Struktura BH3 domén apoptotických proteinů

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE Struktura BH3 domén apoptotických proteinů Bakalářská práce Vendula Měchová Vedoucí práce: RNDr. Radka Svobodová Vařeková, Ph.D. Brno 2012

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Vendula Měchová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav chemie Struktura BH3 domén apoptotických proteinů Chemie Chemie se zaměřením na vzdělávání Biologie se zaměřením na vzdělávání RNDr. Radka Svobodová Vařeková, Ph.D. Akademický rok: 2011/2012 Počet stran: 35+3 Klíčová slova: Apoptóza; Aktivátor; BH3-only proteiny; Enabler; BH3 doména; Databáze RCSB PDB; SiteBinder; Superimpozice; RMSD

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Vendula Měchová Faculty of Science, Masaryk University Department of chemistry Structure of BH3 domains in apoptotic proteins Chemistry Chemistry with a view to Education Biology with a view to Education RNDr. Radka Svobodová Vařeková, Ph.D. Academic Year: 2011/2012 Number of Pages: 35+3 Keywords: Apoptosis; Activator; BH3 only proteins; Enabler; BH3 domain; RCSB BDP datbase; SiteBinder; Superimposition; RMSD

4 Abstrakt V této bakalářské práci jsem se zaměřila na podrobný mechanismus apoptózy, programované buněčné smrti. Klíčovou pozici zaujímá rodina BCL-2 proteinů, která je zodpovědná za změnu propustnosti vnější mitochondriální membrány. BH3-only proteiny, podskupina této rodiny, obsahují strukturně velmi podobné vazebné místo pro komplexující molekuly - BH3 doménu. Pomocí webové aplikce SiteBinder lze tyto strukturní motivy porovnávat a zjistit, do jaké míry je struktura BH3 domény ovlivněna samotným BH3-only proteinem, komplexující molekulou, organismem, ve kterém se nachází, a také funkcí proteinu (aktivátor, enabler). Abstract In this thesis I focused on studying detailed mechanism of apoptosis, programmed cell death. The BCL-2 family of proteins play key role in controlling outer mitochondrial membrane permeabilization. The BH3 only proteins are one of the most important members of this reunion and contain a structurally similar binding region for complexing molecule - the BH3 domain. Using a web application SiteBinder we are able to compare these structures and find out how they are influenced by BH3 only protein itself, by complexing molecule, by organism from which it originates and also by function of these proteins (activator, enabler).

5

6

7 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat především vedoucí mé práce paní RNDr. Radce Svobodové Vařekové, Ph.D. za její odborný přístup, trpělivost, čas a podání pomocné ruky při seznamování se se základy některých chemoinformatických a bioinformatických metod. Velký dík patří také Ondřeji Novákovi za technickou podporu. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 30. května 2012 Jméno Příjmení

8 Obsah Úvod... 8 Kapitola 1 Teorie Apoptóza Příčiny apoptózy Mechanismy apoptózy Průběh apoptózy Důsledky apoptózy Apoptotické enzymy Proteinová rodina BCL Aktivátory Enablery Kapitola 2 Metody RCSB PDB SiteBinder Motivace Míra podobnosti Superimpozice Technické detaily Kapitola 3 Výsledky a diskuze Příprava vstupních dat Vyhodnocení výsledků Porovnání aktivátorů a enablerů Vliv BH3-only proteinu na strukturu Vliv komplexující molekuly na strukturu Vliv organismu na strukturu Celkové porovnání struktur BH3 domény Kapitola 4 Závěr Seznam použité literatury... 36

9 Úvod Apoptóza [1][2] je aktivní formou zániku buňky, při které dochází k typickým morfologickým a biochemickým změnám. Apoptóza je proces z biologického hlediska velmi významný, protože 99,9 % programované buněčné smrti probíhá tímto procesem. Apoptotické procesy se spouští například v okamžiku, kdy buňka není schopna vykonávat svou funkci nebo je příliš poškozena [3]. Tyto procesy buňku rozloží tak, aby byla okolní tkáň co nejméně poškozena. Rozhodnutí, jestli je signál předávaný buněčným receptorem tolerován nebo způsobí apoptózu je citlivě regulováno proteiny z rodiny BCL-2 [4]. Významnou součástí této rodiny jsou BH3-only proteiny [5], které zpracovávají specifické signály jako je genotoxický stres, stres způsobený akumulací denaturovaných proteinů atd. Klíčovou oblastí těchto proteinů je BH3 doména, která je zodpovědná za interakci BH3-only proteinů s dalšími apoptotickými proteiny [6]. V současné době máme k dispozici velké množství informací o strukturách BH3- only proteinů. Tyto informace se nacházejí v Protein Data Bank [7], veřejně přístupné databázi struktur biomolekul. Díky těmto informacím máme možnost studovat strukturu BH3 domén apoptotických proteinů pomocí metod výpočetní chemie a strukturní bioinformatiky. Uvedeným studiem je možno získat cenná data ohledně rozdílů a podobností struktur BH3 domén v různých typech apoptotických proteinů. Z těchto dat je poté možno například vyvodit závěry týkající se vztahu mezi strukturou BH3 domén a funkcí daných proteinů [8]. Z tohoto důvodu je má bakalářská práce zaměřena na studium a porovnávání struktury BH3 domén v apoptotických proteinech. Konkrétní cíle práce jsou: Nastudovat základní pojmy z oblasti apoptózy a BH3-only proteinů Seznámit se s Protein Data Bank a se softwarem SiteBinder, který slouží pro přikládání strukturních motivů proteinů Připravit si datovou sadu pro analýzu BH3 domén. Analyzovat vliv různých faktorů na strukturu BH3 domén. Konkrétně vliv proteinu, ze kterého doména pochází, proteinu, se kterým je doména kompletována a organizmu, z něhož doména pochází. 8

