UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd ZMĚNY LIPIDOVÉHO SPEKTRA BĚHEM REDUKCE HMOTNOSTI PACIENTŮ S DIABETES MELLITUS Diplomová práce Školitel: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Školitel - specialista: RNDr. Mgr. Alena Tichá, PhD. Hradec Králové, 2013 Bc. Barbora Šmídová

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum Podpis

3 Děkuji paní RNDr. Mgr. Aleně Tiché, Ph.D. za odbornou metodickou pomoc, ochotu a čas, který mi v průběhu práce věnovala, panu Prof. MUDr. Jaroslavu Dršatovi, CSc. za cenné rady. Dále děkuji všem pracovníkům Výzkumné laboratoře kliniky gerontologické a metabolické za podporu a pomoc při vypracování praktické části.

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Barbora Šmídová Školitel: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Školitel - specialista: RNDr. Mgr. Alena Tichá, PhD. Název diplomové práce: ZMĚNY LIPIDOVÉHO SPEKTRA BĚHEM REDUKCE HMOTNOSTI PACIENTŮ S DIABETES MELLITUS Diplomová práce se zabývá stanovením lipidových parametrů (celkových mastných kyselin, celkového cholesterolu, cholesterolu v lipoproteinech, triglyceridů, prekurzorů cholesterolu (lathosterolu a skvalenu) a markerů absorpce cholesterolu (ß-sitosterolu a kampesterolu)) u obézních pacientů s diabetes mellitus 1. a 2. typu, kteří podstoupili sedmidenní hladovku a následně dodržovali nízkokalorickou diabetickou dietu. Předpokládá se, že snížením tělesné hmotnosti, by mělo dojít ke zlepšení inzulínové rezistence. Záměrem práce je zhodnocení lipidových parametrů během redukce hmotnosti u obézních pacientů s diabetes mellitus. Lipidy byly stanovovány před zahájením hladovky, po sedmidenní hladovce a za měsíc od začátku hladovky (u diabetiků 1. typu též rok po hladovce). Metoda plynové chromatografie byla použita pro stanovení celkových mastných kyselin a necholesterolových sterolů a skvalenu. Cholesterol a triglyceridy byly stanoveny rutinním enzymatickým kolorimetrickým testem. U diabetiků 1. typu byly nalezeny významné změny v hladinách celkových mastných kyselin a dále snížení hladin lathosterolu, kampesterolu a jejich poměrů s celkovým cholesterolem po roce od hladovky. U diabetiků 2. typu byl nalezen zvýšený poměr lathosterol/celkový cholesterol po měsíci od hladovky. Dále bylo u obou skupin diabetiků zaznamenáno významné snížení cholesterolu v lipoproteinech o vysoké hustotě (HDL-C) po ukončení hladovky.

5 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Barbora Šmídová Supervisor: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Supervisor - specialist: RNDr. Mgr. Alena Tichá, PhD. Title of diploma thesis: CHANGES OF LIPID SPECTRUM DURING BODY MASS REDUCTION IN PATIENTS WITH DIABETES MELLITUS The thesis deals with the determination of lipid parameters (plasma total fatty acids, plasma total cholesterol, lipoprotein cholesterol, plasma triglycerides, plasma cholesterol precursors (lathosterol and squalene) and markers of cholesterol absorption (β-sitosterol and campesterol)) in obese patiens with diabetes mellitus type 1 and type 2 who were tested with a seven-day fasting, followed by low-calorie diabetic diet. It is assumed that weight loss should improve insulin resistence. The aim of this work is to evaluate the lipid parameters during the body weight reduction in obese patients suffering with diabetes mellitus. Lipids were determined before and after a seven-day fasting and after one month from the beginning of fasting (in patiens with diabetes mellitus type 1 also after one year). Gas chromatography was used for the determination of fatty acids and non-cholesterol sterols and squalene. Cholesterol and triglycerides were determined by a routine enzymatic colorimetric test. In patients with diabetes mellitus type 1 significant changes in the levels of fatty acids were found and decreased levels of lathosterol and campesterol as well decrease in their ratio with total cholesterol were observed after the fasting period. In patients with diabetes mellitus type 2 an increased ratio of lathosterol/total cholesterol after one month from fasting was found. Equally, for both diabetic groups a significant decrease in high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels after fasting was determined.

6 Obsah 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Lipidy Mastné kyseliny Cholesterol (celkový, LDL-C, HDL-C), triglyceridy Prekurzory cholesterolu (skvalen a lathosterol) Markery absorpce cholesterolu (β-sitosterol a kampesterol) Diabetes mellitus Etiologická klasifikace a patogeneze diabetes mellitus Diabetes mellitus 1. typu Diabetes mellitus 2. typu Diagnostika, komplikace a léčba diabetes mellitus Inzulín Metabolismus lipidů u obézních pacientů s diabetes mellitus Diabetes mellitus a obezita Inzulínová rezistence Metabolický syndrom Diabetes mellitus a poruchy metabolismu lipidů Redukce hmotnosti a její vliv na metabolismus lipidů Současná metodika stanovení lipidových parametrů Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu CÍL PRÁCE METODIKA A MATERIÁL Protokol studie Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Přístroje a pomůcky... 49

7 Chemikálie Analytický postup Chromatografické podmínky Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu Přístroje a pomůcky Chemikálie Příprava roztoků Analytický postup Příprava standardů Chromatografické podmínky Enzymatické stanovení cholesterolu (celkového, LDL-C, HDL-C) a triglyceridů VÝSLEDKY Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Chromatografické stanovení celkových MK u pacientů s DM 1. typu Chromatografické stanovení celkových MK u pacientů s DM 2. typu Chromatografické stanovení necholesterolových sterolů a skvalenu Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu u pacientů s DM 1. typu Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu u pacientů s DM 2. typu Enzymatické stanovení cholesterolu (celkového, LDL-C, HDL-C) a TAG Enzymatické stanovení cholesterolu a TAG u pacientů s DM 1. typu Enzymatické stanovení cholesterolu a TAG u pacientů s DM 2. typu DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM ZKRATEK LITERATURA... 99

8 1. ÚVOD Výskyt obezity a diabetes mellitus v naší populaci neustále narůstá, příčinou je zejména nezdravý životní styl spojený s pozitivní energetickou bilancí. Spolu s nárůstem tělesné hmotnosti stoupají i zdravotní rizika související zejména se značnými změnami metabolismu lipidů a sacharidů. Viscerální tuk je více škodlivý než tuk podkožní, má odlišný metabolický účinek, je rezistentní k antilipolytickému účinku inzulínu, a to zapříčiní uvolňování velkého množství volných mastných kyselin do krevní cirkulace, což může následně vést až k rozvoji inzulinové rezistence. Obezita je součástí metabolického syndromu, což je soubor rizikových faktorů, které spolu často souvisí, vyskytují se společně a ve svém důsledku vedou předčasně k rozvoji diabetes mellitus 2. typu, aterosklerózy a následně kardiovaskulárním onemocněním. Všechny tuky však nejsou nutně příčinou chorob, existují i takové, které mají na organismus pozitivní vliv. Jednotlivé mastné kyseliny mají v metabolismu odlišný význam, je to dáno jejich chemickou strukturou, tj. délkou uhlovodíkového řetězce a počtem násobných vazeb. Lidské tělo si v případě potřeby umí většinu MK syntetizovat, ale není tomu tak v případě esenciálních mastných kyselin -3 a -6, jež působí na organismus příznivě, snižují hladinu cholesterolu, mají protizánětlivé a vazodilatační účinky. Je nezbytné, aby byly tyto MK dodávány ve stravě. Cholesterol patří mezi látky steroidní povahy, do této skupiny látek řadíme i rostlinné steroly ( -sitosterol, kampesterol), které mohou metabolismus cholesterolu ovlivňovat. Na tukovou tkáň bylo dříve pohlíženo pouze jako na mechanickou bariéru, avšak dnes už je objasněna další funkce tukových buněk, kterou je sekrece tkáňových hormonů, cytokinů a růstových faktorů. Některé z těchto látek mohou být zodpovědné za vznik poruch glukózové tolerance a následného rozvoje diabetes mellitus. Předkládaná práce se zabývá hodnocením lipidového spektra u obézních pacientů s diabetes mellitus 1. a 2. typu, kteří podstoupili sedmidenní hladovku a následně dodržovali nízkokalorickou diabetickou dietu. U těchto pacientů je předpokládáno snížení inzulínové rezistence během redukce hmotnosti. V rámci práce jsou měřeny hladiny celkových mastných kyselin, celkového cholesterolu, cholesterolu v lipoproteinech, 1

9 triglyceridů, prekurzorů cholesterolu (lathosterolu a skvalenu) a markerů absorpce cholesterolu (ß-sitosterolu a kampesterolu). Získaná data z oblasti lipidů budou v kontextu studie FN HK dále interpretována s dalšími stanovenými hodnotami, např. inzulínové senzitivity, či hormonů tukové tkáně. Z tohoto důvodu jsou grafy ve výsledkové části uvedeny s popiskami v anglickém jazyce. V mé bakalářské práci (2011), která byla také experimentálního charakteru, jsem se rovněž zabývala problematikou lipidů, konkrétně zastoupením mastných kyselin v mateřském mléce. Ke stanovení celkových mastných kyselin jsem použila stejnou metodu úpravy vzorku i stanovení jako nyní v práci diplomové. Výsledky mé bakalářské práce byly prezentovány na mezinárodním kongresu (32nd ESPEN congress) a abstrakt práce byl publikován v odborném časopise Clinical Nutrition. 2

10 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Lipidy Lipidy jsou velmi různorodou skupinou přírodních látek, jejichž společným znakem je relativní nerozpustnost ve vodě. Společným rysem všech lipidů je také to, že jejich biosyntéza vychází z molekuli acetyl-coa. Lipidy jsou důležitou složkou potravy, a to jak pro svou vysokou energetickou hodnotu, tak pro obsah esenciálních mastných kyselin a v tucích rozpustných vitamínů, jež jsou obsaženy v lipidové složce potravin přírodního původu (Murray a kol. 2002). Tuk v těle slouží jako vydatný zdroj energie, buď přímo, nebo v podobě zásob v tukové tkáni. Též má význam jako tepelný izolátor v podkožní tkáni a okolí některých orgánů. Nepolární lipidy tvoří elektrickou izolaci, která umožňuje rychlé šíření depolarizačních vln podél myelinizovaných nervových vláken. Nervová tkáň je velmi bohatá na tuky. Kombinací tuků a proteinů vznikají částice zvané lipoproteiny, které jsou důležitou součástí membrán a umožňují transport lipidů krví (Murray a kol. 2002) Mastné kyseliny Mastné kyseliny (MK) jsou organické sloučeniny, jejichž skelet je tvořen uhlíkovým řetězcem o délce 4 až 36 atomů a jež obsahují jednu karboxylovou skupinu. MK se dělí dle struktury na nasycené, které neobsahují žádnou dvojnou vazbu, a nenasycené, které ve své molekule obsahují jednu (mononenasycené) či více (polynenasycené) dvojných vazeb. U vyšších živočichů a rostlin převažují MK se 16 a 18 uhlíkovými atomy, především se jedná o kyselinu palmitovou, stearovou, olejovou a linolovou. Kyseliny, jejichž řetězec je kratší než 14 a delší než 22 uhlíkových atomů, představují jen minoritní část. Nenasycené MK není lidské tělo schopné syntetizovat a musí je přijímat ve stravě (Nelson a Cox 2005). Tyto esenciální MK poskytují eikosaenové MK (C 20 ), z kterých se odvozuje několik skupin látek, zejména prostaglandiny, thromboxany a leukotrieny. Tyto látky se souhrnně označují jako eikosanoidy (Murray a kol. 2002). 3

11 MK mají v organismu mnoho důležitých úloh, představují podstatnou složku lipidů. Jsou součástí fosfolipidů, jež tvoří základní strukturu buněčných membrán (viz Obr. 1.), v triglyceridech představují významný zdroj metabolické energie, jsou součástí lipoproteinů a v tukové tkáni slouží jako mechanické a tepelné izolátory. MK jsou též ligandy některých nukleárních receptorů, jež se účastní mnoha metabolických procesů na subcelulární úrovni. Nenasycené MK s atomy uhlíku jsou prekurzory eikosanoidů (prostaglandinů, leukotrienů a tromboxanů), které mají široký rozsah regulačních vlastností, s autokrinními i parakrinními účinky. Inkorporaci proteinů do membrán umožní až kovalentní modifikace právě mastnými kyselinami. MK se vyskytují i v neesterifikované formě jako tzv. volné MK, především v krevní plazmě vázané na albumin, avšak těchto MK je jen minoritní část (Tvrzická a kol. 2009b). Obr. 1. Struktura buněčné membrány Na obrázku je zobrazena základní struktura buněčné membrány. Polar head (polární hlavička) a fatty acid chain (řetězec mastné kyeliny) tvořící phospholipid (fosfolipid). Peripheral protein on outer surface (periferní protein na vnějším povrchu), carbohydrate attached to protein (sacharid připojený k proteinu), part of cytoskeleton (část buněčného skeletu), integral protein forming a channel (integrální protein tvořící kanál), peripheral protein on inner surface (periferní protein na vnitřním povrchu membrány). Převzato z: web Biologymad.com/cells/cellmembrane 4

