UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA Iva Matějčková Molekulárně genetická diagnostika cystické fibrózy Bakalářská práce Praha 2014

2 Autor práce: Iva Matějčková Vedoucí práce: RNDr. Miroslava Krkavcová Oponent práce: MUDr. Jaroslav Kotlas Datum obhajoby: 2014

3 Bibliografický záznam MATĚJČKOVÁ Iva. Molekulárně genetická diagnostika cystické fibrózy. Praha: Univerzita Karlova, 2. lékařská fakulta, s. Vedoucí bakalářské práce RNDr. Miroslava Krkavcová Anotace Cystická fibróza (CF) je velmi rozšířené a závažné onemocnění. Jde o autozomálně recesivní chorobu s incidencí 1 : : Při tomto onemocnění dochází k mutacím CFTR genu, které jsou zodpovědné za poruchu chloridových kanálů. Jde o multiorgánové postižení, které postihuje především respirační a gastrointestinální systém, dále ale i hepatobiliární systém, reprodukční systém a potní žlázy. Cystickou fibrózu lze diagnostikovat pomocí potního testu, molekulárně genetické diagnostiky, výjimečně také pomocí transepiteliálních rozdílů potenciálů, tato metoda ale není dosud v České republice prováděna. Od roku 2009 se v České republice provádí novorozenecký screening CF, který napomáhá k rychlejší diagnóze a následně k rychlému zavedení vhodné terapie. Zavedení včasné terapie totiž výrazně zlepšuje prognózu pacienta. V současné době se pacienti s CF dožívají v průměru třiceti až čtyřiceti let. Pro diagnostické vyšetření CFTR genu se využívá postnatální, prenatální nebo preimplantační materiál. Z těchto vzorků se izoluje DNA, která se dále vyšetřuje pomocí genetických metod, které jsou založeny na principu PCR, reverzní hybridizace, restrikční analýzy, sekvenování DNA nebo MLPA. Klíčová slova Cystická fibróza, CFTR, molekulárně genetická diagnostika, polymerázová řetězová reakce.

4 Annotation Cystic fibrosis is a very common and serious disease. It is an autosomal recessive disease with an incidence of 1 : : With this disease, CTFR gene mutations occur which are responsible for the failure of chloride channels. It is a multi-organ handicap, which primarily infects the respiratory and gastrointestinal system, but also affects the hepatobiliary system, reproductive system, and sweat glands. Cystic fibrosis can be diagnosed by a sweat test, molecular genetic diagnosis, or more rarely, using transepitel potential differences, which has not been introduced in the Czech Republic yet. Since 2009, the Czech Republic applies neonatal screening CF, which helps make a faster diagnosis to then be able to proceed to the rapid introduction of appropriate treatment. The introduction of an early treatment has significantly improved the prognosis of the patient. Currently CF patients can live on average from thirty to forty years. For the CFTR gene genetic testing is used postnatal, prenatal or preimplantation material. From these samples, DNA gets isolated and is further investigated using genetic methods, which may be based on the principle of PCR, reverse hybridization, restriction analysis, DNA sequencing or MLPA. Keywords Cystic fibrosis, CFTR, molecular genetic diagnostics, Polymerase chain reaction.

5 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením RNDr. Miroslavy Krkavcové, uvedla všechny použité literární a odborné zdroje a dodržovala zásady vědecké etiky. Dále prohlašuji, že stejná práce nebyla použita pro získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze. Iva Matějčková

6 Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucí své práce RNDr. Miroslavě Krkavcové za cenné rady a připomínky, kterými přispěla k vypracování této práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Vilému Helešicovi, který mi vždy ochotně pomohl a poradil. Mé poděkování patří i všem zaměstnancům laboratoře Genvia, s.r.o., kteří tvořili příjemný kolektiv během mé práce v laboratoři. V neposlední řadě bych ráda poděkovala své rodině, příteli a přátelům za podporu nejen při psaní této práce, ale i během celého studia.

7 Obsah Obsah 1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 7 ÚVOD CYSTICKÁ FIBRÓZA HISTORIE CYSTICKÉ FIBRÓZY CFTR GEN CFTR PROTEIN MUTACE CFTR GENU KLASIFIKACE MUTACÍ V CFTR GENU KLINICKÉ PROJEVY A KOMPLIKACE CF Dýchací systém Gastrointestinální trakt Jícen Žaludek Pankreas Tenké střevo Tlusté střevo Hepatobiliární systém Reprodukční systém Potní žlázy DIAGNOSTIKA CF Potní test Molekulárně genetické vyšetření Postnatální diagnostika Prenatální diagnostika Preimplantační diagnostika Transepiteliální rozdíl potenciálů Novorozenecký screening ZÁKLADNÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ PRINCIPY METODA PCR Fáze PCR Reagencie a technické vybavení pro PCR Reakční směs Termocykler Využití PCR Výhody a nevýhody PCR Výhody PCR Nevýhody PCR ELEKTROFORÉZA Kapilární elektroforéza Gelová elektroforéza REVERZNÍ HYBRIDIZACE DALŠÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ PRINCIPY Metoda MLPA Sekvenování DNA dle Sangera Restrikční analýza CÍLE PRÁCE PRAKTICKÁ ČÁST DIAGNÓZY Skupiny diagnóz PREANALYTICKÁ FÁZE... 37

8 5.2.1 Příjem vzorku Izolace DNA PŘEHLED METOD Průkaz 50 mutací v CFTR genu kitem ELUCIGENE CF EU Přítomnost zeleného píku u N1303K potvrzuje heterozygotní stav mutací v CFTR genu kitem Devyser CFTR Core Modrý pík znázorňuje mutantní alelu N1303K. Dva černé píky v dolní části signalizují polymorfismus 7T/9T v intronu Molekulární diagnostika mutací v genu CFTR (Cystická fibróza) POROVNÁNÍ METOD VÝSLEDKY DISKUZE ZÁVĚR REFERENČNÍ SEZNAM PŘÍLOHY... 57

9 Seznam použitých zkratek 1 Seznam použitých zkratek ATP CF CFTR CFRD DIOS datp dgtp dctp dttp ddntp DNA EDTA GGT IRT MKN MLPA MSD m-rna NBD NS PGD PCR RNA UBLG WHO Adenosintrifosfát Cystická fibróza Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, transmembránový regulátor vodivosti Cystic fibrosis related diabetes, diabetes na podkladě cystické fibrózy Distální intestinální obstrukční syndrom Deoxyadenosintrifosfát Deoxyguanosintrifosfát Deoxycytidintrifosfát Deoxythymidintrifosfát Dideoxynukleosidtrifosfát Deoxyribonukleová kyselina Etylendiaminotetraoctová kyselina Gama glutamyltransferáza Imunoreaktivní trypsin Mezinárodní Klasifikace Nemocí Multiplex ligation-dependent probe amplification Membrane spanning domain Mediátorová ribonukleová kyselina Nukleotide binding domain, doména vázající nukleotid Novorozenecký screening Preimplantační genetická diagnostika Polymerase chain reaction, Polymerázová řetězová reakce Ribonukleová kyselina Ústav biologie a lékařské genetiky World Health Organization - Světová zdravotnická organizace 7

10 ÚVOD ÚVOD Cystická fibróza je závažné autozomálně recesivní onemocnění vyvolané mutacemi genu CFTR. Incidence tohoto onemocnění v evropské populaci je 1 : : 4500, přičemž v České republice se narodí přibližně 33 postižených novorozenců ročně. Dnes je známo přes více než 1960 mutací způsobujících změny v CFTR genu, ne všechny změny však způsobují zmiňované onemocnění. Mutace jsou klasifikovány do pěti tříd dle účinku na funkci genu. Populačně významných je však pouze asi 20 mutací, ostatní nejsou příliš často diagnostikovány. Nejvíce rozšířenou mutací ve světě je F508del. Včasný záchyt mutace hraje roli z hlediska rychlého nasazení léčby, která zlepšuje prognózu onemocnění. K rychlé diagnostice přispívá novorozenecký screening. Další postupy, které slouží k diagnostice CF, jsou založeny na detekci chloridů v potu a molekulárně genetické diagnostice CFTR genu, vzácněji se využívá metoda transepiteliálního rozdílu potenciálů. Při detekci CFTR genu pomocí molekulárně genetické diagnostiky se využívá převážně těchto principů: amplifikace DNA, reverzní hybridizace, MLPA, sekvenování DNA nebo restrikční analýza. V genetické laboratoři GENvia, s.r.o., kde byla zpracována praktická část této práce, se využívají tři akreditované metody, založené na principu metody PCR (amplifikace DNA) a reverzní hybridizace. K praktické části laboratoř GENvia, s.r.o. poskytla soubor 2487 pacientů za časové období mezi roky , kteří byli roztříděni do tří skupin dle indikačních diagnóz. V praktické části je také popisován postup laboratorního vyšetření, od příjmu vzorku přes izolace DNA až po popis konkrétních metod, díky kterým lze detekovat mutace CFTR genu. Shromážděná data byla vyhodnocena a zaznamenána do výsledných tabulek a grafů. 8