10 Kapitola 1 Teorie 1.1. Apoptóza Přestože důsledkem apoptózy [1][2] (z řeckého apo = po, ptosis = pád) je smrt buňky, ne vždy ovšem znamená, že je dějem pouze patologickým. Fyziologicky se vyskytuje v průběhu embryonálního a fetálního vývoje, kdy je opakovaným buněčným dělením produkován nadměrný počet buněk, a při udržování normální buněčné dynamiky v některých tkáních. Buňka uplatňuje své vlastní mechanismy zakódované v jejím genomu k sebezničení. Apoptózou probíhá 99,9 % programované buněčné smrti, proto je tento děj často zaměňován za pojem programovaná buněčná smrt. Jedná se o aktivní formu zániku buňky, při kterém dochází k typickým morfologickým a biochemickým změnám Příčiny apoptózy Příčiny vyvolávající apoptózu jsou různé, nejvyšší podíl má však [2]: aktivace specifických buněčných receptorů jako receptory pro cytosin TNFα [1][2] a receptor Fas [1] poškození DNA a jiných struktur buňky účinkem ionizujícího záření a jiných mutagenů, virových infekcí, cytostatiky, oxidativním stresem, teplem apod. nadměrný vstup Ca 2+ iontů do buňky nedostatečná aktivace receptorů pro specifické růstové faktory, jejichž stálá stimulace ligandem, tj. specifickým růstovým faktorem, je nutná i pro klidový metabolismus buňky Neméně důležitým faktorem, který rozhoduje o tom, zda bude aktivována apoptóza, je samotná odolnost buňky vůči tomuto ději. Právě znalost mechanismu smrti buněk při určitých onemocněních vede k účinnější terapii, např. při AIDS nebo degenerativním onemocnění mozku je vhodné apoptózu potlačit, kdežto u nádorových onemocnění ji naopak podpořit. 9

11 Mechanismy apoptózy Apoptóza je děj programovaný. Mechanismus účinku apoptotických proteinů není přesně znám, ale je lokalizován v mitochondriích. Ukazuje se, že nepřímo ovlivňují proteolytickou aktivitu skupiny nitrobuněčných proteáz, kaspáz [9]. Vnější dráha aktivace kaspáz začíná navázáním ligandu na Fas receptor (Fas-L [2]), který vytvoří komplex z kaspázy-10, kaspázy-8 a jejich adaptorního proteinu, jehož funkcí je zajistit vhodné prostorové uspořádání kaspázy-8, která se vlastním štěpením aktivuje. Kaspáza-8 následně aktivuje prokaspázu-3 za vzniku efektorní kaspázy-3. Apoptóza může být iniciována i vnějším poškozením buňky (tzv. vnitřní dráha), kdy klíčovou roli hraje vyplavení cytochromu c z mitochondrie [10]. Ten v cytosolu aktivuje adaptorní protein APAF-1 [11], jenž následně způsobí přeměnu prokaspázy-9 na kaspázu-9, která předá signál efektorní kaspáze-3 [9]. Efektorním kaspázám slouží jako substráty buněčné proteiny lamininy (jejich přeměna způsobí rozpad jaderné membrány), aktiny v cytoskeletu, proteiny regulující buněčný cyklus (např. p21 [12]), proteiny účastnící se replikace DNA (topoizomeráza I [13]) a transkripce. Dále signální proteiny (kináza C [14]) a také aktivují DNázu nazývanou CAD (caspase activated DNase), rozvolněním její vazby na ICAD (inhibitor of caspase activated DNase), jež putuje do jádra, kde způsobí fragmentaci DNA [15]. Buňka je natolik poškozena, že už není schopná oprav a přežití. Je nucena spáchat sebevraždu. Obrázek č. 1: Schéma apoptózy [16] 10

12 Průběh apoptózy Apoptotické změny se u buněk projeví charakteristickými změnami biochemickými (popsáno v sekci té a té) i morfologickými. Jako důsledek působení dolních kaspáz dochází k degradaci cytoskeletu, narušení jaderné membrány a aktivaci endonukleáz, které štěpí dvoušroubovici DNA na fragmenty [15] obsahující asi 200 párů bazí (a jejich násobky), pyknotické jádro s kondenzovaným chromatinem se rozpadá. Ochabuje i buněčná membrána, tím buňka ztrácí kontakt s okolními buňkami. Objem buňky se během apoptózy zmenšuje (na rozdíl od nekrózy, kdy se zvětšuje) a buňka se nakonec rozpadne na několik menších fragmentů, tzv. apoptotických tělísek [2]. Jejich buněčná membrána je pozměněna a to způsobí jejich fagocytózu a odstranění okolními buňkami bez vyvolání místní zánětlivé reakce. Obrázek č. 2: Průběh apoptózy [17] Důsledky apoptózy Zánik buňky apoptózou probíhá jak u fyziologických procesů, tak i u procesů patologických [1]. Největší fyziologický význam má tento děj při redukci buněčných populací u vývoje plodu v těle matky, také při zániku postnatálně se obměňujících se buněk jako krevní elementy nebo buňky tenkého střeva. U žen se díky programované buněčné smrti zmenší po laktaci mléčná žláza. V pozdějším věku se důsledky apoptózy projeví v období klimakteria a také v přirozeném stárnutí organismu. 11

13 V případě patologickém může být apoptóza buď inhibována, anebo naopak indukována. Její patologická inhibice má za následek zejména vznik nádorových onemocnění (tumor prostaty, vaječníků nebo mléčné žlázy), vznik autoimunitních onemocnění jako systémový lupus erythematodes [1] nebo různých alergií. Při bakteriálních (TBC) a virových (herpesviry, HIV) onemocněních je programované buněčné smrti také bráněno. Naopak zvýšení incidence apoptózy bylo prokázáno u neurodegenerativních onemocněních (Parkinsonova a Alzheimerova nemoc), ischemickém poškození (infarkt myokardu), toxickém poškození jater nebo u následku napadení člověka virem HIV (AIDS) Apoptotické enzymy Apoptóza je děj programovaný, její průběh je regulován specifickými enzymy. Tohoto procesu se kromě přímých aktivátorů a efektorů účastní i jiné proteiny, které jsou neméně důležité. Zde bych zařadila výše zmíněné kaspázy a také tkáňový protein p53 [2]. Kaspázy jsou enzymy s cysteinem ve svém aktivním místě a štěpí peptidovou vazbu specificky za aspartátem (z toho je také odvozen anglický název caspase = cysteinyl aspartate specific protease). V buňce jsou přítomny v neaktivní formě jako prokaspázy. Apoptotické kaskády se účastní sedm kaspáz, čtyři z nich jsou tzv. iniciační (kaspáza-2, 8, 9, 10) a zbylé tři jsou tzv. efektorové (kaspáza-3, 6, 7). Iniciační kaspázy figurují na úplném začátku procesu, kdy jsou aktivovány vazbou ligandu (z NK-buněk nebo T-lymfocytů [1]) na Fas receptor. Efektorní kaspázy jsou výkonné proteiny, jejichž působením jsou přeměněny pro život buňky důležité proteiny jako např. lamininy v jaderné membráně nebo aktiny cytoskeletu. Nejvýznamnějším proteinem nepocházejícím z BCL-2 rodiny [4] je cytosolický p53, který je řazen do skupiny přímých aktivátorů apoptózy. Poté, co je buňka vystavena genotoxickému nebo onkogennímu stresu, je p53 stabilizován a pomocí transkripce reguluje nejen růstové faktory produkované během buněčného cyklu, ale i další pochody jako oprava DNA fragmentů a stárnutí buněk. Zajímavostí je, že tento protein má schopnost jak vyvolat apoptózu bez transkripce a translace tak vyřadit antiapoptotické BCL-2 proteiny a tím přímo aktivovat BAX a BAK [18][19][20]. Navíc je mu přisuzována funkce, jakou mají derepresorové BH3 only proteiny, a mnohé jejich domény jsou v tomto úkolu s ním spojovány [18][21]. 12