12 MK ve formě fosfolipidů jsou strukturními složkami všech buněčných membrán (Tvrzická a kol. 2009b). Jednou z nejdůležitějších funkcí membránových lipidů je ovlivnění fluidity membrán. Nejvíce zastoupenými fosfolipidy plazmatických membrán jsou fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin a sfingomyelin. Minoritní část tvoří fosfatidylserin, fosfatidylinostitol, lyzofosfatidylcholin a lyzofosfatidylethanolamin. Zastoupení mastných kyselin v jednotlivých lipidových třídách výrazně ovlivňuje fluiditu membrán. Významnou složkou membránových lipidů jsou kyselina palmitová a vysoký obsah polynenasycených MK (PUFA). PUFA odštěpené z fosfolipidů jsou využity pro syntézu eikosanoidů, jsou významnými ligandy receptorů, účastní se transkripce genů a hrají roli v přenosu signálů. Zastoupení fosfolipidů a MK v nich obsažených je charakteristické pro jednotlivé tkáně i pro každý živočišný druh (Tvrzická a kol. 2009a). Neesterifikované MK (NEFA) neboli tzv. volné MK jsou v prostředí plazmy vázány na albumin. Tyto MK vznikají jako produkty lipolýzy a zároveň jsou využívány jako zdroj pro syntézu lipidů. V plazmě jsou NEFA přítomny jen ve velmi nízkých koncentracích, mohou být oxidovány, reesterifikovány, nebo mohou podléhat elongaci či desaturaci. Zvýšené hladiny NEFA mají na plazmatické membrány toxický účinek, což může vyvolávat arytmie, dále protrombogenní účinek a jiné (Tvrzická a kol. 2009a). Biosyntéza MK probíhá v cytosolu, a to zejména v játrech, tukové tkáni, laktující mléčné žláze a v menší míře i v ledvinách, mozku a plicích. Biosyntéza MK je sérií probíhajících reakcí, které způsobí, že se uhlíková kostra MK prodlouží vždy o 2 uhlíky, které pocházejí z acetyl-coa. Acetyl-CoA je zároveň i molekula stojící na počátku biosyntézy MK, vzniká převážně v cytoplazmě jako produkt glykolýzy. Další způsoby tvorby acetyl-coa jsou degradace MK, ketolátek či uhlíkatých zbytků aminokyselin. Úvodním a zároveň regulačním krokem syntézy MK je karboxylace acetyl-coa na malonyl-coa, při reakci je spotřebována jedna molekula ATP a katalyzátorem je enzym acetyl-coa-karboxylasa. Poté se účastní reakce multienzymový komplex synthasy MK, tzv. FAS (fatty acid synthasa), který se skládá ze dvou podjednotek. Aktivní je pouze dimer. Konečným produktem syntézy MK je kyselina palmitová (Kraml 2008). 5

13 Obr. 2. Syntéza mastných kyselin v přehledu Převzato z: Liu, T., Vora, H., Khosla, C. Quantitative analysis and engineering of fatty acid biosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering. 2010;12(4): K prodlužování řetězce MK dochází v endoplazmatickém retikulu, je k němu potřeba tzv. mikrosomální systém neboli elongasa. Má podobnou funkci jako FAS, prodlužuje acyl-coa o dva uhlíky pomocí malonyl-coa. (Murray a kol. 2002) Tvorba nenasycených MK probíhá v játrech v hladkém endoplazmatickém retikulu pomocí enzymů desaturas. Jde o řetěz enzymatických reakcí, který umožňuje transport páru elektronů (Kraml 2008). β-oxidace je proces degradace MK, který probíhá v mitochondriích. Jedná se o aerobní proces, který vyžaduje přítomnost kyslíku. V podstatě jde o opakující se sled reakcí, jehož následkem je zkracování uhlíkového řetězce pokaždé o dva uhlíky. Uhlíky se odštěpují v podobě acetyl-coa. Každý krok představuje reakci derivátů acyl-coa katalyzovanou různými enzymy využívajícími NAD + a FAD jako koenzymy. Energetický 6

14 výtěžek β-oxidace MK je velmi vysoký. β-oxidace se tento katabolický biochemický proces nazývá proto, že k oxidaci dochází vždy na β-uhlíku (C3) acylu MK (Murray a kol. 2002). Větší míra oxidace MK je charakteristická pro hladovění a diabetes mellitus, ve svém důsledku vede k produkci ketonových látek v játrech. Vzhledem k faktu, že glukoneogeneze je závislá na oxidaci MK, každá porucha v oxidaci MK vede k hypoglykémii (Murray a kol. 2002). Mnoho patologických stavů je doprovázeno změnami ve složení mastných kyselin, velmi často nalézáme pokles obsahu nenasycených MK a naopak nárůst obsahu nasycených MK (např. u dislipidémie, zánětu, malnutrice či vrozených chorob) (Tvrzická a kol. 2009b) Cholesterol (celkový, LDL-C, HDL-C), triglyceridy Cholesterol je látka steroidní povahy, která je v těle hojně zastoupená a má v našem organismu mnoho důležitých funkcí. Struktura cholesterolu je uvedena na Obr. 3. Všechny steroidy těla jsou odvozeny od cholesterolu. Je součástí vnější vrstvy buněčné membrány, zabraňuje krystalizaci uhlovodíků v membráně a hraje důležitou roli v permeabilitě buněčné membrány. Podílí se na produkci pohlavních hormonů (estrogenů, androgenů) a hormonů nadledvinek (aldosteronu, kortizolu, kortikosteronu aj.). Svou úlohu má i při tvorbě žluče, je základní prekurzor žlučových kyselin. Tvoří izolaci nervových vláken, pomáhá konvertovat sluneční svit na vitamín D a v neposlední řadě je důležitý pro metabolismus vitamínů rozpustných v tucích (A, D, E, K), (Nordqvist 2012). Jeho zvýšená hladina je však pro organismus škodlivá, zvyšuje riziko rozvoje aterosklerózy a tvorby žlučových kamenů. 7

15 Obr. 3. Strukturní vzorec cholesterolu Převzato z: web chebi The diabase and ontology of Chemical Entities of Biological Interest Hladina cholesterolu je závislá na několika vzájemně propojených procesech: syntéze cholesterolu, jeho absorpci z potravy a exkreci do žluče. Rovnováha mezi těmito procesy je u každého jedince individuální (Kostner 2007). Endogenní cholesterol je syntetizován ve všech tkáních, především ale v játrech, reprodukčních orgánech a kůře nadledvin (Češka a kol. 2005). Absorpce cholesterolu ve střevě je velmi variabilní, a to i u zdravých jedinců, hodnoty se pohybují v rozmezí mezi % (s průměrem 56 %) (Kostner 2007). U osob, které přijímají v potravě relativně málo cholesterolu, je hepatální produkce cholesterolu zhruba 800 mg za den, což postačuje k náhradě ztrát žlučí a posléze stolicí. Dietní přísun cholesterolu do střeva kolísá v závislosti na stravě mezi 300 až 700 mg denně. U zdravých osob je plazmatická hladina cholesterolu udržována poměrně v úzkém rozmezí, redukce nabídky cholesterolu ve střevě je rychle kompenzována zvýšením jeho syntézy játry (Češka a kol. 2005). 8

16 Obr. 4. Regulace biosyntézy cholesterolu v buňce Faktory, které ovlivňují rovnováhu cholesterolu na buňěčné úrovni. C cholesterol, CE - estery cholesterolu, ACAT - acyl-coa:cholesterol acyltransferasa, LCAT - lecithin:cholesterol acyltransferasa, A1 - apoprotein A1, LDL lipoproteiny o nízké hustotě, VLDL lipoproteiny o velmi nízké hustotě, HDL lipoproteiny o vysoké hustotě, (- ) = inhibice syntézy cholesterolu a (+) = aktivace ACAT. Převzato z: Ratushny A.V. a kol. Mathematical model of cholesterol biosynthesis regulation in the cell. Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Russia (web <Mgs.bionet.nsc.ru/mgs/papers/ratushny/cholesterol/>) Na počátku syntézy cholesterolu je molekula acetyl-coa. Klíčovým momentem v tomto složitém metabolickém procesu je přeměna 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzymu A (HMG-CoA) na mevalonát, která je katalyzována enzymem HMG-CoA reduktázou 9

17 (Češka a kol. 2005). Zjednodušené schéma syntézy cholesterolu je uvedeno na Obr. 5. Zvýšení intracelulárního cholesterolu stimuluje fosforylaci HMG-CoA reduktázy, která snižuje aktivitu enzymu a urychluje její degradaci. Cholesterol je ve střevě emulzifikován žlučovými kyselinami. Následkem toho vznikají micely, které transportují lipidy ze střevního lumen na povrch střevní mukózy, kde jsou následně absorbovány enterocyty. Uvnitř enterocytu je volný cholesterol esterifikován acyl-coa:cholesterolacyltransferázou (ACAT) a zabudován do chylomikronů, které jsou secernovány do lymfy a posléze do krve. Výstup cholesterolu z enterocytu je modulován Adenosin trifosfat binding cassette proteinem (ABCA1). Exprese ABCA1 pravděpodobně redukuje vstřebávání cholesterolu zvýšením zpětného transportu cholesterolu zpět do střeva (Češka a kol. 2005). Obr. 5. Schéma syntézy cholesterolu Převzato z: Honda, A. a kol. Down-regulation of cholesterol biosynthesis in sitosterolemia: diminished activities of acetoacetyl-coa thiolase, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase, reductase, squalene synthase, and 7-dehydrocholesterol Δ 7 -reductase in liver and mononuclear leukocytes. Journal of Lipid Research. 1998;39:

18 Lipidy se v krvi transportují v podobě lipoproteinů, tedy navázané na příslušný apoprotein. Je to nezbytné z toho důvodu, že lipidy jsou ve vodě nerozpustné a tím nastává problém, jak je transportovat ve vodném prostředí krevní plazmy do tkání a orgánů, kde by mohly být dále využity a uloženy. Lipoproteiny se skládají z nepolárních lipidů (estery cholesterolu a triacylglyceroly), polárních lipidů (fosfatidylcholin, sfingomyelin a volný cholesterol) a proteinu, zvaného též apoprotein nebo apolipoprotein (viz Obr. 6.). Apoproteiny mají v lipoproteinech funkci aktivátorů enzymů (např. apo-c-ii a apo-a-i) a ligandů pro buněčné receptory (např. apo-a-i, apo-e, apo-b-100), (Murray a kol. 2002). Rozlišujeme čtyři hlavní skupiny lipoproteinů, které jsou fyziologicky důležité a významné pro klinickou diagnózu. Jsou to: a) chylomikrony, které pocházejí ze střevní resorpce triglyceridů (TAG), b) lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL, very low density lipoproteins), které pocházejí z jater a podílejí se na exportu TAG, c) lipoproteiny o nízké hustotě (LDL, low density lipoproteins) a d) lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL, high density lipoproteins), které se účastní v metabolismu VLDL a chylomikronů a také v transportu cholesterolu. TAG je v chylomikronech a VLDL převažujícím lipidem, zatímco cholesterol a fosfolipidy převládají v LDL a HDL částicích (Murray a kol. 2002). Přehled složení jednotlivých lipoproteinových částic je uveden v Tab. 1. a 2. Významnou poruchou lipoproteinového metabolismu je diabetes mellitus, při němž nedostatek inzulínu způsobí nadměrnou mobilizaci volných MK a malá spotřeba chylomikronů a VLDL vede k hypertriglycerolemii (Murray a kol. 2002). 11

19 Obr. 6. Obecná struktura lipoproteinů Free cholesterol (volný cholesterol), peripheral apoprotein eg. apo-c (periferní apoprotein např. apo-c), phospholipid (fosfolipid), cholesteryl ester (estery cholesterolu), triacylglycerol, core consist mainly of nonpolar lipids (jádro obsahující převážně nepolární lipidy), monolayer of mainly amphipatic lipids (vrstva složená hlavně z amfipatických lipidů), integral apoprotein eg. apo-b (integrální apoprotein např. apo-b). Převzato z: Hjelmborg, P. S. a kol. Cellular uptake of lipoproteins and persistent organic compounds - An update and new data. 2008;108(2):

20 Tab. 1. Přehled charakteristiky lipoproteinů zdroj průměr (nm) hustota (g/ml) hl. apoproteiny Chylomikrony střevo < 0,95 B-48, E, A-I, A-II VLDL játra, (střevo) ,95-1,006 B-100, E, C-I,II,III IDL VLDL ,006-1,019 B-100 LDL VLDL ,019-1,063 B-100 HDL 2 (játra, střevo, ,063-1,125 A-I, A-II, E, C-I,II,III HDL 3 VLDL a chylom.) 7,5-10 1,125-1,210 A-I, A-II, E, C-I,II,III Tabulka nám ukazuje přehlednou charakteristiku jednotlivých lipoproteinů (chylomikronů, VLDL, IDL, LDL, HDL 2 a HDL 3 ), konkrétně jejich metabolický zdroj, průměr částic v nm, hustotu v g/ml a hlavní apoproteiny lipoproteinových částic. Převzato z: Murray a kol Tab. 2. Složení lipoproteinů Procenta z celkového lipidu protein (%) celkový lipid (%) TAG PL CHE Chol VMK Chylomikrony VLDL IDL LDL HDL HDL V tabulce je uvedeno procentuální složení lipoproteinů v plazmě člověka. V první části tabulky je zastoupení celkových lipidů a proteinu, v druhé části je znázorněno zastoupení jednotlivých lipidů. TAG-triglyceridy, PL-fosfolipidy, CHE-estery cholesterolu, Chol-volný cholesterol, VMK-volné mastné kyseliny. Hodnoty lipidových složek jsou uvedeny v procentech z celkového lipidu. Převzato z: Murray a kol

