FUNKČNÍ VZOREK. OPTIMALIZOVANÝ BIOKATALYZÁTOR LENTIKATS S IMOBILIZOVANÝMI KVASINKAMI SACCHAROMYCES sp. PRO BIOTECHNOLOGICKÉ APLIKACE

Transkript

1 FUNKČNÍ VZOREK OPTIMALIZOVANÝ BIOKATALYZÁTOR LENTIKATS S IMOBILIZOVANÝMI KVASINKAMI SACCHAROMYCES sp. PRO BIOTECHNOLOGICKÉ APLIKACE AUTOŘI: Libuše Váchová 1, Zdena Palková 2, Radek Stloukal 3, Hana Sychrová 4, Iva Pichová 5 1 Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. Vídeňská 1083, Praha 4 Tel.: , Fax: mbu@biomed.cas.cz, Web: 2 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Albertov 6, Praha 2 Tel.: , Fax: tajemnik@natur.cuni.cz, Web: 3 LentiKat s a.s. Pod Vinicí 83, Stráž pod Ralskem Tel.: , Fax: info@lentikats.eu, Web: 4 Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vídeňská 1083, Praha 4, Tel.: , Fax: fgu@biomed.cas.cz, Web: 5 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. Flemingovo nám. 542/2, Praha 6 Tel.: , Fax: uochb@uochb.cas.cz, Web: Tento funkční vzorek vznikl za finanční podpory projektu Využití imobilizovaných kvasinek v biotechnologiích: vývoj nových aplikací pro výrobní procesy (č. projektu TA ) z prostředků státního rozpočtu prostřednictvím Technologické agentury České republiky (TA ČR)

2 Číslo výsledku: LentiKvas Garant výsledku: Ing. Radek Stloukal, PhD Jazyk výsledku: CZE čeština Hlavní obor: EI Biovědy / Biotechnologie a bionika Rok uplatnění výsledku: 2013 Abstrakt výsledku česky: Presentovaný funkční vzorek je optimálně osazený Biokatalyzátor lentikats kvasinkami Saccharomyces sp. pro různé biotechnologické procesy, které využívají živé mikroorganismy (kvasinky) pro přeměnu zkvasitelných cukrů na různé metabolity. Cílem optimalizace bylo dosažení maximálních koncentrací vitálních kvasinek v polyvinylalkoholové matrici schopných přeměňovat zkvasitelné cukry. Klíčová slova výsledku česky: Biokatalyzátor lentikats, Saccharomyces sp., imobilizace, polyvinylalkoholová matrice Název výsledku anglicky: Optimized Lentikats Biocatalysts with immobilized yeasts Saccharomyces sp. for biotechnology applications Abstrakt výsledku anglicky: The presented function sample is the Lentikats Biocatalyst with optimal concentration of immobilized biomass of Saccharomyces sp. for application in different biotechnological processes that use native microorganism (yeasts) for fermentation of fermentable sugars to different metabolites. The aim of this process is to achieve maximal concentrations of vital yeasts in polyvinylalcohol matrix capable to ferment sugar substrates. Klíčová slova výsledku anglicky: Lentikats Biocatalyst, Saccharomyces sp., imobilization, polyvinylalcohol matrix

3 Vlastník výsledku: LentiKat s a.s. Pod Vinicí 83, Stráž pod Ralskem Tel.: Fax: info@lentikats.eu Web: IČ vlastníka výsledku: DIČ vlastníka výsledku: CZ Lokalizace: LentiKat s a.s. Středisko výzkumu a vývoje INBIT LentiKat s (laboratoře), Kamenice 34, Brno Stát: CZ Česká republika Využití výsledku jiným subjektem: N: využití výsledku jiným subjektem je možné bez nabytí licence Licenční poplatky: N: poskytovatel licence na výsledek nepožaduje licenční poplatek Technické parametry: Optimalizované složení Biokatalyzátoru lentikats s imobilizovanými kvasinkami Saccharomyces sp. (větší hustota osídlení porézní PVA matrice, větší výsledná hmotnost a aktivita na původní hmotnost) Ekonomické parametry: Nižší výrobní spotřeba Biokatalyzátoru lentikats, a tím zlevnění výrobních nákladů Kategorie výsledku podle nákladů na jeho dosažení: A (do 5 mil. Kč)

