Klasifikace plazmid. Charakteristikaplazmid dsdna kružnicová nebo lineární, velikost: kb

Transkript

1 Charakteristikaplazmid dsdna kružnicová nebo lineární, velikost: kb Základní typyplazmid : kryptické - funkce neznámá epizomální - reverzibilní intergace do chromozomu hostitele konjugativní - schopné p enosu konjugací mobilizovatelné p enositelné za p ítomnosti konjugativního plazmidu P íkladyplazmid : * F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní) -zodpov dné za konjugaci, p íp. mobilizaci jiných plazmid * R-plazmidy (R-faktory) -zodpov dné za rezistenci k antibiotik m, ada z nich konjugativní * kolicinogenní (Col-plazmidy) - tvorba protein s antibiotikovým charakterem (Enterobacteriaceae) * Ti-plazmidy (tumory indukující) - tvorba nádor u dvoud ložných rostlin (Agrobacterium tumefaciens) * plazmidy odbourávající organické slou eniny (Pseudomonas) * plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium). * Plazmidy používané jako vektory pro p enos DNA (pbr322, puc) Klasifikace plazmid - podle druhu, v n mž se vyskytují - podle vlastností, které kódují - podle inkompatibility - na základ molekulárních charakteristik -restrik ní mapy, sekvence, informa ní obsah D kaz p ítomnosti plazmidu v bakteriální bu ce a jeho velikosti - izolace DNA a elektroforéza v agarózovém gelu - centrifuga ní metody (satelitní pruhy v sacharozovém nebo CsCl gradientu) - elektronová mikroskopie D kaz protein kódovaných plazmidem - Systém využívající minibu ky - systém využívající maxibu ky - systém translace in vitro Odstra ování plazmid z bun k -p sobením interkala ních barviv (akridinoranž, etidiumbromid, akriflavin) -p sobením antibiotik (novobiocin, rifampicin, mitomycin C) -p sobením povrchov aktivních látek (SDS) - další metody: zvýšená teplota, regenerace protoplast, využití inkompatibility aj.

2 Klasifikace plazmid podle po tu kopií: - s nízkým po tem (1-2/chromozom) -se st edním po tem (~15) - s vysokým po tem (nad 20) Stanovení etnosti replikace plazmid centrifugací v gradientu CsCl Plazmid, který se nereplikoval Plazmid, který se replikoval 1x A) ultracentrifugací v gradientu CsCl-EB B) gelovou elektroforézou v agaróze 0,3 generace 0,5 generace 1,0 generace 15N 14N/15N 14N Plazmid, který se replikoval dvakrát nebo vícekrát Lokalizace ori na plazmidové molekule Št pení RE REPLIKACE PLAZMID - za íná ve specifickém míst vytvo ením volné 3 OH skupiny malé plazmidy: místn specifická topoizomeráza kódovaná plazmidem (Rep protein) vytvá í jedno et zcový zlom velké plazmidy: v míst ori je po vazb inicia ních faktor syntetizována primer-rna plazmidy typu ColE1 nevyžadují pro tvorbu primer-rna protein kódovaný plazmidem

3 Regulace replikace plazmidu ColE1 Regulation of primer (rep) RNA one inhibition Moderator (Rom) Interakce RNAI s RNAII p i iniciaci replikace ColE1 Regulace replikace plazmidu ColE1