21 LDL (lipoproteiny o nízké hustotě, low density lipoproteins) je lipoprotein, jenž je velmi bohatý na obsah cholesterolu a zajišťuje jeho transport z jater do buněk celého těla. Většina LDL pravděpodobně vzniká přeměnou z VLDL částic. Vyskytují se buď v podobě velkých neaterogenních nebo malých denzních aterogenních částic. Cholesterol z LDL částic je vychytáván pomocí receptorů pro apo B-100 (Murray a kol. 2002). V této fázi se lipidy ukládají do zásob, a to zejména v tukové tkáni. V případě poruchy vychytávání cholesterolu specifickými LDL receptory vzniká vysoké riziko rozvoje aterosklerózy (Murray a kol. 2002, Škrha a kol. 2009). HDL (lipoproteiny o vysoké hustotě, high density lipoproteins) má přesně opačnou funkci než LDL, účastní se na odstraňování cholesterolu z periferních tkání celého těla přenosem do jater, působí tedy na organismus protektivně. Při zpětném transportu se HDL váže na apo A-I receptor, což má za následek přesun cholesterolu k buněčné membráně a odtud do HDL. Koncentrační gradient je udržován aktivitou LCAT (lecithincholesterolacyltransferasa), a to umožňuje, aby byl cholesterol esterifikován a uložen do jádra HDL. Estery cholesterolu obsažené v HDL jsou vychytávány játry buď přímo nebo po přenosu do VLDL či LDL za pomoci transferinového proteinu pro estery cholesterolu. V játrech je cholesterol přeměněn na žlučové kyseliny a vyloučen do střeva prostřednictvím žlučového traktu. Další funkcí HDL je působit jako zásobárna apolipoproteinů C a E, jež jsou nezbytné pro metabolismus chylomikronů a VLDL (Murray a kol. 2002). 14

22 Obr. 7. Přehled uplatnění lipoproteinů v metabolismu cholesterolu Exogenous pathway (vnější cesta), endogenous pathway (vnitřní cesta). Dietary fat (tuky přijaté potravou), intestine (střevo), LP lipasa (lipoproteinová lipasa), adipose tissue (tuková tkáň), muscle (svalovina), chylomikron remnant (zbytky chylomikronů), liver cells (jaterní buňky), VLDL (lipoprotieny o velmi nízké hustotě), LDL (lipoproteiny o nízké hustotě), HDL (lipoproteiny o vysoké hustotě), LCAT (lecitincholesterolacyltransferasa), nonliver cells (jiné buňky než jaterní). Převzato z: Saland, H. G. Lipoprotein metabolism in chronic renal insufficiency. Pediatr Nephrol. 2007; 22:

23 Triglyceridy (TAG) jsou estery alkoholu glycerolu a MK. Jsou přítomny v krevní plazmě a pocházejí buď z tuků obsažených ve stravě, odkud jsou po střevní absorpci transportovány v chylomikronech, nebo jsou syntetizovány v játrech z jiných zdrojů, nejčastěji sacharidů, odkud jsou transportovány pomocí VLDL (Murray a kol. 2002). Nejvýznamnější funkcí triglyceridů je působení jako zásobárna energie, pokud není přítomna energie z potravy, jsou uvolněny triglyceridy z tukové tkáně a využity jako zdroj energie. Tento proces je řízen hormony (Nordqvist 2012). Syntéza TAG probíhá nejintenzivněji v endoplazmatickém retikulu buněk tukové tkáně, jater a tenkého střeva. Výchozí sloučeninou nezbytnou k syntéze TAG je glycerol v aktivované podobě glycerol-3-fosfátu, který se postupně sloučí s dvěma acyl-coa za vzniku kyseliny fosfatidové. Z kyseliny fosfatidové se hydrolyticky odštěpí fosfát a vznikne 1,2-diacylglycerol, na který se připojí třetí acyl z acyl-coa za katalýzy acyltransferasy a vytvoří se triacylglycerol. Degradace TAG (lipolýza) probíhá za katalýzy lipasami s různou specifičností. Hlavním lipolytickým enzymem tukové tkáně je hormonsenzitivní lipasa, na povrchu endotelu kapilár je lokalizována lipoproteinová lipasa a lipasa, která je soustředěna na štěpení TAG z chylomikronových zbytků a HDL, se nazývá jaterní lipasa. Výsledkem lipolýzy TAG je uvolnění MK, které se dále využívají jako živina pro většinu tkání (vyjma mozku), (Murray a kol. 2002). Triglyceridy (TAG) jsou majoritní složkou jader chylomikronů a lipoproteinů o velmi nízké hustotě (VLDL). Nejhojněji zastoupenou MK v TAG je kyselina olejová (40%), palmitová (22%) a linolová (20%). MK slouží v TAG tukové tkáně jako zdroj energie a izolátor (Tvrzická a kol. 2009a). Estery cholesterolu (CE) představují v organismu zásobní a transportní formu cholesterolu. Nejvíce zastoupenou kyselinou v transportních CE je kyselina linolová (cca 50%), která je následována kyselinou olejovou (18%), palmitovou (15%) a arachidonovou (7%), (Tvrzická a kol. 2009a). 16

24 Prekurzory cholesterolu (skvalen a lathosterol) Kompletní biosyntéza cholesterolu probíhá v důsledku přibližně 200 enzymatických reakcí. Během těchto reakcí vznikají látky, které jsou označovány jako prekurzory cholesterolu. Mezi nejvýznamnější patří skvalen, lathosterol, lanosterol a další (Češka a kol. 2005). Skvalen (2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexan) je sloučenina isoprenoidního charakteru, která je strukturálně velmi podobná beta karotenu, je jedním z mnoha meziproduktů syntézy cholesterolu. (Kelly 1999) Skvalen je však mnohem více než jen prekurzor cholesterolu, jen 10 % endogenního skvalenu je využito pro syntézu cholesterolu a zbylých 90 % je skladováno nebo působí jako antioxidant (Masterjohn 2005). Také je považován za chemopreventivní látku (Charlton a Durrington 2007). Do tkání je transportován v séru, a to převážně ve spojení s VLDL (lipoproteiny o velmi nízké hustotě). Nejvyšší koncentrace skvalenu v lidském těle se nachází v kůži, povrchem kůže je ho denně vyloučeno asi mg/den (Kelly 1999, Charlton a Durrington 2007). Skvalen může být jak endogenního tak exogenního charakteru. Nejvíce je ho obsaženo v oleji jater hlubinného žraloka (z nich byl také poprvé izolován), ale rovněž je složkou i některých rostlinných olejů (Masterjohn 2005). Z potravy však pochází jen částečně a absorbováno je ho přibližně 60 %. Majoritní podíl skvalenu je syntetizován játry (Kelly 1999). Obr. 8. Strukturní vzorec skvalenu Převzato z: web Chemistry About.com 17

25 Lathosterol (5α-cholest-7en-3β-ol) je taktéž prekurzorem cholesterolu a jeho plazmatická koncentrace výrazně koreluje s hladinou cholesterolu. Předností využití lathosterolu jako indikátoru syntézy cholesterolu je jeho relativně vysoká koncentrace v plazmě. Příčina tohoto faktu však není známa. Lathosterol velmi významně koreluje především s aktivitou klíčového enzymu 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reduktázy (Kempen a kol. 1988). Obr. 9. Strukturní vzorec lathosterolu Převzato z: web chebi The diabase and ontology of Chemical Entities of Biological Interest Prekurzory cholesterolu jsou uvolňovány z buněk v neesterifikované formě, avšak v plazmě jsou některé esterifikovány enzymem lecitin-cholesterol-acyl transferasou. Steroly jsou tímto enzymem esterifikovány různou rychlostí. Např. cholesterol a lathosterol jsou esterifikovány z 50%, lanosterol pouze z několika málo procent (Eckfeld a kol. 1991). 18

26 Markery absorpce cholesterolu (β-sitosterol a kampesterol) Jsou jimi rostlinné tuky, jež jsou svou strukturou velice podobné cholesterolu, liší se pouze přítomností ethylové skupiny, která je navázána na postranním řetězci. Mezi nejvíce obvyklé patří β-sitosterol (24β-ethylcholesterol), kampesterol (24α-methylcholesterol), stigmasterol. Tyto steroly se v nejvyšší míře vyskytují v běžných rostlinných olejích, jako jsou řepkový, olivový, slunečnicový, dále je můžeme nalézt v některých semenech a ořechách. Jsou přijímány pouze potravou, v lidském těle se nesyntetizují (Tikkanen 2005). Sledování koncentrací těchto rostlinných sterolů se běžně využívá k hodnocení změn absorpce cholesterolu (Jakulj a kol. 2013). Tyto látky jsou významnými inhibitory absorpce cholesterolu ve střevě, protože rostlinné steroly v podstatě soutěží s cholesterolem o absorpci ve střevě a tím pádem jeho absorpci snižují. Současně však hladina cirkulujících rostlinných sterolů odráží absorpci cholesterolu ve střevě (Tikkanen 2005). Obr. 10. Strukturní vzorec β-sitosterolu Obr. 11. Strukturní vzorec kampesterolu Převzato z: web chebi The diabase and ontology of Chemical Entities of Biological Interest U pacientů, kteří mají omezenou absorpci cholesterolu (např. vlivem onemocnění střev), nacházíme jeho zvýšenou syntézu, která je zjištěna právě díky zvýšené koncentraci markerů β-sitosterolu a kampesterolu (Kostner 2007). Tyto steroly mají ale i některé negativní účinky. Jejich zvýšená koncentrace v plazmě může způsobit zvýšenou křehkost membrány erytrocytů nebo působit negativně na jaterní buňky (Tikkanen 2005). 19

27 2.2. Diabetes mellitus Diabetes mellitus (DM) neboli cukrovka či úplavice cukrová je celosvětově rozšířené závažné metabolické onemocnění, jež zahrnuje několik podtypů s různou etiopatogenezí a klinickými projevy. Patří mezi jednu z nejčastějších chronických endokrinních poruch. DM vzniká jako důsledek absolutního či relativního nedostatku inzulinu, který následně vede ke zvýšení hladiny glukózy v krvi (hyperglykémii). Hyperglykémie a s tím související následné změny metabolismu tuků, bílkovin a minerálů jsou společným projevem všech typů diabetu. Fyziologické hodnoty glykémie nalačno se pohybují v rozmezí 3,9 5,6 mmol.l -1, tato koncentrace zajišťuje optimální zásobení orgánů, jež jsou odkázané na nepřetržitý přísun glukózy z krve, ale zároveň nezpůsobuje jejich poškození, které dlouhodobě vysoké koncentrace glukózy zapříčiní. Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) je diabetes definován jako: Stav chronické hyperglykémie, který vzniká jako následek řady zevních a genetických faktorů současně působících Etiologická klasifikace a patogeneze diabetes mellitus ( dle Longo a kol. 2012) Diabetes mellitus typ 1 (dříve označovaný Inzulín-dependentní diabetes mellitus, IDDM) o autoimunitní o idiopatický Diabetes mellitus typ 2 (dříve označovaný Noninzulín-dependentní diabetes mellitus, NIDDM) o převážně inzulínorezistentní o převážně inzulínodeficitní 20

28 Ostatní specifické typy - nejsou způsobeny primárním postižením sekrece nebo účinku inzulínu, ale vznikají jako důsledek jiného základního onemocnění. o genetické poruchy funkce B-buněk o genetické poruchy účinku inzulínu o onemocnění exokrinního pankreatu o endokrinopatie o pankreatická dysfunkce způsobená drogami nebo chemikáliemi o infekční choroby o méně časté formy imunitně zprostředkovaného diabetu o jiné genetické syndromy, které mohou být přidružené s diabetes mellitus Gestační diabetes mellitus - se vyznačuje manifestací v těhotenství. U většiny žen dochází ke vzniku relativního nedostatku inzulínu až během druhé poloviny těhotenství, tento stav následně vede k hyperglykémii. U většiny pacientek se tento stav samovolně upraví po porodu, ale je nutné brát ho jako rizikový faktor vzniku diabetes mellitus 2. typu v pozdějším životě (Mayfield 1998) Diabetes mellitus 1. typu Je charakterizován absolutním deficitem inzulínu, jenž je způsoben destrukcí B- buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu. Pacienti s tímto typem diabetu jsou závislí na každodenním externím přívodu inzulínu. Obvykle se vyskytuje v raném věku a dospívání, před dosažením 25 roku života, z toho důvodu nesl dříve označení juvenilní. Incidence je u obou pohlaví stejná (American Diabetes Association 2004, Mayfield 1998). DM 1. typu se vyznačuje akutním vznikem a rozvojem v průběhu několika dnů až týdnů a je doprovázen intenzivními subjektivními potížemi, kterým dominuje zejména polydipsie, polyurie, hubnutí, únava a někdy i polyfagie a zastřené vidění (American Diabetes Association 2004, Mayfield 1998). Pacienti s tímto typem diabetu mají sklon ke vzniku ketoacidózy (Racek a kol. 2006). 21

29 Zvláštním typem diabetu 1. typu je Latentní autoimunitní diabetes dospělých (LADA). Tento typ diabetu je obtížně diagnostikovatelný, rozvíjí se až v dospělosti, obvykle mezi 30 až 40 rokem života, nejčastěji u neobézních pacientů. Nejdříve vykazuje podobnou manifestaci jako DM 2. typu a postupně dochází k rozvoji inzulínové dependence a rozvoji DM 1. typu s autoimunitním podkladem. Asi 20 % pacientů s diagnózou diabetes mellitus 2. typu může mít LADA (Brahmkshatriya a kol. 2012). Patogeneze DM 1. typu Příčinou vzniku autoimunitního DM 1. typu jsou pravděpodobně autoimunitní děje, často způsobené virovou infekcí či chemickou modifikací B-buněk pankreatu, které následně vedou k destrukci těchto buněk. Na poškození se bezpochyby podílejí i volné radikály, konkrétně reaktivní formy kyslíku (Mayfield 1998, Racek a kol. 2006). Jedná se o primární poškození, tělo není schopno produkovat dostatečné dávky inzulínu (American Diabetes Association 2004). Většina pacientů s touto formou diabetu často trpí i jiným autoimunitním onemocněním, jako je např. Hashimotova či Addisonova nemoc, vitiligo nebo perniciózní anémie (Mayfield 1998). U idiopatické formy DM 1. typu stále neznáme její vyvolávající příčinu Diabetes mellitus 2. typu Je nejrozšířenějším typem DM v naší populaci, postihuje až 90 % diabetiků, obvykle jedince po 40. roce života, incidence s přibývajícím věkem výrazně stoupá. Na jeho vzniku se vedle genetické předispozice podílí i faktory zevního prostředí, jako jsou věk, obezita, nedostatek pohybu, hektický životní styl a stres. Většina pacientů trpících DM 2. typu je obézních. Tento typ diabetu je častější u žen, zejména pokud byl u nich diagnostikován gestační diabetes během těhotenství (American Diabetes Association 2004, Brahmkshatriya a kol. 2012, Mayfield 1998). Rozvoj DM 2. typu je na rozdíl od DM 1. typu pozvolný a nenápadný, někdy je odhalen až s rozvojem diabetických komplikací. Tento typ DM nemá na rozdíl od DM 1. 22