4 Podstata technického řešení: Současným celosvětovým trendem je přechod od složitých chemických syntéz aktivních látek k jejich produkci pomocí biologicky šetrných a vysoce selektivních biokatalyzátorů. Zavedení biokatalyzátorů významně přispívá k ochraně životního prostředí, protože při chemických syntézách vzniká celá řada nežádoucích a nebezpečných odpadů a dochází k vysoké spotřebě energie. Imobilizace do polyvinyalkoholové (PVA) matrice, tzv. Biotechnologie lentikats, je v porovnání s ostatními imobilizačními technikami nejen velmi univerzální, ale má rovněž minimální vliv na aktivitu imobilizované biomasy. Nosič se vyznačuje vysokou mechanickou stabilitou a dalšími fyzikálně-mechanickými vlastnostmi, které zaručují difúzi substrátu k imobilizované biomase. Snadno se separuje z kultivačních směsí. Biotechnologie lentikats má tedy široké využití, ale pro její efektivní a cílené využívání je nezbytné nalézt optimální podmínky, jak pro přípravu matrice, tak pro její efektivní osazení biologickým materiálem. Důležitým faktorem je i možnost kontroly stavu (životnost buněk) imobilizovaného biologického materiálu během výroby. K tomuto účelu byla zavedena metoda analýzy osazení PVA matrice imobilizovanými kvasinkami přímo v partikulích LentiKats pomocí konfokální fluorescenční mikroskopie. Dále byly zavedeny metody, které umožňují zjistit přežívání kvasinek po imobilizaci a ukončené kultivaci. Tímto způsobem lze připravit unikátně osazený Biokatalyzátor lentikats, který vykazuje vyšší hmotnosti po kultivacích a s tím spojené nižší náklady na jeho výrobu a nižší provozní náklady pro konečné uživatele.

5 Popis funkčního vzorku: Standardní postup výroby Biokatalyzátoru lentikats se sestává ze sedmi fází: Fáze 1: Příprava zásobního PVA gelu Fáze 2: Chlazení a temperace zásobního PVA gelu Fáze 3: Vmíchání roztoku biomasy kvasinek a homogenizace roztoku před kapáním Fáze 4: Lentiprintrování nebo kapání PVA gelu s biomasou Fáze 5: Sušení Biokatalyzátoru lentikats Fáze 6: Rebotnání, stabilizace Biokatalyzátoru lentikats Fáze 7: Skladování Biokatalyzátoru lentikats Optimalizace 3. fáze: 1. Imobilizací v intervalu počáteční sušiny biomasy kvasinek 0,2 0,8 g DW biomasy/1l PVA gelu získáme osazení a strukturu pórů PVA matrice připraveného Biokatalyzátru lentikats znázorněného na obrázku 1. Struktura Biokatalyzátoru lentikats je znázorněna na obrázku 2. Obrázek 1: Osazení Biokatalyzátoru lentikats kvasinkami Saccharomyces cerevisiae T73 při použití standardního množství biomasy k imobilizaci (0,4 g DW biomasy/1l PVA gelu): zelená buňky nebo mikrokolonie buněk, imobilizáty skladované ve vodě (zvětšení 20x) Obrázek 2: Biokatalyzátor lentikats se Saccharomyces cerevisiae T73 po kultivaci: imobilizované množství biomasy 0,4 g DW biomasy/1l PVA gelu (vlevo) a prázdný Biokatalyzátor lentikats bez imobilizované biomasy (vpravo)

6 Při imobilizaci v poměru 1 4 g DW biomasy/1l PVA gelu (5-20 krát vyšší koncentrace biomasy v porovnání se standardně imobilizovaným množstvím) získáme optimalizovaný Biokatalyzátor lentikats, jehož osazení pórů PVA matrice kvasinkami je znázorněno na obrázku 3. Obrázek 3: Osazení Biokatalyzátoru lentikats kvasinkami Saccharomyces cerevisiae T73 při použití standardního množství biomasy kvasinek na imobilizaci (0,5 g DW biomasy/1l PVA gelu), kultivováno 8 h, zelená buňky nebo mikrokolonie buněk: (zvětšení 20x), (zvětšení 63x) Při imobilizaci 1 4 g DW biomasy/1l PVA gelu je standardní struktura Biokatalyzátoru lentikats zachována a nedochází k žádným deformacím PVA matrice. Při imobilizaci 4 10 g DW biomasy/1l PVA gelu (10 25 krát vyšší koncentrace biomasy v porovnání se standardně imobilizovaným množstvím) dle výše uvedeného poměru získáme optimalizovaný Biokatalyzátor lentikats. Osazení pórů PVA matrice takto připraveného Biokatalyzátru lentikats je znázorněno na obrázku 4 a 5. Obrázek 4: Osazení Biokatalyzátoru lentikats kvasinkami Saccharomyces cerevisiae T73 při použití optimalizovaného množství biomasy k imobilizaci (4 g DW biomasy/1l PVA gelu), zelená buňky nebo mikrokolonie buněk: a) imobilizáty skladované 15 týdnů ve vodě (zvětšení 20x), a1 2) imobilizáty skladované ve vodě a těsně před analýzou kultivovány krátkodobě v kultivačním médiu (zvětšení 20x a 63x), a3) imobilizáty kultivované těsně po přípravě a následně skladovány (zvětšení 63x)

