbě. Hlavním principem transplantace kmenových buněk v léčbě míšního poranění je náhrada ztracených buněk a vytvoření vhodného prostředí nosného substrátu pro regeneraci poškozených axonů. Vědci od kmenových buněk dále očekávají, že jsou schopny tvořit řadu působků podporujících regeneraci, modifikovat vzniklou imunitní odpověď, enzymaticky rozrušit gliovou jizvu, reprogramovat endogenní KB, eliminovat zbytky poškozené tkáně, mírnit sekundární poranění ochranou neuronů a nahradit non-neurální složky tkáně Obrázek 1. Myší neurální kmenové buňky kultivované in vitro rostou ve formě trojrozměrných útvarů neurosfér (např. krevní cévy), které jsou nezbytné pro optimální regeneraci. Ideálním zdrojem kmenových buněk pro obnovu poraněné nervové tkáně jsou neurální kmenové buňky. Tyto buňky lze získat buď z vyvíjející se fetální nervové tkáně nebo z výše uvedených oblastí dospělé nervové tkáně. Vyjmutím těchto buněk z jejich přirozeného prostředí a expozicí růstovým faktorům bfgf (basic fibroblast growth factor) a EGF (epidermal growth factor) in vitro lze navodit proliferaci NKB a jejich mnohonásobnou expanzi. Tímto lze zajistit dostatečné množství NKB pro transplantaci i přes počáteční malý výtěžek odebrané tkáně. NKB rostou ve formě trojrozměrných útvarů tzv. neurosfér (obrázek 1). Neurosféra, která vzniká proliferací jediné kmenové buňky, je tvořena jednak kmenovými buňkami, jednak více diferencovanějšími neurálními buňkami, přičemž kmenové a progenitorové buňky tvoří povrchovou vrstvu. Následnou disociací těchto útvarů na jednotlivé buňky a jejich další kultivací vzniknou z každé KB další neurosféry a počet KB se pasážováním exponenciálně zvyšuje. NKB lze tímto způsobem kultivovat neomezeně dlouho. Přestože lze NKB snadno kultivovat a expandovat, pro použití v klinické praxi vzniká problém tyto buňky získat. Jedním z použitelných avšak málo dostupných zdrojů jsou fetální NKB z potracených lidských plodů. Kromě etických problémů značnou nevýhodou použití těchto fetálních buněk je, že tento alogenní transplantát je třeba doplnit imunosupresí. Obejít problém imunosuprese je možné pouze při použití NKB z vlastních zdrojů pacienta. Ovšem získat dospělé tkáňově specifické NKB z CNS pacienta není dost dobře proveditelné. V poslední době byl odhalen i jiný alternativní zdroj autologních kmenových buněk. V čichové sliznici existuje kromě smyslových a podpůrných buněk i malé množství kmenových buněk v bazální vrstvě čichového epitelu. Bylo prokázáno, že tyto buňky lze izolovat a kultivovat in vitro ve formě neurosfér a navíc diferenciační potenciál těchto KB je shodný s NKB (24). Ačkoliv ještě v odborném tisku nebyly publikovány žádné výsledky, v Lisabonu již probíhají první transplantace těchto buněk z čichové sliznice s poměrně překvapivými výsledky. HLAVNÍ TÉMA 2 / 2005 NEUROLOGIE PRO PRAXI / 65

3 Obrázek 2. Monolayer BMSSCs kultivovaných in vitro, 53. den, 2. pasáž (původní zvětšení 120 ) Obrázek 3. BMSSCs kultivované in vitro (barvení dle Giemsy Romanowského), 33. den, 3. pasáž (původní zvětšení 240 ) Jedním z alternativních přístupů izolace kmenových buněk z vlastních zdrojů pacienta je využít jedné z vlastností KB plasticity. Plasticita neboli vzájemná zastupitelnost kmenových buněk umožňuje využít KB z jiné dostupné tkáně (např. tuková tkáň, BMSSCs Bone Marrow Stromal Stem Cells z kostní dřeně) a reprogramovat tyto KB v typově odlišné elementy neurální buňky. Posledním možným a