11 Cystická fibróza 2 Cystická fibróza Cystická fibróza je vrozené onemocnění, které je i přes velký pokrok medicíny v současné době nevyléčitelné. Jde o nejčastější onemocnění bělošských populací. V Evropské populaci je incidence tohoto onemocnění 1 : : 4500 novorozenců. V České republice se toto onemocnění vyskytuje v poměru 1 : 2736 novorozenců, což znamená, že každý 26. jedinec je nosičem mutace CF [30]. Ročně se tedy narodí přibližně 33 novorozenců postižených cystickou fibrózou. V současné době je u nás, dle Českého národního registru, diagnostikováno 680 pacientů [7, 15, 29, 30, 36]. Cystická fibróza je monogenní, autozomálně recesivní onemocnění. Při křížení dvou heterozygotů, nesoucích mutovanou alelu, existuje tedy 25% pravděpodobnost, že potomci těchto rodičů budou trpět CF, 50% možnost, že potomci budou zdravými přenašeči této nemoci a 25% pravděpodobnost, že potomci budou zcela zdraví [29, 30, 36]. Onemocnění je způsobené mutacemi genu CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) na chromozomu 7. Dochází k narušení chloridových kanálků, k hromadění chloridových solí v potu a k tvorbě abnormálně vazkého hlenu, převážně v plicích. CF je multiorgánové onemocnění, které napadá především plíce, pankreas, játra, střeva a reprodukční systém [29, 30, 36]. 2.1 Historie cystické fibrózy Historická šetření ukazují, že již 3000 let před naším letopočtem se u některých jedinců objevovaly charakteristické znaky CF. Z lidových pověr je známo, že již ve středověku matky, které při políbení svých dětí cítily slanou chuť, věděly, že jejich dítě brzy zemře. Těmto dětem se říkalo začarované a byly považovány za prokleté. Roku 1595 P. Pauw, profesor botaniky a anatomie v Leidenu, sepsal pitevní zprávu o jedenáctileté pacientce, ve které popisuje těžké změny pankreatu [3, 26, 30]. Q. Fanconi roku 1936 publikoval nemoc jako cystickou fibromatózu s bronchoektázií u dětí, o kterých se myslelo, že trpí celiakií. Dva roky poté americká patoložka D. Andersenová popsala patologicko-anatomické nálezy u 49 dětí, z nichž 20 zemřelo na onemocnění, pro které použila označení cystická fibróza pankreatu [30]. S. Faber v roce 1945 zavedl termín mukoviscidóza. Byl přesvědčen, že hlavní příčinou onemocnění je tvorba hlenu. To, že je nemoc genetického původu a že jde o 9

12 Cystická fibróza autozomálně recesivní onemocnění publikovali roku 1946 Andersen a Hodges [19, 24, 26, 30]. V roce 1952 v USA v období veder bylo zjištěno, že děti mající CF, trpěly šokem z horka. Na základě tohoto objevu začal Paul di Sant Agnese studovat pot u takto nemocných a zjistil, že pot u dětí s CF obsahuje více solí než pot u normálních dětí. Na základě tohoto faktu se začala CF diagnostikovat pomocí nové metody zvané pilokarpinová iontoforéza. Vznikl tak potní test, který je v diagnostice CF využíván dodnes [20, 24, 26, 30]. Česká republika není v této problematice vůbec pozadu. První pacient s cystickou fibrózou byl roku 1946 diagnostikován na II. dětské klinice v Praze. První kazuistiky onemocnění CF se v české literatuře objevily po druhé světové válce. Roku 1948 vzniká první soubor nemocných s CF, na kterém se podíleli Švejcar, Benešová a Houštěk. S vyšetřováním chloridů v potu se v ČR začalo v roce Po roce 1989 došlo k výraznému pokroku. Byla založena specializovaná centra pro CF, zlepšila se dostupnost léků, a od roku 1998 se započalo s transplantacemi plic u pacientů s CF [24, 30]. 2.2 CFTR gen Gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) byl roku 1987 lokalizován na dlouhém raménku chromozomu 7 (7q 31.2). O rok později byl pomocí pozičního klonování identifikován jako gen, jehož mutace jsou zodpovědné za CF [2, 4, 20, 30]. Skládá se z 27 kódujících exonů a rozprostírá se přibližně v oblasti dlouhé asi 250 kb [20, 37]. 2.3 CFTR protein Protein kódovaný CFTR genem se nazývá CFTR protein a je řazen do skupiny tzv. ATP binding cassette transportních proteinů [20]. Funkcí této skupiny je transport malých molekul, jako jsou například ionty, proteiny, ATP a disacharidy [30]. Hlavní funkcí CFTR proteinu je řízení chloridových kanálů v apikální membráně epiteliálních buněk. Reguluje však i další chloridové, sodíkové nebo draslíkové kanály [4, 30, 36, 37]. Protein CFTR je tvořen pěti doménami. Dvěma transmembránovými doménami MSD1(Membrane spanning domain 1) a MSD2 (Membrane spanning domain 2), každá se skládá ze šesti segmentů. Dále z 2 domén - NBD1(Nukleotide binding domain 1) a 10

13 Cystická fibróza NBD2 (Nukleotide binding domain 2), které váží dvě ATP molekuly a z regulační R domény. MSD1 a MSD2 slouží k uchycení CFTR proteinu v apikální membráně, NBD1 a NBD2 tvoří vazebná místa pro aktivovaný ATP a R doména má regulační schopnost, která uzavírá tok iontů chloridovým kanálem [4, 20, 30, 37]. Obr. č. 1. Schéma struktury genu CFTR, jeho proteinové sekvence a topologie v cytoplazmatické membráně. Upraveno podle [36]. 2.4 Mutace CFTR genu Podle databáze Cystic fibrosis mutation database je dnes známo více než 1960 mutací způsobujících změny v CFTR genu [6]. Je však důležité upozornit, že ne všechny změny v sekvenci CFTR genu vyvolávají onemocnění CF. Bylo zjištěno, že více než 400 polymorfismů nemá žádný vliv na fenotyp jedince [4, 30]. Jde o mutace germinálního původu, které se vyskytují ve všech buňkách jedince. To je důvod, proč jsou přenášeny z generace na generaci [30]. Mezi nejčastější mutace můžeme řadit mutace tzv. minssence, při nichž dochází k záměně aminokyseliny za jinou, což mění smysl čtecího rámce. Tento typ mutací tvoří 40,1 % všech vyskytujících se mutací. Další mutace způsobující změnu v CFTR genu jsou frameshift mutations (posunové mutace). Způsobují poruchu čtecího rámce a tvoří 15,95 % všech mutací v CFTR genu. Další typ vyskytujících se 11

14 Cystická fibróza mutací je nonsence (mutace beze smyslu), kdy dojde k vytvoření stop kodonu a k předčasnému ukončení proteosyntézy. Dalšími vyskytujícími se mutacemi mohou být delece, inzerce nebo samesence mutace. [6, 14, 20]. Ze všech dodnes známých mutací je pouze asi 20 mutací klinicky a populačně významných v celosvětové populaci. Ostatní mutace se vyskytují vzácně. Za zmínku stojí celosvětově nejrozšířenější mutace v CFTR genu, známa už přes 50 tisíc let. Jde o mutaci F508del. Nachází se v exonu 10, kde dochází k deleci tří nukleotidů, které kódují aminokyselinu fenylalanin na pozici 508. Dle klasifikace řadíme tuto mutaci do třídy II., která způsobuje poruchu posttranslačních úprav a poruchu transportu CFTR proteinu. Frekvence výskytu ve světě je 66 % [2, 20, 30]. Tabulka č. 1. Přehled 20 celosvětově nejčastějších mutací v CFTR genu. V evropské frekvenci je u některých mutací uvedena i oblast. Důvodem je, že v jiné oblasti, či populaci se daná mutace nevyskytuje. Mutace Molekulární patogeneze Světová frekvence (%) Evropská frekvence (%) F508del Delece Phe na pozici 66 66,8 508 G542X Nestabilní mrna 2,42 2,64 G551D Gly Asp na pozici 1,64 1,5 551 N1303K Asn Lys na pozici 1,34 1, W1282X Nestabilní mrna 1,22 1,01 R553X Nestabilní mrna 0,73 0, G T Sestřihová porucha 0,72 0,54 mrna G A Sestřihová porucha 0,65 0,83 mrna G A Sestřihová porucha 0,6 méně než 0,1 mrna CFTRdele2,3/21kb Delece exonů 2 a 3 0,51 1,00 / R1162X Předčasný stop kodon 0,29 0,51 R347P Arg Pro na pozici 0,24 0, kb C T Sestřihová porucha 0,24 0, G A Sestřihová porucha 0,12 0,22 mrna R334W Arg Trp na pozici 334 0,12 0,16 12

15 Cystická fibróza 394delTT Delece TT od nukleotidu delTA Delece TA od nukleotidu AA G Posun se stop kodonem 2184insA Posun se stop kodonem 2143delT Posun se stop kodonem Upraveno podle [30]. 0,10 0,16 (oblast Baltu) méně než 0,1 0,44 (Černomoří) méně než 0,1 0,29 (Tyrolsko) méně než 0,1 0,28 (Slované) méně než 0,1 0,27 (Slované) 2.5 Klasifikace mutací v CFTR genu Mutace CFTR genu rozdělil Tsui et al. do pěti tříd podle jejich účinku na funkci CFTR genu [30]. I. třída Porucha syntézy proteinu Tato třída obsahuje mutace, které vedou k narušení syntézy proteinu CFTR. Mutace v této třídě zahrnují převážně nonsence mutace, které vedou k předčasnému ukončení kodonů. Příkladem je G542X nebo posunové mutace, které mohou vytvořit zkrácené formy CFTR genu, jako například 2143delT. Tyto mutace jsou spojeny s těžkou formou CF a pankreatickou insufiencí [4, 20, 30]. II. třída Porucha transportu a vyzrávání proteinu Mutace této třídy omezují, v některých případech dokonce blokují, správnou posttranslační glykosilaci, výslednou terciální konformaci proteinu CFTR a následný transport na apikální membránu [30]. To tedy vede k defektu CFTR proteinu na apikální membráně epiteliálních buněk. Hlavní mutací této třídy je F508del, která je nejrozšířenější mutace nejen v Evropě, ale i po celém světě. Frekvence této mutace ve světě je 66 % [2]. Stejně tak, jako u první třídy, tyto mutace doprovází těžká forma CF [4, 20, 30]. III. třída Porucha regulace proteinu V této třídě se jedná o mutace, které jsou zodpovědné za špatnou regulační funkci proteinu. Dochází k blokaci ATP vazby na NBD1 nebo NBD2. Tato vazba je nezbytná k aktivaci iontového kanálu. Příkladem mutace, patřící do této třídy je G551D. Stejně tak, jako u předešlých tříd, jsou tyto mutace spojovány s klasickým a velmi závažným průběhem CF [4, 20, 30]. 13