4 Interakce RNAI, RNAII a proteinu Rom p i iniciaci replikace ColE1 plazmidu Po átek replikace plazmidu F obsahuje následující elementy: bp sekvenci obsahující oris, 46 bp dlouhou AT bohatou sekvenci (zahrnutá do iniciace replikace), dva obklopující DnaA-boxy (místa vazby DnaA proteinu), a 4 sekvence o délce 19 bp (iterony), které tvo í lokus incb. 2.gen repe (neboli copa), kódující 29 kda protein; mutace v tomto genu ovliv ují po et kopií plazmidu. 3.P t dalších 19 bp iteron, které tvo í lokus incc (neboli copb). Mutace v tomto lokusu ovliv ují po et kopií. Pro zahájení replikace v oris jsou nezbytné jen dv první oblasti. Protein RepE se váže na iterony v oblasti incb-oris a spole n s proteiny hostitele tvo í replika ní komplex. Kontrola regulace iniciace replikace plazmidu F zprost edkovaná iterony Mechanismy zajiš ující stabilní udržení plazmid v bu kách (segrega ní stabilita plazmid ) aktivace L-iterony Rep - protein R-iterony delece - vyšší po et adice - nižší po et kopií represe u vícekopiových plazmid (>20) typu ColE1 je p ítomen nekódující úsek cer (380 bp), který je cílem p sobení místn specifické rekombinázy (kódovaná xerc a xerd na chromozomu) - u v tších plazmid jsou rekombinázy kódovány plazmidovými geny Rep-protein se váže nejd íve na R-iterony (k iniciaci replikace proto nedochází), po zvýšení koncentrace též na L-iterony, R6K což pak vede k zahájení replikace - tím se zdvojnásobí po et R- iteron a poklesne koncentrace Rep-proteinu a další iniciace replikace neprobíhají u nízkokopiových plazmid jsou p ítomny aktivní mechanismy rozd lování: 1. aktivní segregace: partitioning (lokud inc + proteiny Par(Sob)) 2. postsegrega ní usmrcování bun k, které ztratily plazmid (interakce stabilního toxinu s nestabilním antitoxinem)

5 Systém pro rozd lování multimerních plazmidových forem Zajišt ní po tu kopií systémem cer a xer P ímá opakování resolváza Geny pro stabilizaci F-plazmidu Sop = stability of plasmid Postsegrega ní zabíjení bezplazmidových bun k p sobením systému hok/sok u plazmidu R1 hok = host killing (toxin); sok = suppression of killing (antitoxin) par stabilní Proteiny hostitele nestabilní sopa kóduje protein, který reguluje expresi genu sopb. Protein SopB se váže spole n s proteiny hostitele na lokus sopc, který obsahuje dvanáct 43 bp tandemových opakování a je zakotven ve vnit ní membrán bu ky Kolaps membránového potenciálu

6 Postsegrega ní usmrcování bezplazmidových bun k p sobením proteinových systém Složky proteinových systém pro udržení plazmidu v bu ce Negativní regulace v nadbytku Degradace antitoxinu proteázami Proteiny pro replikaci chromozomu bu ky RM-systémy typu II nesené na plazmidu (EcoRI) Struktura R-plazmid

7 Hlavní funk ní oblasti F-plazmidu Bakteriocinogenní plazmidy (p íklad: kolicinogenní plazmidy) Bakteriociny - proteiny interagující s citlivými bakteriemi a inhibující jednu nebo více základních funkcí (replikace, transkripce, translace, energetický metabolismus) - vážou se na specifické receptory v bun né st n citlivých bun k -bu ka produkující bakteriocin je v i n mu imunní -na nár stu citlivých bun k vytvá ejí zóny inhibice: lakuny Koliciny (E. coli, enterobakterie) a) pravé koliciny b) defektní fágové ástice (geny kódující lytický enzym a bi íkové proteiny) Col-plazmidy - typ 1: malé, mnohokopiové, nekonjugativní - typ 2: velké, nízkokopiové, konjugativní

8 Charakteristika Ti-plazmid Hostitel: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rubi Agrobacterium rhizogenes (Ri-plazmidy) Ti zp sobuje kr kové nádory (crown galls) Ri zp sobuje vlasaté ko eny (hairy roots) Velikost plazmidu: kb Geny na plazmidu: T-DNA (15-45 kb) syntéza opin a fytohormon Geny pro virulenci Geny pro katabolismus opin Ori Geny pro konjugaci Struktura nopalinového Ti-plazmidu ptic58 Tum = geny zodpov dné za tvorbu nádoru Nos = syntéza nopalinu Noc = katabolismus nopalinu Typy Ti-plazmid (/podle typu opinu) nopalinový oktopinový agropinový sukcinamopinový Typy Ri-plazmid manopinový agropinový

9 Pr b h p enosu Ti-plazmidu do rostlinné bu ky

10