velmi významným zdrojem buněk pro transplantaci jsou ES (embryonic stem) buňky. Embryonální kmenové buňky jsou totipotentní kmenové buňky schopné generovat jakýkoliv buněčný typ přítomný v lidském organizmu včetně neurálních buněk. Tyto buňky jsou odvozené z embryoblastu blastocysty formující se v časné fázi vývoje a jsou schopny neomezené sebeobnovy. Lákavou perspektivou je produkce embryonálních kmenových buněk obsahující DNA daného pacienta. Toto lze uskutečnit přenosem jádra somatické buňky pacienta do zygoty nebo do zralého oocytu, který je následně partenogeneticky instruován k zahájení buněčného dělení. Ve fázi blastocyty jsou z vnitřní buněčné masy izolovány ES buňky a ošetřením vhodnou kombinací působků (kys. retinová, Shh) lze buňky nasměrovat v neuronální linii. Výhodou použití histokompatibilních buněk pro transplantaci je fakt, že se lze vyhnout dlouhodobé imunosupresi, která je nezbytná při použití alogenních buněk a která představuje velké riziko vzniku infekce u pacientů s míšním poraněním. Nevýhoda plyne z faktu, že ne všechny ES buňky během ošetření podlehnou diferenciaci a z méně zralých buněk mohou vzniknout nádory. Předpokladem úspěšné transplantace je její správné načasování. Přestože se názory na výběr vhodné doby pro aplikaci KB liší, většina badatelů preferuje období prvních 14 dnů od vzniku poranění. Bylo prokázáno, že v krátké době po poranění stoupá v místě postižení sekrece SDF-1α (stromal cell-derived factor 1α) zejména astrocyty a endotelovými buňkami a tento faktor působí chemoatraktivně nejen pro buňky účastnící se zánětlivé reakce, ale také pro endogenní kmenové buňky (5, 13). Koncentrace SDF-1α je nejvyšší během prvních 48 hodin po poranění, později jeho hladina klesá. Kmenové buňky na svém povrchu nesou receptor CXCR4, který rozpoznává a váže SDF-1α, což způsobuje na základě chemického gradientu migraci těchto buněk do míst poranění. Bylo prokázáno, že NKB kultivované in vitro po expozici SDF-1α zvyšují svoji proliferaci a migrují do místa se zvýšenou hladinou chemokinu nejen in vitro, ale také in vivo, což znamená, že i exogenně podané NKB intravenózně mají schopnost selektivně migrovat do místa, kde je jich potřeba. Jiní autoři naopak tvrdí, že podání NKB v akutní fázi po poranění je díky vzniku časné zánětlivé reakce nevhodné. V místě poranění vznikají vysoké hladiny zánětlivých cytokinů (IL-1ß, IL-6), které aktivují signální dráhy (Jak/ Stat), které ve svém důsledku vedou k diferenciaci endo- i exogenních NKB výhradně v astrocyty. V subakutní fázi (7 14 dní po poranění) tato nepříznivá situace ustává a vzniká příznivé terapeutické okno pro podání kmenových buněk (11). Navíc v tomto období se obnovuje cévní řečiště, které má pozitivní vliv na přežívání NKB a jejich začlenění do míšního parenchymu (2). Při uplynutí delšího časového intervalu dochází k tvorbě gliové jizvy, která inhibuje regeneraci poškozených axonů a může také modifikovat případné začlenění neuronů vydiferencovaných z NKB do míšního parenchymu. Důležitým momentem pro úspěšnost transplantace KB je cesta podání. Je třeba vždy zajistit, aby vlastní aplikace KB ve svém důsledku nezhoršila stav již přítomného poranění. Jednou z možností volby je přímá aplikace KB do místa poranění, která také představuje i experimentálně nejpoužívanější přístup. Tento způsob je však chirurgicky náročnější a hrozí zde nebezpečí dalšího poranění již tak poraněné míchy. Umožňuje však KB umístit