16 Cystická fibróza IV. třída Snížení vodivosti proteinu U těchto mutací je zachována normální syntéza proteinu CFTR a správný transport na apikální membránu, dochází však k poškození iontového kanálu, a tím ke snížení jeho vodivosti. Do této třídy řadíme například mutace R347P nebo R117H. Tyto mutace jsou spojovány s mírnějším klinickým průběhem než mutace předešlé [4, 20, 30]. V. třída Snížení funkce syntézy proteinu U těchto mutací dochází ke snížení funkce CFTR proteinu. Tato třída zahrnuje sestřihové mutace, které vedou k nesprávnému sestřihu mrna [30]. Tyto mutace představují 5 % CFTR mutací. Do této třídy řadíme například mutaci kb C T. Jedná se o mutace, které jsou spojovány s mírným klinickým průběhem a s hraniční hodnotou chloridů v potu [4, 20, 30]. 2.6 Klinické projevy a komplikace CF U CF dochází k mutaci genu CFTR, která znemožňuje správnou funkci chloridových kanálků, v důsledku toho dochází k poruše transportu chloridů. Defekt CFTR genu způsobuje multiorgánové onemocnění, kdy jsou postiženy hlavně dýchací cesty, gastrointestinální trakt a hepatobiliární systém. Dále postihuje mužský reprodukční systém, potní žlázy i další orgány Dýchací systém Respirační onemocnění je považováno za nejvážnější klinický projev CF. Je hlavní příčinou úmrtnosti pacientů s CF. Udává se, že až 90 % pacientů trpících cystickou fibrózou umírá na respirační selhání nebo cor pulmonale (zvětšení pravé komory v důsledku plicního onemocnění) mezi třicátým a čtyřicátým rokem života [29]. Projevy nemoci se mohou objevit už v kojeneckém věku, ale propuknout mohou až v adolescentním nebo dospělém věku. Respirační projevy postihují téměř všechny pacienty s cystickou fibrózou [30, 33, 37]. Nejčastějším projevem je kašel. Jeho zhoršení je téměř vždy projevem infekce v dýchacích cestách s produkcí většího množství hlenu. Dalším projevem je obstrukce dýchacích cest, která je spojována s přítomností hlenu v dýchacích cestách. Dochází též ke změně tvaru hrudníku, který se vyklenuje do soudkovitého tvaru [20, 30, 32, 33]. Paličkovité prsty jsou dalším častým projevem CF. Jde o nedostatečné okysličování krve. Postihuje konečky prstů na nohou i rukou, které jsou rozšířené a ztluštělé [30,31]. 14

17 Cystická fibróza Výskyt paličkovitých prstů roste s věkem a vyvíjí se časně po rozvoji zánětlivých plicních změn. Paličkovité prsty však nemusí být projevem jen cystické fibrózy, ale mohou se vyskytovat i u jiných chorob, například u karcinomů a vrozených srdečních vad [30, 31]. Často se vyskytující projevy, které postihují pacienty téměř po celý život, jsou virové a bakteriální infekce. Důvodem infekcí je přítomnost hlenu v dýchacích cestách, kde jsou tak vytvořené příznivé podmínky pro život virů či bakterií. Mezi nejčastější virové původce patří virusy chřipky A a B, virusy panchřipky, adenoviry nebo rhinoviry. Nejčastějšími bakteriálními původci jsou Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa a Burkholderia cepacia [15, 19, 33]. Komplikace, které postihující dýchací cesty, jsou rhinitidy (zánět nosní sliznice), a zejména sinusitidy (zánět vedlejších nosních dutin). Jde o časté komplikace, které se vyskytují téměř u všech pacientů trpících cystickou fibrózou po celou dobu života. Další komplikací u pacientů s CF, vyskytující se poměrně často, jsou nosní polypózy (nenádorové zduření sliznice nosu a vedlejších nosních dutin). Mohou být bez jakýchkoliv klinických projevů, v tomto případě se hovoří o malých nosních polypech. Oproti tomu velké polypy mohou způsobovat nosní obstrukce, které mohou vést až k deformaci tvaru nosu [19, 31, 32, 33]. Atelektázy jsou další komplikací cystické fibrózy. Jedná se o ucpání průdušky hlenem, v důsledku toho se postižená část stává nevzdušnou. Může patřit k prvním projevům CF, v některých případech se může objevit před stanovením diagnózy. [19, 30, 33]. Velmi závažnou a častou komplikací je pneumotorax, kdy dochází k ruptuře plicních alveolů a k úniku vzduchu do pleurální dutiny. Projevy pneumotoraxu jsou bolest na hrudi a náhlá dušnost. Pokud jde o rozsáhlý pneumotorax, prognóza je pro pacienty nepříznivá. Další velmi závažnou komplikací je hemoptýza, která vzniká v důsledku ruptury bronchiálních artérií. Může jít pouze o mírné krvácení z nosu nebo horních dýchacích cest, které postihuje asi polovinu pacientů s CF. Může však dojít i k masivnímu krvácení. Udává se, že se může vyskytnout asi u 5 % pacientů s CF [30, 31, 32, 33]. V pozdějších stádiích nemoci, v důsledku hromadění hlenu nebo často se opakujících infekcí, dochází k narušení výměny krevních plynů v plicích, což vede k respiračnímu selhání. Při nedostatečném okysličení krve v cévách dochází k plicní hypertenzi, která vede ke vzniku cor pulmonale, případně k srdečnímu selhání [31, 32, 33]. 15

18 Cystická fibróza Gastrointestinální trakt Součástí klinického obrazu cystické fibrózy jsou i gastrointestinální projevy. U každého jedince trpícího tímto onemocněním, se projevy mohou vyskytovat různě. Nejčastěji vyskytující se klinický projev je maldigesce (porucha trávení) související s insuficiencí pankreatu. Postižen může být i jícen, tlusté a tenké střevo. Jícen Častou komplikací vyskytující se u nemocných s CF je gastroezofageální reflux postihující jícen. Neví se však, zda se jedná o poruchu primární, či vzniká sekundárně poruchou intraluminálního trávení. Udává se, že 20 % - 55 % pacientů s CF trpí gastroezofageální refluxem, přičemž výskyt u dospělých je méně častý než u dětí. Jde o poškození svěrače mezi jícnem a žaludkem, které způsobuje zpětný tok žaludečního obsahu do jícnu. Projevem jícnových obtíží je pyróza (pálení žáhy), regurgitace (návrat nestrávené potravy do úst) nebo zvracení. Může se však projevit i pocit předčasné sytosti či odmítání stravy [30, 32, 33]. Žaludek K onemocněním postihující žaludek při CF patří gastritida (zánět žaludku), která je spojována s hyperaciditou (zvýšená kyselost) žaludku. Na vzniku gastritid se dále může podílet i agresivní léčba či dlouhodobý stres. Častěji se však u postižených vyskytují peptidické vředy, na jejichž vzniku se může podílet hypersekrece žaludečních šťáv a nízký obsah bikarbonátů v pankreatické šťávě. Na vzniku vředů se může podílet, stejně jako u gastritid, fyzický i psychický stres pacienta [32, 33]. Pankreas Nejčastější poruchou pankreatu u CF je insuficience její exokrinní funkce. Insuficience pankreatu postihuje % pacientů do dvou let [33]. Funkcí pankreatu je tvorba enzymů - trypsinu, amylázy, lipázy. Jako u všech orgánů, tak i v pankreatu probíhá tvorba vazkého hlenu, který ucpává vývody slinivky a zabraňuje tak průběhu trávení. Zevní insuficience pankreatu se už od kojeneckého věku projevuje maldigescí vedoucí až k steatorhoei. Projevuje se páchnoucí, objemnou, mastnou a průjmovou stolicí, provázenou nadýmáním a bolestí břicha [30, 32, 33]. Pankreatitidy neboli záněty slinivky břišní, jsou poruchy slinivky, které se vyskytují ojediněle. Většinou postihuje pacienty se zachovalou funkcí pankreatu. 16

19 Cystická fibróza Pankreatitidy mohou být jediným projevem CF vyskytujícím se u mírných forem mutací CFTR genu. Nejčastějšími projevy pankreatitid bývají bolesti břicha a časté zvracení [30, 32, 33]. Závažnou komplikací postihující slinivku břišní je diabetes mellitus vázaný na CF, uváděný jako Cystic fibrosis retated diabetes (CFRD). Jde o poruchu glukózové tolerance, která se vyskytuje v různých populacích odlišně. Klinicky se CFRD projevuje polydipsií neboli nadměrnou žíznivostí a polyurií neboli zvýšenou ztrátou moči [30, 33]. U typického diabetu je častým příznakem ketoacidóza. U pacientů s CF se však vyskytuje výjimečně. Důvodem je, že dochází ke snížení sekrece nejen inzulinu, ale i ke snížení sekrece glukagonu. Udává se, že u pacientů s CF, kteří trpí CFRD, je až šestkrát větší úmrtnost než u pacientů trpící CF s normální glukózovou tolerancí [30]. Tenké střevo Časným projevem CF je mekoniový ileus, vyskytující se přibližně u 10 % novorozenců. Většinou se objevuje už ve druhém trimestru těhotenství. Jde o obstrukci dolní části tenkého střeva způsobenou mekoniovou zátkou. Klinické příznaky se projevují velmi časně po porodu objemným bříškem, zvracením s příměsí žluči, absencí odchodu mekonia. Výskyt mekoniového ilea bývá často spojován s pankreatickou insuficiencí. Mohou nastat i komplikace, jako perforace střeva (protržení stěny střeva) nebo peritonitida s kalcifikací (zánět pobřišnice s postupným zvápenatěním). Je to velmi závažný stav, který vyžaduje rychlé řešení. Nejčastěji se mekoniový ileus řeší operativně [19, 30, 32, 33]. Dalším onemocněním postihující tenké střevo je distální intestinální obstrukční syndrom (DIOS). Toto postižení připomíná novorozenecký mekoniový ileus, který se vyskytuje hlavně u adolescentů a dospělých pacientů s CF. U DIOS dochází ke hromadění vazkého hlenu v oblasti terminálního ilea a vzestupného tračníku, což způsobuje střevní obstrukci. K rozvoji DIOS může přispívat dehydratace, malabsorpce tuků a abnormální střevní hlen. Projevem akutní DIOS jsou kolikovité bolesti břicha, nadýmání, nauzea až zvracení. U chronické formy nedochází k úplné obstrukci a projevy pak bývají mírnější. Chronický DIOS se tedy projevuje nechutenstvím, opakovanými bolestmi břicha, mastnými stolicemi a zácpou [30, 32, 33]. 17