30 typu sklon ke ketoacidóze a subjektivní potíže pacienta bývají obvykle jen velmi mírné (American Diabetes Association 2004). Patogeneze DM 2. typu DM 2. typu je onemocnění podmíněné relativním nedostatkem inzulínu, kdy je jeho podstatou oslabená schopnost B-buněk produkovat inzulín nebo může být zhoršeno působení inzulínu v cílových tkáních (tzv. inzulínová rezistence, viz kapitola ), zejména v játrech, svalové a tukové tkáni. V patogenezi se mohou uplatňovat obě výše zmíněné příčiny, přičemž v mnoha případech nalézáme jejich současné působení. Rezistence k inzulínu je způsobena buď snížením počtu receptorů nebo postrecepční blokádou. Organismus se po jídle hůře vyrovnává s udržením žádoucí glykémie, která zůstává déle zvýšená. Nadváha je jednou ze stěžejních příčin inzulinové rezistence tkání, tudíž primárním krokem léčby u diabetiků 2. typu je redukce hmotnosti a poučení pacienta o správných dietních návycích (American Diabetes Association 2004, Mayfield 1998, Perušičová a kol. 1996, Racek a kol. 2006). Familiární výskyt DM 2. typu má vysoké zastoupení, pravděpodobně je podmíněn dědičností polygenního typu. V některých případech byly objasněny mutace konkrétního genu, a to např. genu pro inzulín, pro glukokinázu, inzulínový receptor a jiné (Racek a kol. 2006) Diagnostika, komplikace a léčba diabetes mellitus Diagnostika diabetu je založena na průkazu hyperglykémie za stanovených podmínek. Měří se hladina glykémie ve venózní plazmě standardními metodami. Diagnostická kritéria pro DM se v průběhu historie výrazně měnila. V dnešní době je dle Doporučeného diagnostického a léčebného postupu pro všeobecné praktické lékaře (Karen a kol. 2009) diagnóza DM určována třemi způsoby: 1) v přítomnosti klasických příznaků diabetu + naměřená náhodná glykémie 11,1 mmol.l -1, 2) naměřená glykémie nalačno 7,0 mmol.l -1, 3) glykémie ve 120. minutě orálního glukózového tolerančního testu (ogtt, 23

31 požití 75 g glukózy) 11,1 mmol.l -1. Pokud jsou přítomny nejasnosti v klinickém obrazu, tak k diferenciální diagnóze mezi 1. a 2. typem diabetu lze využít stanovení C-peptidu jako ukazatele endogenní sekrece inzulinu (Karen a kol. 2009). V současné době je diagnostikována pouze polovina lidí, kteří trpí diabetes mellitus. Screening pro včasné odhalení diabetes mellitus u nerizikových pacientů by měl začít ve 45 letech a každé 3 roky by se měl opakovat. U pacientů vykazujících rizikové faktory, jako jsou obezita, diagnostikovaný DM u nejbližších příbuzných, hypertenze, hypertriglyceridémie nebo předchozí potvrzení poruchy glukózové homeostázy, by se mělo se screeningem začít dříve a měl by se opakovat častěji (Mayfield 1998). Diabates mellitus mohou provázet komplikace, které jsou pro něho typické. Tyto komplikace můžeme dělit na akutní a chronické (tzv. pozdní komplikace). Mezi akutní diabetické komplikace řadíme hypoglykémii a hypoglykemické kóma, hlavními příčinami jejich vzniku je omylem aplikovaná vyšší dávka inzulínu či vynechání jídla. Další akutní život ohrožující komplikací je naopak hyperglykémie a hyperglykemické kóma s diabetickou ketoacidózou, postihující především pacienty s DM 2. typu v pokročilejším věku. Chronickými komplikacemi jsou diabetická mikroangiopatie (retinopatie s možnou ztrátou zraku, nefropatie vedoucí k selhání ledvin, periferní neuropatie s možným výskytem vředů na nohou a rizikem následné amputace) a diabetická makroangiopatie (ischemická choroba srdeční, cévní mozková příhoda, diabetická noha). Dalšími často se vyskytujícími komplikacemi u diabetických pacientů jsou arteriální hypertenze, abnormality v metabolismu lipoproteinů, předčasný rozvoj aterosklerózy se všemi jejími orgánovými projevy (American Diabetes Association 2004, Perušičová a kol. 1996, Racek a kol. 2006). Kromě výše popsaných mohou být diabetici, zejména vyššího věku, postiženi depresemi, kognitivními poruchami, svalovou slabostí (sarkopenií), pády a následnými zlomeninami či fyzickou slabosti. Tyto potíže by měly být do budoucna klasifikovány jako třetí kategorie diabetických komplikací u starších pacientů s diabetem. Po dlouhou dobu byly tyto projevy v souvislosti s diabetem podceňovány (Kim a kol. 2012). Léčba každého pacienta by měla být nastavena individuálně, zejména s přihlédnutím k jiným současně se vyskytujícím onemocněním, přítomnosti komplikací, 24

32 typu a závažnosti diabetu a v neposlední řadě i délce života jednotlivých pacientů. Je třeba věnovat zvláštní pozornost nepříznivým účinkům léčby, zvláště hypoglykémii (Kim a kol. 2012). Hlavním cílem léčby je dlouhodobé dosažení normoglykémie nebo alespoň její co největší přiblížení. Kromě farmakologické léčby je nedílnou součástí vhodně zvolená dieta a fyzická aktivita s ohledem na věk, hmotnost a celkový stav pacienta. Pacienti s DM 1. typu potřebují od začátku léčbu externě dodávaným inzulínem, jeho aplikace je nutná minimálně třikrát denně před hlavními jídly, a to v podobě krátkodobě působícího inzulínu, a jednou nebo dvěma dávkami dlouhodobě působícího inzulínu, to alespoň částečně napodobuje fyziologickou sekreci inzulínu (tzv. prandiální a bazální). Nezbytnou součástí léčby diabetu 1. typu je selfmonitoring glykémií, kterou provádí sám pacient a to buď formou glykemického profilu nebo cíleně pomocí jednotlivých glykémií. V léčbě DM 2. typu se používají perorální antidiabetika (např. metformin, glimepirid, gliklazid, repaglinid), která se často kombinují. Pacienti docházejí na měření kontrolní glykémie po 3 až 6 měsících (Karen a kol. 2009). Zejména u diabetiků 2. typu má obrovský význam v terapii úprava životního stylu v podobě dostatečné fyzické zátěže a správné diety, která má snížený obsah sacharidů. Redukce tělesné hmotnosti zvyšuje citlivost tkání k působení inzulínu Inzulín Inzulín je hormon syntetizovaný zejména v B-buňkách Langerhansových ostrůvků pankreatu, a to ve formě tzv. proinzulínu, který je prekurzorem inzulínu a je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem, jehož konce jsou spojeny dvěma disulfidovými můstky (Arvan a kol. 2012, Ward a Lawrence 2011). Odhaduje se, že biosyntéza inzulínu tvoří přibližně 0,4 % veškeré produkce bílkovin pankreatem a to i přesto, že Langerhansovy ostrůvky tvoří pouze 1 až 2 % z celkové hmotnosti pankreatu. Před vlastní sekrecí je proinzulín proteolyticky štěpen na dvě části, vlastní molekulu inzulínu a tzv. C-peptid (Arvan a kol. 2012). Hladina C-peptidu v periferní krvi vypovídá o míře sekrece endogenního inzulínu, v externě dodávaném inzulínu totiž přítomen není (Racek a kol. 2006). Vlastní molekula inzulínu se skládá ze dvou polypeptidových řetězců spojených dvěma disulfidovými 25

33 můstky. První řetězec (označovaný jako řetězec A) obsahuje 21 aminokyselinových zbytků, druhý řetězec (řetězec B) obsahuje 30 aminokyselinových zbytků (Ward a Lawrence 2011). Obr. 12. Struktura proinzulínu Chain A (řetězec A), chain B (řetězec B) a connecting peptid (C-peptide), který je proteolyticky odštěpen, čímž vznikne vlastní molekula inzulínu tvořena pouze řetězcem A a B spojenými dvěma disulfidickými můstky. Převzato z: web Campbell.edu (< Sekrece inzulínu z B-buněk pankreatu je efektivně regulována v závislosti na akutních změnách v metabolismu a současné poptávce organismu (Arvan a kol. 2012). Sekrece probíhá ve dvou fázích, a to ve fázi časné a pozdní. Časnou fází máme na mysli bezprostřední uvolnění inzulínu ze sekrečních granul, které nastává do několika minut po sekrečním stimulu. Potom dochází k jejímu poklesu s pozvolným nástupem druhé, tzv. pozdní fáze sekrece (Perušičová a kol. 1996). 26

34 Funkce inzulínu Inzulín je anabolický centrální regulátor metabolické homeostázy (Arvan a kol. 2012). V cílových tkáních účinkuje prostřednictvím specifických membránových receptorů IRS. Vazba inzulínu na receptory je velmi dynamická, v průběhu dne se stále mění, a to zejména v závislosti na koncentraci inzulínu v séru. Po jídle (tedy při zvýšené koncentraci inzulínu) vazba výrazně klesá. Po navázání inzulínu na receptor dojde k produkci cyklického AMP (Perušičová a kol. 1996, Racek a kol. 2006), což v důsledku způsobí zejména zvýšené vychytávání glukózy buňkami, které jsou na inzulínu závislé a glukózu využívají jako zdroj energie, zejména se jedná o buňky ve svalech a tukové tkáni (Saltiel a Kahn 2001). Výjimku tvoří buňky centrálního nervového systému a erytrocyty, které nejsou závislé na přítomnosti inzulínu, glukóza do nich proniká i bez jeho přítomnosti (Racek a kol. 2006). Inzulín podporuje ukládání tuku v adipocytech prostřednictvím specifických receptorů pro inzulín, které jsou lokalizované na membráně adipocytu a tím je umožněno realizovat metabolické účinky hormonu přímo v buňce. Aktivace substrátu inzulínového receptoru IRS a následně i aktivace signalizační kaskády zprostředkované fosfatidylinositol-3-kinasou (PI-3-K) vedou k translokaci glukózových transportérů GLUT4, a to umožní vychytávání glukózy adipocytem a její utilizaci glykolýzou (viz Obr. 13.). Tímto procesem se inzulín podílí i na tvorbě intermediárního produktu glycerol-3-fosfátu a aktivací jeho acyltransferasy se zvýší syntéza TAG. Aktivace lipoproteinové lipázy (LPL), která podmiňuje uvolnění volných MK z TAG chylomikronů usnadňuje jejich transport do adipocytů, kam se dostávají prostou difúzí nebo prostřednictvím transportních proteinů pro MK FATP (fatty acid transport proteins) a FABP (fatty acid binding proteins). Vazba FATP a FABP s koenzymem A katalyzovaná acyl-coa-syntázou a následná esterifikace s glycerolem vytváří TAG (Škrha a kol. 2009). Výsledkem působení inzulínu je dále inhibice jaterní produkce glukózy (glukoneogeneze, glykogenolýza), inhibice degradace bílkovin a lipolýzy v tukové tkáni. Naopak podporuje ukládání substrátů v tuku, játrech a svalech, a to stimulací lipogeneze, syntézy glykogenu a proteinů. Má tedy hypoglykemizující efekt a zásadní vliv na proces regulace koncentrace glukózy v krvi. Inzulín ovlivňuje i některé další pochody, stimuluje 27

35 růst buněk a jejich diferenciaci, dále má vliv na vstup aminokyselin, draslíku a fosfátů do buněk a také ovlivňuje expresi genů (Charvát a kol. 2001, Saltiel a Kahn 2001). Obr. 13. Mechanismus ovlivnění příjmu glukózy do buněk inzulínem IR (inzulínový receptor), IRS-1/2 (substráty inzulínového receptoru), PI3-K (fosfatidylinositol-3-kinasa), PKB (proteinkinasa B), GLUT4 (na inzulínu závislý přenašeč glukosy GLUT4). Navázání inzulínu na IR aktivuje PI3-K, prostřednictvím které dojde i k aktivaci PKB, která způsobí translokaci vesikul s GLUT4 a tím umožní fúzi glukózy plazmatickou membránou. Převzato z: Eriksson, J. W. Metabolic stress in insulin s target cells leads to ROS accumulation A hypothetical common pathway causing insulin resistence. FEBS Letters. 2007;581(19): Nedostatečná hladina inzulínu vede k hyperglykémii a rozpadu tkáňových bílkovin a tuků. Proto má diabetik s nedostatečnou hladinou inzulínu tendenci k hubnutí. Pokud je překročen renální práh pro glukózu, dochází ke glykosurii. Buňky však současně trpí nedostatkem glukózy a energii si musí zajistit z mastných kyselin, tento proces má za následek zvýšenou produkci ketolátek, tudíž kromě glykosurie je přítomna i ketonurie. Hyperglykémie, glykosurie a ketonurie patří mezi elementární laboratorní ukazatele neléčeného diabetu (Racek a kol. 2006). 28