14 Proteinová rodina BCL-2 Rodina BCL-2 proteinů [4] reguluje apoptózu pomocí tzv. mitochondriální cesty, tedy souborem navazujících pochodů, které ovlivňují integritu vnější mitochondriální membrány. Tento postup způsobí změnu propustnosti vnější membrány mitochondrie pro proteiny (např. cytochrom c) nacházející se v jejím mezimembránovém prostoru, jež se tímto mohou volně přesunout do cytosolu buňky. Aby cytochrom c oligomerizoval v útvar kaspázové aktivace (zvaný apoptosom), naváže se na APAF-1. Tato vazba podporuje aktivaci iniciační kaspázy-9, která dále aktivuje výkonnou kaspázu-3 a -7. Tímto se spustí celý mechanismu vedoucí buňku ke spáchání sebevraždy tím, že výkonné kaspázy štěpí buněčné substráty, aby vyvolaly buněčný apoptotický fenotyp [9]. Tato rodina je funkčně rozdělena na proteiny proapoptotické (aktivátory) a antiapoptotické (enablery). Ve většině buněk probíhá proces exprese různých pro- a antiapoptotických BCL-2 proteinů a právě regulace interakcí řídí jejich přežití nebo spáchání sebevraždy pomocí apoptózy Aktivátory Proapoptotičtí členové BCL-2 rodiny jsou rozděleni na efektorové proteiny a BH3-only proteiny. Jsou známy dva efektorové proteiny, jedním je BAK (BCL-2 antagonist killer), druhým BAX (BCL-2 associated x protein). Oba během své aktivace homooligomerizují v proteolipidové póry ve vnější mitochondriální membráně, což má za následek zvýšení její propustnosti. Hlavním přímým spouštěčem apoptózy je tedy aktivace BAK nebo BAX. BH3-only proteiny [5] jsou zapojeny v případě, kdy je buňka vystavena stresu. Základní jednotkou BH3-only proteinů je BH3 doména (BCL-2 homolog 3), jež je charakterizována specifickým pořadím třinácti aminokyselin. První skupinou jsou tzv. přímé aktivátory, které interagují jednak s antiapoptotickými proteiny a jednak s efektory. Do této skupiny patří BID (BCL-2-interacting domain death antagonist) a BIM (BCL-2-interacting mediator of cell death). Početnější druhou skupinu tvoří senzitizéry a derepresory, tedy sloučeniny, které se váží pouze s antiapoptotickými proteiny. Zde řadíme BAD (BCL-2 antagonist of cell death), BIK (BCL-2-interacting 13

15 killer), HRK (Harakiri), PUMA (p-53 upregulated modulator of apoptosis) a Noxa. Pojmy senzitizér a derepresor se používají, když chceme vyjádřit následky vazby mezi BH3 only proteinem a jakýmkoliv antiapoptotickým. Senzitizéry snižují práh aktivace pro BAK a BAX i propustnost vnější mitochondriální membrány, avšak samotnou apoptózu nezpůsobí. V tomto případě se vytvoří vazba mezi antiapoptotickým proteinem a senzitizérem, která brání inhibici pozdějších přímých aktivátorů. Např. pokud je BCL-2 vázaný s PUMA, BIM nemůže být inhibován a dochází ke tvorbě pórů ve vnější mitochondriální membráně. Avšak při absenci PUMA by BIM mohl být vyřazen a buňka by přežila. U derepresorů je mechanismus účinku odlišný. Antiapoptotický BCL-2 protein je vázán s přímým aktivátorem (BIM, BID) a následně BH3 only protein vypustí přímý aktivátor. Jako příklad lze uvést situaci, kdy je buňka vystavena stresu. BIM může být aktivován, ale jeho funkce je zablokovaná antiapoptotickými proteiny a buňka přežije. Pokud je během této inhibice indukován derepresorový BH3-only protein, později se může uskutečnit vazba na BCL-2 a tím uvolní z původního komplexu BIM, který je pak jako přímý aktivátor efektorů schopen vyvolat smrt buňky. Derepresory představují možnost farmakologické regulace při nádorech, jako je chronická lymfocytární leukémie (CLL), kdy je apoptóza silně potlačena. Pacientům musí být dodávána BH3 mimetika, která jsou schopna na sebe vázat antiapoptotické proteiny a tím vyvolat smrt nádorových buněk. Třetí možností je ještě tzv. neutralizační model, který předpokládá tvorbu komplexu mezi proteinem BCL-2 a BAX, kdy je inhibován apoptotický efektor. Následnou interakcí přímého aktivátoru BIM s BCL-2 dojde k uvolnění BAX z komplexu a může tedy dojít ke zvýšení propustnosti vnější mitochondriální membrány. Nejméně dva BH3-only proteiny jsou schopny přímo působit jako efektory (BID, BIM). Aktivní forma BID nebo BIM podporuje oligomerizaci BAK a BAX, zvýší propustnost membrány a tím je umožněn cytochromu c vstup do cytosolu [22][23]. Prvním krokem při BID-indukované aktivaci je navázání BH3 domény BID na BH4 doménu BAX, následuje změna prostorového uspořádání BAX, která způsobí jeho insertaci a oligomerizaci ve vnější mitochondriální membráně [6]. Interakce mezi BIM a BAX byla demonstrována pomocí NMR. Existují i neproteinové faktory aktivující BAX 14

16 a BAK, jako jsou například detergenty, zvýšená teplota nebo příliš vysoké ph [3][24][25] Enablery Antiapoptotické BCL-2 proteiny obsahují čtyři BCL-2 homologní domény [4] (BH1-4). Většinou jsou vázány na vnější mitochondriální membránu, ale mohou se vyskytovat také v cytosolu nebo v membráně endoplazmatického retikula. Jejich hlavní funkcí je chránit vnější mitochondriální membránu proti poškození přímou inhibicí proapop-totických proteinů (viz kapitola Aktivátory). Mezi hlavní členy této skupiny řadíme gen A1, BCL-2 (B-cell leukemia 2), jeho delší isoformu BCL-xL, BCLw a MCL-1 (myeloid cell leukemia 1). 15