20 Cystická fibróza Tlusté střevo Poměrně vzácný projev postihující tlusté střevo je fibrotizující kolonopatie. Jde o zúžení lumen vzestupného tračníku. Může se projevovat velmi podobně jako DIOS, bolestmi břicha, vodnatými průjmy či obstrukcí, někdy můžeme ve stolici nalézt i příměs krve [30, 32, 33]. Zajímavostí je, že toto onemocnění postihující tlusté střevo nebylo v ČR doposud prokázáno u žádného pacienta s CF [30] Hepatobiliární systém Patologické změny u pacientů s CF postihují i játra a žlučové cesty. U každého nemocného se však může vyskytnout s jinou intenzitou. Udává se, že asi u 5 % pacientů se vyskytuje závažné jaterní onemocnění a u 25 % pacientů má jaterní onemocnění mírné projevy [30, 33]. Protahovaný ikterus novorozence může být prvním projevem onemocnění. Žloutenka v pozdějším věku života může být symptomem výrazného zhoršení jaterní funkce. Dalším projevem bývá hepatomegalie (zvětšení jater) a splenomegalie (zvětšení sleziny). U většiny nemocných může probíhat asymptomaticky několik let. Zvětšení jater a sleziny bývá většinou projevem rozvíjející se jaterní hypertenze. Steatóza jater (zvýšené ukládání tuku v jaterních buňkách) je dalším projevem CF spojované se špatným stavem výživy u dětí. Mírné jaterní steatózy však můžeme zjistit i u pacienta s dobrým stavem výživy v jakémkoli věku. Další onemocnění, které postihuje hepatobiliární systém, je biliární cirhóza, která se nejčastěji diagnostikuje ve školním věku. K jejímu vzniku dochází při dlouhodobé obstrukci žlučových cest [30, 33]. Komplikací jaterních hepatopatií může být portální hypertenze, která vede ke splenomegalii. Projevuje se bolestmi břicha a může vést až k masivnímu krvácení do gastrointestinálního traktu. Další komplikací je výskyt ascitu (zvýšené množství tekutiny v břišní dutině). Téměř vždy se spojuje se závažným snížením funkce jater [30, 33]. Neobvyklým nálezem u pacienta s CF není ani cholelitiáza (přítomnost žlučových kamenů). Její výskyt stoupá s věkem. Komplikací tvorby žlučových kamenů může být biliární kolika, cholecystitida (zánět žlučníku) nebo obstrukce žlučových cest. Tyto komplikace se však vyskytují vzácně [30, 33]. 18

21 Cystická fibróza Reprodukční systém Mužský reprodukční systém Udává se, že až 98 % mužů s CF trpí neplodností, jejímž důvodem je obstruktivní azoospermie (nedostatek až nepřítomnost živých spermií v semenu). Je pravděpodobné, že toto postižení vzniká již před narozením, a to z důvodu ucpání vývodů vazkým hlenem. Spermie mužů s CF se u většiny případů tvoří normálně a mají normální pohyblivost, ale z důvodů již uvedené obstrukce se nedostávají do ejakulátu. U pacientů bývá opožděná puberta, většinou o dva roky. Tito muži mohou vést normální sexuální život a v dospělém věku se mohou stát i biologickými otci pomocí asistované reprodukce [30, 32, 33]. Ženský reprodukční systém I u žen s CF může být jejich plodnost snížena. Nejčastější příčinou je přítomnost vazkého hlenu v cervikálním kanálu. Ten může způsobovat obtíže při oplodnění. Puberta, stejně tak jako u mužů, může být opožděna o jeden až dva roky. Asi 10 % žen trpící CF nezačne vůbec menstruovat a přibližně u 17 % žen může dojít k ztrátě menstruace. Důvodem je těžká podvýživa a respirační problémy. U žen s CF můžeme nalézt polypy na děložním čípku a vaječníky mohou být postiženy cystami. [30, 32, 33] Potní žlázy O poruše sekrece potních žláz jsou zmínky již od středověku. Jde nejspíše o první projev cystické fibrózy, který se popisuje v literatuře. V 50. letech 19. století byl popsán potní test založený na podkladě anomálií potních žláz. U pacientů s CF je výskyt chloridů v potu pětkrát větší než u nepostižených jedinců. Projevem poruchy potních žláz je tvorba krystalků na kůži, jiné projevy se vyskytují ojediněle. Pokud ale dojde k nadměrnému pocení, které může být způsobeno horečkou nebo extrémní okolní teplotou, dochází ke ztrátě chloridů vyvolávající dehydrataci, následně pak metabolickou alkalózu vedoucí až k hypoelektrolytemickému šoku. Klinicky se pak metabolická alkalóza projevuje nechutí k jídlu, neprospíváním a zvracením. Takovýmto pacientům by se měla přisolovat potrava a co nejméně je vystavovat nadměrnému pocení [30, 32, 33]. 19

22 Cystická fibróza Tabulka č. 2. Shrnutí klinických projevů a komplikací cystické fibrózy. Příčina Postižení Projevy Pulmonární Vedlejší nosní dutiny Rhinitidy Sinusitidy Nosní polypózy Bronchopulmonární Kašel Obstrukce dýchacích cest Paličkovité prsty Atelektázy Bronchiektázie Pneumotorax Hemoptýza Gastrointestinální Jícen Gastroezofageální reflux Ezofagitidy Pankreas Insuficience vnější sekrece pankreatu Pankreatitidy Diabetes mellitus Tenké střevo Mekoniový ileus Sy distální intestinální obstrukce Tlusté střevo Fibrotizující kolonopatie Prolaps rekta Hepatobiliární Játra Steatóza Fokální biliární cirhóza Multilobuární cirhóza Portální hypertenze Žlučové cesty Mikrožlučník Cholelitiáza Stav výživy Malnutrice, neprospívání Deficit vitamínů A,D,E,K Osteoporóza Potní žlázy Syndrom ztráty solí Dehydratace Metabolická alkalóza Hypoelektrolytémický šok Reprodukční muži Obstrukční azoospermie ženy Interfertilita Upraveno podle [15,30,33]. 2.7 Diagnostika CF Diagnóza CF musí být stanovena co nejdříve a spolehlivě, aby se zabránilo pozdějším závažným komplikacím tohoto onemocnění. Diagnostikuje se na základě diagnostických kritérií, která spočívají v přítomnosti jednoho nebo více klinických projevů, pozitivní rodinné anamnéze, popřípadě pozitivního novorozeneckého screeningu [30]. CF však nemůže být diagnostikována pouze na základě symptologie, musí být potvrzena i laboratorním vyšetřením [28]. Prokazuje se abnormální funkce 20

23 Cystická fibróza CFTR genu dokumentovaná vysokou koncentrací chloridů v potu (patologické hodnoty nad 60 mmol/l), přítomností dvou mutací genu CFTR, popřípadě poruchou transportu elektrolytů nosním epitelem [15, 30]. U 98 % pacientů je CF diagnostikována na základě klinických projevů. Nesmí se však zapomínat, že u 2 % postižených probíhá takzvaná atypická forma CF. Jde o pacienty s hraniční nebo normální koncentrací chloridů v potu, pankreatickou suficiencí, nepřítomností mekoniového ilea a hepatitid [15, 30] Potní test První, kdo objevil, že pacienti trpící CF mají zvýšenou koncentraci chloridů v potu, byl v roce 1952 Paul di Sants Agnese se svými spolupracovníky. Tento objev se stal praktickým po zavedení pilokarpinové iontoforézy pány Gibsonem a Cookem. Od té doby je potní test považován za základní diagnostický test pro cystickou fibrózu [11, 18, 19, 30]. Je velmi důležité, aby byl tento test prováděn zkušenými pracovníky v laboratoři, která provádí minimálně pět potních testů týdně [32]. Dále je potřeba získat dostatečné množství potu a tento test opakovat minimálně dvakrát. Potní test je založen na stimulaci pocení pilokarpinovou iontoforézou a kvantitativním stanovením koncentrace chloridů v potu [30]. U pacientů, kterým je naměřena koncentrace chloridů v potu vetší než 60 mmol/l, je pravděpodobná diagnostika CF. Pokud je koncentrace chloridů v potu do 30 mmol/l, jedná se ve většině případů o nepostižené jedince. Hraniční hodnota, taková, která ani nepotvrdí ani nevyvrátí CF, je mmol/l [13, 18, 35]. Nesmí se však zapomínat, že u 5-10 % nepostižených jedinců může být koncentrace chloridů v potu fyziologicky zvýšená. Dále je koncentrace zvýšená u přenašečů mutace způsobující CF a i u novorozenců v prvních dvaceti čtyřech dnech života, proto se při interpretaci výsledků musí přikládat váha k věku vyšetřovaného pacienta [19]. Aby se tedy předešlo falešně negativním, či pozitivním výsledkům, se tento test opakuje minimálně dvakrát a u všech pacientů s pozitivními, či hraničními výsledky je potní test doprovázen molekulárně genetickým vyšetřením, které vyvrátí nebo potvrdí diagnózu CF. 21