přímo do cílového prostoru bez toho, aby část podaných KB byla ztracena. Intravenózní podání je oproti předešlému způsobu minimálně invazívní zákrok nijak nezatěžující pacienta, avšak lze předpokládat že injikované KB se zachytí pravděpodobně z větší části i v orgánech mimo poraněnou míchu. Úspěšnost lze zvýšit opakovaným podáním zejména v akutní a subakutní fázi po poranění, kdy je navíc otevřena v důsledku poranění a následného zánětu hematoencefalická bariéra a existuje zde i signalizace přitahující kmenové buňky do místa poranění. Žilní způsob podání buněk je zcela nevhodný pro diferencované elementy, které byly zmíněny v předchozím oddíle buněčné terapie (Schwannovy buňky, OECs (olfactory ensheating cells), geneticky modifikované buňky uzpůsobené k produkci cytokinů apod.). Mezenchymové kmenové či mezenchymové progenitorové buňky (BMSSCs, MSCs Mesenchymal Stem Cells, MPCs Mesenchymal Progenitor Cells) jsou vzácné buněčné populace (obrázky 2, 3) vyskytující se v kostní dřeni s frekvencí zhruba 2 5 na 10 6 jaderných buněk. Jedná se o klíčovou populaci buněk zodpovědnou za vytvoření a udržení struktury stromatu kostní dřeně. MSCs jsou v současné době intenzivně studovány pro své schopnosti podpory krvetvorby, modulace imunitních funkcí a diferenciace směrem ke specializovaným tkáním (kost, chrupavka, šlacha, srdeční sval, nervová tkáň aj.). Disponují značným proliferačním (3) a diferenciačním potenciálem (12). Diferenciace jsou tyto buňky schopné jak in vitro po poskytnutí diferenciačních podnětů, tak in vivo po přenesení do vhodného prostředí. MSCs / MPCs se nabízejí pro potenciální, široké klinické využití (buněčná a genová terapie) a laboratorní modelování. V r se vědcům podařilo prokázat schopnost transdiferenciace BMSSCs v astroglie, a o rok později několik výzkumných týmů vypracovalo metodiku transdiferenciace BMSSCs v neurony (14, 21). Práce Terady et al. (17) a Ying et al. (23) publikované r však toto pozorování napadají s tím, že BMSSCs nediferencují v neurony a glie popisují proces tzv. spontánní buněčné fúze, kterým si BMSSCs osvojí fenotyp jiných buněk. Sasaki (15) ve své práci prokazuje uplatnění BMSSCs v procesu remyelinizace. Další autoři diskutují metodiky aplikace BMSSCs (16), srovnávají aplikaci intravenózně, intratekálně a přímo do léze. Satake (16) dokonce ve své práci popisuje ascendentní migraci subarachnoidálně aplikovaných BMSSCs do oblasti míšní léze (experimentální lézi provedl v oblasti hrudní míchy, BMSSCs aplikoval do subarachnoidálního prostoru v lumbální oblasti). Mezi nepochybné výhody BMSSCs patří nejen možnost autotransplantace a s tím související histokompatibilita transplantátu, ale též jejich schopnost diferenciace ve většinu buněčných typů, nízké riziko tumorigeneze a etická přijatelnost jejich odběru a separace / NEUROLOGIE PRO PRAXI 2 / 2005

4 Shrnutí problematiky Základní výzkum a rozvoj experimentálních metod léčby míšní léze neodmyslitelně patří k současné péči o pacienta s míšním poraněním. Vytouženému cíli kauzální terapii jsme stále blíže a blíže. Na kterém místě v algoritmu léčby míšního poranění se nachází experimentální terapie? V odpovědi na tuto otázku se kloníme k tzv. konceptu pyramidy, který schematicky zobrazuje léčebný a rehabilitační proces. Na bazi pyramidy se nachází pacient s míšním poraněním v akutním stadiu. Toto stadium nemocnému musíme pomoci překlenout a to nejen intenzivní péčí s případným chirurgickým