17 Kapitola 2 Metody 2.1. RCSB PDB Proteinová databanka (Protein Data Bank, PDB) [7] byla založena v Národní knihovně v Brookhavenu roku 1971 a za její management se stala zodpovědná v roce 1998 Výzkumná laboratoř strukturní bioinformatiky (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, RCSB). Aby se archív zachoval, byly na začátku druhého tisíciletí (2003) vytvořeny volně přístupné webové stránky s jednotlivými PDB soubory ( PDB je jediné celosvětové úložiště informací 3D struktury velkých biologických molekul, hlavně proteinů a nukleových kyselin, vyskytujících se ve všech organismech od bakterií, kvasinek přes rostliny až po zvířata a člověka. Informace o struktuře biomolekul v kombinaci s teoretickými znalostmi nám pomáhají při vyvozování a chápání jejich rolí nejen v biochemii a medicíně, ale i při vývoji nových účinných léčiv. Archív obsahuje jak struktury velmi malých proteinů, fragmenty DNA tak i informace o samostatných funkčních celcích buňky, jako např. ribozomu SiteBinder Motivace V dnešní době existuje velké množství dat o 3D strukturách proteinů i jejich komplexů a naším cílem je vytěžit z těchto dat co nejvíce chemicky a biologicky zajímavých informací. Webová aplikace SiteBinder [8] nám umožňuje porovnávat proteiny a přikládat je na sebe ve velmi krátkém časovém úseku pomocí tzv. superimpozice [8], kterou lze realizovat pro dvě molekuly, ale i pro např. tisíc molekul. Často potřebujeme porovnat stovky nebo tisíce molekul současně, abychom vypátrali podobnostní trendy nebo zvláštnosti. V tomto případě je nezbytné provést hromadné přiložení, což nám napoví o studované skupině proteinů nebo motivů mnohem více než srovnávat pouze dvě molekuly současně. 16

18 Míra podobnosti Pro dvojici molekul je měřítkem podobnosti v rámci superimpozice hodnota RMSD [26] (root mean square deviation, tedy odmocnina střední kvadratické odchylky). Tato hodnota je definována následujícím vztahem: kde A i -B i je vzdálenost mezi i-tým atomem první (A) a druhé molekuly (B) a n je číslo atomu použité pro výpočet. Jednotka RMSD je 1 Å. Pro více molekul je pak podobnost vyjádřena zobecněnou hodnotou RMSD, což je průměrná hodnota RMSD mezi všemi páry molekul: RMSD ( M ) m 2 1 m 1 m i1 ji1 RMSD M i, M j 2 kde M je sada motivů a m je počet motivů v sadě. Když provádíme samotný proces superimpozice 3D struktur, musíme realizovat dva základní úkoly. Prvním je najít nejlepší párování chemicky totožných atomů jedné i druhé struktury. Párování nám stanoví konkrétně, který atom první struktury se nejlépe hodí k příslušnému atomu druhé struktury. Následně je nutné vypočítat geometrickou transformaci, která optimálně přiloží obě struktury na sebe Superimpozice Superimpozice se skládá z několika vzájemně na sobě závislých kroků. Prvním je najít nejlepší párování chemicky totožných atomů jedné i druhé struktury. Párování nám stanoví konkrétně, který atom první struktury se nejlépe hodí k příslušnému atomu druhé struktury. Následně je nutné vypočítat geometrickou transformaci, která optimálně přiloží obě struktury na sebe. Posledním krokem je vyhodnocení kvality shody, k němuž nám slouží výpočet RMSD mezi sadami 3D souřadnic patřících přiloženým strukturám. 17

19 Z matematického hlediska je párování bijektivní (vzájemně jednoznačné) zobrazení, kdy každý element z první sady má k sobě přiřazen právě jeden element ze sady druhé. Pro struktury s n atomy tedy můžeme vytvořit bijekci n! a může proto existovat n! párování. Naším úkolem je najít nejlepší způsob párování tak, aby výsledná hodnota RMSD byla co nejnižší, což ovšem znamená časově náročné testování všech vytvořených párů. Řešením jsou tyto tři metody: implicitní párování, systematický přístup a aplikace tzv. groupingu (seskupování). Implicitní párování je použitelné jen za předpokladu, že atomy v obou molekulách mají stejný index nebo jsou na stejné pozici, tj. párování i-tého atomu první molekuly s i-tým atomem druhé molekuly. Výhodou je jednak velká rychlost výpočtu a také to, že postupným tvořením párů se vytvoří každý pár vždy jen jednou. Tuto metodu ovšem nemůžeme přímo použít u superimpozice, jelikož pořadí atomů nebo aminokyselin v PDB souboru jednoho motivu se může lišit od PDB souboru druhého motivu. Např. obrázek X ukazuje, jak výrazně se může lišit superimpozice při použití různého párování. a) b) Obrázek č. 3: a) Implicitní párování mezi dvěma phenylalaniny z PDB struktury 2wh6 (modře PHE 83, žlutě PHE 91). b) Nejlepší možné párování mezi dvěma phenylalaniny z PDB struktury 2wh6 (modře PHE 83, žlutě PHE 91) [8]. Metoda systematického přístupu je vhodnější, jelikož vyhledává všechny možné páry. Slabinou této metody je její časová náročnost, protože při přiložení dvou motivů s n atomy existuje n! párování (např. okolo párování pro 30 atomů). Proto je velmi žádoucí redukce počtu párování. Jedna z cest, jak docílit této redukce, je sledovat pouze taková párování, která jsou z chemického hlediska smysluplná, tedy spojující v obou strukturách atomy stejného prvku. Další možností snížení je zaměřit se na informace 18

20 v PDB souboru, kde je každý atom přiřazen určité aminokyselině, která má svůj název a číslo, jenž specifikuje polohu uvedené aminokyseliny v sekvenci proteinu. Abychom byli schopni implementovat popsané principy, je nutno roztřídit atomy v obou strukturách do skupin a podskupin zachycujích výše zmíněná pravidla. Grouping neboli seskupování (nejúčinnější metoda pro redukci počtu párování) je termín označující sady atomů v motivu, které jsou rozděleny do skupin a podskupin. Pokud jsou nějaké atomy z prvního groupingu společně ve skupině nebo podskupině, mohou být párovány pouze s atomy z druhého groupingu, které jsou také společně v odpovídající skupině nebo podskupině. Dvě seskupení označujeme za kompatibilní, existuje-li alespoň jedno párování (bijekce), které může být vytvořeno mezi jejich atomy. V procesu superimpozice můžeme použít pouze kompatibilní groupingy. Rozlišujeme tři typy groupingu: podle názvu aminokyseliny tento grouping seskupuje atomy, které patří stejné aminokyselině a navíc má tato aminokyselina i stejný index v rámci proteinu. V rámci aminokyselin se navíc atomy seskupují podle chemické značky prvků.. Pro obrázek č. 4 tedy platí: {{{1,3} N, {2,4,5} C } HIS1, {{6,9} N, {7,8,10} C } HIS2, {{11,13} O, {12} C } ASP, {{14,16} O, {15} C } GLU, {{17} Zn } Zn }. podle indexu aminokyseliny seskupuje atomy, které patří aminokyselině se stejným indexem v proteinu. V rámci aminokyselin se navíc atomy seskupují podle chemické značky prvků. Příkladem tohoto groupigu pro obrázek č. 4: {{{1,3} N, {2,4,5} C } 1, {{6,9} N, {7,8,10} C } 2, {{11,13} O, {12} C } 3, {{14,16} O, {15} C } 4, {{17} Zn } 5 }. podle chemické značky prvku seskupuje atomy se stejnou chemickou značkou Pro obrázek č. 4 vypadá takovýto grouping následovně: {{{1,3,6,9} N } N, {{2,4,5,7,8,10,12,15} C } C, {{11,13,14,16} O } O,{{17} Zn } Zn }. 19