24 Cystická fibróza Obr. č. 2. Pilokarpiniová iontoforéza, kterou se získává pot k vyšetření koncentrace chloridů Převzato z [32] Molekulárně genetické vyšetření Při molekulárně genetickém vyšetření se detekují mutace CFTR genu. Tato vyšetření se provádí u izolované DNA z postnatálních vzorků, kdy se odebírá periferní krev. Dále je můžeme provádět z prenatálních vzorků, kdy se odebírají choriové klky, plodová voda či pupečníková krev. K molekulárně genetickému vyšetření můžeme využít i preimplantační vzorek, což může být pólové tělísko nebo dvě odebrané buňky z embrya. Laboratoř GENvia, s.r.o. přijímá ke genetickému vyšetření prenatální a postnatální vzorky, ze kterých se izoluje DNA. Postnatální diagnostika Mutace CFTR genu se vyšetřují pomocí přímé nebo nepřímé DNA diagnostiky. Vyšetřují se již narození jedinci pro potvrzení klinického podezření CF. Dále postnatální diagnostika slouží k indikaci prenatálního vyšetření v dalším těhotenství. Při odhalení mutace u vyšetřovaného jedince se pak provádí další postnatální vyšetření příbuzných ke stanovení případného přenašečství možných mutací. Jak přímá, tak nepřímá diagnostika CF může být založena na amplifikaci konkrétního úseku DNA, o kterém je známo, že obsahuje časté mutace [22]. K vyšetření CFTR genu se ale mohou využívat i jiné molekulárně genetické postupy, založené na reverzní hybridizaci, 22

25 Cystická fibróza sekvenaci DNA, restrikční analýze nebo metodě MLPA. K tomuto vyšetření je potřeba mít informovaný souhlas pacienta, popřípadě zákonného zástupce [1]. Přímá diagnostika U přímé diagnostiky se identifikuje určitá mutace přímo. Musí se však přesně znát gen, jehož mutace způsobuje dané onemocnění. V případě CF jde o gen CFTR na chromozomu 7. Ke stanovení diagnózy postačí pouze vyšetření postiženého jedince [14]. Provádí se kaskádovité vyšetření nejčastějších mutací genu CFTR. Poměrně využívanou metodou v současné době je Průkaz 50 mutací v CFTR genu kitem ELUCIGENE CF - EU2. Tento kit umožňuje záchyt 90,66 % mutací [23], které se vyskytují na území České republiky. Tabulka č nejrozšířenějších mutací CFTR na území ČR MUTACE MOLEKULÁRNÍ PATOGENEZE % 1 F508del Delece Phe na pozici ,0 2 CFTRdele 2,3 Delece exonů 2 a 3 5,5 3 G551D Gly za Asp na pozici 551 3,8 4 N1303K Asn za Lys na pozici ,9 5 G542X Nestabilní mrna 2, G-A Sestřihová porucha mrna 2, del T Posun se stop kodonem 1,2 8 R437P Arg za Pro na pozici 347 0, kb C T Sestřihová porucha 0,6 10 W1282X Nestabilní mrna 0,6 Upraveno podle [2, 30] Nepřímá diagnostika Nepřímá diagnostika je využívána v případě, kdy není možné identifikovat kauzální mutaci. Je třeba vyšetřit daného jedince, ale i jeho rodinu. Využívá se polymorfních úseků (tzv. genových markerů), které jsou v těsné vazbě se zkoumaným genem. Čím těsnější vazbu tvoří polymorfismus s daným genem, tím je pravděpodobnost crossing overu nižší a má i méně falešných výsledků. Integrované polymorfismy jsou takové genové markery, které se nacházejí přímo v daném genu. S použitím těchto markerů počet falešných výsledků klesá na minimum [14, 22, 30, 33]. 23

26 Cystická fibróza Prenatální diagnostika Prenatální diagnostika CF je založena na vyšetření mutace v CFTR genu v časném těhotenství. Pro toto vyšetření se provádí biopsie choriových klků v týdnu těhotenství nebo amniocentéza, což je odběr plodové vody v týdnu těhotenství. V ojedinělých případech se provádí v 21. týdnu kordocentéza neboli odběr pupečníkové krve z vena umbilicalis [14, 30]. Každý odběr musí provádět zkušený gynekolog, za použití ultrazvuku, aby bylo minimalizováno riziko poškození plodu. Využívá se molekulárně genetických metod, kde je z DNA plodu možné určit, zda se dítě narodí postižené nebo zdravé bez výskytu mutace nebo zda bude přenašečem pro danou mutaci. Toto vyšetření je nabízeno všem rodinám, které mají riziko vzniku CF 25 %. Stejně tak jako u postnatálního vyšetření využíváme přímé diagnostiky DNA, a to u rodin, kde jsou známy obě mutace v CFTR genu [32, 33]. U rodin, kde je známa jen jedna nebo žádná mutace, se využívá nepřímá diagnostika DNA. Ve většině případů se molekulárně genetické vyšetření doplňuje biochemickým vyšetřením plodové vody, hlavně se měří aktivita GGT v týdnu těhotenství, kdy bývá vyšetření nejspolehlivější [30, 32, 33]. Pokud je GGT v plodové vodě snížené pod 3. percentil, je pravděpodobné, že plod trpí CF. Riziko chybné diagnózy je pouze 1-2 % [1, 30]. Přesto je toto vyšetření doprovázeno ultrazvukovým vyšetřením, které sleduje hyperechogenitu dutiny břišní u plodu, což se po porodu může projevit mekoniovým ileem novorozence [32]. Obě komplikace plodu mají za následek postižení pankreatu a ucpání ilea, což způsobuje malabsorpci plodu. [1] Tyto parametry nemusí být abnormální pouze u CF, ale můžou se vyskytovat i u vrozených vývojových vad, chromozomových aberací nebo virových infekcí [1, 30]. V případě, že se u plodu prokáže klasická forma CF, je zákonem České republiky povoleno přerušit do 24. týdne těhotenství. Zákrok je však proveden pouze po svobodném rozhodnutí obou rodičů, a to na základě získání co nejpřesnějších a nejpodrobnějších objektivních informacích od genetického poradce [30]. Preimplantační diagnostika Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je nejnovější metodou včasné prevence CF [32, 33]. Tato metoda spočívá v in vitro oplodnění několika vajíček. Po proběhnutí prvního dělení se z 8 buněčných embryí odebere jedna nebo dvě buňky (tzv. blastomery), ty se pak použijí pro molekulárně genetické vyšetření [14]. Tento zákrok je 24

27 Cystická fibróza možné provádět, aniž by došlo k poškození vývoje plodu. Z této diagnostiky můžeme rozpoznat, která embrya budou postižená a která budou zdravá [22]. Preimplantační vyšetření se může provádět i z pólového tělíska, kdy se nemusí zasahovat do vývoje embrya biopsií blastomer [14, 30]. Zdravá embrya se pak implantují do dělohy matky. Toto vyšetření, ačkoli je spolehlivé, se doporučuje ověřovat v týdnu těhotenství prenatální diagnostikou [30, 32, 33]. Tím je možné předejít narození postiženého plodu. PGD je indikovaná hlavně tam, kde předchozí prenatální diagnostika vedla k opakovaným potratům, dále ženám, které podstupují asistovanou reprodukci z jiných příčin nebo rodinám, které odmítají přerušení gravidity, například z náboženských důvodů [1, 30]. Obr. č. 3. Schéma preimplantační diagnostiky. Upraveno podle [22] Transepiteliální rozdíl potenciálů Za nejdůležitější testy pro diagnostiku CF jsou považovány potní test a molekulárně genetické vyšetření. Pokud je však diagnóza CF po provedení těchto testů nejasná, což se stává výjimečně, použije se metoda transepiteliálního rozdílu potenciálů. Měření probíhá in vivo mezi epitelem nosní sliznice a podkožím. Tato metoda byla popsána Knowlesem roku 1981 a v Evropě se provádí jen na několika málo pracovištích. V České republice nebyla tato metoda dosud zavedena [30] Novorozenecký screening Novorozenecký screening (NS) byl zaveden v návaznosti na zprávu J. R. Crossley et al. v roce 1979, která říká, že koncentrace imunoreaktivního trypsinogenu se 25

28 Základní molekulárně genetické principy zvyšuje u pacientů s CF [17]. Slouží k časné diagnostice CF. Rozpoznání časné diagnostiky tohoto onemocnění je velmi důležité [13]. Studie prokazují, že pokud se CF diagnostikuje do dvou měsíců života, má pacient, v důsledku časného zahájení léčby, lepší nutriční stav, lepší funkci plic a především dochází ke snížení počtu úmrtí pacientů s CF v raném dětství. Pozdní diagnostika, která bohužel není vzácná, může vést často k mnoha komplikacím a hospitalizacím [1, 30]. Od roku 2005 v ČR probíhal dvouletý projekt novorozeneckého screeningu CF. Cílem tohoto projektu bylo zjistit, zda je screening efektivní z hlediska včasné diagnózy tohoto onemocnění. Tento projekt splnil všechna kritéria stanovená WHO pro jeho celoplošné zavedení. V současně době je novorozenecký screening zaveden v mnoha zemích, včetně ČR i USA [1, 30]. NS se provádí ze suché kapky krve z patičky v hodině života novorozence. Vyšetřuje se koncentrace imunoreaktivního trypsinogenu (IRT), který produkují pankreatické aciny. U CF dochází k blokádě pankreatických vývodů, a tak trypsinogen proniká do cirkulace [5, 9, 12, 30]. U novorozenců s CF je koncentrace IRT zvýšena (nad 60 µg/ l) [5]. Tento test však není specifický. Ke zvýšení hladiny IRT může přechodně dojít i u normálních dětí. Proto se test po 21. dni života opakuje. Pokud je koncentrace IRT znovu zvýšena, provádí se molekulárně genetické vyšetření nebo potní test [9, 17, 30]. Centra, která se zabývají screeningem CF, musí spolupracovat s genetickým poradenstvím a centry pro cystickou fibrózu, aby byla zajištěna okamžitá léčba všech diagnostikovaných pacientů [30]. 3 Základní molekulárně genetické principy Gen CFTR je možno detekovat mnoha různými metodami, které jsou založeny na různých principech. Tato kapitola se věnuje převážně molekulárně genetickým principům, které jsou využívány při detekci CFTR genu v akreditované laboratoři GENvia s.r.o. V laboratoři se využívá tří akreditovaných metod, z nichž dvě jsou založeny na amplifikaci DNA (PCR metoda) s následnou analýzou pomocí kapilární elektroforézy, a třetí je založena na amplifikaci DNA s následnou reverzní hybridizací. DNA je získáváno izolací, pomocí kitu QIAamp DNA Blood Mini, ze vzorků periferní krve, choriových klků, plodové vody či fetální krve. Pod dohledem odborného pracovníka laboratoře mi bylo umožněno si izolaci DNA z periferní krve a všechny tři 26