zákrokem, ale také intenzivní rehabilitací s psychologickou podporou. Přes jednotlivé stupně se dostáváme na pomyslný vrchol pyramidy, na kterém se nachází použití experimentálních přístupů v klinickém experimentu. Jen takové počínání považujeme vzhledem k nemocnému a jeho blízkým za korektní a etické. Nejen terapeutická transplantace pomocí kmenových buněk (KB), kterou jsme se Vám snažili přiblížit, představuje perspektivní a nový léčebný přístup. Soustavně se také vylepšuje symptomatická terapie. V současné době se např. intenzivně studuje vliv TGF-β (Transforming Growth Factor-β) na rozsah sekundárního poranění. Tyor et al. (18) v experimentu na potkanech prokázal redukci objemu míšní léze o 50 % za 48 hod po i. v. aplikaci TGF-β. Redukce objemu léze korelovala s redukcí počtu mononukleárních elementů v místě léze. Jak dokládají experimentální studie, KB případně jejich buněčné potomstvo lze využít při terapii míšních lézí a podpoře regenerace přetnutých periferních nervů. Metoda má své zastánce, odpůrce i skeptiky. Zatímco v Evropě panuje optimizmus a je snahou přejít v klinické experimenty, v USA převažuje skepticizmus a studium zvířecích modelů. Kde je zlatá střední cesta? Co je ještě etické? Jak odolat mediál nímu tlaku? Jaké snahy v péči o nemocného s míšním poraněním jsou pro naše pacienty přínosem? Na tyto otázky musíme společně s našimi nemocnými najít odpověď a jak jistě všichni cítíte, tato ožehavá problematika vyžaduje širokou diskuzi napříč medicínskými i nemedicínskými obory. Je třeba si uvědomit, že léčba míšního poranění pomocí kmenových buněk je pouze jednou z možností volby (obrázek 4) a sama o sobě bez kombinace s jinými výše diskutovanými přístupy a hlavně bez dlouhodobé a intenzivní rehabilitace není účinná. Nepochybně buněčná terapie je svými hlavními výhodami (podává se většinou pouze jednou, není toxická, produkované buňky si osvojí fenotyp cílové oblasti) přímo předurčena k léčbě míšního poranění. Obrázek 4. Srovnání obtížnosti jednotlivých metodik experimentální terapie míšní léze Je pouze otázkou času, než budou procesy následující míšní poranění, schopnost vlastní regenerace nervové tkáně a procesy neuronogeneze a gliogeneze poznány do takové míry, že je budeme moci ovlivnit a vytvořit tak vhodné podmínky pro regeneraci axonů a náhradu zničených nervových buněk. Kvalitní rehabilitace však vždy zůstane základem jakékoliv zvolené doplňující léčby. Na samý závěr bychom s jistou dávkou skepticizmu měli připomenout, že v současné době věda dosud nedospěla k takovým úspěchům např. stran užití kmenových buněk v experimentu, aby bylo etické dávat našim nemocným falešnou naději. Způsoby provedení vlastní buněčné transplantace i dosažené výsledky jednotlivých studií se do jisté míry liší úkolem současného výzkumu je nalezení optimálních postupů ke spolehlivému dosažení žádaného terapeutického účinku. Je nutné dále zpřesnit techniku buněčné separace, stanovit zevní působky usměrňující diferenciaci žádoucím směrem, vymezit přesný typ buněčných změn, ke kterým po přenosu buněk dochází, určit jejich prospěšnost, nalézt optimální metodiku přenosu, zlepšit metody průkazu diferenciace funkčních buněk a prokázat plnou integraci transplantovaných buněk. Literatura 1. Arlotta P, Magavi SS, Macklis JD. Induction of adult neurogenesis: molecular manipulation of neural precursors in situ. Ann NY Acad Sci 2003; 991: Casella GT, Marcillo A, Bunge MB, Wood PM. New vascular tissue rapidly replaces neural parenchyma and vessels destroyed by a contusion injury to the rat spinal cord. Exp Neurol 2002; 173: Colter DC, Class R, DiGirolamo CM, et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: Guest JD, Rao A, Olson L, Bunge MB, Bunge RP. The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord. Exp Neurol 1997; 148(2): Imitola J, Raddassi K, Park KI, Mueller FJ, Nieto M, Teng YD, Frenkel D, Li J, Sidman RL, Walsh CA, Snyder EY, Khoury SJ. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stroma cell-derived factor 1α/CXC chemokine receptor 4 pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: Jones LL, Sajed D, Tuszynski MH. Axonal regeneration through regions of chondroitin sulfate proteoglycan deposition after spinal cord injury: a balance of permissivness and inhibition. J Neurosci 2003; 23(28): Li S, Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antagonist promotes recovery from spinal cord injury. J Neurosci 2003; 23(10): Mokrý J. Neurální prokurzorové buňky a jejich kultivace. Praha: Galén s. 9. Mokrý J. Nové poznatky o kmenových buňkách. Lék Zpr LF UK Hradec Králové 2000; 45(5 6): Novikova LN, Novikov LN, Kellerth JO. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol 2003; 16(6): Okano, H, Oqawa Y, Nakanuta M, Kaneko S, Iwanami A, Toyama Y. Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury. Semin Cell Dev Biol 2003; 14: Pittengel MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: HLAVNÍ TÉMA 2 / 2005 NEUROLOGIE PRO PRAXI / 67

5 13. Ratajczak MZ, Kucia M, Reca R, Majka M, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J. Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mrna for early muscle, liver and neural cells hide out in the bone marrow. Leukemia 2004; 18: Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, Hazzi C, Stedeford T, Willing A, Freeman TB, Saporta S, Janssen W, Patel N, Cooper DR, Sanberg PR. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol. 2000; 164(2): Sasaki M, Honmou O, Akiyama Y, Uede T, Hashi K, Kocsis JD. Transplantation of an acutely isolated bone marrow fraction repairs demyelinated adult rat spinal cord axons. Glia 2001; 35(1): Satake K, Lou J, Lenke LG. Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue. Spine 2004; 29(18): Terada N, Hamazaki T, Oka M, Hoki M, Mastalerz DM, et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: Tyor WR, Avgeropoulos N, Ohlandt G, Hogan EL. Treatment of spinal cord impact injury in the rat with transforming growth factor-beta. J Neurol Sci 2002; 200: Weidner N, Grill RJ, Tuszynski MH. Elimination of basal lamina and the collagen scar after spinal cord injury fails to augment corticospinal tract regeneration. Exp Neurol 1999; 160: West NR, Leblanc V, Collins GH. Support of axonal regrowth by endogenous mechanisms following spinal cord injury in adult rats. Neuropathology 2001; 21(3): Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000; 61(4): Woerly S, Petrov P, Sykova E et al. Neural tissue formation within porous hydrogels implanted in brain and spinal cord lesions: ultrastructural, immunohistochemical, and diffusion studies. Tissue Eng 1999; 5(5): Ying QL, Nichols J, Evans EP, Smith AG. Changing potency by spontaneous fusion. Nature 2002; 416: Zhang X, Klueber KM, Guo Z, Lu C, Roisen FJ. Adult human olfactory neural progenitors cultured in defined medium. Exp Neurol 2004;186: / NEUROLOGIE PRO PRAXI 2 / 2005