21 Obrázek č. 4: Příklad proteinového motivu [8]. Celý proces superimpozice lze tedy popsat následujícím pseudokódem: Krok 1: Příprava groupingů podle názvu aminokyselinypro oba motivy. Pokud jsou kompatibilní, pokračujte Krokem 5. Krok 2: Příprava groupingů podle indexu aminokyseliny pro oba motivy. Pokud jsou kompatibilní, pokračujte Krokem 5. Krok 3: Příprava groupingů podle chemické značky prvku pro oba motivy. Pokud jsou kompatibilní, jděte na Krok 5. Krok 4: Nebyly vytvořeny žádné kompatibilní groupingy. Změňte výběr atomů v nejméně jednom motivu a pokračujte Krokem 1. Krok 5: Použijte grouping vytvořený v předchozím kroku a vytvořte všechny možné atomové páry dodržující metodu groupingu. Krok 6: Pro každé vytvořené párování vypočítejte optimální přiložení (pomocí kvaternionové algebry, cituj nějaký článek, co citujeme v našem článku). Spojte je touto transformací a vypočítejte hodnotu RMSD. Krok 7: Najděte párování, které vede k nejnižší hodnotě RMSD. Krok 8: Proveďte superimpozici motivů užitím párování z kroku 7. Získáte nové souřadnice přiložených motivů a hodnotu RMSD. 20

22 Technické detaily SiteBinder je k dispozici na webové adrese Jakmile napíšeme do webového prohlížeče tuto adresu, ukáže se nám úvodní obrazovka s možností nahrát své vlastní motivy nebo použít sadu vzorků struktur. Následně zjistíme, že tato webová stránka je velmi jednoduše a intuitivně uspořádaná do dvou hlavních částí: velké levé okno vizualizace a pravé okno s tabulkami motivů a více vpravo se objeví strom aminokyselin s možností výběru konkrétních atomů v jednotlivých aminokyselinách. Vlevo nahoře si můžeme po kliknutí na tlačítka Balls and Sticks, Sticks a Backround dle potřeby volně měnit formu zobrazení struktur buď jako kuličky a tyčky (Balls and Sticks) nebo pouze jako tyčky (Sticks). Tlačítkem Backround je možno měnit barvu pozadí jako bílou, šedou nebo černou. Po selekci relevantních atomů klikneme na tlačítko Click to superimpose. Ve vizualizačním okně se nám zobrazí přiložené struktury, v levém pak panel výsledků s hodnotami RMSD a tabulkami motivů seřazenými podle RMSD. Po najetí myší na atom jakéhokoliv motivu se nám u něj zobrazí tabulka s konkrétním popisem tohoto atomu (chemická značka, index ve struktuře, jakému atom motivu náleží) a zároveň se nám motiv v pravém okně zvýrazní. Kliknutím na tlačítko Export Data v panelu výsledků je možno vyexportovat data v PDB formátu. Dostaneme na výběr možnost uložení, v Save as type menu vybereme Zipped PDB file a průměrný model bude vyexportován pod názvem average.pdb. 21

23 Kapitola 3 Výsledky a diskuze 3.1. Příprava vstupních dat Prvním krokem v mé práci byla příprava jednotlivých strukturních motivů apoptotických proteinů. Ve volně dostupné internetové proteinové databázi RCSB PDB jsem si vyhledala struktury proteinů podle jejich identifikačního kódu (PDB ID), stáhla PDB soubor a v něm pak musela najít BH3 doménu, kterou tvoří 13 aminokyselin ve specifickém pořadí (ne vždy bylo stejných všech 13 aminokyselin, shoda musela být minimálně v šesti zvýrazněných aminokyselinách v tabulce č. 1). Tabulka č. 1: Název, PDB identifikátor a sekvence aminokyselin v BH3 doméně aktivátorů a enablerů použité pro superimpozici v SiteBinderu. Poslední řádek ukazuje sjednocené názvy aminokyselin použité ve vstupních PDB souborech v SiteBinderu. Skupina Aktivátory PDB ID BH3- only protein Komplex s Sekvence aminokyselin v BH3 doméně 2VOI Bid A1 ILE ALA ARG HIS LEU ALA GLN ILE GLY ASP GLU MET ASP 2VM6 Bim A1 ILE ALA GLN GLU LEU ARG ARG ILE GLY ASP GLU PHE ASN 2VOF Puma A1 ILE GLY ALA GLN LEU ARG ARG ILE ALA ASP ASP LEU ASN 2BZW Bad BCL-XL TYR GLY ARG GLU LEU ARG ARG MET SER ASP GLU PHE GLU Enablery 2VOG BMF A1 ILE ALA ARG LYS LEU GLN CYS ILE ALA ASP GLN PHE HIS 2NLA Noxa B MCL-1 GLU CYS ALA GLN LEU ARG ARG ILE GLY ASP LYS VAL ASN Přejmenování pro SiteBinder A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 A12 A13 * aminokyseliny, u kterých je jejich výskyt prokazatelně vyšší než 50%, jsou tučně zvýrazněny [4] Doména se většinou nacházela v řetězci B, což mi mnohdy zlehčilo hledání. Nalezenou sekvenci jsem poté vykopírovala do textového editoru, kde byly provedeny úpravy před zpracováním dat v SiteBinderu. Každá aminokyselina v BH3 doméně musela být přejmenována tak, aby ta na prvním místě měla název A01, na druhém A02 a tak podobně až po třináctou s názvem A13 (Tabulka č. 1), čímž jsem si připravila dobré startovní podmínky pro metodu párování a seskupování. Jako názorný příklad uvádím část (první tři aminokyseliny) PDB ID 2VM6: 22