36 2. 3. Metabolismus lipidů u obézních pacientů s diabetes mellitus Diabetes mellitus a obezita Obezita je chronické multifaktoriálně podmíněné onemocnění charakterizované zmnožením tukové tkáně v důsledku pozitivní energetické bilance. Patří mezi nejčastější metabolická onemocnění v rozvinutých zemích (Charvát a kol. 2001). Spolu s nárůstem tělesné hmotnosti stoupají i zdravotní rizika (zejména kardiovaskulární, metabolické a respirační komplikace, hyperurikémie aj.). Obezita je jedním z nejvýznamnějších rizikových faktorů podílejících se na vzniku DM 2. typu. Sama o sobě je faktorem způsobujícím hyperinzulinémii a inzulínovou rezistenci (Perušičová a kol. 1996). Energetická rovnováha a homeostáza glukózy se fyziologicky udržuje pomocí klíčových metabolických hormonů inzulínu a leptinu, jejichž působení je vzájemně propojeno (Yang a kol. 2012). Avšak při obezitě dojde k metabolickým změnám a rovnováha je porušena. Stále větší počet důkazů ukazuje, že obezita může být sama o sobě zánětlivé onemocnění. Osoby s DM 2. typu, metabolickým syndromem nebo obezitou vykazují výraznější a déletrvající zánětlivé reakce než osoby s fyziologickým metabolickým stavem. Chronický zánět může být tedy primárním iniciátorem DM 2. typu a aterosklerózy (Teelucksingh a kol. 2012). Bylo prokázáno, že nezáleží pouze na stupni obezity (velikosti body mass indexu - BMI), ale zejména na distribuci tuku v těle (Eckel a kol. 2011). U pacientů s DM 2. typu se setkáváme především s obezitou vyznačující se abdominálním uložením tuku. Tento typ obezity je spojován s metabolickým syndromem, pro který je charakteristická řada rizikových faktorů, jako je inzulínová rezistence, hyperinzulinemie, zvýšená hladina triacylglycerolů, snížení HDL cholesterolu aj. U obézních pacientů byla popsána pozitivní korelace se stupněm oxidace LDL cholesterolu, důsledkem je zvýšené riziko vzniku a rozvoje aterosklerózy. Zvýšené riziko kardiovaskulárních onemocnění vykazují jedinci s BMI 25 kg.m -2, vysoké riziko platí pro jedince s BMI 30 kg.m -2 (Charvát a kol. 2001). Kromě rozdílů v distribuci tělesného tuku, nacházíme i důkazy, které vypovídají o tom, že různé podtypy tukové tkáně mohou být funkčně odlišné a ovlivňovat homeostázu 29

37 glukózy diferencovaně. Tuková tkáň je složená z heterogenních buněčných typů a např. buňky imunitního systému pravděpodobně také mají vliv na systémové metabolické procesy (Eckel a kol. 2011) Inzulínová rezistence Inzulínová rezistence (IR) by se dala charakterizovat jako stav, kdy obvyklé množství inzulínu nezajistí adekvátní využití glukózy a dojde tak ke vzniku relativní hyperglykémie (Perušičová a kol. 1996). Cílové tkáně (játra, svaly a tuková tkáň) vykazují sníženou citlivost k působení inzulínu. K udržení glykémie na normální hladině je nutná vyšší hladina inzulínu v krvi (hyperinzulinémie). Je pozoruhodné, že mnoho jedinců s rozvinutou inzulínovou rezistencí se nestane diabetiky, protože jejich B-buňky jsou schopny vyrovnat se se zvýšenou potřebou inzulínu. Ve skutečnosti se pouze u jedné třetiny inzulín rezistentních obézních jedinců rozvine diabetes mellitus 2 typu (Barbarroja a kol. 2012). Bylo zjištěno, že obézní jedinci s normoglykémií mají zvýšenou aktivitu a hmotnost pankreatických B-buněk (Eckel a kol. 2011). Významnou úlohu v tomto mechanismu sehrává omezený efekt inzulínu v tukové tkáni, kde nedochází ke kompletnímu zablokování lipolýzy. Nejdůležitějším faktorem, který vede ke snížené oxidaci glukózy, je zvýšené uvolňování mastných kyselin (tzv. Randleův cyklus). Účinek inzulínu je nedostačující též v játrech, kde dochází ke zvýšené glykogenolýze a glukoneogenezi a tím zvýšené produkci glukózy, což podmiňuje hyperglykémii nalačno. Snížená citlivost na inzulín je u obézních diabetiků prokazatelná i ve svalové tkáni (Perušičová a kol. 1996). IR jen nadále stimuluje B-buňky k vyšší sekreci inzulínu, což má za následek hyperinzulinémii (Perušičová a kol. 1996). Můžeme tedy říct, že mezi inzulínovou rezistencí a inzulínovou sekrecí je vztah dynamické interakce. Pokud potřeba inzulínu přesáhne určitou hranici, dojde k vyčerpání B-buněk, tím k poklesu sekrece inzulínu a může se rozvinout až porucha glukózové tolerance a následně DM 2. typu. (Charvát a kol. 2001). Nejméně tři různé mechanismy pojí obezitu s IR a předurčují k diabetu 2. typu: 1) zvýšená produkce adipokinů/cytokinů, včetně TNF alfa, resistinu a retinol-binding proteinu 30

38 4, které přispívají k inzulínové rezistenci, stejně jako snížení hladiny adiponektinu, 2) ektopické ukládání tuku, zejména v játrech (možná též v kosterních svalech) a z toho plynoucí metabolické následky, 3) mitochondriální dysfunkce, která by mohla být jedním z mnoha důležitých základních defektů propojujících obezitu s DM, a to jak snížením citlivosti k inzulínu, tak defektem funkce B-buněk. Mezi další faktory, které pojí obezitu a DM 2. typu patří pozměněný metabolismus MK a změny funkce endoplazmatického retikula (Eckel a kol. 2011). Příčiny inzulínové rezistence nejsou zcela zřejmé, avšak kromě genetické predispozice, nacházíme postupné zhoršování citlivosti k inzulínu s věkem, obezitou, při nedostatečné fyzické aktivitě a také může být následkem špatné kompenzace diabetu (Yang a kol. 2012) Metabolický syndrom Byl to Reaven, kdo v roce 1988 představil poprvé koncept metabolického syndromu (MS), (Teixeira a kol. 2012). Pohlíželo se na něho jako na soubor rizikových faktorů, které mezi sebou často vzájemně souvisely, vyskytovaly se společně a ve svém důsledku vedly předčasně k rozvoji DM 2. typu, aterosklerózy a následně kardiovaskulárním onemocněním (El-Koofy a kol. 2012). Avšak za posledních let došlo v této problematice k významné změně pohledu, v dnešní době jsou jednotlivé symptomy sjednoceny do jednoho syndromu, který souhrně nazýváme metabolický syndrom a jsou posuzovány kompletně. Výskyt MS má ve světě narůstající frekvenci (Golbidi a kol. 2012). Pro označení MS existuje mnoho synonym, jako příklad uvedu Reavenův syndrom, syndrom X, syndrom inzulínové rezistence aj. Rozvoj metabolického syndromu je ovlivněn jak genetickou predispozicí, tak zevními faktory, zejména nevhodným životním stylem. Hlavní patofyziologickou úlohu všech částí tohoto syndromu má oxidační stres, jenž je definován jako nerovnováha mezi vznikem a inaktivací reaktivních kyslíkových radikálů. Důsledkem oxidačního stresu jsou následné záněty, v tukové tkáni se hromadí makrofágy, které vylučují řadu zánětlivých cytokinů (TNF α, IL-1 a IL-6), jež vyvolají inzulínovou rezistenci, která pravděpodobně spojuje všechny symptomy tohoto onemocnění (Golbidi a kol. 2012, Chu a kol. 2012, Barbarroja a kol. 2012). 31

39 Kromě hyperglykémie a/nebo hyperinzulinémie nacházíme u pacientů s MS i vážnou dysregulaci v metabolismu lipidů, jež se projevuje zejména zvýšenými hladinami cirkulujících volných mastných kyselin a triglyceridů (Golbidi a kol. 2012). MS je spojován i s vaskulární endoteliální dysfunkcí, představuje kombinaci synergických vaskulárních patologických stavů, které vedou k progresi aterogenního stavu, ta pak zhoršuje schopnost pacienta uspokojivě reagovat na humorální, buněčnou i mechanickou námahu (Rentoukas a kol. 2012). Diagnostická kritéria pro MS byla stanovena různými organizacemi, liší se od sebe většinou jen nepatrnými rozdíly. Přehled definicí MS podle organizací nejčastěji používaných k jeho diagnostice je uveden v Tab

40 Tab. 3. Definice metabolického syndromu Kritéria WHO NCEP ATP III IDF přítomnost min 1 z: DM, přítomnost 3 přítomnost centrální IR, porucha gluk. tolerance, z následujících příznaků: obezity: obvod pasu 94 porucha glukózy nalačno cm (M) a 80 cm (Ž) + 2 z následujících + 2 z následujících příznaků: příznaků: Hypertenze TK 140/90 mmhg TK 130/85 mmhg TK 130/85 mmhg Dyslipidémie TAG 1,695 mmol.l -1 TAG 1,7 mmol -1 TAG 1,7 mmol.l -1 HDL 0,9 mmol.l -1 (M) HDL 1,0 mmol.l -1 (M) HDL < 1,03 mmol.l -1 (M) HDL 1,0 mmol.l -1 (Ž) HDL 1,3 mmol.l -1 (Ž) HDL < 1,29 mmol.l -1 (Ž) Centrální pas/boky > 0,90 (M) obvod pasu: obezita pas/boky > 0,85 (Ž) > 102 cm (M) nebo BMI > 30 kg.m -2 > 88 cm (Ž) Mikro- v moči 20 µg.min -1 albuminurie alb/krea 30 mg.g -1 Glykémie Glykémie > 6,0 mmol.l -1 Glykémie > 5,6 mmol.l -1 nebo diagnóza DM v minulosti WHO World Health Organisation, NCEP National Cholesterol Education Programe, IDF International Diabetes Federation. Tabulka shrnuje diagnostická kritéria výše uvedených organizací. DM diabetes mellitus, IR inzulínová rezistence, TK krevní tlak, TAG triglyceridy, HDL lipoproteiny o vysoké hustotě, BMI body mass index, alb/krea poměr albumin/ kreatinin. M muži, Ž ženy. Převzato z: web International diabetes Federation, web American diabetes association 33

41 Diabetes mellitus a poruchy metabolismu lipidů Onemocnění diabetes mellitus je často provázeno změnami v parametrech krevních lipidů, typická je zejména přítomnost hypertriacylglycerolémie. Pravidelné monitorování hladin jednotlivých lipidů a léčba dyslipidémie je proto nedílnou součástí terapie diabetu (Škrha a kol. 2009). Na prvním místě však zůstává snaha o kompenzaci diabetu, nikoli o farmakoterapii dyslipidémie, protože ta často bývá jen projevem dekompenzace diabetu (Perušičová a Anděl 2000). Pro některé lipidové parametry, konkrétně pro celkový cholesterol, HDL-C, LDL-C a TAG, jsou stanoveny hraniční hodnoty, které se monitorují zejména v souvislosti se snížením rizika vzniku negativních změn cévních stěn (Škrha a kol. 2009). U úspěšně kompenzovaného diabetika 1. typu, který má dostatečný přísun inzulínu, nemusíme nacházet žádné dyslipidémie, čímž se významně odlišuje od diabetika 2. typu. Avšak v případě, že diabetik 1. typu není dobře kompenzovaný, dochází v lipidovém profilu k zásadním změnám. Nacházíme zvýšené VLDL-TAG, VLDL-C, LDL-C, TAG, tch a naopak snížený HDL-C (Perušičová a Anděl 2000). Při onemocnění DM nacházíme zvýšené hladiny antagonistů inzulínu a naopak snížené hladiny inzulínu nebo přítomnost periferní inzulínové rezistence. U neléčeného pacienta s DM 1. typu je lipolytický efekt až desetkrát vyšší než u zdravého jedince. Zvýšená lipolýza způsobí nárůst koncentrací volných MK v plazmě. Nedostatek inzulínu má za následek zvýšenou lipolýzu tukové tkáně, ale také zvýšenou oxidaci MK v játrech a sníženou utilizaci ketolátek ve svalstvu. Následkem těchto mechanismů je rozvoj hyperketonemie. Při nedostatku inzulínu je snížena lipogeneze v tkáních senzitivních k inzulínu, avšak lipogeneze ve střevě probíhá i přes nedostatek inzulínu, není citlivá k jeho účinku. Lipogeneze ve střevě závisí na dodávce substrátů, která je při DM vysoká a tím pádem dochází i ke zvýšení syntézy TAG a MK (Brathena 1999). Cirkulující volné MK hrají významnou roli v prevenci rozvoje ketózy z hladovění do patologické ketoacidózy. Principem tohoto procesu je fakt, že pomáhají udržovat bazální rychlost sekrece inzulínu, který má za úkol inhibovat lipolýzu v tkáních. K narušení tohoto mechanismu zpětné vazby dochází u pacientů s DM 1. typu, kdy je výsledným efektem nadměrná lipolýza, hladina 34