7 Obrázek 5: Osazení Biokatalyzátoru lentikats kvasinkami Saccharomyces cerevisiae T73 při použití optimalizovaného množství biomasy k imobilizaci (10 g DW biomasy/1l PVA gelu), zelená buňky nebo mikrokolonie buněk: b) imobilizáty skladované 15 týdnů ve vodě (zvětšení 20x), b1 2) imobilizáty skladované ve vodě a těsně před analýzou kultivovány krátkodobě v kultivačním médiu (zvětšení 20x a 63x), b3) imobilizáty kultivované těsně po přípravě a následně skladovány (zvětšení 63x). Při imobilizaci 4 10 g DW biomasy/1l PVA gelu dochází ke změně struktury Biokatalyzátoru lentikats, která se projeví po kultivaci krát vyšší koncentrace imobilizované biomasy způsobuje částečnou deformaci standardní PVA matrix a v případě imobilizace 10 g DW biomasy/1l PVA gelu dochází k jevu tzv. rolování Biokatalyzátoru lentikats (Obrázek 6). Obrázek 6: Optimalizovaný Biokatalyzátor lentikats s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae T73 po kultivaci: imobilizované množství biomasy 4g DW biomasy/1l PVA gelu (vlevo) a 10 g DW biomasy /1l PVA gelu (vpravo)

8 Příklad ekonomického přínosu při využití optimalizovaného Biokatalyzátoru lentikats: Porovnání ekonomiky klasické technologie s Biotechnologií lentikats využívající standardní Biokatalyzátor lentikats a Biokatalyzátor lentikats po optimalizaci je znázorněno na příkladu melasového lihovaru o kapacitě l/den. Tabulka 1: Porovnání spotřeby standardního Biokatalyzátoru lentikats a Biokatalyzátoru lentikats po optimalizaci Parametr Standardní Biokatalyzátor lentikats Optimalizovaný Biokatalyzátor lentikats Celková dávka Biokatalyzátoru [tuna] 44,6 44,6 Množství Biokatalyzátoru v 1reaktoru [tuna] 22,3 22,3 Životnost Biokatalyzátoru [měsíc] Roční spotřeba Biokatalyzátoru [tuna] 66,9 44,6 66,9 44,6 Optimální osazení pórů PVA matrice kvasinkami nemění tvar Biokatalyzátoru lentikats a umožňuje získat vyšší finální hmotnost imobilizátů po kultivaci kvasinek uvnitř porézní PVA matrice na jednotku její hmotnosti (2-5 krát). Pro konečné uživatele to znamená, že roční spotřeba katalyzátoru je stejná, nicméně jeho pořizovací cena je násobně (2-5) nižší, což se projeví ve snížení provozních nákladů konečného uživatele. Tabulka 2: Porovnání klasické technologie s Biotechnologií lentikats využívající standardní Biokatalyzátor lentikats a Biokatalyzátor lentikats po optimalizaci Parametr Klasická technologie Biotechnologie lentikats Optimalizovaný Biokatalyzátor lentikats Kvasný objem [m 3 ] (2 x 180) 360 (2 x 180) Rezervní reaktor [m 3 ] Předkvasný objem [m 3 ] Objem pro přípravu živin [m 3 ] Vyrovnávací nádrž před destilací [m 3 ] Sanitační nádrž [m 3 ] Celkový objem [m 3 ] Produkce etanolu [ l/rok ]

9 Popis Novosti funkčního vzorku: Biotechnologie lentikats, jako biotechnologie umožňující uzavírat (imobilizovat) nativní buňky do pevného PVA nosiče, je velmi výhodná pro většinu biokatalýz v různých procesech. PVA má vynikající fyzikálně-mechanické vlastnosti, které poskytují dlouhodobou mechanickou stabilitu, je biologicky obtížně odbouratelný, je netoxický, a proto ho lze využít pro velmi účinné biokatalýzy potravinářských, farmaceutických a dalších procesů. Využití Biotechnologie lentikats v praxi je teoreticky velmi široké a je určeno vlastnostmi a možnostmi biologického materiálu, který je v partikulích imobilizován. Dosavadní aplikace této technologie směřují zejména k vývoji, výrobě a použití při čištění průmyslových vod, výrobě lihu, při produkci meziproduktů pro farmacii. Biokatalyzátor lentikats s optimalizovaným osazením kvasinek Saccharomyces cerevisiae nebyl doposud použit v průmyslovém měřítku. Námi navrhovaný systém, ve kterém bylo navrhnuto optimalizované složení imobilizovaných kvasinek pro fermentace zkvasitelných cukrů, je nový nejenom pro využití Saccharomyces cerevisiae pro biotechnologickou produkci, ale lze jej využít i v případě imobilizace jiných kvasinkových kmenů v dalších odvětvích průmyslu. Optimální osazení pórů PVA matrice kvasinkami nemění tvar Biokatalyzátoru lentikats a umožňuje získat vyšší finální hmotnost imobilizátů po kultivaci kvasinek uvnitř porézní PVA matrice na jednotku její hmotnosti (2-5 krát). Využití optimalizovaného Biokatalyzátoru lentikats, do průmyslových procesů umožní jejich zefektivnění a sníží výrobní cenu Biokatalyzátoru lentikats, vzhledem k imobilizovanému množství biomasy, v přepočtu na původní vyrobené množství Biokatalyzátoru lentikats.