24 ATOM 1241 N A01 B N ATOM 1242 CA A01 B C ATOM 1243 C A01 B C ATOM 1244 O A01 B O ATOM 1245 CB A01 B C ATOM 1246 CG1 A01 B C ATOM 1247 CG2 A01 B C ATOM 1248 CD1 A01 B C ATOM 1249 N A02 B N ATOM 1250 CA A02 B C ATOM 1251 C A02 B C ATOM 1252 O A02 B O ATOM 1253 CB A02 B C ATOM 1254 N A03 B N ATOM 1255 CA A03 B C ATOM 1256 C A03 B C ATOM 1257 O A03 B O ATOM 1258 CB A03 B C ATOM 1259 CG A03 B C ATOM 1260 CD A03 B C ATOM 1261 OE1 A03 B O ATOM 1262 NE2 A03 B N kde první dva sloupce představují číslo atomu ve struktuře, třetí sloupec chemickou značku prvku a jeho postavení v řetězci, čtvrtý pak pořadí aminokyseliny v rámci našeho motivu, pátý v jakém řetězci se daný atom nachází, šestý pořadí aminokyseliny v rámci daného řetězce proteinu, sedmý, osmý a devátý sloupec uvádí souřadnice atomu v prostoru. Desátý až dvanáctý sloupec obsahuje doplňkové informace o atomech. Posledním krokem v programu bylo uložení přejmenované sekvence jako soubor PDB. Další mravenčí práce se odehrávala ve výše zmíněné webové aplikaci SiteBinder. Nahrála jsem si mnou vytvořené PDB soubory se stejně přejmenovanými aminokyselinami, v levém oknu se mi zobrazily 3D struktury vybraných domén, v pravém pak seznam motivů a výběrový strom s konkrétními atomy. Úplně vpravo ve výběrovém stromu jsem zvolila páteřní strukturu všech BH3 domén, kterou představuje peptidická vazba (Obrázek č. 5) spojující jednotlivé aminokyseliny (A01-A13), konkrétně výběr atomů v každé aminokyselině N, C A, C. Obrázek č. 5: Peptidická vazba 23

25 Po spočtení vybraných atomů nám tedy vychází 26 atomů uhlíků a 13 atomů dusíku na aminokyselinu. Stiskem tlačítka Click to superimpose se motivy porovnaly a dostala jsem výslednou hodnotu RMSD a hodnotu standardní odchylky σ. Motivy s větší hodnotou odchylky než 1σ jsem vyřadila ze sady, aby nezkreslovaly výsledky (mnohdy to ani nebylo potřeba, maximum vypuštěných motivů bylo 2). Následně jsem sestavila tabulku, do které jsem zapsala dvě hodnoty RMSD, celkovou a po vyřazení, počty motivů celkem a po vyřazení a vše doplnila příslušným obrázkem motivů po superimpozici Vyhodnocení výsledků Při vyhodnocení výsledků jsem se zaměřila na srovnání struktury BH3 domén jednotlivých proteinů z různých hledisek. Nejdříve porovnání na základě toho, zda jsou tyto proteiny aktivátory nebo enablery apoptózy, dále jaký obsahují hlavní protein, s jakým proteinem jsou kompletovány a z jakého organismu jsou extrahovány (Tabulka č. 2). Tabulka č. 2: Tabulka apoptotických proteinů s názvem hlavního proteinu, s čím jsou komplexovány, PDB ID a ve kterých organismech se vyskytují. Hlavní protein Komplexováno s PDB ID Organismus BAK BH3 A1 2VOH Myš BID BH3 A1 2VOI Myš BIM BH3 A1 2VM6 Člověk BMF BH3 A1 2VOG Myš PUMA BH3 A1 2VOF Myš BAD BAK 2YV6 Člověk BAD BAK homodimer 2IMS Člověk BAD BAK homodimer 2IMT Člověk BAD BAK1 2JCN Člověk acyl-sulfonamide-based ligand BCL-XL 1YSI Člověk acyl-sulfonamide-based ligand BCL-XL 1YSN Člověk alpha/beta foldamer BCL-XL 3FDM Člověk BAD BCL-XL 2BZW Myš BAK BCL-XL 1BXL E. Coli BIM BCL-XL 1PQ1 Myš BIM BH3 BCL-XL 3FDL Člověk BIM L12F BCL-XL 3IO8 Člověk peptide from BAD BCL-XL 1G5J Člověk SAR ligands BCL-XL 1YSG Člověk W BCL-XL 3INQ Člověk - BCL-XL 1PQ0 Myš BID BH3 MCL-1 2KBW Člověk BIM BH3 MCL-1 2NL9 Myš a Člověk BIM BH3 MCL-1 2PQK Člověk BIM BH3 mutant F4aE MCL-1 3KJ2 Člověk BIM BH3 mutant I2dA MCL-1 3KJ1 Člověk BIM BH3 mutant I2dY MCL-1 3KJ0 Člověk BIM L12Y MCL-1 3IO9 Člověk MCL-1 BH3 MCL-1 3MK8 Člověk MCL-1 selected peptide MCL-1 3KZ0 Člověk MCL-1 selective BH3 ligand MCL-1 3D7V Myš a Člověk 24

26 NOXA B MCL-1 2JM6 Myš NOXA B BH3 MCL-1 2NLA Myš a Člověk PUMA MCL-1 2ROC Myš - MCL-1 1WSX Myš Z původního souboru dat jsem musela vyčlenit ty proteiny, u kterých není známo, s čím jsou komplexovány. Rovněž jsem vyčlenila skupiny proteinů (vytvořené podle toho, s čím jsou komplexovány), které mají méně než čtyři členy. Na základě porovnání takto nízkého počtu vzorků totiž nelze formulovat nějaké signifikantnější závěry. Jeden Noxa A protein (PDB ID 2rod) musel byt vyřazen, jelikož jeho struktura byla zjištěna pomocí NMR, zatímco ostatní struktury byly určeny pomocí rentgenové krystalografie Porovnání aktivátorů a enablerů Přikládala jsem 14 motivů aktivátorů (BAK, BAX, BH3-only proteiny), z toho dva motivy dosahovaly vyšších hodnot RMSD než σ, a 12 enablerů (BCL-2, BCL-xL, MCL-1, A1), z nichž bylo použito 11 s menší hodnotou RMSD než σ. Hodnota RMSD, která je i s obrázkem přiložení součástí tabulek 3A a 3B, byla u aktivátorů rovna 0,235 Å a u enablerů 0,892 Å. Tento výsledek nám ukazuje, že aktivátory si jsou strukturně mnohem podobnější než enablery. Důvod je zcela jednoduchý a to ten, že aktivátory jsou schopny reagovat na stejné podněty a tím vyvolat apoptózu [8]. Naopak každý enabler má specifickou strukturu BH3 domény, aby mohl svou vazbou blokovat proapoptotické proteiny jako přímé aktivátory, senzitizéry nebo derepresory a tím zabránit smrti buňky. Tabulky č. 3A a 3B: Porovnání aktivátorů a enablerů - počet všech motivů, počet motivů σ, RMSD, názorný obrázek. 25