42 volných MK se dramaticky zvyšuje a jaterní produkce ketolátek je neřízená (McGarry 2002). Mastné kyseliny, jsou za určitých okolností nejdůležitějším zdrojem energie pro tkáně. Snadněji dochází k oxidaci nenasycených MK než nasycených MK, které se proto ve větší míře ukládají do tukové tkáně. Ve svalové tkáni je oxidace MK s dlouhým řetězcem ovlivňována hladinou glukózy a inzulínu cestou regulace vstupu do mitochondrie, kdežto oxidace MK se středně dlouhým řetězcem na jejich přítomnosti závislá není. U pacientů s DM, je s nízkou hladinou inzulínu snížena aktivita pyruvátdehydrogenázového komplexu, to má za následek nižší míru oxidace glukózy. Ke kompenzaci tohoto stavu dochází zvýšenou oxidací MK, jež je zapříčiněna zvýšenou aktivitou 3-hydroxyacyl-CoA degydrogenasy v játrech (Brathena 1999). Jednou z úloh inzulinu je regulace syntézy VLDL v játrech, konkrétně jeho účinkem dochází ke zvýšené degradaci apo-b v cytosolu. Inzulín také snižuje syntézu microsomal triglyceride transfer proteinu, jehož úkolem je mikrosomální transfer TAG. V důsledku inzulínové rezistence dochází u diabetiků 2. typu k poklesu lipoproteinové lipázy (LPL) v periferních tkáních, to vede k poklesu hydrolýzy TAG jak ve VLDL, tak v chylomikronech, též je snížená clearance VLDL a chylomiker. To je důvodem proč často nacházíme spolu se zvýšenými hladinami TAG rovněž zvýšené hladiny VLDL částic (viz Obr. 14.). Spolu s tímto procesem stoupá endogenní lipáza v tukové tkáni, důsledkem toho je zvýšená nabídka MK pro hepatocyt, což zapříčiní zvýšenou syntézu VLDL, resp. TAG, jež jsou majoritní lipidovou složkou VLDL částic (Perušičová a Anděl 2000). U diabetiků 1. typu vedou snížené hladiny inzulínu k poklesu lipoproteinové lipázy, a to stejným mechanismem jako bylo popsáno výše u diabetiků 2. typu. Zároveň dochází ke vzestupu endogenní lipázy v tukové tkáni. Důsledkem toho je zvýšení přísunu volných MK do jater a vzestup syntézy VLDL. Také dochází ke glykaci a peroxidaci lipoproteinů (Perušičová a Anděl 2000). 35

43 Obr. 14. Vliv inzulínové rezistence na metabolismus lipidů FFA release from adipocytes (volné mastné kyseliny uvolněné z adipocytů), TG-rich VLDL (lipoproteiny o velmi nízké hustotě bohaté na triglyceridy), LPL activity (aktivita lipoproteinové lipasy), CETP (cholesterylester transfer protein), small dense LDL (malé denzní částice lipoproteinů o nízké hustotě) a increased atherogenity (zvýšená aterogenita). Převzato z: Stephen, N. D. Diabetic Dyslipidemia and Atherosclerosis. Clinical Cornerstone. 2008;9(2): Necholesterolové steroly cirkulující v lidském séru byly shledány jako spolehlivé markery metabolismu cholesterolu, které vypovídají jak o absorpci, tak o syntéze cholesterolu. Bylo prokázáno, že je syntéza cholesterolu pozitivně spjata se syntézou sterolových intermediátů (lathosterolu) a negativně se steroly souvisejícími s absorpcí (βsitosterolem a kampesterolem), (Miettinen a kol převzato z Shay a kol. 2009). Kromě spojení s metabolismem cholesterolu je známo, že rostlinné steroly soutěží s 36

44 biliárním cholesterolem a cholesterolem z diety ve střevní absorpci, která má vliv na snížení koncentrace cholesterolu v séru (Patch a kol. 2006). Dosavadní údaje naznačují, že DM 1. typu může souviset se sníženou syntézou cholesterolu a zvýšenou absorpcí cholesterolu a rostlinných sterolů (Gylling a kol. 2004, Miettinen a kol převzato z Shay a kol. 2009), a dle dalších nálezů se zdá, že u diabetiků 2. typu je to přesně naopak (Yoshida a kol převzato z Shay a kol. 2009). Simonen a kol. (2002a) předpokládá, že obezita u diabetiků 2. typu ovlivňuje syntézu a absorpci cholesterolu, a to zvýšením syntézy a snížením absorpce, což se shoduje s předešlou hypotézou. Snížení příjmu v potravě snižuje syntézu cholesterolu a zvyšuje absorpci rostlinných sterolů (Simonen a kol. 2002b - převzato z Šmahelová a kol. 2005). Podle Miettinen et al. ( převzato z Shay a kol. 2009) a Kuksis ( převzato z Šmahelová a kol. 2005), je možné stanovit endogenní syntézu cholesterolu na základě měření koncentrace jeho prekurzorů, a to za předpokladu, že jsou prekurzory cholesterolu přítomny v plazmatických lipoproteinech úměrně k jejich tvorbě v průběhu syntézy cholesterolu. Kempen a kol. (1988) využívá pro sledování celkové tělesné syntézy cholesterolu poměru lathosterol/cholesterol. Podle nedávné studie, snížená a dokonce i normální hladina celkového cholesterolu u pacientů s metabolickým syndromem, zahrnující zejména diabetiky 2. typu, má významný vliv na délku jejich života (Sever a kol převzato z Šmahelová a kol. 2005). V podstatě, normální hladiny cholesterolu u diabetických pacientů s MS naznačují, že jsou pravděpodobně přítomny změny v endogenní syntéze cholesterolu nebo je porušena absorpce cholesterolu z potravy (Šmahelová a kol. 2005). Studie dle Šmahelové a kol. (2005) se zabývala stanovením lipidových parametrů a jejich porovnáním mezi dvěma skupinami osob, a to pacienty s diabetes mellitus 2. typu a pacienty bez diabetu. Byly nalezeny signifikantní rozdíly v některých parametrech, u diabetiků byly významně vyšší hladiny TAG (průměrná hodnota 2,28 mmol.l -1 v porovnání s 1,60 mmol.l -1 u nediabetických pacientů) a lathosterolu (6,97 µmol.l -1 oproti 5,11 µmol.l -1 ) a naopak nižší hladiny sitosterolu (5,03 µmol.l -1 oproti 8,98 µmol.l -1 ) a campesterolu (6,35 µmol.l -1 oproti 9,80 µmol.l -1 ). 37

45 Redukce hmotnosti a její vliv na metabolismus lipidů Jsou-li zásobní schopnosti tukové tkáně saturovány, jako je tomu u obézních pacientů, hypertrofované adipocyty nejsou schopny absorbovat další lipidy a ty se ukládají do jiných tkání, nejčastěji svalové a jaterní. Z hypertrofovaných adipocytů jsou vyplavovány neesterifikované MK do cirkulace. V takovéto situaci se pak klinicky projeví jaterní steatóza, inzulínová rezistence a následně rozvoj diabetu mellitu. Četné patofyziologické mechanismy a produkované mediátory umožní vazbu mezi hypertrofovanou tukovou tkání a vznikem DM 2. typu. Metabolismus v adipocytech a proliferace adipoblastů je významně závislá na obsahu cukrů, tuků (zejména MK) v dietě. Nasycené MK stimulují tukovou tkáň k hyperplazii. Nenasycené MK inhibují vlastní syntézu a na tomto procesu se podílí pravděpodobně transkripční faktor SREBP 1, který je induktorem lipogenních genů. Dále nenasycené MK stimulují oxidaci lipidů ve svalech, játrech a pravděpodobně i bílé tukové tkáni prostřednictvím transkripčního faktoru PPARα. MK ω-3 tak snižují triacylglycerolémii a riziko kardiovaskulárních onemocnění, a to zejména v kombinaci s dietním režimem. V průběhu hladovění dochází také k inhibici lipogeneze (Kopecký a Flachs 2010). Intramuskulární obsah lipidů se s obezitou zvyšuje a naopak klesá během procesu hubnutí. (Goodpaster a kol. 2000) U kosterního svalstva nacházíme při obezitě zvýšenou hladinu TAG, i když v porovnání s jejich obsahem v tukové tkáni, je jejich hladina ještě poměrně malá. Avšak v případě kosterní svaloviny hraje hladina TAG významnou roli v rozvoji inzulínové rezistence, kdy je poškozena schopnost kosterního svalu modulovat vychytávání glukózy v reakci na inzulín. Nárůst TAG může být způsoben buď zvýšeným příjmem MK, nebo sníženou oxidací lipidů (Goodpaster a kol. 2000, Kelley a kol. 1999). Studie dle Kelley a kol. (1999) prokázala, že na svalový metabolismus MK během hladovky má výrazný vliv závažnost inzulínové rezistence a míra obezity. Goodpaster a kol. (1999) zkoumal ve své studii vliv váhového úbytku na distribuci tuku a inzulínovou senzitivitu u obézních jedinců. Po ukončení čtyř měsíčního programu na snížení hmotnosti došlo u sledovaných osob k výraznému poklesu (P < 0,01) sérových hladin TAG, cholesterolu, inzulínu a leptinu. Byl prokázán vztah úbytku hmotnosti a snížení viscerálního tuku na zlepšení inzulínové senzitivity, avšak výsledky naznačují, že 38

46 po překročení určité prahové hodnoty úbytku hmotnosti, není vztah nárůstu citlivosti k inzulínu lineární k probíhajícímu hubnutí (Goodpaster a kol. 1999). Hladovění provázené poklesem hladiny inzulínu zapříčiní mobilizaci volných MK z tukové tkáně, cirkulací se transportují do dalších tkání, kde působí jako vydatný energetický substrát. Volné MK nevyužité při β-oxidaci se podílejí v játrech na tvorbě TAG, které se následně transportují v podobě VLDL částic do tukové tkáně. Volné MK jsou ukazatelem rovnováhy mezi lipolýzou a lipogenezí, které jsou ovlivňovány hormony. Jak je známo, inzulín stimuluje lipogenezi a současně inhibuje lipolýzu, tento jev nastává po požití stravy. Naopak výsledkem hladovění je lipolýza, která nastává v důsledku snížené hladiny inzulínu. Vlivem kontraregulačních hormonů, zejména katecholaminů, dochází při hladovění k aktivaci hormon senzitivní lipázy (HSL), která v prvním kroku odštěpuje jednu MK v molekule TAG. Cestou camp dochází k aktivaci proteinkinázy A, která fosforyluje serinové zbytky v molekule HSL. Takto fosforylovaná HSL se transportuje z cytoplazmy do komplexu s proteinem lipotransinem na kapénkách tuku krytých proteinem perilipinem, což umožní, aby v nich proběhla lipolýza katalyzovaná HSL. Při zvýšených hladinách inzulínu (po požití potravy) dochází k blokaci fosforylace HSL štěpením camp fosfodiesterázou nebo též fosfatázou, ale účinkem lipoproteinové lipázy (LPL) se mohou uvolňovat MK z TAG v chylomikronech, a to zejména v kapilárách tukové tkáně. Vztah HSL a LPL je inverzní. Inzulín stimuluje jak syntézu, tak sekreci LPL a současně tedy inhibuje HSL (Škrha a kol. 2009). Studie dle Purnell a kol. (1999) prokázala, že snížením množství abdominálního tuku redukcí hmotnosti klesala aktivita jaterní lipázy (HL), což má příznivé účinky na metabolismus lipidů. Jelikož snížení aktivity HL ovlivňuje nárůst velikosti LDL částic a zvyšuje HDL-C. Na Obr. 15. je znázorněna regulace syntézy cholesterolu v játrech za podmínek hladovění. Syntéza je za těchto podmínek ovlivněna dvěma mechanismy; potláčováním enzymů syntézy cholesterolu prostřednictvím inhibice transkripčního faktoru SREBP-2 (Horton a kol. 2002, Brown a Goldstein převzato z Shibata a kol. 2006) a indukcí SPF (supernatant protein faktor) zprostředkovanou aktivací jaderných receptorů PPAR- α. 39

47 SPF je protein exprimovaný v játrech a tenkém střevě, jež se podílí na urychlení syntézy cholesterolu (Shibata a kol. 2006). Obr. 15. Regulace syntézy cholesterolu v játrech za podmínek hladovění Fasting (hladovění), PPAR-α (Peroxisome proliferator-activated receptor α), SPF (supernatant protein faktor), SREBP-2 (Sterol-regulatory element-binding protein 2). Převzato z: Shibata a kol Bylo zjištěno, že hladovka způsobuje dramatické snížení (v mrna až o 80%) hladin enzymů uplatňujících se v syntéze cholesterolu (HMG-CoA synthasa, HMG-CoA reductasa a skvalen synthasa aj.). Snížení je pravděpodobně způsobeno v důsledku poklesu SREBP-2 (Horton a kol. 1998, Engelking a kol převzato z Shibata a kol. 2006). Zatímco u jaterní produkce cholesterolu došlo ke snížení enzymů pouze o 50% (Wiss převzato z Shibata a kol. 2006), plazmatické hladiny cholesterolu zůstaly téměř neovlivněné (Horton a kol. 1998, Newberry a kol převzato z Shibata a kol. 2006). Koncentrace HDL-C v plazmě je ovlivňována mnoha faktory, zahrnujícími syntézu apolipoproteinu A-I (apoa-i), ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1), který zprostředkovává sekreci cholesterolu z periferních tkání, další vliv má lipoproteinová lipasa katalyzující lipolýzu chylomikronů a VLDL a jaterní scavenger receptor třídy B typu I (SR- 40