29 Základní molekulárně genetické principy akreditované metody vyzkoušet. Konkrétněji se popisu izolace DNA a těchto metod věnuji v kapitole č Preanalytická fáze a v kapitole č. 5.3 Přehled metod. Další metody, které se mohou být využity při detekci mutací v CFTR genu, jsou založeny na principu MLPA, sekvenování DNA dle Sangera nebo restrikční analýza v agarozovém gelu. 3.1 Metoda PCR Polymerázová řetězová reakce neboli PCR je amplifikační metoda, která slouží k amplifikaci (zmnožení) daných úseků DNA. Objevitelem metody PCR byl roku 1985 Karl Mullis. Principem metody je replikace DNA, kdy jako primery slouží oligonukleotidy DNA, nikoli molekuly RNA [14, 22] Fáze PCR Metoda se skládá ze tří základních kroků: denaturace, hybridizace a elongace. Cyklus těchto tří kroků se opakuje až třicetkrát, aby se úsek DNA amplifikoval na dostatečný počet kopií [22]. 1. Denaturace Denaturace je proces, kdy z dvouvláknové DNA vznikají dva řetězce jednovláknové DNA. Denaturace probíhá za zvýšené teploty, zpravidla větší než 90 C, kdy dojde k rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi DNA a dvoušroubovice se tak rozdělí na dvě části [14, 22]. 2. Hybridizace Při hybridizaci, neboli annealingu primerů, dochází ke komplementárnímu navázání primerů na cílovou sekvenci DNA. Tento krok probíhá při teplotě C [14, 22, 27]. 3. Elongace Při elongaci neboli syntéze nukleotidových řetězců, jsou pomocí DNA polymerázy přiřazovány nové nukleotidy, a tím dochází k prodlužování řetězce DNA ve směru 5 3. Poslední krok jednoho cyklu probíhá při teplotě C [14, 22, 27, 29]. Každý cyklus trvá sekund. Dochází ke zdvojnásobení množství cílového úseku DNA, který je ohraničen primery, a exponenciálnímu nárůstu cílové DNA, kdy po n cyklech vzniká 2 n kopií dané sekvence DNA [14, 22, 27, 29]. 27

30 Základní molekulárně genetické principy Obr. č. 4. Princip PCR. Upraveno podle: Reagencie a technické vybavení pro PCR Reakční směs Reakční směs obsahuje PCR pufr, který obsahuje Tris-HCl pufr, který udržuje optimální ph, KCl, který je nezbytný pro navázání primeru a hořečnaté ionty, které jsou kofaktorem DNA polymerázy. Dále jsou v reakční směsi deoxyribonukleotidy (datp, dgtp, dctp, dttp), které slouží jako základní stavební kameny při tvorbě nových řetězců. Taq DNA polymeráza (termostabilní) je izolována z bakterie Thermus aquaticus, která přežívá v teplotách větší než 90 C. Funkcí polymerázy je přiřazování jednotlivých nukleotidů k templátu DNA dle komplementarity bazí a vytvářet tak dvojřetězcovou DNA. Nedílnou součástí reakční směsi jsou i dva primery, což jsou oligonukleotidové sekvence, které jsou navržené tak, že jeden je komplementární k jednomu denaturovanému řetězci DNA a druhý je komplementární k druhému řetězci. Oba primery tak, každý z jedné strany, ohraničují cílovou sekvenci DNA [22, 27, 29]. Termocykler Termocykler je přístroj, ve kterém probíhá reakce PCR. Tento přístroj je schopen automaticky měnit teplotu v určitých časových intervalech. Uvnitř přístroje je 28

31 Základní molekulárně genetické principy umístěn kovový blok s otvory, do kterých vkládáme mikrozkumavky s reakční směsí a cílovou DNA [14]. Obr. č. 5. Termocykler Převzato z Využití PCR Metoda PCR se využívá k detekcím geneticky podmíněných chorob, které bývají často vyvolávány mutací daného genu. Příkladem je právě cystická fibróza nebo Duchennova svalová dystrofie. Dále se poměrně často využívá v prenatální diagnostice, při určení pohlaví nebo při diagnostice dalších dědičných chorob. Může se využívat i k identifikaci infekčního onemocnění způsobeného bakteriemi i viry, kdy se může ve vzorku pacientovi krve detekovat přítomnost virové nebo bakteriální DNA, popřípadě RNA [14, 22]. Tato metoda má obrovský význam nejen v lékařství, ale i ve forenzní medicíně a v archeologii. Pomocí PCR je možné amplifikovat téměř nepatrné množství DNA a využít ho k další analýze, která v případě forenzní genetiky pomůže identifikovat pachatele. V archeologii se využívá především k amplifikaci DNA z kosterních pozůstatků. [14] Výhody a nevýhody PCR Výhody PCR Metoda PCR je v současné době velmi rozšířenou metodou, kterou využívají všechny molekulárně genetické laboratoře. Mezi výhody této metody můžeme zařadit vysokou citlivost, kdy k analýze postačí pouze jedna molekula DNA. Další výhodou je 29

32 Základní molekulárně genetické principy rychlost, její vysoká rozlišovací schopnost, bezpečnost práce, a skutečnost, že amplifikovanou sekvenci DNA je možno dále využít k dalším analýzám [14]. Nevýhody PCR Nevýhodami této metody je délka amplifikovaného úseku, kdy nemůžeme amplifikovat příliš dlouhý úsek sekvence DNA. Dále je nutné přesně znát ohraničující sekvence vyšetřované DNA pro zvolení správné komplementárního primeru. Někdy může také dojít ke kontaminaci cizorodou DNA nebo k nepřesné replikaci, kdy při elongaci řetězce může dojít k špatnému zařazení nukleotidu a vzniku mutace, která by se následně přenesla do dalšího cyklu [14]. 3.2 Elektroforéza Elektroforéza je elektromigrační metoda, která je založena na separaci molekul na základě rozdílné pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli. Pomocí molekulárního síta, které je většinou tvořeno z polymerních vláken, dochází k separaci fragmentů nukleových kyselin dle jejich různé velikosti. Kratší fragmenty se pohybují rychleji, než ty delší. Přítomnost záporných fosfátových skupin dává DNA i RNA záporný náboj, tudíž migrují ke kladně nabité elektrodě (anodě). Touto metodou se docílí úplného oddělení všech fragmentů s odlišnou molekulovou hmotností. Nejčastěji se v laboratořích využívá elektroforéza kapilární nebo gelová [14, 22, 27]. V molekulární biologii se elektroforéza využívá k ověření kvality vzorku DNA, dále k detekci některých mutací, jak při přímé, tak i nepřímé diagnostice, a může se využít i při sekvenování DNA nebo klonování [14, 27] Kapilární elektroforéza Při kapilární elektroforéze dochází k oddělení molekul uvnitř kapiláry, která je naplněna elektrolytem. Délka kapiláry je většinou 20 až 50 cm [27]. Kapilára je umístěna mezi dvě nádoby naplněné elektrolytem, ve kterých jsou umístěny elektrody. V jedné nádobě je elektroda s kladným nábojem (anoda), v druhé je pak elektroda se záporným nábojem (katoda). Po vložení stejnosměrného proudu putuje nukleová kyselina směrem od katody k anodě. Detekce je umožněna pomocí monochromatického světla, které je absorbováno procházejícími molekulami. Detektor je propojen s počítačem se speciálním programem, který vyhodnocuje naměřená data pomocí grafického znázornění [14]. 30

33 Základní molekulárně genetické principy Pokud je elektrolyt nahrazen gelem, mluvíme o gelové kapilární elektroforéze. Vizualizaci fragmentů provádíme pomocí fluorochromů, kterými značíme vyšetřovanou DNA, kdy zdrojem záření je laser [14, 27] Gelová elektroforéza Při gelové elektroforéze dochází k separaci molekul za použití agarózového nebo polyakrylamidového gelu. Agarózový gel se využívá k separaci delších fragmentů nukleových kyselin, naopak polyakrylamid má velmi husté molekulární síto a slouží k separaci převážně kratších fragmentů. Gel se vloží do vaničkové aparatury, do které jsou na koncích zavedené elektrody, a zalije se pufrem. Do jamek v gelu se napipetuje DNA a aparatura se připojí ke stejnosměrnému proudu. K vizualizaci DNA a elektroforetickému gelu se přidá fluorescenční barvivo, které září v ultrafialovém světle. Nejčastěji využívaným fluorescenčním barvivem je ethidium bromid, který je schopen se inkorporovat do dvoušroubovice DNA. K zviditelnění dochází pomocí transluminátoru, který vydává UV záření [14]. 3.3 Reverzní hybridizace Hybridizace obecně je komplementární spojení dvou vláken DNA, přičemž jedno vlákno je vyšetřovaná DNA a druhé vlákno je umělé připravený úsek DNA, který se nazývá sonda. [14]. Pokud jde o reverzní hybridizaci, neznačené sondy, jejichž sekvence odpovídá vyšetřované DNA, jsou zafixovány na pevném podkladě. V případě analýzy mutací CFTR jsou sondy na proužcích (stripech) nitrocelulózové membrány. Sonda obsahuje běžnou (wild type) sekvenci nebo mutovanou sekvenci. PCR produkty jsou značeny biotinem a po vymytí nenavázaných PCR produktů se přidá streptavidinem konjugovaná alkalická fosfatása. Po přidání chromogenního substrátu dochází ke vzniku hnědofialových proužků [27]. 31