27 3A Aktivátory Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 14 0,327 Motivy σ 12 0,235 3B Enablery Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 12 1,147 Motivy σ 11 0, Vliv BH3-only proteinu na strukturu Další hodnotící kritérium jsem si zvolila vliv BH3-only proteinu. Hodnoty RMSD byly více rozdílné než při zohlednění vlivu komplexující molekuly. Nejvíce podobné BH3 domény obsahují aktivátory, zejména BIM proteiny (RMSD = 0,209 Å), pak následuje PUMA (RMSD = 0,278 Å), BID (RMSD = 0,420 Å), BAD (RMSD = 0,520 Å), BAK (RMSD = 0,569 Å) a nejméně podobné si jsou domény u NOXA proteinů s velmi vysokou hodnotou RMSD = 1,556 Å. U přímých aktivátorů ze skupiny BIM byla hodnota RMSD velmi nízká, přestože tyto struktury byly komplexovány s různými antiapoptotickými proteiny. Toto je ve shodě s publikovanými výsledky [odkaz na váš článek] a poukazuje to na fakt, že vliv komplexujícího proteinu na strukturu BH3-only proteinu není příliš výrazný Pro zajímavost jsem srovnala BIM proteiny vázající se na BCL-xL a MCL-1 proteiny. Hodnoty RMSD byly velmi nízké u komplexů BIM MCL-1 26

28 a to 0,153 Å. U komplexů BIM BCL-xL byla hodnota RMSD o něco vyšší, 0,235 Å, tedy dokonce vyšší i než u kompletně srovnaných všech BIM proteinů. Odkazuj v textu tabulky, kde máš příslušná porovnání. Tabulky č. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G a 4H: Porovnání motivů podle hlavního proteinu (BAK, BID, BIM, BIM u BCL-xL, BIM u MCL-1, PUMA, BAD, NOXA B/A) - počet všech motivů, počet motivů σ, RMSD, názorný obrázek. 4A BAK Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 2 0,569 Motivy σ 2 0,569 4B BID Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 2 0,420 Motivy σ 2 0,420 27

29 4C BIM Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 10 0,250 Motivy σ 9 0,209 4D BIM u BCL-xL Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 3 0,283 Motivy σ 2 0,235 4E BIM u MCL-1 Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 6 0,177 Motivy σ 5 0,153 28

30 4F PUMA Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 2 0,278 Motivy σ 2 0,278 4G BAD Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 6 0,757 Motivy σ 5 0,521 4H NOXA B/A Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 2 1,556 Motivy σ 2 1,556 29

31 Vliv komplexující molekuly na strukturu Mým cílem bylo také zjistit, zda má na strukturu BH3 domény vliv molekula, se kterou se daný protein komplexuje. Sadu motivů jsem rozdělila na čtyři skupiny podle molekuly, s níž komplexují - tedy A1, BAK, BCL-xL a MCL-1. U proteinu A1 je hodnota RMSD pouze 0,188 Å, u BAK 0,478 Å, u BCL-xL 0,533 a u MCL-1 0,457 Å. Obecně můžeme tedy říci, že struktura BH3 domén je u jednotlivých skupin velmi podobná, hodnota RMSD se pohybovala v rozmezí od 0,188 Å do 0,533 Å. Vliv proteinu, s nímž BH3-only proteiny komplexují, není tedy příliš výrazný a není proto schopen např. překrýt vliv samotného BH3-only proteinu (např. strukturní rozdíly mezi aktivátory a enablery). Tabulky č. 5A, 5B, 5C a 5D: Porovnání motivů podle toho, s jakým proteinem vytvářejí komplex (A1, BAK, BCL-xL, MCL-1) - počet všech motivů, počet motivů σ, RMSD, názorný obrázek. 5A A1 Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 5 0,243 Motivy σ 4 0,188 30

32 5B BAK Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 4 0,521 Motivy σ 3 0,478 5C BCL-xL Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 12 1,298 Motivy σ 10 0,533 5D MCL-1 Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 14 0,781 Motivy σ 13 0,457 31

33 Vliv organismu na strukturu Zohlednění vlivu organismu na strukturu poskytuje zase o něco ucelenější pohled na BH3 domény proteinů. Vytvořila jsem tři skupiny podle toho, v jakém organismu se daný protein vykytuje, tedy u člověka, myši a u obou zároveň. Nejpodobnější jsou motivy společné lidem i myším (RMSD = 0,111 Å). Protože jsou tyto motivy sdíleny oběma typy organismů, jsou evolučně konzervovány. Z tohoto důvodu mají i pevnou 3D strukturu. Následují myší proteiny s hodnotou RMSD = 0,386 Å a nakonec nejvíce odlišné lidské proteiny s RMSD = 0,672 Å. Vyšší hodnota RMSD u člověka než u myši může ukazovat, že u lidí probíhají v rámci programované buněčné smrti selektivnější reakce na různé podněty. Případně může být také způsobena tím, že vzorky myších BH3-only proteinů byly získány z geneticky velmi podobných jedinců. Konkrétní analýzou tohoto jevu se budu zabývat v rámci své diplomové práce. Tabulky č. 6A, 6B a 6C: Porovnání motivů podle organismu, ve kterém se vyskytují (člověk, myš a u obou zároveň) - počet všech motivů, počet motivů σ, RMSD, příslušný obrázek. 6A Člověk Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 21 1,204 Motivy σ 17 0,672 32

34 6B Myš Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 10 0,386 Motivy σ 10 0,386 6C Člověk a myš Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 3 1,394 Motivy σ 2 0, Celkové porovnání struktur BH3 domény Na závěr své studie jsem porovnala BH3 domény všech analyzovaných proteinů. Výsledky porovnání jsou shrnuty v tabulce 7 a ukazují, že průměrná hodnota RMSD je 1,076 Å. Dříve porovnávané skupiny s větší hodnotou RMSD než 1 Å jsou tedy nadprůměrně odlišné, naopak skupiny mající RMSD menší než 1 Å vykazují vyšší shodu než je průměrná hodnota RMSD. Při srovnání všech apoptotických proteinů z tabulky č. 2 je hodnota RMSD = 1,076 Å. 33

35 Tabulka č. 7: Porovnání všech motivů - počet motivů, RMSD, názorný obrázek. Všechny Motivy Počet RMSD (Å) Všechny 35 1,076 34