48 BI), který umožňuje vychytávání HDL-C v játrech (Shibata a kol. 2006). Haas a kol. ( převzato z Shibata a kol. 2006) zjistil, že po 48 h hladovění dojde u krys k výraznému zvýšení jaterní a střevní produkce apoa-i. Studie dle Kok a kol. ( převzato z Shibata a kol. 2006) prováděná na myších prokázala během hladovění zvýšení exprese ABCA1 a snížení jaterní SR-BI. Jaterní produkce VLDL má též vliv na plazmatické hladiny HDL-C (Ishikawa a Fidge převzato z Shibata a kol. 2006), což bylo potvrzeno i ve studii dle Shibata a kol. (2006), která odhalila, že během hladovky byla produkce VLDL-C u myší významně snížena, což může mít za následek snížení HDL-C vznikajícího lipolýzou VLDL. Důsledkem hladovky je aktivace AMP-aktivované proteinové kinázy (AMPK), jež ve svém důsledku také vede ke snížení HDL-C. AMPK je hlavní složkou kinázové kaskády a plní funkci jakéhosi metabolického senzoru. Aktivita AMPK je závislá na poměru ATP/AMP v cytoplazmě. V případě náhlého nárůstu hladiny AMP (v důsledku snížení ATP) se kináza aktivuje a přepíná buněčný metabolismus do katabolického režimu (tedy k produkci ATP). AMPK fosforyluje pouze ty proteiny, které obsahují určité aminokyselinové sekvence. U savců AMPK zasahuje do regulačních mechanismů řídících glukosou transport z krve do buněk, glukoneogenezi, lipogenezi, oxidaci MK a lipolýzu v játrech, tukové tkáni, kosterních svalech a dalších tkáních. Bylo zjištěno, že aktivace AMPK v izolovaných hepatocytech vyvolaná buněčným stresem, který je provázen vyčerpáním zásob ATP (např. tepelný šok), vede k inhibici lipogeneze a syntézy sterolů a nárůstu mitochondriální oxidace MK. Aktivovaná AMPK fosforyluje klíčový enzym biosyntézy MK (acetyl-coa-karboxylasu) a tím inhibuje jeho aktivitu. To má za následek snížení hladiny malonyl-coa, který blokuje transport MK do mitochondrií. Zvýšený transport MK do mitochondrií vede k indukci jejich oxidace a k produkci ATP. Aktivace AMP-aktivované proteinové kinázy taktéž inhibuje lipogenezi i nepřímo potlačením exprese transkripčního faktoru SREBP1 (sterol response element-binding protein 1), který reguluje syntézu lipogenních enzymů (Kopecký a Flachs 2010). AMPK má důležitou roli při regulaci lipidového metabolismu i v bílé tukové tkáni, kde podobnými mechanismy blokuje lipogenezu. Je zřejmé, že AMPK kinázová kaskáda má v řízení buněčného metabolismu v závislosti na energetických nárocích organismu 41

49 centrální roli. Detailní poznání této signalizační kaskády by mohlo vést k novým poznatkům v problematice vzniku obezity a metabolického syndromu. Aktivace AMPK také stimuluje leptin k oxidaci MK v kosterním svalu. Účinek metforminu, často užívaného antidiabetika, na metabolismus jater spočívá v inhibici tvorby ATP v mitochondriích a tím zprostředkované aktivaci AMPK. Je velmi pravděpodobné, že AMPK a UCP (mitochondriální odpřahující proteiny) se ve svalech a tukové tkání účastní regulace sacharidového a lipidového metabolismu (Kopecký a Flachs 2010). Hardie (2008) je toho názoru, že by mohly být aktivátory AMPK využívány jako účinné látky pro léčbu obezity, diabetu 2. typu a metabolického syndromu, a to pro schopnost AMPK přepnout buňky z anabolického do katabolického režimu. Obr. 16. Regulace metabolismu glukózy a mastných kyselin řízená AMPK AMPK (AMP-aktivovaná proteinová kináza), heart (srdce), skeletal muscle (kosterní svalovina), adipose tissue (tuková tkáň), liver (játra). Tlusté šipky naznačují stimulaci pomocí aktivované AMPK, tenké šipky přeškrtnuté napříč naopak značí inhibici uvedených procesů. Převzato z: Hardie

50 2.4. Současná metodika stanovení lipidových parametrů V této kapitole jsou uvedeny metody používané ke stanovení mastných kyselin a sterolů. Již několik let je za spolehlivou metodu využívanou ke stanovení MK a sterolů považována plynová chromatografie. Celkový cholesterol, cholesterol v lipoproteinech a triglyceridy jsou stanovovány enzymaticky, a to buď v séru, nebo plazmě, jedná se o metodu prováděnou rutinně v klinické laboratoři Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Nejčastěji používanou metodou pro analýzu mastných kyselin je plynová chromatografie methylesterů MK s plamenově ionizační detekcí. Analýza mastných kyselin probíhá ve dvou hlavních krocích, těmi jsou: příprava methylesterů MK a vlastní analýza methylesterů MK pomocí GC (Santha a Napolitano 1992). Při derivatizaci MK používáme esterifikační činidla, která konvertují volné MK na jejich estery, nebo transesterifikační činidla, ta převádějí acylglyceroly na methylestery MK (viz reakce str. 21, 22). Neexistuje žádná metoda esterifikace, která by byla univerzální a ideální pro každý derivatizační proces. Proto je k získání přesných kvantitativních výsledků vždy nutné derivatizační krok optimalizovat. Při nevhodně provedené derivatizaci může docházet k takovým komplikacím jako je neúplná konverze MK na jejich methylestery, změna původního složení MK či vznik artefaktů, které mohou být následně chybně identifikovány jako MK (Santha a Napolitano 1992). Konvenční techniky pro stanovení složení mastných kyselin v biologickém vzorku pomocí GC vyžadují extrakci do rozpouštědla, čištění, hydrolýzu a derivatizační postupy, které jsou velmi zdlouhavé a těžkopádné. Jako derivatizační činidla se nejčastěji užívají methoxid sodný či hydroxid draselný v methanolu jakožto transesterifikační činidla. Esterifikaci můžeme provádět převedením MK na kvarterní amoniové soli či za využití diazomethanu v přítomnosti methanolu. Fluorid boritý - methanol našel uplatnění jako transesterifikační i esterifikační činidlo. (Lepage a Roy 1986, Santha a Napolitano 1992). 43

51 CH 2 OCO R 1 CH 2 OH CH 3 COCl CH OCO R CH 3 OH CH 3 COO R 1 + CH 3 COO R 2 + CH 3 COO R 3 + CH OH CH 2 OCO R 3 CH 2 OH Obr. 17. Reakce transesterifikační R - uhlovodíkový řetězec mastné kyseliny CH 3 COCl RCOOH + CH 3 OH R COO CH 3 + H 2O Obr. 18. Reakce esterifikační R - uhlovodíkový řetězec mastné kyseliny Většinu přírodních MK úspěšně oddělíme pomocí kapilárních kolon typu WCOT (Wall Coated Open Tubular) vyráběných z taveného křemene, nejčastěji se stacionární fází střední polarity nebo nepolární stacionární fází. Tyto kolony nabízejí vynikající rozlišovací schopnost bez ohledu na typ vzorku. Příkladem polárních stacionárních fází je polyethylenglykol či dimethyl-kyanopropylsilikonové sloučeniny, nejčastěji používanou nepolární stacionární fází je methylsilikon. Speciální aplikace, jako je např. oddělení komplexu směsi cis-trans mastných kyselin, vyžadují zvláštní chromatografické podmínky, např. použití velmi dlouhých kapilárních kolon nebo více polárních stacionárních fází (Santha a Napolitano 1992) Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu Při úpravě vzorku před vlastní analýzou se využívá skutečnosti, že krevní steroly spolu se skvalenem jsou součástí tzv. nesaponifikovatelné frakce séra. Saponifikace séra je prováděna pomocí roztoku hydroxidu draselného v etanolu nebo hydroxidem 44

52 tetramethylamonným (Eckfeldt a kol. 1991). V průběhu saponifikace dochází k hydrolýze triacylglycerolů a fosfolipidů na polární látky (soli mastných kyselin, glycerol a kyselinu fosforečnou). Tím se esterifikované steroly uvolňují z vazby s mastnými kyselinami. Následuje extrakce do nepolárního rozpouštědla, nejčastěji n-hexanu. Vzhledem k polárnímu charakteru hydroxylové skupiny na nepolárním skeletu a vysokému bodu varu je nezbytná derivatizace (Crhová 2001). Separace je prováděna plynovou chromatografií na nepolární kapilární koloně (Crhová 2001). Detekce je možná několika způsoby, a to plameno-ionizačním detektorem nebo hmotnostním spektrometrem, který je pro svou specifitu využíván čím dál tím častěji. Toho využíváme zejména při stanovení lanosterolu a fytosterolu vzhledem k jejich strukturální podobnosti (Eckfeldt a kol. 1991). Skvalen je též součástí nesaponifikované frakce plazmy, i přesto, že je alifatický polynenasycený uhlovodík, který se strukturně liší od sterolů. Vzhledem ke své struktuře je choulostivý k působení hydroxidu, proto je nezbytné dodržovat určenou délku saponifikace. Nesaponifikovanou frakci plazmy je možné oddělit na uhlovodíky a steroly s využitím extrakce na pevnou fázi, v tomto případě na neutrální oxid hlinitý (Eckfeldt a kol. 1991). Metabolismus cholesterolu může být dále posouzen metodou bilance cholesterolu, nebo na bázi izotopů. Tyto metody jsou zlatým standardem měření absorpce a syntézy cholesterolu, avšak pro použití v každodenní klinické praxi jsou drahé a komplikované (Šmahelová a kol. 2005). Bilance cholesterolu je založena na měření množství cholesterolu přijatého potravou a potom vyloučeného stolicí nebo měření žlučových kyselin pomocí plynové chromatografie. Sérové hladiny sitosterolu a kampesterolu korelují s výše popsanými metodami (Kuksis 2001, Miettinen a kol. 1970). 45

53 3. CÍL PRÁCE o Stanovit zastoupení vybraných lipidových parametrů u obézních pacientů s diabetes mellitus 1. a 2. typu, jež podstoupili sedmidenní hladovku a následně dodržovali 21 dní nízkokalorické diety, o získaná data porovnat a vyhodnotit změny, které nastaly v průběhu hladovky a následné diety, o stanovit benefit nastavené redukce hmotnosti na měřené parametry. 46

54 4. METODIKA A MATERIÁL 4.1. Protokol studie Vzorky krevní plazmy pro stanovení lipidů byly získány ve spolupráci s diabetologickým oddělením Kliniky gerontologické a metabolické Fakultní nemocnice Hradec Králové. Od všech pacientů byl získán písemný informovaný souhlas a studie byla schválena místní etickou komisí. Hypotéza studie Obezita znamená pro pacienta s diabetes mellitus výrazné zhoršení jeho zdravotního stavu. V rámci studie, která se zabývala předpokladem snížení inzulínové rezistence u obézních pacientů s DM během redukce jejich hmotnosti, byly stanoveny i lipidy, jimiž se tato diplomová práce zabývá. Režim redukce hmotnosti zahrnoval 7 dní trvající hladovkou s následnou 21 denní nízkokalorickou diabetickou dietou. Soubor pacientů Studie se zúčastnilo 14 obézních pacientů s DM 1. typu a 12 obézních pacientů s DM 2. typu. Podmínkou zařazení pacientů do studie bylo BMI větší než 30 kg.m -2, věk mezi 18 a 70 lety a DM bez výraznějších komorbidit. Kontrolní skupinu tvořilo 13 neobézních pacientů s DM 1. typu (s BMI 22.6±2.1 kg m -2 ) u nichž neproběhla hladovka, ale pouze jeden odběr provedený za standardních podmínek, z něhož byly zjištěny hodnoty inzulínové rezistence a vybraných lipidových parametrů. Hladovka a redukční diabetická dieta Pacienti mohli v průběhu 7 denní hladovky konzumovat pouze vodu či neslazené nápoje. Byli suplementováni draslíkem (40 mmol/den), kyselinou askorbovou (100 mg/den) a komplexem vitaminu B (thiamin 15 mg/den, riboflavin 15 mg/den, pyridoxine 47

55 10 mg/den, niacin 50 mg/den). Pacienti dostávali pouze bazální dávku inzulínu, která se upravovala podle aktuální glykémie. Časové schéma studie: 1. hospitalizace pacientů pro studii dva dny před zahájením hladovky, 2. měření inzulínové rezistence a ostatních parametrů den před zahájením hladovky (odběry na lačno), 3. následuje 7 - denní hladovka, během které mohli pacienti pít pouze vodu nebo jiné neslazené nápoje, 4. po 7 - denní hladovce následovalo druhé měření (odběry po hladovce), 5. dalším krokem bylo 21 dní redukční diabetické diety, při které pacienti přijímali pouze 150 g sacharidů a maximálně 5000 kj, 6. třetí měření bylo provedeno po redukční dietě (odběry měsíc od prvního měření), 7. odběr krve na biochemické parametry (po roce od prvního měření), byly provedeny pouze u pacientů s DM 1 na hladovce. Příprava vzorků k analýze Vzorky byly odebrány do zkumavky s obsahem protisrážlivého činidla EDTA, potom byly po dobu 3 min uchovány na ledu, pak se centrifugovaly při teplotě 4 C o a 2500 rcf. Následně se oddělila plazma a skladovala se při 20 C o. Měřené lipidy: celkové mastné kyseliny chromatografické stanovení necholesterolové steroly (lathosterol, β-sitosterol, kampesterol) a skvalen chromatografické stanovení cholesterol (celkový, LDL-C, HDL-C) a TAG enzymatické stanovení 48

56 4.2. Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Přístroje a pomůcky Automatické pipety μl (Bihohit Proline, Finsko) Labdancer (IKA, Německo) Laboratorní rotátor Stuart SB3 (Biolote, Velká Británie) Termoblok QBT ( Tectra a.s., ČR) Chlazená centrifuga Labofuge 400 R (Heraeus Instruments, Německo) Skleněné pasteurovy pipety 1,5 ml (Kavalier, ČR) Skleněné zkumavky se šroubovacím uzávěrem 12 ml Teflonové zátky Odměrné baňky Vialky s crimpovacími hliníkovými víčky - 11 mm, 1,5 ml (Supelco, USA) Kleště crimpovací 11mm Crimper (Perkin Elmer, USA) Helium 5,5 (Siad, ČR) Vzduch 2,2 a (Siad, ČR) Vodík 4,0 (Siad, ČR) Kapilární kolona Supelco SP TM m x 0,25 mm x 0,2 μm film thickness (Supelco, USA) Plynový chromatograf GC 8000 series (Fisions Instruments, Prago LAB, ČR) Chromatografický software Clarity (Data Apex, USA) Chemikálie Acetylchlorid p.a. (Merck, USA) Metanol p.a. (Penta, ČR) Toluen p.a. (Merck, USA) Uhličitan draselný p.a. (Penta, ČR) Standard F. A. M. E. MIX, C8 - C24 (Sigma, USA) 49