34 Základní molekulárně genetické principy Obr. č. 6. Princip reverzní hybridizace na nitrocelulózové membráně (1). Neznačená DNA sonda obsahující zdravou (2) nebo mutovanou (3) sekvenci. Na konci 5 primeru navázaný biotin (4). Přidá se streptavidinem konjugovaná alkalická fofatása (5). Přidá se chromogenní substrát (6), dojde k enzymatické změně vlastností a vzniku barevného produktu. Převzato z [27]. 3.4 Další molekulárně genetické principy Metoda MLPA Metoda MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) je založena na hybridizaci sondy s vyšetřovanou DNA a následné amplifikaci sondy pomocí PCR. Výhodou této metody je schopnost analyzovat větší počet úseků sledované DNA. V případě CFTR genu se MLPA využívá k detekci větších přestaveb, zahrnujících delece či duplikace jednoho či více exonů. S každým úsekem DNA hybridizují dvě sondy, ležící v těsné blízkosti, které jsou následně propojeny DNA ligázou. Tento produkt se dále amplifikuje pomocí PCR. Všechny sondy jsou amplifikovány stejnou dvojicí primerů, přičemž každý amplifikovaný úsek má svoji specifickou délku. Analýza amplikonů se provádí pomocí kapilární elektroforézy [14]. 32

35 Základní molekulárně genetické principy Obr. č. 7. Princip metody MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe) Upraveno podle Sekvenování DNA dle Sangera Pomocí sekvenování DNA je možné stanovit přesnou sekvenci nukleotidů v molekule DNA (popř. RNA). Sangerova metoda je založena na schopnosti DNA polymerázy přiřazovat komplementární báze k vláknům vyšetřované DNA ve směru 5 3. Jedná se vlastně o modifikaci PCR reakce, kdy reakční směs obsahuje jeden primer, komplementární k počátku vyšetřované DNA, DNA polymerázu, deoxynukleosidtrifosfáty (datp, dttp, dctp, dgtp) a dideoxynukleosidtrifosfáty (ddntp). Dideoxynukleosidtrifosfáty jsou značeny fluorescenčně, postrádají 3 OH skupinu, na kterou už DNA polymeráza nedokáže nasednout, a tudíž se po jeho zařazení tvorba řetězce zastaví. Tímto způsobem dochází ke vzniku velkého počtu fragmentů DNA o různé velikosti. Fragmenty se rozdělí pomocí kapilární elektroforézy a dle specifického fluorescenčního barviva na konci fragmentu se zjistí, kterým ddntp byla syntéza ukončena. Pořadí ddntp pak určuje sekvenci vyšetřované DNA [14, 27]. Obr. č. 8. Princip sekvenování DNA dle Sangera Převzato z [14]. 33

36 Základní molekulárně genetické principy Restrikční analýza Restrikční analýza je metoda, která umožňuje detekci bodových mutací na základě štěpení DNA restrikční endonukleasou. Restrikční endonukleásy mají schopnost rozpoznat konkrétní místo v sekvenci DNA, tzv. restrikční místo, ve kterém je DNA štěpena na menší fragmenty. Pokud však dojde ke změně sekvence v restrikčím místě, ke štěpení nedojde, což vypovídá o přítomnosti mutace v dané sekvenci [14,27]. 34

37 Cíle práce 4 Cíle práce Cílem práce bylo: 1. Vypracování přehledu všech metod, detekující mutace v CFTR genu, které jsou prováděny v akreditované laboratoři GENvia, s.r.o. a porovnat je mezi sebou. 2. Soubor 2487 pacientů, vedený v laboratoři GENvia, s.r.o. za časové období 2010 až 2013, roztřídit do skupin dle jednotlivých diagnóz. Dále nalézt v tomto souboru všechny mutace CFTR genu detekované v laboratoři za již zmíněné období a porovnat tyto nálezy s výskytem veškerých mutací, které byly detekovány v české populaci. 35

38 Praktická část 5 Praktická část Ke zpracování praktické části této práce jsem využila údaje molekulárně genetických nálezů v CFTR genu, které mi poskytla akreditovaná laboratoř GENvia, s.r.o. Pracovala jsem s údaji, které byly nasbírány za časové období Během těchto let bylo vyšetřeno celkem 2487 vzorků. K molekulárně genetickému vyšetření DNA byly použity vzorky DNA vyizolované z lymfocytů z periferní krve, popřípadě z choriových klků, plodové vody nebo fetální krve, jejichž zpracování proběhlo dle zavedených postupů v laboratoři GENvia, s.r.o. K izolaci DNA byl použit izolační kit QIAamp DNA Blood Mini. Mutace v CFTR genu byly vyšetřovány pomocí tří akreditovaných molekulárně genetických metod genetické laboratoře GENvia, s.r.o. s názvy Molekulární diagnostika mutací v genu CFTR (Cystická fibróza), Průkaz 50 mutací v CFTR genu kitem ELUCIGENE CF EU2 a Průkaz 36 mutací v CFTR genu kitem Devyser CFTR Core. 5.1 Diagnózy Všechny nálezy za časové období jsem rozdělila do skupin podle diagnóz za pomoci příručky MKN (Mezinárodní Klasifikace Nemocí). U jednotlivých diagnóz jsem pak vyhledávala případy s nálezy mutace v CFTR genu Skupiny diagnóz U každého nálezu byla uvedena diagnóza pod určitým kódem, který lze dohledat v příručce MKN. Jde o příručku, která obsahuje seznam diagnóz. U zpracovaných údajů byl poměrně velký počet diagnóz, ze kterých byly následovně vytvořeny 3 skupiny: Mužská neplodnost Dárci pohlavních buněk Jiné diagnózy Do této skupiny jsem zařadila diagnózy, které nespadají do dvou výše uvedených skupin. V této skupině jsou zařazeny především případy, kdy nebylo primárně indikováno vyšetření CFTR genu. Vzorek přišel do laboratoře pod jinou diagnózou a až dodatečně bylo indikováno vyšetření CFTR genu. Dále sem byly zařazeny diagnózy související s potraty či prenatálním vyšetřením. 36

39 Praktická část 5.2 Preanalytická fáze Příjem vzorku Přijímané vzorky periferní krve určené pro molekulárně genetické vyšetření CFTR genu jsou odebírány do zkumavek s fialovým uzávěrem obsahujících EDTA (Etylendiaminotetraoctová kyselina). Při příjmu vzorku je nutno pečlivě zkontrolovat, zda je zkumavka řádně a čitelně označena. Vzorek musí být doprovázen správně vyplněnou žádankou s přiloženým informovaným souhlasem pacienta. Pokud nejsou tyto požadavky splněny, laboratoř má právo vzorek odmítnout. Dále se tato data zadávají do informačního systému laboratoře a vzorek je co možná nejdříve po přijetí zpracován Izolace DNA Po příjmu vzorku k molekulárně genetickému vyšetření CFTR genu je nutno provést izolaci DNA z periferní krve, případně z plodové vody, ev. jiné tkáně. Laboratoř GENvia, s.r.o. využívá k izolaci DNA kit QIAamp DNA Blood Mini. QIAGEN Proteasa, pomocí které dochází k degradaci bílkovin, se napipetuje do zkumavky a přidá se vzorek (periferní krev, plodová voda, ev. jiné tkáně). Dále se přidá AL lyzační pufr, detergent, který narušuje buněčnou stěnu. Tato směs se promíchá na Vortexu a nechá se inkubovat při teplotě 56 C, dojde k rozkladu bílkovinných i lipidických komponent izolovaných buněk a DNA je uvolněna do roztoku. Po ukončení inkubace se ke vzorku přidává etanol, ve kterém se DNA sráží. Tato směs se znovu promíchá na Vortexu, přenese se do QIAamp Spin kolonek a nechá se centrifugovat po dobu 1 minuty při 6000 g. DNA, která se uvolnila z jader, se absorbuje na QAIamp silikagelovou membránu kolonky, přičemž bílkoviny a jiné kontaminanty, které by mohly rušit při analýze, membránou prochází. Kolonka se vloží do nové zkumavky a zkumavka s eluátem se vyhodí. V dalším kroku se do kolonky přidává promývací pufr AW1. Vzorek se znovu centrifuguje po dobu jedné minuty při otáčkách 6000 g. Po centrifugaci se kolonka vloží do nové zkumavky a zkumavka s eluátem se odstraní. Dále se přidává promývací pufr AW2 a vzorek se centrifuguje po dobu 3 minut při otáčkách g. Zkumavka s eluátem se opět vyhodí a kolonka se vloží do zkumavky, která je označená příjmením pacienta a číslem DNA. Dále se přidá destilovaná voda a vzorek se nechá inkubovat při pokojové teplotě po dobu 1 minuty. Po inkubaci se vzorek centrifuguje po dobu 1 minuty při 6000 g otáčkách. Čistá DNA se 37