36 Kapitola 4 Závěr Programovaná buněčná smrt uskutečněná cestou apoptózy je velmi důležitý proces, kdy je buňka nucena přesně vyhodnotit, zda je její poškození natolik závažné, aby ukončila svou existenci, či nikoli. Nejdůležitější součástí tohoto kaskádovitého procesu jsou proteiny z BCL-2 rodiny, zejména pak BH3-only proteiny obsahující BH3 doménu. V mé práci jsem se zaměřila na strukturu BH3 domén apoptotických proteinů. Nejprve jsem si vyhledala struktury jednotlivých proteinů ve volně přístupné webové databázi RCSB PDB a v nich našla BH3 doménu. Z vhodně upravených PDB souborů jsem si sestavila jednotlivé sady pro zkoumání, kdy jsem si vymezila čtyři kritéria. Prvním byla funkce v mechanismu apoptózy (aktivátor, enabler), druhým vliv BH3-only proteinu na strukturu. Třetím úhlem pohledu byl vliv komplexující molekuly, čtvrtým organismus, ve kterém se protein nachází. Při porovnání aktivátorů a enablerů vyšla hodnota RMSD výrazně menší u aktivátorů, protože jsou schopny reagovat na stejné podněty, tudíž musí být jejich BH3 doména strukturně málo odlišná. Vliv BH3-only proteinu na strukturu je opět nejnižší (nejmenší hodnota RMSD) pro aktivátory, nejpodobnější si jsou ty z rodiny BIM, naopak nejodlišnějí jsou molekuly s hlavním proteinem NOXA B/A. Vliv komplexujícího proteinu je u všech vzorků málo výrazný, což ukazuje, že hlavním faktorem ovlivňujícím strukturu BH3 domény je struktura BH3-only proteinu. BH3 domény proteinů vyskytujících se u člověka i myši zároveň jsou strukturně velmi podobné, z čehož můžeme usoudit, že jsou pevně evolučně zakódovány v DNA. Myší proteiny byly méně vzájemně odlišné než lidské, patrně proto, že vzorky mohly být odebrány z geneticky podobných jedinců. Celá práce i s výsledky bude dále využita v rámci projektů v Národním centru pro výzkum biomolekul (NCBR). 35

37 Seznam použité literatury [1] Hořejší, V.; Bartůňková, J. Základy imunologie, Triton, [2] Nečas, E.; at all. Obecná patologická fyziologie, Karolinum, [3] Khaled, A. R.; Reynolds, D. A.; Young, H. A.; Thompson, C. B.; Muegge, K.; and Durum, S. K. Interleukin-3 withdrawal induces an early increase in mitochondrial membrane potential unrelated to the Bcl-2 family. Roles of intercellular ph, ADP transport, and F(0)F(1)-ATPase. J. Biol. Chem , [4] Chipuk, J.E.; Moldoveanu, T.; Llambi, F.; Parson, M. J.; Green, D. R. The Bcl-2 family reunion. Mol. Cell , [5] Chen, L.; Willis, S. N.; Wei, A.; Smith, B. J.; Fletcher J. I.; Hinds, M. G.; Colman, P. M.; Day, C. L.; Adams, J. M.; and Huang, D. C. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic fiction. Mol. Cell , [6] Leber, B.; Lin, J.; and Andrews, D. W. Embedded together: the life and death consequences of interaction of the Bcl-2 family with membranes. Apoptosis , [7] Worldwide Protein Data Bank Advisory Committe: Research Collaboratory for Structural Bioinformatcs. [online]. Dostupné z World Wide Web [citováno ]. [8] Sehnal, D.; Svobodová Vařeková, R.; Huber, H. J.; Geidl, S.; Ionescu, C.-M.; Wimmerová, M.; and Koča, J. SiteBinder: An improved approach for comparing multiple protein structural motifs. Journal of Chemical Information and Modeling, 52, , , 17 s. ISSN [9] Pop, C.; Salvesen, G. S.; Human Caspases: Activation, Specificity, and Regulation. The Journal of Biological Chemistry [online]. 2009, vol. 284, s , dostupné také z < ISSN X. [10] Green, D. R.; and Evan, G. I.; A matter of life and death. Cancer cell ,

38 [11] Zou, H.; Henzel, W. J.; Liu, X.; Lutschg, A.; Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell (3): [12] Gartel, A. L.; Radhakrishnan, S. K. Lost in transcription: p21 repression, mechanisms, and consequences. Cancer Res (10): [13] National Library of Medicine - Medical Subject Headings, DNA Topoisomerases, ses [citováno ]. [14] Murray, R. K.; Granner, D. K.; Mayes, P. A.; Rodwell, V. W. Harper s illustrated biochemistry, 2003, [15] Nagata, S.; Apoptotic DNA Fragmentation minireview. Experimental Cell Research [online]. 2000, vol. 256, s , dostupné také z < [16] [citováno ]. [17] [citováno ]. [18] Chipuk, J. E.; Kuwana, T.; Bouchier-Hayes, L.; Drion, N. M.; Newmeyer, D. D.; Schuler, M.; and Green, D. R. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis. Science , [19] Leu, J. I.; Dumont, P.; Hafey, M.; Murphy, M. E.; and George, D. L. Mitochondrial p35 activates Bak and causes disruption of a Bak-Mcl1 complex. Nat. Cell Biol , [20] Mihara, M.; Erster, S.; Zaika, A.; Petrenko, O.; Chittednen, T.; Pancoska, P.; and Moll, U. M. p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. Mol. Cell ,

39 [21] Pietsch, E. C.; Perchiniak, E.; Canutescu, A. A.; Wang, G.; Dunbrack, R. L.; and Murphy, M. E. Oligomerization of BAK by p53 utilizes conserved residues of p53 the DNA binding domain. J. Biol. Chem , [22] Kuwana, T.; Mackey, M. R.; Perkins, G.; Ellisman, M. H.; Latterich, M.; Schneiter, R.; Green, D. R.; and Newmeyer, D. D. Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell , [23] Wei, M. C.; Lindsten, T.; Mootha, V. K.; Weiler, S.; Gross, A.; Ashiya, M.; Thompson, C. B.; and Korsmeyer, S. J. tbid, a membrane-targeted death ligand, oligomerizes BAK to release cytochrome c. Genes Dev , [24] Hsu, Y. T.; and Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J. Biol. Chem , [25] Pagliari, L. J.; Kuwana, T.; Bonzon, C.; Newmeyer, D. D.; Tu, S.; Beere, H. M.; and Green, D.R. The multidomain proapoptotic molecules Bax and Bak are directly activated by heat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , [26] Konaguru, A. S.; Whisstock, J. C.; Stuckey, P. J.;Lesk, A. M. MUSTANG: a multiple structural alignment algorith. Proteins 2006, 64,