57 Heptadekanová kyselina (C 17), (Sigma, USA) Analytický postup Do označených skleněných zkumavek se šroubovacím uzávěrem bylo napipetováno 3 ml metanolu, 200 μl plazmy, 50 μl heptadekanové kyseliny a 1 ml směsi toluenacetylchlorid (4:1). Zkumavky se vzorky se protřepaly na labdanceru a na 15 min umístily do rotátoru (při 40 otáčkách). Poté byly vloženy na 1 hod do termostatu, který byl vytemperován na 100 C o. Nechaly se vychladnout na laboratorní teplotu. Následovala extrakce 6 ml 12% K 2 CO 3 a třepání po dobu 15 min při 40 otáčkách. Po důkladném promísení byly zkumavky centrifugovány v chlazené centrifuze (3500 rcf, 10 min, 4 C o ). Poté se odpipetovala horní organická vrstva pomocí skleněných pasteurových pipet do připravených autosamplerových vialek a důkladně, pomocí krimpovacích kleští, se viale uzavřely hliníkovými víčky. Obsah vialek s transmethylovanými a extrahovanými MK byl analyzován pomocí plynového chromatografu s FID detekcí Chromatografické podmínky Tlak nosného plynu (He): 300 kpa Teplota injektoru: 280 C Teplota termostatu kolony: počáteční teplota 110 C po dobu prvních 2 min, poté dochází ke vzestupu teploty po 14 C až na konečných 250 C Teplota plamenově ionizačního detektoru: 330 C 50

58 4.3. Chromatografické stanovení sterolů a skvalenu Přístroje a pomůcky automatické pipety s vyměnitelnými špičkami a dávkovače (Biohit, Brandt, Německo) zábrusové zkumavky, zábrusové zátky Wassermannovy zkumavky (Kavalier, ČR) kónické vialky (Supelco, USA) viale, krepovací víčka, krepovací kleště horizontální třepačka (Kavalier, ČR) Biological termostat BT 120 (ČR) Chlazená centrifuga Eppendorf 5810 termoblok (Tectra QBT2, Velká Británie) koncentrátor Eppendorf AG (Eppendorf, Německo) kapilární kolona CP-Sil 8 CB LOW BLEED/MS, délky 30 m x 0,32 mm ID, tloušťka filmu 0,5 m (Chrompack, USA) plynový chromatograf GC 8000 series (FISONS Instruments, USA) Chemikálie Aceton p. a. (Kulich, ČR) Etanol (Lachema, ČR) Hydroxid draselný (Merck, Německo) Hexan (Merck, Německo) Pyridin (Merck, Německo) Redestilovaná voda (GORO, ČR) Bis (trimethylsilyl)trifluoracetamid (Supelco, USA) Stigmastanol (Sigma Aldrich, Německo) Skvalen (Sigma Aldrich, Německo) Lathosterol (Sigma Aldrich, Německo) Kampesterol (Sigma Aldrich, Německo) 51

59 Sitosterol (Sigma Aldrich, Německo) Příprava roztoků 33% vodný roztok KOH (33 g KOH do 100 ml destilované vody) Bis (trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) s pyridinem v poměru 1:1 roztok stigmastanolu (= interní standard) o koncentraci 200 mg/ml hexanu roztok skvalenu o koncentraci 2mg/100 ml hexanu roztok lathosterolu o koncentraci 1mg/100 ml hexanu roztok kampesterolu o koncentraci 1mg/50 ml hexanu roztok β-sitosterolu o koncentraci 1mg/50 ml hexanu Analytický postup Vzorky plazmy byly k analýze připraveny pomalým rozmražením při 2-4 C v chladničce, poté byly důkladně promíchány. Do zábrusové zkumavky o objemu 25 ml bylo nejprve pipetováno 500 l vzorku, poté 5 l interního standardu stigmastanolu, 4,7 ml etanolu, který způsobíl denaturaci bílkovin, a nakonec následovalo přidání 0,3 ml vodného roztoku hydroxidu draselného (33%). Vše bylo důkladně protřepáno na labdanceru. Zábrusové zkumavky byly pečlivě uzavřeny a směs byla temperována na 45 C po dobu 60 minut v biologickém termostatu. Zde došlo k hydrolýze triglyceridů a fosfolipidů na polární látky. Mezitím se připravily Wassermannovy zkumavky, které bylo nutné vypláchnout acetonem, což zabrání možným interferencím při analýze. Po vyjmutí zábrusových zkumavek z termostatu bylo nutné je ochladit na laboratorní teplotu (v chladničce po dobu 5-10 minut). Po ochlazení bylo pipetováno 5 ml redestilované vody, zkumavky se protřepaly a bylo přidáno 5 ml n-hexanu. Zábrusové zkumavky byly opět zazátkovány. Následně proběhla extrakce lipidových látek do hexanu, a to třepáním na horizontální třepačce po dobu 10 min. Poté byla hexanová vrstva odseparována centrifugací (10 min při 4 C a 3000 rcf). Horní hexanová vrstva (4 ml) byla pečlivě odebrána plastovou špičkou do Wassermannovy zkumavky a následně odpařena v koncentrátoru (program 2) při 45 C do sucha. 52

60 Poté se opakovalo provedení druhé a následně i třetí extrakce. Odparek ve zkumavce byl rozpuštěn v 0,5 ml hexanu. Konečný extrakt byl přenesen do kónické viale, v koncentrátoru (program 2) byl při 45 C odpařen do sucha. Následně bylo přidáno 100 l směsi BSTFA s pyridinem (1 : 1). Viale se uzavřely víčky, krouživým pohybem se omylo dno viale. Poté se provedla derivatizace v termobloku, po dobu 45 min a při teplotě 75 C. Vzniklé trimethylsilyl deriváty (Obr ) sterolů byly chromatograficky separovány a analyzovány. Obr. 19. Derivatizace lathosterolu, vznik trimethylsilyl derivát lathosterolu Obr. 20. Derivatizace β-sitosterolu, vznik trimethylsilyl derivát β-sitosterolu 53

61 Obr. 21. Derivatizace kampesterolu, vznik trimethylsilyl derivát kampesterolu Příprava standardů Do kónických vialek byly napipetovány připravené standardní roztoky (viz ) dle hodnot uvedených v Tab. 4. Tab. 4. Příprava standardů skvalen lathosterol kampesterol sitosterol (µmol/l) (µmol/l) (µmol/l) (µmol/l) l konc. l konc. l konc. l konc. standard , , standard , , standard , , Hexanové roztoky standardů byly odpařeny v koncentrátoru (program 2) po dobu 20 min při 45 C. Poté bylo k odparkům ve vialích přidáno 100 µl směsi BSTFA s pyridinem (1:1), uzavřelo se pertlovacími víčky a derivatizovalo po dobu 45 minut při 75 C. 54

62 Chromatografické podmínky Injektor typu split/splitless (liner 2 mm ID) o teplotě: 300 C Objem nastřikovaného vzorku: 1 l Perioda uzavřeného splitu (splitless): 1 min Tlak na hlavu kolony: 100 kpa Rychlost nosného plynu (He): 37 cm/s Teplota termostatu kolony: počáteční teplota 50 C po dobu prvních 2 min, poté dochází k vzestupu teploty o 15 C za minutu až na konečných 315 C (po dobu 14 min) Teplota plamenově ionizačního detektoru (FID): 330 C 4.4. Enzymatické stanovení cholesterolu (celkového, LDL-C, HDL-C) a triglyceridů Stanovení koncentrace celkového cholesterolu, cholesterolu v lipoproteinech a triglyceridů v séru a plazmě je rutinní metoda. Využívá se k němu enzymatický kolorimetrický test. Jednou z nejčastějších souprav pro stanovení cholesterolu je reakční kyt firmy ROCHE. Koncentraci určíme na analyzátoru metodou absorpční spektrofotometrie, kdy měříme absorbanci vzorku, jež je přímo úměrná koncentraci cholesterolu ve vzorku. Tato metoda vylučuje stanovení silně hemolytického a ikterického séra, výsledky u takovýchto vzorků jsou zkreslené. Praktické stanovení cholesterolu a TAG bylo provedeno v rutinní laboratoři ÚKBD fakultní nemocnice Hradec Králové, na analyzátoru Modular (Roche Basilej, Švýcarsko) kolorimetrickou metodou. 55

63 5. VÝSLEDKY Získaná data byla statisticky zpracována pomocí softwaru SigmaStat (SyStat Software, USA). Pro porovnání byl použit test One Way Analysis of Variance. Za statisticky významné změny byly považovány výsledky, kdy hladina statistické významnosti P byla nižší než 0,05. Všechny údaje jsou vyjádřeny jako průměr ± SD, pokud není uvedeno jinak. Pro grafické znázornění byly použity krabicové grafy (Box Plot), jejichž výhodou je, že nám podají dobrý přehled o naměřených hodnotách, odlehlé hodnoty jsou zobrazeny zvlášť a nezkreslí tak výsledek. Je to graf, který je vhodný pro grafické zobrazení numerické proměnné. Z krabicového grafu je patrný medián, 1. a 3. kvartil, odlehlé hodnoty a zobrazení maximální a minimální hodnoty (vyjma odlehlých hodnot). Podrobné popisky a vysvětlení grafu je uvedeny na Obr. 23. Pro předpokládanou další interpretaci výsledků jsou grafy opatřeny popisky v anglickém jazyce s řádným vysvětlením v komentáři pod ním. Statistické zhodnocení všech stanovovaných celkových MK je uvedeno v Tab a na Obr Z výsledků vyplývá, že významné změny hladin MK v plazmě pacientů s DM 1. typu během hladovky a následné redukční diabetické diety, nastaly u kyseliny myristové (Obr. 23.), palmitové (Obr. 24.), stearové (Obr. 25.), olejové (Obr. 26.), linolové (Obr. 27.), alfalinolenové (Obr. 28.), dihomogamalinolenové (Obr. 29.), arachidonové (Obr. 30.), eikosapentaenové (Obr. 31.) a dokosahexaenové (Obr. 32.). U všech výše zmíněných MK byly nalezeny signifikance v době po hladovce a před hladovkou, dále u všech zmíněných vyjma kyseliny dihomogamalinolenové po hladovce a po roce. U kyseliny myristové (Obr. 23.), linolové (Obr. 27.), alfalinolenové (Obr. 28.), arachidonové (Obr. 30.) a dokosahexaenové (Obr. 32.) byly nalezeny signifikance v době po hladovce a po měsíci. U kyseliny palmitové (Obr. 24.), arachidonové (Obr. 30.) a dokosahexaenové (Obr. 32.) byly nalezeny signifikance po měsíci a po roce a u kyseliny dokosahexaenové (Obr. 32.) byla nalezena signifikantní změna hladiny i v době před hladovkou a po roce. U pacientů s DM 2. typu nebyly během hladovky a redukční diety 56

64 zaznamenány signifikantní změny hladin celkových MK, v průběhu naší studie byli pacienti suplementováni hypolipidemiky, což mělo pravděpodobně na výsledek významný vliv. Statistické zhodnocení stanovovaných necholesterolových sterolů a skvalenu je uvedeno v Tab a na Obr Během hladovky a následné redukční diabetické diety byly u pacientů s DM 1. typu nalezeny signifikantní změny u hladin lathosterolu (Obr. 34.), kampesterolu (Obr. 35.), poměru lathosterolu/celkového cholesterolu (Obr. 36.) a kampesterolu/celkového cholesterolu (Obr. 37.). U všech výše zmíněných sterolů byla nalezena signifikance v době po měsíci a po roce, před hladovkou a po roce a po hladovce a po roce. Hladiny kampesterolu (Obr. 35.) se signifikantně měnily i v době před hladovkou a po hladovce a před hladovkou a po měsíci. U kampesterolu/celkového cholesterolu (Obr. 37.) byla nalezena signifikance před hladovkou a po hladovce. U pacientů s DM 2. typu byla nalezena signifikance u poměru lathosterolu/celkového cholesterolu (Obr. 38.) v době po měsíci a před hladovkou. Statistické zhodnocení stanovovaného celkového cholesterolu, cholesterolu v lipoproteinech a TAG je uvedeno v Tab a na Obr Výsledky ukazují na významnou změnu hladin HDL C (Obr ) během hladovky a následné redukční diety, signifikance byla zaznamenána jak u pacientů s DM 1. typu i DM 2. typu. U obou skupin byla nalezena signifikance v době před hladovkou a po hladovce a po měsíci a po hladovce. U diabetiků 1. typu byla navíc ještě nalezena signifikance v době po roce a po hladovce, po roce a po měsíci a po roce a před hladovkou. Na hranici signifikance se nalézá hladina LDL C (Obr. 42.) u pacientů s DM 2. typu. 57

65 5.1. Chromatografické stanovení celkových mastných kyselin Chromatografický záznam spektra methylesterů celkových mastných kyselin v plazmě je uveden na Obr. 22. Obr. 22. Chromatogram spektra methylesterů celkových mastných kyselin v plazmě. Chromatogram je závislostí odezvy detektoru (osa y) na retenčním čase (osa x). Retenční časy konkrétních methylesterů MK jsou uvedeny v popisu na obrázku nad jednotlivými píky. Analýza byla prováděna za podmínek uvedených v kapitole