40 Praktická část uvolňuje z membrány kolonky do označené zkumavky. Takto izolovaná DNA se skladuje při teplotě -20 C [25]. 5.3 Přehled metod Průkaz 50 mutací v CFTR genu kitem ELUCIGENE CF EU2 Tato metoda umožňuje identifikaci padesáti v evropské populaci nejrozšířenějších mutací a Tn polymorfismu intronu 8 CFTR genu. Metoda je založena na principu multiplexní alelicky specifické PCR amplifikace. Analýza výsledku se provádí za pomoci kapilární elektroforézy a následné vyhodnocení se provádí pomocí speciálního softwaru GeneMapper, který identifikuje PCR produkty dle velikosti a fluorescenční barvy [10]. Amplifikace produktů Pro každý vzorek se připraví zkumavka řádně označená identifikačním číslem vzorku a písmenem A, a to z důvodu, že se přidává Primer mix A. Do jednotlivých zkumavek se napipetuje Master mix, Primer mix A a vyšetřovaná DNA. K sérii vyšetřovaných vzorků se vždy připravuje i negativní kontrola, která obsahuje všechny složky reakční směsi kromě vyšetřované DNA, která je nahrazena deionizovanou vodou. Pro snížení rizika kontaminace vzorku se zmíněné úkony provádějí v digestoři a v ochranných rukavicích. Připravené vzorky se vkládají do termocykleru, kde proběhne multiplexní alelicky specifická PCR za reakčních podmínek uvedených v tabulce č. 4. [10]. Tabulka č. 4. Podmínky PCR reakce pro Kit Elucigene CF-EU2. Složka PCR směsi Teplota Čas Počet cyklů Počáteční 94 C 20 min denaturace Denaturace 94 C 60 s Annealing 57 C 120 s Elongace 72 C 60 s Konečná elongace 72 C 20 min 30 cyklů Upraveno podle [10]. 38

41 Praktická část Analýza PCR produktů Amplikony jsou analyzovány pomocí kapilární elektroforézy na přístroji 3130 Genetic Analyzer. Pro analýzu je nutno smíchat velikostní markér a formamid. Tato směs se pak pipetuje do jamek na 96jamkové destičce, ke které se jednotlivě přidává PCR produkt ze směsí A. Destička se vloží do analyzátoru, nastaví se požadovaný program a spustí se analýza [10]. Interpretace výsledků Jednotlivé fragmenty jsou rozděleny pomocí kapilární elektroforézy a následně vizualizovány pomocí fluorescenčních barviv. Výsledky analýzy se hodnotí pomocí analytického softwaru GenneMapper. Nejdříve je analyzována směs A, ve které jsou detekovány mutantní sekvence, které jsou znázorňovány jako modré píky. Dále směs A obsahuje normální alelu F508, pomocí které můžeme rozlišit, zda se jedná o normálního jedince F508 (přítomnost pouze zeleného píku), nebo heterozygotního jedince pro F508del (přítomnost modrého i zeleného píku), nebo jde o homozygotního jedince pro F508del (zelený pík není přítomen). Ve směsi A jsou ještě detekovány polymorfismy Tn intronu 8, které jsou zobrazovány jako černé píky. V případě nálezu jiné mutantní sekvence než F508del je dle postupu uvedeného výše připravena a analyzována směs B vyšetřovaného pacienta, kde jsou detekovány nemutantní sekvence znázorňované jako zelené píky. Výsledky ze směsi B nám umožní zjistit, zda se mutace vyskytuje v homozygotním či heterozygotním stavu. U jedince v homozygotním stavu zelený pík není přítomen a u jedince v heterozygotním stavu je pík přítomen, ale dochází ke snížení původní výšky píku [10]. 39

42 Praktická část Obr. č. 9. Detekce mutace N1303K v heterozygotním stavu pomocí kitu ELUCIGENE CF-EU2. Směs A Obrázek znázorňuje mutantní alelu N1303K v podobě modrého píku, zelený pík znázorňuje F508del wt (wild type) a černé píky znázorňují polymorfismus intronu 8, označovaný jako Poly T (polythymidinový trakt). V tomto případě se jedná o kombinaci 7T/9T, což znamená, že poly T má na jedné alele 7 reptic Thyminů a na druhé 9. Obr. č. 10. Detekce mutace N1303K v heterozygotním stavu pomocí kitu ELUCIGENE CF EU2. Směs B. Přítomnost zeleného píku u N1303K potvrzuje heterozygotní stav. 40

43 Praktická část mutací v CFTR genu kitem Devyser CFTR Core Kit Devyser CFTR Core umožňuje detekci 36 mutací CFTR genu a tří variant polymorfismu intronu 8. Metoda je založena na principu multiplexní alelicky specifické PCR amplifikaci a následné detekci mutovaných a nemutovaných alel. Amplifikované fragmenty jsou hodnoceny kapilární elektroforézou na genetickém analyzátoru a identifikovány jsou dle své délky a fluorescenčního barviva [8]. Příprava reakčních mixů Reakční mixy pro všechny vzorky se připravují následovně: do zkumavky s PCR aktivátorem se přidá mix Core 1 nebo mix Core 2, Master mix se promísí na třepačce, zcentrifuguje a skladuje se při -18 C [8]. Amplifikace produktů Každý vzorek se musí testovat jak mixem Core 1, tak mixem Core 2. K připraveným mixům Core 1 a Core 2 se přidává vyšetřovaná DNA. Jako u předešlé metody se ke vzorkům připravuje negativní kontrola, kdy se DNA vyšetřovaného jedince nahrazuje deionizovanou vodou. Připravenou směs lehce stočíme a vložíme do termocykleru, kde proběhne zmnožení produktů za reakčních podmínek uvedených v tabulce č. 5. [8]. Tabulka č. 5. Podmínky PCR reakce pro Kit Devyser CFTR Core. Složka PCR směsi Teplota Čas Počet cyklů Počáteční 95 C 15 min denaturace Denaturace 94 C 30 s Annealing 62 C 60 s Elongace 72 C 60 s 29 cyklů Koncová elongace 72 C 15 min Upraveno podle [8]. Analýza PCR produktů Před vložením do analyzátoru napipetujeme do jamek mikrotitrační destičky nanášecí směs (formamid a velikostní standard) a přidáme PCR produkt. Takto 41

44 Praktická část připravenou destičku vložíme do analyzátoru, který pracuje na principu kapilární elektroforézy, nastavíme příslušný program a spustíme analýzu [8]. Interpretace výsledků Po elektroforéze a laserové detekci jsou data analyzována pomocí programu GenneMapper. Analýza se prováděla se dvěma oddělenými Core mixy. Core mix 1 detekuje nemutované zdravé alely a Core mix 2 detekuje odpovídající mutantní alely a polymorfismy intronu 8. Pokud jde o mutaci v heterozygotním stavu, jsou dané píky přítomny v obou Core mixech, pokud jde však o mutaci v homozygotním stavu, pík detekované alely je přítomen pouze v mixu Core 2, nikoli v mixu Core1 [8]. Obr. č. 11. Detekce mutace N1303K v heterozygotním stavu pomocí kitu Devyser CFTR Core. Core 1. Obrázek znázorňuje wt (wild type) sekvence. Obr. č. 12. Detekce mutace N1303K v heterozygotním stavu pomocí kitu Devyser CFTR Core. Core 2. 42

45 Praktická část Modrý pík znázorňuje mutantní alelu N1303K. Dva černé píky v dolní části signalizují polymorfismus 7T/9T v intronu Molekulární diagnostika mutací v genu CFTR (Cystická fibróza) Tato metoda detekuje 36 mutací CFTR genu pomocí 2 stripů. První strip CFTR 17+Tn Update strip obsahuje sondy pro 17 mutací a 3 Tn polymorfismy intronu 8 CFTR genu. Druhý strip CFTR 19 obsahuje sondy pro dalších 19 mutací CFTR genu. Metoda je založena na principu PCR a následné reverzní hybridizaci. PCR produkty hybridizují se specifickými oligonukleotidy (primery), které jsou ukotveny na membránách stripů. K hybridizovaným produktům se přidává streptavidinem konjugovaná alkalická fosfatáza. Následná inkubace s chromogenním substrátem vytváří hnědofialové proužky, které se pak hodnotí dle přiložených šablon [12]. Amplifikace produktů Každý vzorek je nutné amplifikovat s master mixem 1 a master mixem 2 odděleně. K master mixu se přidává izolovaná DNA, k negativní kontrole přidáváme místo DNA deionizovanou vodu. Takto připravená směs se vloží do předehřátého termocykleru a nechá se proběhnout reakce při určitých podmínkách uvedených v tabulce č. 6. Po amplifikaci DNA se provede gelová elektroforéza pro ověření PCR produktů [12]. Tabulka č. 6. Podmínky PCR reakce pro Stripy INNO LiPA. Složka PCR směsi Teplota Čas Počet cyklů Počáteční 95 C 15 min denaturace Denaturace 95 C 1 min Annealing 57 C 1 min 30 cyklů Elongace 68 C 1 min Koncová elongace 68 C 10 min Upraveno podle [12]. 43

46 Praktická část Reverzní hybridizace Vybere se počet proužků z obou kitů CFTR 17 a CFTR 19. Proužky se vloží do drážek na destičce a do horní části drážky se napipetuje denaturační roztok. K denaturačnímu roztoku se přidává PCR produkt 1 a PCR produkt 2. Po denaturaci amplifikovaných produktů se do drážky přidá předehřátý hybridizační roztok. Stripy s hybridizačním roztokem se nechají inkubovat ve vodní lázni [12]. Vizualizace Stripů INNO - LiPA Po hybridizaci se stripy dvakrát promyjí, aby se odstranily produkty, které nebyly plně hybridizovány. Po promytí se přidává streptavidinem konjugovaná alkalická fosfatáza. Ta se naváže na PCR produkty hybridizované na proužcích a vzorky se nechají inkubovat na třepačce po dobu třiceti minut. Dále se každý proužek znovu dvakrát promyje a přidá se k němu chromogenní substrát. Fosfatáza po navázání substrátu v místě hybridizace vytvoří po inkubaci hnědofialové proužky. K zastavení vybarvování proužků přemyjeme stripy destilovanou vodou minimálně dvakrát. Výsledky se pak odečítají pomocí přiložených šablon [12]. 44

47 Praktická část Obr. č. 13. Analýza mutace N1303K v heterozygotním stavu pomocí metody INNO LiPA CFTR 17 + Tn Update a CFTR 19. CFTR 19 CFTR 17 + Tn Update Pomocí stripu CFTR 19 byla zachycena mutace N1303K v heterozygotním stavu a pomocí stripu CFTR 17 + Tn Update byl detekován polymorfismus 7T/9T intronu 8. 45